CN109730990B - 15-苄亚基-14-脱氧-11,12-脱氢穿心莲内酯衍生物在抗纤维化药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，公开了15‑苄亚基‑14‑脱氧‑11,12‑脱氢穿心莲内酯衍生物在制备预防和治疗人体器官或组织纤维化药物中的应用。经实验证明，该类化合物显著抑制TGF‑β1诱导的人肺泡Ⅱ型上皮细胞A549间充质转化；显著抑制TGF‑β1诱导的人肾皮质近曲小管上皮细胞HK‑2间充质转化；抑制血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的人原代心肌纤维化细胞HCFB增殖。显著降低博来霉素诱导的小鼠肺纤维化程度，显著降低单侧输尿管结扎诱导的大鼠肾纤维化程度和异丙肾上腺素ISO造成的昆明小鼠心肌纤维化程度。将该类化合物作为活性成份用于制备抗肾、肺、心脏等纤维化药物，高效低毒，为与纤维化相关疾病的治疗和预防提供了新的药物途径，从而扩大了临床用药的可选择范围，具有良好的应用开发前景。

Description

15-苄亚基-14-脱氧-11,12-脱氢穿心莲内酯衍生物在抗纤维 化药物中的应用

技术领域

本发明涉及穿心莲内酯衍生物作为抗人体器官或组织纤维化药物的应用，具体涉及14-脱氧-11,12-脱氢穿心莲内酯C15取代衍生物，属医药技术领域。

背景技术

组织纤维化是一种慢性疾病，多发于肝、肺、心脏、肾脏等部位。全球有1/3的人死于组织纤维化以及由此产生的器官衰竭。当组织受到损伤后，损伤部位发生一系列细胞反应，导致细胞外基质过度沉积，发生组织纤维化。最终可导致器官功能障碍，甚至死亡。心血管组织纤维化在高血压和心力衰竭引起的心血管组织重构中发挥了重要作用，同时也是引起动脉粥样硬化的主要原因。心肌纤维化的特征是细胞外基质蛋白在细胞间质中堆积，并引起心脏收缩和舒张功能障碍。心肌纤维化是失代偿性心肌肥厚和心力衰竭的重要标志，参与高血压、肥厚性心肌病、心力衰竭和心肌梗塞引起的心肌重构。

近年来肺纤维化发病率和致死率呈不断上升趋势。肺纤维化是许多肺部疾病发展、演变、疤痕化的最终结局，其病因多种多样。许多慢性肺疾病，包括哮喘、支气管扩张、慢阻肺、肺结核、肺癌、间质性肺病等，都伴有纤维化病理改变。其主要病理特点包括肺组织间充质细胞增殖、细胞外基质增生沉积及肺实质的重构等。对于特发性肺纤维化、呼吸窘迫综合征、嗜酸性肉芽肿等多种肺疾病而言，肺组织纤维增生和纤维化程度决定了该疾病的临床愈后情况。这些疾病发展到晚期，严重妨碍病人正常工作和生活质量，甚至导致病人因呼吸衰竭或心力衰竭而死亡。在过去的20年间，特发性肺纤维化发病率总体呈现明显增长的趋势，诊断后平均存活时间约3年，5年生存率30％～50％，愈后极差。

肾纤维化表现为细胞外基质和不适当结缔组织在肾聚集，导致肾结构改变和功能受损的病理过程，也是几乎所有肾脏疾病进展到终末期肾衰的共同通路。许多急慢性肾脏疾病也都与组织纤维化发生发展密切相关，特别是糖尿病肾病和高血压引起的肾纤维化改变。多种免疫和自身免疫疾病例如关节炎、全身硬化症和系统性红斑狼疮也有组织纤维化的改变。

由于引起上述各种组织器官纤维增生性疾病的病因众多、发病机制复杂、病程迁延数年至几十年不等，目前组织纤维化的确切发病机制尚未完全阐明，也没有公认的、真正能够逆转组织纤维化的药物。目前对纤维化疾病的治疗药物非常少，大多仅起到辅助治疗作用。在肺纤维化方面糖皮质激素和免疫抑制药物等虽能改善肺纤维化的症状，延缓疾病发展，但具有强烈的副作用。美国FDA批准的药物只有由InterMune，Inc.公司研制生产的Esbriet(pirfenidone,吡非尼酮)和德国殷格翰公司研制生产的尼达尼布(Nintedanib)，但这两种药物目前患者获益并不理想。

目前研究较多的与组织、器官纤维化发生发展相关的信号通路包括TGF-β₁/Smad信号通路、Wnt/β-catenin信号通路、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶(PI3K/Akt)信号通路等。例如，黄柏内酯通过对小鼠纤维化肺组织中TGF-β信号通路的抑制，下调α-SMA和胶原蛋白的生成(专利号：CN 105560255 A)。甲蟛蟆菊内酯—硫酸酯可显著抑制TGF-β诱导的人胚肺成纤维细胞的增殖及其羟脯氨酸(HYP)含量从而发挥改善肺纤维化程度的药理作用(专利号：CN 103919769 A)。作用于TGF-β下游的PI3K抑制剂用于治疗肺纤维化疾病(专利号：CN104093408 A)。还有利用土木香中的倍半菇一异土木香内酯类衍生物及其盐治疗肺纤维化(专利号：CN 106496243 A)的专利报道。在抗肾纤维化方面，灵芝内酯D可明显抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞Smad3磷酸化，对于肾脏纤维化具有治疗作用(专利号：CN106220643 A)。中国人民解放军第三军医大学第三附属医院发现芹菜素通过TRPV4介导Ca²⁺的内流,激活AMPK/SITR1信号通路,抑制肾脏纤维化。

