CN109734701B - Rock抑制剂-二氯乙酸复盐及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物化学和药物治疗学领域，具体涉及一种ROCK抑制剂‑二氯乙酸复盐或其药学上可接受的盐，它们的制备方法、含有这些化合物的药用组合物以及它们的医药用途，特别是在制备预防和/或治疗肺动脉高压、缺血性脑卒中、蛛网膜下腔出血等心脑血管疾病的药物中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种ROCK抑制剂-二氯乙酸复盐，具体涉及一种ROCK抑制剂-二氯乙酸复盐，它们的制备方法、含有这些化合物的药用组合物以及它们的医药用途，属于药学技术领域。
背景技术
Rho激酶(Rho associa ted kinase，ROCK)，是参与细胞有丝分裂粘附、细胞骨架调整、肌肉细胞收缩、肿瘤细胞浸润等一系列细胞生命现象的重要酶。自1996年以来，已发现的ROCK分为ROCK I(ROCKβ)和ROCK II(ROCKα)。前者主要存在于非神经组织如心脏、肺、骨胳肌等细胞；后者主要存在于中枢神经系统，如海马锥体神经元、大脑皮质、小脑浦肯野细胞等。Rho激酶(ROCK)在血管平滑肌细胞收缩、细胞迁移、增殖以及凋亡等多项细胞功能中具有重要的细胞内信号转导作用。在多种心血管疾病中都发现了Rho激酶异常活化，如动脉粥样硬化、再狭窄、高血压、肺动脉高压和心肌肥厚等。研究表明，慢性缺氧和野百合碱所致大鼠肺动脉高压模型以及严重肺动脉高压患者肺组织和肺动脉中Rho激酶活性均显著增高。
法舒地尔[六氢-1-(5-磺酰基异喹啉)-1(H)-1，4–二氮杂卓，Fasudil，又名HA1077]，是日本旭化成株式会社和名古屋大学药理学研究室合作开发的一种新型异喹啉磺胺衍生物。做为一种新型、高效的血管扩张药，法舒地尔可以有效缓解脑血管痉挛，改善蛛网膜下隙出血(SAH)患者的预后，自1996年法舒地尔在日本上市以来，其对于肺血管的作用一直受到研究者的广泛关注，大量的动物实验和临床研究均表明法舒地尔可以：1)激活内源性的神经干细胞促进脑组织修复；2)增加星状胶质细胞刺激因子；3)抑制细胞内钙离子的释放；4)舒张脑部血管；5)保护神经细胞和改善伸进功能；6)促进轴突的再生。因此法舒地尔也用于缺血性脑卒中的治疗。此外，法舒地尔也能够安全有效地治疗肺动脉高压。ROCK抑制药法舒地尔可以渗透入血管平滑肌细胞，在正常或病理情况下都能与ATP竞争Rho激酶催化区的ATP结合位点，特异地阻断Rho激酶活性。目前盐酸法舒地尔抗PAH处于II期临床研究阶段。
此外，ROCK抑制剂还有上市用于治疗青光眼的Ripasudil和Netarsudil。
发明内容
目的：本发明提供一种ROCK抑制剂-二氯乙酸复盐、其制备方法及医药用途。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一类化合物，为ROCK抑制剂-二氯乙酸复盐。
进一步的，所述ROCK抑制剂选自法舒地尔、Netarsudil、Ripasudil。
具体的，所述化合物为法舒地尔二氯乙酸盐，结构式如下：
法舒地尔二氯乙酸盐的制备方法为：
取适量法舒地尔置于反应容器中，加入适量反应溶剂混合，得法舒地尔与反应溶剂的混合液；
在反应温度0-100度下边搅拌边加入适量的二氯乙酸到上述混合液中，滴完后继续搅拌一段时间，得反应液；
然后将反应液减压浓缩出去溶剂，洗涤、重结晶，即得法舒地尔二氯乙酸盐。
优选的制备过程中，反应温度为室温，反应溶剂为水，加入的法舒地尔与二氯乙酸的摩尔比为1:1.5，重结晶溶剂为异丙醇。