穿心莲内酯是穿心莲Andrographis paniculata(Burm.f.)Nees中提取的二萜内酯类化合物，是中药穿心莲的主要有效成份之一。临床上主要用于治疗上呼吸道感染、细菌性痢疾等。近年来，穿心莲内酯在抗肿瘤、保肝利胆、抗病毒等方面的应用研究不断深入。黄成亮等发现穿心莲内酯可减轻博来霉素或者平阳霉素致肺纤维化大鼠肺泡炎和纤维化程度，降低肺组织PDGF表达和减少HYP含量；范贤明等研究发现穿心莲内酯可减轻博来霉素致肺纤维化大鼠肺泡炎和肺纤维化程度,降低肺组织I、III型胶原mRNA表达,降低支气管肺泡灌洗液(BALF)中TNF-α,TGF-β1浓度,且对肝、肾无明显毒副作用。孙景辉等研究发现穿心莲内酯注射液减轻病毒性心肌炎小鼠炎症和纤维化程度，机制可能是能抑制心肌中ST2的表达。聂梦琪等研究发现穿心莲内酯具有一定的抗肾间质纤维化作用，其机制可能与抗炎、抗氧化、降低TGF-β1及IGFBP-3的表达有关。钟星明等研究证明了穿心莲内酯可通过提高钠钾ATP酶和钙镁ATP酶活性，降低羟脯氨酸含量，从而抑制心脏纤维化，起抗心肌肥厚作用。Singha P等研究显示穿心莲内酯对乙醇引起的小鼠肝肾损伤具有一定的保护作用。Roy DN等研究证明穿心莲内酯与D-青霉胺联合治疗铜中毒比单一D-青霉胺在抗纤维化及细胞坏死方面效果更佳。

本发明人在前期研究中(CN1978437；CN100999520；CN100999535；CN101003527)获得了大量结构新颖的穿心莲内酯衍生物，并对部分衍生物在抗肿瘤、抗炎、抗HBV、HCV及急性肝损伤保护作用等应用申请了专利保护，本发明人还对15-苄亚基-14-脱氧-11,12-脱氢穿心莲内酯衍生物在制备抗肝纤维化药物中的应用进行了保护(申请号：201710214066.4)。进一步通过对15-苄亚基-14-脱氧-11,12-脱氢穿心莲内酯衍生物在除了肝脏以外的其它组织(器官)纤维化方面进行了活性试验研究，目前未见相关文献报道。

发明内容

本发明人在前期研究成果的基础上，通过对合成的化合物进行抗人体组织或器官纤维化活性筛选，发现15-苄亚基-14-脱氧-11,12-脱氢穿心莲内酯衍生物具有显著的预防和治疗纤维化相关疾病的作用，高效低毒，具有开发为抗纤维化药物的潜力。为此，本发明目的在于提供15-苄亚基-14-脱氧-11,12-脱氢穿心莲内酯衍生物在制备抗肺、肾和心脏纤维化药物中的应用。

所述15-苄亚基-14-脱氧-11,12-脱氢穿心莲内酯衍生物结构如通式1所示。

通式1

其中：R₁、R₂分别为氢或苯基和它们的单取代、多取代物中的一种；R₁、R₂分别为环己基、环戊基等环状取代基团中的一种；R₁、R₂可以是相同的取代基团或者不同的取代基团。R₃、R₄分别为氢或CH₂CH₂COOHCH₂CH₂CH₂CH₂COOH、CH₂CHCHCH₂COOH、CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂COOH等中的一种或COR₅，R₅为取代或者未取代的苯基、吡啶基、吡咯基、呋喃基等芳香杂环或环己基、环戊基、环丙基、吗啉基、哌啶基等碳环或者杂环结构以及饱和或者不饱和的C1-18长度的碳链等。R₃、R₄可以同时是相同的取代基团或者不同的取代基团。

优选如下化合物：R₁，R₂各自为氢或苯基、2-甲氧基苯基、3-甲氧基苯基、4-甲氧基苯基、2，3，5-三甲氧基苯基、2-羟基苯基、3-羟基苯基、4-羟基苯基、2-氟苯基、2-氯苯基、2-溴苯基、3-氟苯基、3-氯苯基、3-溴苯基、4-氟苯基、4-氯苯基、4-溴苯基、2-氟-3-甲氧基苯基、3-甲氧基-4-氯苯基、2，4-二氟苯基、2，4-二氯苯基、2，4-二溴苯基、2-氟-4-氯苯基、2-溴-4-氯苯基、3-氟-4-氯苯基、3-溴-4-氯苯基、3，4-二氟苯基、3，4-二氯苯基、3，4二溴苯基、2-氯-4-氟苯基、2-溴-4-氟苯基、3-氯-4-氟苯基、3-溴-4-氟苯基、2-氟-4-溴苯基、2-氯-4-溴苯基、3-氟-4-溴苯基、3-氯-4-溴苯基、2，3，4-三氯苯基、2-甲氧基-4-氯苯基、2-羟基-4-氯苯基、2-羟基-4-甲氧基苯基、3-氨基-4-氯苯基、2-氨基-4-氯苯基，2-硝基-4-氟苯基，2-硝基-4-氯苯基，R₁，R₂同时相同或不同但不同时为氢；R₃、R₄各自为氢；或R₃、R₄分别为CH₂CH₂COOH、CH₂CH₂CH₂CH₂COOH、CH₂CHCHCH₂COOH、CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂COOH中的一种，或者R₃、R₄各自为COR₅；R₅为3-吡啶基或CH₂CH₂COOH、CH₂CH₂CH₂CH₂COOH、CH₂CHCHCH₂COOH、CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂COOH中的一种，R₃、R₄选同时相同或不同的取代基团。

优选化合物为：R₁，R₂各自为氢或苯基、2-甲氧基苯基、3-甲氧基苯基、4-甲氧基苯基、2，3，5-三甲氧基苯基、2-羟基苯基、3-羟基苯基、4-羟基苯基、2-氟苯基、2-氯苯基、2-溴苯基、3-氟苯基、3-氯苯基、3-溴苯基、4-氟苯基、4-氯苯基、4-溴苯基、2-氟-3-甲氧基苯基、3-甲氧基-4-氯苯基、2，4-二氟苯基、2，4-二氯苯基、2，4-二溴苯基、2-氟-4-氯苯基、2-溴-4-氯苯基、3-氟-4-氯苯基、3-溴-4-氯苯基、3，4-二氟苯基、3，4-二氯苯基、3，4二溴苯基、2-氯-4-氟苯基、2-溴-4-氟苯基、3-氯-4-氟苯基、3-溴-4-氟苯基、2-氟-4-溴苯基、2-氯-4-溴苯基、3-氟-4-溴苯基、3-氯-4-溴苯基、2，3，4-三氯苯基、2-甲氧基-4-氯苯基、2-羟基-4-氯苯基、2-羟基-4-甲氧基苯基、3-氨基-4-氯苯基、2-氨基-4-氯苯基，2-硝基-4-氟苯基，2-硝基-4-氯苯基，但R₁，R₂不同；R₃、R₄各自为氢；或R₃、R₄分别为CH₂CH₂COOH、CH₂CH₂CH₂CH₂COOH、CH₂CHCHCH₂COOH、CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂COOH中的一种，或者R₃、R₄各自为COR₅，R₅为3-吡啶基或CH₂CH₂COOH，R₃、R₄选相同取代基团。

更优选化合物为：当R₁，R₂其中之一为氢时，R₁，R₂其中之一选如下基团：苯基、2-甲氧基苯基、3-甲氧基苯基、4-甲氧基苯基、2-氟苯基、2-氯苯基、2-溴苯基、3-氟苯基、3-氯苯基、3-溴苯基、4-氟苯基、4-氯苯基、4-溴苯基、2-氟-3-甲氧基苯基、3-甲氧基-4-氯苯基、2，4-二氟苯基、2，4-二氯苯基、2，4-二溴苯基、2-氟-4-氯苯基、2-溴-4-氯苯基、3-氟-4-氯苯基、3-溴-4-氯苯基、3，4-二氟苯基、3，4-二氯苯基、3，4二溴苯基、2-氯-4-氟苯基、2-溴-4-氟苯基、3-氯-4-氟苯基、3-溴-4-氟苯基、2-氟-4-溴苯基、2-氯-4-溴苯基、3-氟-4-溴苯基、3-氯-4-溴苯基、2-甲氧基-4-氯苯基；R₃、R₄各自为氢；或R₃、R₄分别为CH₂CH₂COOH、CH₂CH₂CH₂CH₂COOH、CH₂CHCHCH₂COOH、CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂COOH中的一种，或者R₃、R₄各自为COR₅，R₅为3-吡啶基或CH₂CH₂COOH，R₃、R₄选相同取代基团。

更优选化合物为：

A：R₁＝H，R₂＝C₆H₅，R₃＝R₄＝H；

B：R₁＝H，R₂＝2-F-C₆H₄，R₃＝R₄＝H；

C：R₁＝H，R₂＝2-Cl-C₆H₄，R₃＝R₄＝H；

D：R₁＝H，R₂＝2-Br-C₆H₄，R₃＝R₄＝H；

E：R₁＝H，R₂＝3-F-C₆H₄，R₃＝R₄＝H；

F：R₁＝H，R₂＝3-Cl-C₆H₄，R₃＝R₄＝H；

G：R₁＝H，R₂＝3-Br-C₆H₄，R₃＝R₄＝H；

H：R₁＝H，R₂＝4-Cl-C₆H₄，R₃＝R₄＝H；

I：R₁＝H，R₂＝4-F-C₆H₄，R₃＝R₄＝H；

J：R₁＝H，R₂＝4-Br-C₆H₄，R₃＝R₄＝H；

K：R₁＝H，R₂＝4-CH₃O-C₆H₄，R₃＝R₄＝H；

L：R₁＝H，R₂＝2-CH₃O-4-Cl-C₆H₃，R₃＝R₄＝H；

M：R₂＝H，R₁＝2-Br-C₆H₄，R₃＝R₄＝H；

N：R₂＝H，R₁＝3-Cl-C₆H₄，R₃＝R₄＝H；

O：R₂＝H，R₁＝2-F-4-Cl-C₆H₃，R₃＝R₄＝H；

P：R₂＝H，R₁＝2,4-二氯苯基，R₃＝R₄＝H；

Q：R₂＝H，R₁＝4-F-C₆H₄，R₃＝R₄＝H；

R：R₂＝H，R₁＝C₆H₅，R₃＝R₄＝H；

S：R₁＝H，R₂＝3-F-4-Cl-C₆H₃，R₃＝R₄＝H；

T：R₁＝H，R₂＝2,4-二氟苯基，R₃＝R₄＝H；

U：R₁＝H，R₂＝3,4-二氯苯基，R₃＝R₄＝H；

V：R₁＝H，R₂＝4-Cl-C₆H₄，R₃＝R₄＝COR₅，R₅＝3-吡啶基；

W：R₁＝H，R₂＝4-Cl-C₆H₄，R₃＝R₄＝CH₂CH₂COOH；

X：R₁＝H，R₂＝4-Cl-C₆H₄，R₃＝R₄＝COR₅，R₅＝CH₂CH₂COOH；

Y：R₂＝H，R₁＝4-Cl-C₆H₄，R₃＝R₄＝H；

Z：R₂＝H，R₁＝4-Cl-C₆H₄，R₃＝R₄＝COR₅，R₅＝3-吡啶基。

本发明提出的上述化合物其制备方法已在发明专利CN:200510107247.4中公开。

为研究所述化合物在制备抗肺、肾和心脏纤维化药物中的应用效果，本发明利用人肺泡Ⅱ型上皮细胞A549评价本发明化合物对TGF-β1诱导的A549细胞间充质转化的抑制活性，评价化合物的抗肺纤维化活性；利用人肾皮质近曲小管上皮细胞HK-2评价本发明化合物对TGF-β1诱导的HK-2细胞间充质转化的抑制活性，评价化合物的抗肾纤维化活性；采用AngⅡ刺激原代人心肌成纤维细胞HCFB后检测细胞增殖情况评价本发明化合物抗心肌纤维化作用。进一步，分别采用博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型、单侧输尿管结扎诱导大鼠肾纤维化模型(UUO)和异丙肾上腺素ISO造成的昆明小鼠心肌纤维化模型研究本发明代表性化合物抗肺、肾和心肌纤维化作用，评价部分代表性结构的体内抗纤维化作用。

该类化合物显著抑制TGF-β1诱导的人肺泡Ⅱ型上皮细胞A549间充质转化；显著抑制TGF-β1诱导的人肾皮质近曲小管上皮细胞HK-2间充质转化；抑制血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的人原代心肌纤维化细胞HCFB增殖。显著减轻博来霉素诱导的KM小鼠肺组织纤维化程度，显著减轻单侧输尿管结扎诱导的SD大鼠肾纤维化程度，显著减轻异丙肾上腺素ISO造成的昆明小鼠心肌纤维化程度。