具体的，所述化合物为Netarsudil二氯乙酸盐，结构式如下：
制备方法为：Netarsudil溶于四氢呋喃中，将二氯乙酸滴加进反应体系中，常温下搅拌一段时间，旋干，即得Netarsudil二氯乙酸盐。
具体的，所述化合物为Ripasudil二氯乙酸盐；结构式如下：
制备方法为：室温下，取适量Ripasudil置于反应容器中，加入水，边搅拌边将二氯乙酸缓缓滴加入Ripasudil混悬液中，滴完后继续室温搅拌一段时间，得反应液；然后将反应液减压浓缩，洗涤、过滤、干燥，即得Ripasudil二氯乙酸盐。
另一方面，本发明还提供一种药物组合物，其中含有治疗有效量的上述的化合物或其旋光异构体、对映体、非对映体、外消旋体或外消旋混合物，或其药学上可接受的盐及可药用的载体、佐剂或媒剂。
另一方面，本发明还提供上述的化合物在制备预防和/或治疗肺动脉高压、蛛网膜下腔出血、缺血性脑卒中等心脑血管疾病的药物中的应用。
本发明中，在给予哺乳动物上述化合物及其药学上可接受的盐，以及这些化合物的溶剂化物(这里统称为“治疗药物”)时，可以单独使用，或者最好是按照规范的制药方法将其与适于药用的载体或稀释剂配合后使用。给药方式可以经各种途径，包括口服、非胃肠道给药或局部给药。这里所指的非胃肠道给药包括但并不限于静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射和透皮给药。
本发明首先公开了法舒地尔二氯乙酸盐及其制备方法，包括以下步骤：游离的法舒地尔首先与水混合，缓缓滴加入二氯乙酸，继续搅拌5min后，浓缩出去纯净水，剩余物加入乙醚洗涤3次后，再用异丙醇或其他溶剂进行重结晶后得到高纯度的法舒地尔二氯乙酸盐。并通过经氢谱，碳谱，质谱对其结构进行了确证。本发明操作简单，生产成本低，产品收率高，环境污染小，利于工业化大生产。
同时，本发明公开了法舒地尔二氯乙酸盐、Netarsudil二氯乙酸盐和Ripasudil二氯乙酸盐对ROCK I和II的抑制活性。结果发现二氯乙酸盐和ROCK抑制剂成盐提高了其ROCK抑制活性。
本发明公开了法舒地尔二氯乙酸盐(FDCA)对肺动脉高压的治疗作用。首先，细胞实验中法舒地尔二氯乙酸盐(FDCA)可显著抑制血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)和低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)和肺动脉内皮细胞(PAECs)中炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)的表达；进一步进行动物实验，在野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压的治疗模型中，FDCA(43.3mg/kg)灌胃给药可明显降低肺动脉高压大鼠的平均肺动脉压，右心室收缩压和右心室肥厚指数，而对体循环压无明显影响；通过将大鼠肺部和心脏组织进行病理学检查发现，FDCA显著降低大鼠肺小动脉血管壁厚度与肺小动脉直径的比值(PAMT)和肺小动脉纤维化程度；FDCA显著降低右心室心肌细胞面积(CSA)和纤维化程度。值得注意的是FDCA抗肺动脉高压的活性优于等摩尔剂量的法舒地尔二盐酸盐(F)，二氯乙酸钠(DCA)及二者的联合给药，提示FDCA是一种有效的抗肺动脉高压的候选药物，值得进一步研究。
同时，本发明公开了法舒地尔二氯乙酸盐(FDCA)预防和/或治疗蛛网膜下腔出血的作用。在大鼠蛛网膜下腔出血模型中(蛛网膜下腔血管内穿孔造模，造模后0.5h和6h各给药一次，评价24h后大鼠的各项指标)，FDCA显著降低大鼠蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛损伤，改善脑水肿和动物神经学评分，明显改善了基底动脉管径、管腔面积及管壁厚度和顶部皮层局部脑血流量(rCBF)，优于F，DCA以及二者的联合给药。结果提示FDCA是一种有效的抗蛛网膜下腔出血的候选药物，值得进一步研究。
同时，本发明公开了法舒地尔二氯乙酸盐(FDCA)预防和/或治疗缺血性脑卒中的作用。在大鼠短暂缺血模型中(缺血2h复灌，缺血4h给药一次，24h给药，评价48h后的大鼠的各项指标)，FDCA有效地降低脑梗死面积，显著优于上市药物丁苯肽(NBP)组，显著优于法舒地尔二盐酸盐组(F)和二氯乙酸钠(DCA)组，以及F和DCA的联合给药组；此外FDCA还显著地改善了缺血诱导的神经行为功能障碍，明显优于F，DCA以及二者的联合给药，略优于NBP组。结果提示FDCA是一种有效的抗缺血性脑卒中的候选药物，值得进一步研究。
作为ROCK的抑制剂，法舒地尔可以舒张血管、降低血压，抑制血管平滑肌细胞的增殖，抑制血管重构；而二氯乙酸盐是丙酮酸脱氢酶激酶的抑制剂，可以提高丙酮酸脱氢酶的活性，促进葡萄糖的有氧代谢，减少乳酸的生成；同时还可以促进钾离子通道尤其是Kv1.5的表达，抑制平滑肌细胞的增殖和促进其凋亡。因此，法舒地尔和二氯乙酸盐的联合给药可以从多个机制治疗肺动脉高压，缺血性脑卒中以及蛛网膜下腔出血等心脑血管疾病。和联合给药相比，法舒地尔二氯乙酸盐(FDCA)作为一个整体的分子，可能在药物吸收、分布和代谢等方面和联合给药的有差别，因此表现出更好的活性。
附图说明
图1是实施例5中化合物对PASMCs和PAECs在PDGF-BB以及低氧培养条件下TNF-α和IL-6表达的影响；PASMs：肺动脉平滑肌细胞；PAECs：肺动脉内皮细胞；PDGF-BB：血小板衍生生长因子BB；IL-6；白细胞介素-6；CON：空白对照组；Hypoxia：低氧；FDCA：法舒地尔二氯乙酸盐；F：法舒地尔二盐酸盐；DCA：二氯乙酸钠盐；F+DCA：法舒地尔二盐酸盐和二氯乙酸钠盐联合给药组。
图2是实施例5中化合物对MCT诱导的PAH模型大鼠血流动力学的影响；mPAP：平均肺动脉压，RVSP：右心室收缩压；mSAP：平均体循环压；RV/LV+S：右心肥厚指数；Control：对照组，MCT：野百合碱；FDCA：法舒地尔二氯乙酸盐；F：法舒地尔二盐酸盐；DCA：二氯乙酸钠盐；F+DCA：法舒地尔二盐酸盐和二氯乙酸钠盐联合给药组。
图3是实施例5中各给药组对大鼠肺小动脉血管壁厚度与肺小动脉直径的比值(PAMT)和纤维化程度的影响；PAMT：大鼠肺小动脉血管壁厚度与肺小动脉直径的比值；Fibrosis：纤维化；Control：对照组，MCT：野百合碱；FDCA：法舒地尔二氯乙酸盐；F：法舒地尔二盐酸盐；DCA：二氯乙酸钠盐；F+DCA：法舒地尔二盐酸盐和二氯乙酸钠盐联合给药组。
图4是实施例5中各给药组对右心室心肌细胞面积及纤维化程度的影响；CAS：心肌细胞横断面面积；Fibrosis：纤维化；Control：对照组，MCT：野百合碱；FDCA：法舒地尔二氯乙酸盐；F：法舒地尔二盐酸盐；DCA：二氯乙酸钠盐；F+DCA：法舒地尔二盐酸盐和二氯乙酸钠盐联合给药组。
图5A是实施例6中不同化合物对SAH大鼠脑水肿的影响；图5B是实施例6中不同化合物对SAH大鼠自发性活动评分的影响。
图6是实施例7中tMCAO模型大鼠脑组织TTC染色图。
图7是实施例7中tMCAO模型大鼠脑梗死面积统计图。
图8是实施例7中tMCAO模型大鼠神经功能评分。
图9是实施例7中tMCAO模型大鼠脑梗死面积和大鼠神经功能评分图。
具体实施方式