该类化合物的顺、反结构均具有抗纤维化活性，以该类化合物的含与不含结晶水的分子形式，各种晶型或无定型为有效药用成份，或该类化合物的各类前药形式，单独或与其它药物组合，按目前各种常规的制药方法和工艺要求，与制药中可以接受的辅助和/或添加成份混合后，制成用于抗纤维化的口服型制剂、注射型制剂等各类药物剂型。优选将其制备治疗或预防肺、肾、心等各类纤维化疾病的药物。口服型制剂为片剂、丸剂、胶囊、冲剂或糖浆等；注射型制剂包括注射液或冻干粉针剂型等。

本发明优点及创新点：通过活性筛选，确定上述化合物具有明确的抗肾、肺、心脏器官和组织纤维化活性。经实验证明，与母体化合物穿心莲内酯(AD)相比，本发明化合物抗肺、肾和心脏等器官纤维化作用显著提高。因此，将该类化合物作为活性成份用于制备抗肾、肺、心脏纤维化药物，为与纤维化有关疾病的治疗和预防提供了新的药物途径，从而扩大了临床用药的可选择范围，具有良好的应用开发前景。

附图说明

图1为AD和本发明化合物对人肺泡Ⅱ型上皮细胞A549活力的影响,化合物浓度为30.00μM,图中:1.AD；2.A；3.B；4.C；5.D；6.E；7.F；8.G；9.H；10.I；11.J；12.K；13.L；14.M；15.N；16.O；17.P；18.Q；19.R；20.S；21.T；22.U；23.V；24.W；25.X；26.Y；27.Z；

图2为AD和本发明化合物抑制TGF-β1诱导的人肺泡Ⅱ型上皮细胞A549间充质转化作用(统计结果),化合物AD、N、P、Q、S-W和Z的低、高浓度分别为0.63μM和1.25μM，化合物C、E-G、I-L、O、R、X和Y的低、高浓度分别为0.31μM和0.63μM，化合物A、B、D、H和M的低、高浓度分别为0.16μM和0.31μM；图中:1.对照；2.TGF-β1；3.TGF-β1+AD；4.TGF-β1+A；5.TGF-β1+B；6.TGF-β1+C；7.TGF-β1+D；8.TGF-β1+E；9.TGF-β1+F；10.TGF-β1+G；11.TGF-β1+H；12.TGF-β1+I；13.TGF-β1+J；14.TGF-β1+K；15.TGF-β1+L；16.TGF-β1+M；17.TGF-β1+N；18.TGF-β1+O；19.TGF-β1+P；20.TGF-β1+Q；21.TGF-β1+R；22.TGF-β1+S；23.TGF-β1+T；24.TGF-β1+U；25.TGF-β1+V；26.TGF-β1+W；27.TGF-β1+X；28.TGF-β1+Y；29.TGF-β1+Z；

图3为AD和本发明化合物对人肾皮质近曲小管上皮细胞HK-2活力的影响，化合物浓度为30.00μM，图中：1.AD；2.A；3.B；4.C；5.D；6.E；7.F；8.G；9.H；10.I；11.J；12.K；13.L；14.M；15.N；16.O；17.P；18.Q；19.R；20.S；21.T；22.U；23.V；24.W；25.X；26.Y；27.Z；

图4为AD和本发明化合物抑制TGF-β1诱导的人肾皮质近曲小管上皮细胞HK-2细胞间充质转化作用(部分显微图片；×100倍)，图中：1.对照；2.TGF-β1；3.TGF-β1+AD(0.63μM)；4.TGF-β1+T(0.63μM)；5.TGF-β1+A(0.63μM)；6.TGF-β1+H(0.08μM)；7.TGF-β1+F(0.63μM)；8.TGF-β1+J(0.63μM)；9.TGF-β1+K(0.63μM)；10.TGF-β1+Z(0.63μM)；11.TGF-β1+Y(0.16μM)。

图5为AD与本发明代表化合物H(0.3、3.0和15.0μM)对原代人心肌成纤维细胞HCFB增殖作用的影响。

图6为AD(0.63μM)与本发明代表化合物H(0.08μM、0.16μM、0.31μM和0.63μM)抑制血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的原代人心肌成纤维细胞HCFB增殖作用，与AngII组比，^*P＜0.05，^**P＜0.01；与AD组比，^#P＜0.05,^##P＜0.01。

图7为本发明代表性化合物H对博来霉素诱导的KM小鼠肺组织纤维化程度的影响(胶原面积/％)，与模型组比，^*P＜0.05，^**P＜0.01；与AD组比，^##P＜0.01；

图8为本发明代表性化合物H对博来霉素诱导的KM小鼠肺组织纤维化程度的影响(部分Masson染色图片；×100倍)；

图9为本发明代表性化合物H对单侧输尿管结扎诱导的SD大鼠肾纤维化程度的影响(相对胶原面积/％)，与模型组比，^*P＜0.05，^**P＜0.01；与AD组比，^##P＜0.01；

图10为本发明代表性化合物H对单侧输尿管结扎诱导的SD大鼠肾纤维化程度的影响(部分Masson染色图片；×100倍)。

图11为本发明代表性化合物H对异丙肾上腺素ISO造成的KM小鼠心肌纤维化程度的影响(胶原面积/％)，图中：1.正常对照；2.模型组；3.AD(15mg/kg)；4.AD(30mg/kg)；5.H(3.75mg/kg)；6.H(7.5mg/kg)；7.H(15mg/kg)；与模型组比，^*P＜0.05，^**P＜0.01；与AD组比，^##P＜0.01；

图12为本发明代表性化合物H对异丙肾上腺素ISO造成的KM小鼠心肌纤维化程度的影响(部分天狼星红染色图片；×100倍)，图中：1.正常对照；2.模型组；3.AD(15mg/kg)；4.AD(30mg/kg)；5.H(3.75mg/kg)；6.H(7.5mg/kg)。