为了进一步阐明本发明，下面给出一系列实施例，这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
实施例1
法舒地尔二氯乙酸盐
化合物合成及表征数据：
室温下，将10g法舒地尔置于100mL茄形瓶中，加入20mL自来水或纯净水进行搅拌，然后称取4.87g二氯乙酸，缓缓滴加入上述混悬液中，滴加过程中发现法舒地尔或逐渐溶解，滴毕。继续室温搅拌10min。后将反应液减压浓缩，剩余物加入乙醚进行洗涤3次，弃去乙醚，再用有机溶剂进行重结晶，过滤得到白色固体，后置于真空干燥箱中干燥得到13.95g目标化合物，收率为96.9％。Mp：141-143℃.1H NMR(300MHz，D2O，TMS)δ9.20(s，1H)，8.49(d，J＝6.2，1H)，8.21-8.29(m，3H)，7.72(t，J＝7.7，1H)，6.03(s，1H)，3.72(t，J＝5.0，2H)，3.53(t，J＝6.1，2H)，3.35-3.41(m，4H)，2.09-2.17(m，2H).13C NMR(75MHz，D2O)δ170.25，152.36，142.97，134.17，133.01，131.0，130.25，128.10，126.03，116.69，68.07，46.76，46.22，44.41，43.46，24.99.ESI-MS(70eV)m/z：292.2[M+H]+。
实施例2
Netarsudil二氯乙酸盐
化合物合成及表征数据：
4-(3-氨基-1-(异喹啉-6-基氨基)-1-氧代丙-2-基)苄基2，4-二甲基苯甲酸酯(100mg，0.22mmol)溶于四氢呋喃中，将二氯乙酸(28mg，0.22mmol)滴加进反应体系中，常温下搅拌10min，旋干，得到淡黄色固体，为netarsudil二氯乙酸盐。1H NMR(300MHz，DMSO)δ：11.07(s，1H)，9.22(s，1H)，8.43(s，2H)，8.18(s，1H)，8.11(d，J＝8.70Hz，2H)，7.82(t，J＝15.60Hz，3H)，7.51(s，4H)，7.14(s，2H)，6.52(s，1H)，5.28(s，2H)，4.32(m，1H)，3.56(m，2H)，2.51(s，3H)，2.31(s，3H).ESI-MS(70eV)m/z：454.2[M+H]+。
实施例3
Ripasudil二氯乙酸盐
化合物合成及表征数据：
室温下，将100mg Ripasudil置于50mL茄形瓶中，加入3mL自来水或纯净水进行搅拌，然后称取48mg二氯乙酸，缓缓滴加入上述混悬液中，滴加过程中发现反应液逐渐溶解，滴毕。继续室温搅拌10min。后将反应液减压浓缩，剩余物加入乙醚进行洗涤3次，弃去乙醚，过滤得到淡黄色固体，后置于真空干燥箱中干燥得到113.1mg目标化合物，收率为81％。1H-NMR(300MHz，D2O，δ)：1.11(3H，d，J＝6.6Hz)，1.96-2.24(2H，m)，3.13-3.39(2H，m)，3.44-3.72(4H，m)，3.76(1H，m)，5.99(1H，s)，7.69(1H，m)，8.16-8.30(2H，m)，8.31-8.42(1H，s)，8.93(1H，s)；ESI-MS(70eV)m/z：324.2[M+H]+。
实施例4
化合物对ROCK-I和II抑制活性：
表1.化合物对ROCK-I和ROCK-II的抑制活性(nM)
由表1所示，可看出：法舒地尔二氯乙酸盐对ROCK-I和ROCK-II的抑制活性比法舒地尔对ROCK-I和ROCK-II的抑制活性要强；
Netarsudil二氯乙酸盐对ROCK-I和ROCK-II的抑制活性比Netarsudil对ROCK-I和ROCK-II的抑制活性要强；