具体实施方案

下面结合具体实施方案来阐述本发明。应理解这些实施方案仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本发明涉及的化合物不限于实施例中使用的代表性结构，可以更换15位的不同取代基，获得具有抗纤维化活性的化合物；可以用各种导致纤维化的原因作为研究对象来得出本发明化合物具有抗纤维化作用；也可以利用其他各种体内外研究模型(方法)来得出本发明化合物具有抗纤维化作用。

实施例1本发明化合物抑制人Ⅱ型肺泡上皮细胞A549间充质转化

存在于肺泡里的Ⅱ型肺泡上皮细胞受到炎症介质、生长因子等细胞因子的刺激，细胞形态由鹅卵石状变为梭状，完成上皮间充质转化过程(EMT)，具有了间质细胞的功能，进而合成胶原纤维，大量胶原纤维沉积可加剧肺间质纤维化的病程。因此，与穿心莲内酯比较，利用人Ⅱ型肺泡上皮细胞A549，采用形态学观察法和细胞划痕(迁移)实验评价本发明化合物体外抗肺纤维化作用。

1)细胞培养

将A549细胞培养在含10％(V/V)胎牛血清、100μg/mL链霉素、100IU/mL青霉素的RPMI1640培养液中，置体积分数5％CO₂培养箱中于饱和湿度、37℃培养。

2)药物与试剂

穿心莲内酯由四川什邡市金鑫生物科技有限公司生产(批号：120822)，纯度大于99％；本发明化合物由本发明人所在实验室合成，纯度大于99％，下同。

3)MTT法测定细胞毒

将生长对数期的A549细胞用0.25％(W/V)胰蛋白酶消化后，用含10％(V/V)胎牛血清的RPMI1640培养基稀释成5×10⁴/mL细胞悬液，铺于96孔板内，200μL/孔，于37℃，体积分数5％CO₂培养箱中培养24h，加入含药培养基，药物终浓度最高为30.00μmol/L，每个处理4孔重复，继续培养48h，加入MTT(5mg/mL)，20μL/孔，培养4h，弃上清，加入150μL DMSO，震荡l0min，用酶标仪测定吸光值。测定波长为570nm，参考波长为450nm。计算化合物作用后的细胞存活率，存活率(％)＝药物组OD_570-450值/对照组OD_570-450值×100％，结果取平均值，见附图1。

4)形态学观察法检测药物对A549细胞EMT的影响

将生长对数期的A549细胞用0.25％(W/V)胰蛋白酶消化后，用含10％(V/V)胎牛血清的RPMI1640培养基稀释成3×10⁴/mL细胞悬液，铺于96孔板内，每孔200μL。培养24h之后待贴壁细胞融合至80％～90％时，弃去原培养基，无血清培养基同步化培养24h，弃去培养基，用PBS洗两遍，同时加入200μL含有TGF-β1(5ng/mL)及不同浓度待测化合物的RPMI1640培养基后立即在显微镜下拍照(100×)。设3孔重复并且设置对照。培养48h后分别在显微镜下拍照。每种化合物相同浓度选取5个视野，测量大于100个细胞。利用photoshop CS6软件对图片进行处理，并计算其圆形度(公式e＝4π×S/C2，其中e代表圆形度，S代表面积，C代表周长)。结果取平均值，见附图2。

5)实验结果

附图1结果表明，与AD相比，在30.00μM浓度下，本发明化合物对A549细胞的细胞毒活性未见增强。

附图2结果表明：本发明化合物在无毒浓度下，可显著抑制A549细胞上皮间充质转化，且与AD比，对人Ⅱ型肺泡上皮细胞间充质转化的抑制作用更强，安全指数更高。

实施例2本发明化合物抑制TGF-β1诱导的人肾皮质近曲小管上皮细胞HK-2间充质转化作用

早期研究发现肾小管上皮细胞可以向成纤维细胞转分化并表达其标志蛋白成纤维特异性蛋白(FSP1，fibroblast-specific protein 1)，肾小管上皮细胞－间充质细胞转分化是肾脏间质纤维化的重要发病机制之一。因此，与穿心莲内酯AD比较，利用人肾皮质近曲小管上皮细胞HK-2(由中国典型培养物保藏中心提供)，采用TGF-β1刺激后形态学观察法和划痕实验研究本发明化合物体外抗肾纤维化作用。

1)细胞培养

将HK-2细胞培养在含10％胎牛血清(V/V)、100μg/mL链霉素、100IU/mL青霉素的DMEM-F12培养液中，置含体积分数5％CO₂培养箱中，于饱和湿度、37℃培养。

2)MTT法测定细胞毒

将生长对数期的HK-2细胞用0.25％(W/V)胰蛋白酶+0.02％EDTA(W/V)消化后，用含10％(V/V)胎牛血清的DMEM-F12培养基稀释成7.0×10⁴/mL细胞悬液，铺于96孔板内，200μL/孔，于37℃，体积分数5％CO₂培养箱中培养24h，更换为含不同浓度药物培养基，药物最高终浓度为30.00μM，每个处理4孔重复，继续培养48h。其他同实施例1。结果取平均值，如附图3所示。

3)TGF-β1刺激后观察药物对HK-2细胞形态的影响

将生长至对数期的HK-2细胞用0.25％(W/V)胰蛋白酶+0.02％EDTA消化后，用含10％(V/V)胎牛血清的DMEM-F12培养基稀释成5.0×10⁴/mL细胞悬液，铺于96孔板内，每孔200μL。培养24h之后细胞长成单层，弃去原培养基，用0.01MPBS清洗两遍，更换无血清培养基以同步化，再培养24h后，吸弃无血清培养基，加入200μL含不同浓度待测化合物与刺激因子TGF-β1(5ng/mL)的DMEM-F12培养基。设3孔重复并且设置对照。培养48h后分别在显微镜下拍照记录。部分本发明化合物作用细胞后的形态学变化见附图4。

4)实验结果

附图3结果表明，与AD相比，在30.00μM浓度下，本发明化合物对HK-2细胞增殖的抑制作用显著降低。

表1和附图3、4结果表明：本发明化合物在无毒浓度下，可显著抑制TGF-β1诱导的人近端肾小管上皮细胞HK-2向间充质细胞转化，且与AD比，对HK-2细胞向间充质转化的抑制作用更强，安全指数更高。