Ripasudil二氯乙酸盐对ROCK-I和ROCK-II的抑制活性比Ripasudil对ROCK-I和ROCK-II的抑制活性要强。
实施例5
预防和/或治疗肺动脉高压
一、FDCA在PDGF-BB以及低氧培养模型中对PASMCs和PAECs细胞中炎症因子TNF-α和IL-6表达的影响
肺动脉高压特别是结缔组织疾病相关的肺动脉高压往往伴随炎症的产生，炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)可激活炎症因子白细胞介素-6(IL-6)，促进平滑肌细胞的增殖、血管的纤维化以及肺小动脉的重构。首先通过细胞实验考察了法舒地尔二氯乙酸盐(FDCA)对低氧培养条件以及血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)诱导的肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)和肺动脉内皮细胞(PAECs)中TNF-α和IL-6表达的影响。细胞分组：①正常细胞组(Control)；②PDGF-BB或者低氧培养的模型组；③模型组+法舒地尔二氯乙酸盐(FDCA)；④模型组+法舒地尔盐酸盐(F)治疗组；⑤模型组+二氯乙酸钠盐(DCA)治疗组；⑥模型组+F与DCA联合给药组。实验方法如下。PGDFBB模型组：先细胞传代至3-6代，培养后24h后加PDGFBB(5微升配10毫升)养24h，再饥饿48h，加药，各给药组浓度为50μM，培养72h后通过ELISA统计各组细胞中TNF-α和IL-6的表达情况；缺氧模型组：先细胞传代至3-6代，再饥饿24小时后缺氧培养24小时，给药，各给药组浓度为50μM，培养72h后通过ELISA统计各组细胞中TNF-α和IL-6的表达情况)。如图1所示，低氧培养条件和PDGF-BB均可显著提高PASMCs和PAECs中的TNF-α和IL-6的表达，提示低氧培养条件和PDGF-BB均可显著提高炎症；而各给药组在两株细胞中均不同程度地抑制TNF-α和IL-6的表达，减轻炎症。其中FDCA组的抑制炎症效果最佳，优于F、DCA以及二者的联合给药组。提示F和DCA在抗炎方面有一定的协同作用，其可能的原因是FDCA作为一个整体分子相比于F以及DCA具有更好的跨过细胞膜的能力。
二、FDCA化合物对MCT诱导的PAH模型大鼠血流动力学的影响
进一步研究野百合碱(MCT)引起的大鼠PAH模型中，FDCA及相关化合物的治疗作用。动物分组：①正常对照组；②正常对照组+FDCA；③MCT模型组；④法舒地尔二盐酸盐(F)治疗组；⑤DCA治疗组；⑥F+DCA联合治疗组；⑦FDCA给药组。大鼠模型的建立：动物模型组及治疗组一次性腹腔注射野百合碱(MCT)60mg/kg，正常对照组注射等量生理盐水。实验处理：于注射野百合碱的第14天，各给药组以等摩尔剂量开始给药，给药方式为灌胃给药，每天一次，F组37.5mg/kg，DCA组15.5mg/kg，F+DCA联合治疗组包括F(37.5mg/kg)和DCA 15.5mg/kg，正常对照组+FDCA组43.3mg/kg；FDCA组43.3mg/kg。正常组和模型组予以等量的生理盐水喂养。各组在第28天进行平均肺动脉压力(mPAP)，右心室收缩压(RVSP)和平均体循环压(mSAP)的测量，随后处死大鼠取肺组织和心脏进行右心肥厚指数(RV/LV+S)，PCNA检测，免疫组织化学染色、苏木精-伊红染色，Masson染色等处理，评价各给药组在血流动力学、肺动脉平均厚度，肺纤维化程度，右心功能等方面的活性。结果如图2所示，和正常对照组相比，直接给予FDCA对正常大鼠的mPAP，RVSP和RV/LV+S的影响不大，说明FDCA的安全性较高。而MCT模型组可明显升高mPAP，RVSP和RV/LV+S。各给药组均可有效地降低mPAP，RVSP和RV/LV+S，其中FDCA组降低mPAP，RVSP和RV/LV+S的活性最强，优于F，DCA以及二者的联合给药。另外，各给药组对mSAP的影响较小。
三、FDCA化合物对MCT诱导的PAH模型大鼠肺动脉的影响
如图3所示，不同给药组对大鼠肺小动脉血管壁厚度与肺小动脉直径的比值(PAMT)和纤维化程度的影响，可以发现FDCA可有效降低PAMT和肺小动脉纤维化程度，略优于F，DCA及二者的联合给药。
四、FDCA化合物对MCT诱导的PAH模型大鼠右心室的影响
如图4所示，各给药组对右心室心肌细胞面积及纤维化程度的影响，结果提示与空白对照相比，MCT模型组显著增加大鼠右心室心肌细胞面积和纤维化程度。而给药组，尤其是FDCA可显著降低右心室心肌细胞面积和纤维化程度，优于F，DCA及两者联合给药组，结果提示FDCA可有效抑制右心室心肌细胞的增殖与重构。
实施例6
预防和/或治疗蛛网膜下腔出血
实验动物
SPF级SD大鼠，体重260-340g，雌雄对半，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于SPF级饲养环境中，室内温度控制在23±2℃，自由饮食和摄水。动物总数32只。假手术组：等体积生理盐水含1％的DMSO(n＝8)；
实验方法
试验分组情况及药物浓度选择：
SAH模型组：等体积生理盐水含1％的DMSO(n＝8)；法舒地尔二盐酸盐(F)组：(26.0mg/kg)(n＝8)；二氯乙酸钠(DCA)组：(10.7mg/kg)(n＝8)：法舒地尔二盐酸盐联合二氯乙酸钠(F+DDCA)组：(F：26.0mg/kg；DCA：10.7mg/kg)(n＝8)；FDCA组：(30mg/kg)(n＝8)；所有药物配成含1％DMSO的生理盐水溶液，给药方式为尾静脉注射给药。分别在SAH(大鼠蛛网膜下腔出血造模)后0.5h和6h后给药各一次，假手术组和模型组使用等体积生理盐水含1％DMSO代替。
模型及给药方法
参考文献(Stroke,1995,26,1086–1092)所述进行SAH的血管内穿孔模型。即将大鼠麻醉，插管并在手术期间用3％异氟烷在70％/30％医用空气/氧气中保持人工通气。通过直肠探针监测体温，并通过加热灯维持正常热。将锐化的4-0尼龙缝合线引入左颈内动脉(ICA)直至感觉到阻力(距颈总动脉分叉约18mm)。然后将缝合线进一步推入以刺穿前脑动脉和大脑中动脉的分叉，直到克服阻力并在穿孔后立即撤回。在假手术动物中，将缝线插入左ICA，但没有进行穿孔。缝合线移除后，关闭切口，将大鼠单独圈养在加热的笼子中直至恢复。
自发活动评分：将大鼠置于一宽敞、可以自由活动、四壁均可触及的笼中进行自发活动评分。SAH造模后24h由2位实验人员分别以双盲法对实验大鼠进行评价和记录，取2组均值为最后得分，自发活动观察后立即处死大鼠。自发活动评分根据动物精神状态及运动情况分为4级：1级，大鼠活动正常，无活动障碍，积极探索四周环境，至少触及三面笼壁的上缘；2级，轻度活动障碍，即大鼠精神差、嗜睡，行动有一定的延迟，没有到达所有的笼壁，但他至少触及一面笼壁的上缘；3级，中度活动障碍，即大鼠几乎不能站立，在笼中几乎不进行活动；4级，重度活动障碍，即老鼠没有动弹，并显示有肢体的瘫痪。结果见图5A。
脑含水量测定：分别于SAH造模后24h处死大鼠，迅速取出大脑和小脑，用滤纸吸去表面血液。用电子天平分别秤取大脑和小脑的质量(湿重)，然后，将脑组织置于烤箱中，105℃烘烤至恒重，再次称取大脑和小脑的质量(干重)。脑组织含水量的计算公式为：脑组织含水量(％)＝(湿重-干重)/湿重×100％。其中小脑的组织含水量作为正常对照。结果见图5B。