表1本发明化合物抑制TGF-β诱导的人近端肾小管上皮细胞HK-2向间充质细胞转化作用

注：测试浓度为0.08-1.25μM；对照：上皮细胞之间具有相互作用，组织结构紧密，细胞呈典型的铺路石状；TGF-β1处理：上皮细胞失去其典型状态，细胞之间相互作用消失，组织结构相对松散，细胞密度变小，立方呈铺路石状上皮细胞转变为纺锤状纤维细胞的形态；极强(抑制作用)：细胞几乎与对照无异，视野下极少见纺锤状，胞间恢复相互作用，形态恢复其典型的铺路石状；强(抑制作用)：抑制了细胞的侵袭性，细胞紧实，细胞状态几乎完全恢复，少见纺锤纤维状细胞；中强(抑制作用)：细胞密度变大，大部分细胞仍呈立方状态。

实施例3本发明化合物抑制血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的人原代心肌纤维化细胞HCFB增殖作用

有研究表明，心肌成纤维细胞是心肌纤维化的主要效应细胞，在受到AngⅡ等活性物质刺激后会发生数量增殖，其表型转化为有分泌胞外基质功能的肌成纤维细胞。因此，采用MTT法检测AngⅡ刺激原代人心肌成纤维细胞HCFB后的细胞抑制作用评价本发明化合物H抗心肌纤维化作用。

1)细胞培养

采用原代人心肌成纤维细胞HCFB(由商城北纳创联生物科技有限公司提供)，与穿心莲内酯比较，研究本发明化合物H的体外抗心肌纤维化作用。将HCFB细胞培养在含H-DMEM培养液的培养瓶中，培养液中含体积分数10％胎牛血清(美国GIBCO，货号：302220F)、100μg/mL链霉素、100IU/mL青霉素，置于体积分数为5％CO₂培养箱(德国Binder公司)中于饱和湿度、37℃培养。

2)MTT法测定细胞毒

将生长对数期的HCFB细胞用0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化后，用含体积分数10％胎牛血清的H-DMEM培养基稀释成5.0×10⁴/mL细胞悬液，铺于96孔板(美国Costar公司)内，200μL/孔，于37℃，体积分数5％CO₂，饱和湿度的培养箱中培养24h，加入含不同浓度化合物AD或H的培养基，继续培养48h，加入MTT(5mg/mL)，20μL/孔，培养4h，弃上清，加入150μL DMSO，震荡l0min，用酶标仪测定吸光值。测定波长为570nm，参考波长为450nm。计算化合物作用后的细胞存活率，存活率(％)＝药物组A值/细胞对照组A值×100％，结果见附图5。数据利用SPSS 17.0统计学软件进行处理和分析。

3)MTT法检测药物对AngⅡ刺激的心肌成纤维细胞HCFB增殖能力的抑制作用

将对数生长期的HCFB细胞用0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化后，用含体积分数10％胎牛血清的H-DMEM培养基稀释成5.0×10⁴/mL细胞悬液，铺于96孔板内，每孔200μL。培养24h至细胞长成单层，弃去原培养基，用0.01M PBS清洗两遍，更换无血清培养基以同步化，继续培养24h后，吸弃无血清培养基，加入200μL含不同浓度待测化合物与刺激因子AngⅡ(10^-7mol/L)的H-DMEM培养基。设3孔重复，以含0.5％DMSO的H-DMEM培养基为阴性对照，含刺激因子AngⅡ(10^-7mol/L)和0.5％DMSO的H-DMEM培养基为阳性对照。培养48h后MTT法检测细胞存活率。结果见附图6。数据利用SPSS 17.0统计学软件进行处理和分析。数据均采用平均值±标准差

来表示；P﹤0.05组间差异有显著性意义。

4)实验结果

附图5结果表明，本发明化合物H在15.00μM浓度下，对人原代心肌成纤维细胞HCFB细胞增殖未表现出明显的抑制作用。

附图6结果表明：本发明化合物H在无毒浓度下，可显著抑制AngII对HCFB的增殖作用，且与AD比，对人HCFB增殖抑制作用更强，安全指数更高。

实施例4本发明化合物显著降低博来霉素诱导的KM小鼠肺纤维化程度

肺纤维化是由多种原因而引起的肺脏损伤，肺纤维化形成的病理机制复杂，不同致病因子启动炎症、免疫反应，涉及多种细胞包括血管内皮细胞、肺泡上皮细胞、成纤维细胞及巨噬细胞等，多种细胞因子和炎症介质的相互作用。博来霉素属碱性糖肽类抗癌抗生素，该药严重的毒不良反应之一是引起肺纤维化，在动物实验中已证实，博莱霉素所致肺纤维化病理组织学改变与人类肺纤维化非常相似，被普遍作为研究肺纤维化的模型。

1材料与方法

1)实验动物

清洁级KM小鼠，雄性，体重20±2g，购于河南省实验动物中心。许可证号：SCXK(豫)2015-0004。

2)药品、试剂及其配制

注射用盐酸博来霉素由海正辉瑞制药有限公司生产(批号：YBH15562005国药准字：H20055883)；醋酸波尼松片由浙江仙琚制药股份有限公司生产(批号：170410，国药准字，33021207)。其他供试药物、化合物同实施例1；药物配成0.5％的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)混悬液。药用级低聚羧甲基纤维素钠(CMC-Na)由安徽山河药用辅料有限公司生产(批号：131114)。