基底动脉管径、管腔面积及管壁厚度的测量：将上述各组基底动脉的组织切片进行HE染色，光学显微镜下观察照相后，采用image pro-plus6.0图像分析系统测量基底动脉的管径、管腔面积和管壁厚度。管腔面积的测量方法如下：沿基底动脉内表面测定其管腔周长(L)，在根据公式：直径(d)＝L/π计算管腔直径，半径(r)＝L/2π计算管腔半径，管腔面积(S)根据公式：S＝πr2求得。管壁厚度的测量方法如下：测量基底动脉内表面至中膜外缘之距，不包括外膜。每根血管选取4个不同的检测点测量管壁厚度，取其平均值作为该血管的测定值。结果见表1。
顶部皮层局部脑血流量(rCBF)测定：在邮顶部用直径5mm小型环钻开骨窗，中心位于Bergma点后1mm，后外方3mm。将LDF3型激光多普勒血流仪探头固定于定向仪微推进器上，分别于制备SAH前及SAH后1、4、12、24h及时观察rCBF。结果见表2。
统计方法：自发活动评分数据采用散点图表示，其余数据均以means±SD表示；自发活动评分据组间统计学差异采用Kruskal-Wallis检验和Mann-Whitney U检验，其余数据组间统计学差异采用one-way ANOVA和Tukey’s检验，P值小于0.05认为有显著性差异。
2.3实验结果
如图5A-图5B所示，与SAH模型对照组相比，给予不同的受试化合物F、F+DCA和FDCA均可明显改善动物神经学评分，明显降低SAH导致的大鼠脑含水量，其中FDCA表现出最强的活性，显著优于F和DCA，略优于F+DCA。此外，FDCA组明显改善基底动脉管径、管腔面积及管壁厚度(表1)和顶部皮层局部脑血流量(rCBF)(表2)，显著优于F、DCA以及F+DCA组。以上结果显示FDCA具有显著的抗蛛网膜下腔出血的活性，优于上市药物法舒地尔二盐酸盐，以及法舒地尔二盐酸盐和二氯乙酸钠的联合给药。
表1.各给药组大鼠基底动脉管腔直径、管腔面积和管腔厚度的测量
注：与model相比*P<0.05,**P<0.01，与F+DCA组相比#P<0.05,##P<0.01。
表2化合物对SAH大鼠局部脑血流变化的影响
注：与model相比*P<0.05,**P<0.01，与F+DCA组相比#P<0.05,##P<0.01
实施例7
预防和/或治疗缺血性脑卒中
为研究FDCA在体内是否具有神经保护作用，选用短暂性大鼠脑缺血模型(tMCAO)进行实验。
模型及给药方法：将大鼠腹腔注射10％水合氯醛(350mg/kg)麻醉后，仰卧位固定在实验台上，颈正中切口，手术刀切开皮肤，钝性分离各层组织，按照大鼠颈部血管解剖图，于体视显微镜下分离左侧颈总动脉(CCA)，置线备用向上分离左颈外动脉(ECA)和颈内动脉，双重结扎，剪断甲状腺上动脉及枕动脉两条颈外动脉分支，在近CCA分叉约5mm-8mm处双重结扎ECA，于ICA及CCA近心端分别用微动脉夹夹闭，在ECA近分叉处留置一打好单结但不收紧的丝线，在ECA近端结扎处与颈总动脉分叉处之间做一直径约0.2mm的V型微切口，将尼龙线头自切口处轻轻插入，轻轻收紧线结，将颈内动脉于两结扎线间剪断，使之与颈内动脉方向一致松开动脉夹，将尼龙线顺ECA经ICA送入颅内，插入深度约18mm～20mm微遇阻力时停止，使尼龙线头端位于MCA起始处，阻断MCA的血流收紧丝线，缝合切口，留置尼龙线尾端于体外。
缺血2h后，用10％水合氯醛再次麻醉大鼠，轻轻拉动尼龙线使其头端回到微切口处(略有阻力感)，使大脑中动脉恢复血供，进行再灌注。假手术组大鼠只进行麻醉和血管分离术，不结扎血管及导入线栓，术后动物保温。给药方式：缺血4h、24h后大鼠分别尾静脉注射给药。缺血48h后，神经功能评分，再处死大鼠。