3)实验方法

KM小鼠适应性喂养3d后，按照体重随机分组：假手术对照组、模型组、AD对照组(250mg/kg)、波尼松对照组(5mg/kg)、H化合物给药组(62.5mg/kg)和H化合物给药组(250.mg/kg)，共6组，每组15只。腹腔注射质量百分比4％的戊巴比妥钠(2ml/kg)对小鼠进行麻醉，仰卧位固定小鼠，剃去颈部毛发，碘酒消毒皮肤后，沿颈部向下行1cm左右切口，游离支气管，注射博来霉素(2mg/mL)50μL，随即注入150μL空气，快速转动小鼠，使药液均匀分布，然后以4/0号丝线缝合切口，碘伏消毒后，无菌纱布包扎伤口，最后将术后小鼠送至温暖处直至苏醒，其中，假手术组注射同等体积的生理盐水。造模结束24h后，开始定时定点定人灌胃给药，其中假手术组给予同等体积比例提及的CMC-Na，每天1次，给药28d后结束实验。小鼠在末次灌胃前12h更换垫料，严格禁食不禁水。给药后0.5h后采用摘眼球法收集小鼠全血，采集完血液后颈椎脱臼法处死小鼠，采集肺脏，称重，观察并记录肺部病变。拍照后将肺固定于4％多聚甲醛固定液中。固定充分后进行病理切片，经Masson三色染观察肝脏纤维化程度，Image-Pro Plus软件对Masson染色切片的拍照结果进行纤维化组织学半定量分析。计算相对胶原面积：(给药组平均面积－正常组平均面积)/(模型组平均面积－正常组平均面积)×100％，结果见附图7、8。

2实验结果

附图7和8结果表明：在博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型上，本发明化合物H显著减少肺纤维化KM小鼠肺组织纤维化面积，且作用显著强于AD。

实施例5本发明化合物显著降低单侧输尿管结扎诱导的SD大鼠肾纤维化程度

单侧输尿管结扎诱导大鼠肾纤维化模型(UUO)是研究肾纤维化经典模型之一，该模型特征为肾小管间质中细胞成分积聚、成纤维细胞分化/增殖、ECM沉积增加和肾小管萎缩等，与临床肾脏疾病的发生发展过程相似，极其有助于各种肾小管间质损伤疾病防治的研究，且造模方法简便，成模率100％，病变均一，有较好的重复性，能够在短期内造成纤维化，就研究肾间质纤维化的发病规律及机制探讨而言，是一种较为快速、可靠的动物模型。因此，UUO模型广泛应用于肾间质纤维化机制研究及改善肾间质纤维化的治疗效果的评价等。

1材料与方法

1)实验动物

清洁级SD大鼠，雄性，体重200±20g，购于河南省实验动物中心。许可证号：SCXK(豫)2015-0004。

2)药品、试剂及其配制

穿心莲内酯、羧甲基纤维素钠及本实验化合物的来源和配制同实施例1或4。

3)实验方法

SD大鼠适应性喂养3d后，按照体重随机分组：假手术对照组、模型组、AD对照组(0.15mmol/kg)、H化合物给药组(0.06mmol/kg)、H化合物给药组(0.10mmol/kg)、H化合物给药组(0.15mmol/kg)共6组，每组4只。术前准备及麻醉同实施例4，麻醉后，左侧卧位固定大鼠，剃去胸骨下缘至后肢见毛发，铺手术布与剃去毛发的皮肤上，碘酒消毒皮肤后，沿胸骨下缘约0.2cm处向下行2cm左右切口，挤出肾脏，游离输尿管，在距离膀胱约1/3输尿管长度处，以4/0号丝线双重结扎并离断输尿管，肾脏送回腹腔后，以4/0号丝线全层关腹，碘伏消毒后，无菌纱布包扎伤口，最后将术后大鼠送至温暖处直至苏醒，其中，假手术组只游离输尿管不结扎、不离段。造模结束24h后，开始定时定点定人灌胃给药，给药方法同实施例4，给药14d后结束实验。大鼠在末次灌胃前12h更换垫料，严格禁食不禁水。给药后0.5h腹腔注射质量百分比3％的戊巴比妥钠(2mL/kg)麻醉剂，采血后迅速完整地剖离左侧肾脏，称量肾重，测定肾大小，拍照后固定于4％多聚甲醛固定液中。血清制备及Masson染色方法和统计处理同实施例2。Masson染色结果及相对胶原面积统计结构如附图9和10。

2实验结果

结合附图9和10，结果表明：在UUO模型上，本发明代表性化合物H显著降低肾纤维化程度，改善病变肾组织结构，且作用显著强于AD。

实施例6本发明化合物显著减轻异丙肾上腺素(ISO)造成的KM小鼠心肌纤维化程度

1材料与方法

试验动物：SPF级昆明小鼠，雄性，体重23士2g，购于河南省实验动物中心。其许可证号是SCXK(豫)2017-0001

异丙肾上腺素ISO：sigma:产品；供试化合物配成0.5％的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)混悬液。穿心莲内酯、羧甲基纤维素钠及本实验化合物的来源和配制同实施例1或4。

试验方法：KM小鼠适应性喂养3d后，按照体重随机分组:生理盐水对照组、模型组、AD的15mg/kg和30mg/kg剂量组，本发明化合物H的3.75mg/kg，7.5mg/kg，15mg/kg剂量组，每组9只。模型组和其余各给药组以20mg/kg皮下注射ISO，连续7天，生理盐水组皮下注射等量生理盐水。皮下注射药物2h后,生理盐水组和模型组灌胃给予0.5％CMC-Na，其余各给药组给予0.5％CMC-Na混悬的相应药物，给药2w结束。小鼠在末次灌胃前12h更换垫料，严格禁食不禁水。给药后1h，眼球采血，之后迅速完整地剖离心脏并拍照。血液离心后，取上清，保存备用。取小鼠心脏组织于10倍体积4％(w/v)多聚甲醛固定液中固定，24h后更新固定液。固定充分后进行病理切片，经天狼星红染色观察心脏纤维化程度，Image-Pro Plus软件对天狼星染色切片的拍照结果进行纤维化组织学半定量分析。计算相对胶原面积，结果见附图11和图12。数据利用SPSS 17.统计学软件进行处理和分析。数据均采用平均值士标准差(X士S)来表示:P<0.05组间差异有显著性意义。

2实验结果

结合图11、图12，结果表明:在异丙肾上腺素致心肌纤维化模型上，本发明化合物抗肝纤维化作用均显著强于AD药物处理组。

Claims (5)

1.结构如通式1所示的15-苄亚基-14-脱氧-11,12-脱氢穿心莲内酯衍生物在制备药物中的应用，其特征在于，将其作为活性成份用于制备抗肾、肺或心肌纤维化药物；

通式1

R₁，R₂各自为氢或苯基、2-甲氧基苯基、3-甲氧基苯基、4-甲氧基苯基、2，3，5-三甲氧基苯基、2-羟基苯基、3-羟基苯基、4-羟基苯基、2-氟苯基、2-氯苯基、2-溴苯基、3-氟苯基、3-氯苯基、3-溴苯基、4-氟苯基、4-氯苯基、4-溴苯基、2-氟-3-甲氧基苯基、3-甲氧基-4-氯苯基、2，4-二氟苯基、2，4-二氯苯基、2，4-二溴苯基、2-氟-4-氯苯基、2-溴-4-氯苯基、3-氟-4-氯苯基、3-溴-4-氯苯基、3，4-二氟苯基、3，4-二氯苯基、3，4二溴苯基、2-氯-4-氟苯基、2-溴-4-氟苯基、3-氯-4-氟苯基、3-溴-4-氟苯基、2-氟-4-溴苯基、2-氯-4-溴苯基、3-氟-4-溴苯基、3-氯-4-溴苯基、2，3，4-三氯苯基、2-甲氧基-4-氯苯基、2-羟基-4-氯苯基、2-羟基-4-甲氧基苯基、3-氨基-4-氯苯基、2-氨基-4-氯苯基，2-硝基-4-氟苯基，2-硝基-4-氯苯基，但R₁，R₂不同； R₃、R₄各自为氢；或R₃、R₄分别为CH₂CH₂COOH、CH₂CH₂CH₂CH₂COOH、CH₂CHCHCH₂COOH、CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂COOH 中的一种，或者R₃、R₄各自为COR₅，R₅为3-吡啶基或CH₂CH₂COOH，R₃、R₄选相同取代基团。

2.如权利要求1所述的15-苄亚基-14-脱氧-11,12-脱氢穿心莲内酯衍生物在制备药物中的应用，其特征在于，当R₁，R₂其中之一为氢时，R₁，R₂其中之一选如下基团：苯基、2-甲氧基苯基、3-甲氧基苯基、4-甲氧基苯基、2-氟苯基、2-氯苯基、2-溴苯基、3-氟苯基、3-氯苯基、3-溴苯基、4-氟苯基、4-氯苯基、4-溴苯基、2-氟-3-甲氧基苯基、3-甲氧基-4-氯苯基、2，4-二氟苯基、2，4-二氯苯基、2，4-二溴苯基、2-氟-4-氯苯基、2-溴-4-氯苯基、3-氟-4-氯苯基、3-溴-4-氯苯基、3，4-二氟苯基、3，4-二氯苯基、3，4二溴苯基、2-氯-4-氟苯基、2-溴-4-氟苯基、3-氯-4-氟苯基、3-溴-4-氟苯基、2-氟-4-溴苯基、2-氯-4-溴苯基、3-氟-4-溴苯基、3-氯-4-溴苯基、2-甲氧基-4-氯苯基；R₃、R₄各自为氢；或R₃、R₄分别为CH₂CH₂COOH、CH₂CH₂CH₂CH₂COOH、CH₂CHCHCH₂COOH、CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂COOH 中的一种，或R₃、R₄各自为COR₅，R₅为3-吡啶基或CH₂CH₂COOH，R₃、R₄选相同取代基团。

3.如权利要求1所述的15-苄亚基-14-脱氧-11,12-脱氢穿心莲内酯衍生物在制备药物中的应用，其特征在于，选如下化合物：

A：R₁=H，R₂=C₆H₅，R₃= R₄=H；

B：R₁=H，R₂=2-F-C₆H₄，R₃= R₄=H；

C：R₁=H，R₂=2-Cl-C₆H₄，R₃= R₄=H；

D：R₁=H，R₂=2-Br-C₆H₄，R₃= R₄=H；

E：R₁=H，R₂=3-F-C₆H₄，R₃= R₄= H；

F：R₁=H，R₂=3-Cl-C₆H₄，R₃= R₄= H；

G：R₁=H，R₂=3-Br-C₆H₄，R₃= R₄= H；

H：R₁=H，R₂=4-Cl-C₆H₄，R₃= R₄= H；

I：R₁=H，R₂=4-F-C₆H₄，R₃= R₄= H；

J：R₁=H，R₂=4-Br-C₆H₄，R₃= R₄= H；

K：R₁=H，R₂=4-CH₃O-C₆H₄，R₃= R₄= H；

L：R₁=H，R₂=2-CH₃O-4-Cl-C₆H₃，R₃= R₄= H；

M：R₂=H，R₁=2-Br-C₆H₄，R₃= R₄= H；

N：R₂=H，R₁=3-Cl-C₆H₄，R₃= R₄= H；

O：R₂=H，R₁=2-F-4-Cl-C₆H₃，R₃= R₄= H；

P：R₂=H，R₁=2,4-二氯苯基，R₃= R₄= H；

Q：R₂=H，R₁=4-F-C₆H₄，R₃= R₄= H；

R：R₂=H，R₁=C₆H₅，R₃= R₄= H；

S：R₁=H，R₂=3-F-4-Cl-C₆H₃，R₃= R₄= H；

T：R₁=H，R₂= 2,4-二氟苯基，R₃= R₄= H；

U：R₁=H，R₂= 3,4-二氯苯基，R₃= R₄= H；

V：R₁=H，R₂=4-Cl-C₆H₄，R₃= R₄= COR₅，R₅=3-吡啶基；

W：R₁=H，R₂=4-Cl-C₆H₄，R₃= R₄= CH₂CH₂COOH；

X：R₁=H，R₂=4-Cl-C₆H₄，R₃= R₄= COR₅，R₅= CH₂CH₂COOH；

Y: R₂=H，R₁=4-Cl-C₆H₄，R₃= R₄= H；

Z: R₂=H，R₁=4-Cl-C₆H₄，R₃= R₄= COR₅，R₅=3-吡啶基。

4.如权利要求1-3其中之一所述的15-苄亚基-14-脱氧-11,12-脱氢穿心莲内酯衍生物在制备药物中的应用，按常规的制药方法和工艺要求，制成口服型制剂或注射型制剂。

5.如权利要求4所述的15-苄亚基-14-脱氧-11,12-脱氢穿心莲内酯衍生物在制备药物中的应用，其特征在于，口服型制剂为片剂、丸剂、胶囊、冲剂或糖浆；注射型制剂为注射液或冻干粉针剂型。

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