分组：假手术组(Sham)；空白溶剂组(Vehicle)；法舒地尔二盐酸盐组(F，30mg/kg，尾静脉注射)；FDCA组(30mg/kg，尾静脉注射)；丁苯酞组(NBP，5mg/kg，尾静脉注射)
TTC染色：在全脑视交叉及其前后各2mm处，做冠状切四刀，切成五片后迅速将脑片置5ml含有2％TTC的磷酸缓冲溶液中，37℃避光温孵10min，在温孵过程中每隔7～8分钟翻动一次，温孵10min后取出脑片，用数码相机(Olympus C-4000，Japan)拍照，之后用眼科镊分离苍白区(梗塞区)和非苍白区(正常区)，通过Image pro-plus 6.0计算梗塞百分比如下：
梗塞百分比(％)＝苍白区重量/(苍白区重量+非苍白区重量)×100％
神经功能评级：在缺血48h后，根据Longa’s方法对动物的神经功能缺陷进行分级评分，标准如下：
0分：未观察到神经症状；
1分：提尾悬空时，动物的手术对侧前肢表现为腕肘屈曲，肩内旋，肘外展，紧贴胸壁；
2分：将动物置于光滑平面上，推手术侧肩向对侧移动时，阻力降低；
3分：动物自由行走时向手术对侧环转或转圈；
4分；软瘫，肢体无自发活动。
统计方法：神经功能缺陷分级评分数据采用中位数表示，其余数据均以means±SD表示；神经功能缺陷分级评分数据组间统计学差异采用Kruskal-Wallis检验和Mann-Whitney U检验，其余数据组间统计学差异采用one-way ANOVA和Tukey’s检验，P值小于0.05认为有显著性差异。
结果表明，在缺血4h后，给予大鼠FDCA(30mg/kg)有效地降低脑梗死面积(梗死面积百分比：7.48％)，明显低于空白溶剂组(31.4％)和上市药物NBP组(21.1％)，有显著优于法舒地尔二盐酸盐(30mg/kg)组(13.6％)(如图6、图7所示)；此外，FDCA还显著地改善了缺血诱导的神经行为功能障碍，明显优于法舒地尔盐酸盐，略优于NBP(图8)。
进一步考察在大鼠tMCAO模型中，FDCA和等摩尔剂量的法舒地尔二盐酸盐(F)、二氯乙酸钠盐(DCA)以及二者等摩尔联合给药的活性。造模方法和给药时间点同上。结果表明，在缺血4h后，给予大鼠FDCA(30mg/kg)有效地降低脑梗死面积(梗死面积百分比：6.78％)，显著优于F(26.0mg/kg，梗死面积百分比：22.8％)DCA(10.7mg/kg，梗死面积百分比：23.4％)和，以及二者的联合给药组(梗死面积百分比：15.2％)(图9)。此外，FDCA还显著地改善了缺血诱导的神经行为功能障碍，优于F、DCA及二者的联合给药(图9)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一类化合物，其特征在于，为ROCK抑制剂-二氯乙酸复盐；所述ROCK抑制剂选自Ripasudil；所述化合物选自：
Ripasudil二氯乙酸盐；结构式如下：
2.一种药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物或其对映体、非对映体、外消旋体，或其药学上可接受的盐及可药用的载体、佐剂或媒剂。
3.权利要求1所述的化合物在制备预防和/或治疗肺动脉高压疾病的药物中的应用。
4.权利要求1所述的化合物在制备预防和/或治疗蛛网膜下腔出血疾病的药物中的应用。
5.权利要求1所述的化合物在制备预防和/或治疗缺血性脑卒中疾病的药物中的应用。
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