CN109709326A - Ppm1a在哮喘治疗及诊断中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了PPM1A在哮喘治疗及诊断中的应用。PPM1A作为检测靶点在制备支气管哮喘诊断试剂中的应用。检测PPM1A的试剂在制备支气管哮喘诊断试剂中的应用。PPM1A作为治疗靶点在制备或筛选治疗支气管哮喘的药物中的应用抑制PPM1A表达的物质在制备治疗支气管哮喘的药物中的应用。本发明公开了检测支气管患者血浆患者的PPM1A的应用，首次发现PPM1A在哮喘以及正常人的表达差异，该指标可作为支气管哮喘的分子标志物。本发明也首次发现了PPM1A作为miR‑1165‑3p靶基因，通过STAT1、STAT5、Akt通路促进Th2分化，导致哮喘的发生。因此，可以作为哮喘的治疗靶点。

Description

PPM1A在哮喘治疗及诊断中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及PPM1A在哮喘治疗及诊断中的应用。

背景技术

支气管哮喘是一种以慢性气道炎症、气道重塑，气道高反应性为特征的异质性疾病。全世界约有3亿哮喘患者，我国哮喘患者人数超过300万。近年来，随着工业化的进展，我国哮喘的患病率仍在逐年上升，带来了沉重的家庭和社会负担。由于哮喘的异质性，哮喘具有多种表型和内型。全球哮喘防治创议(GINA)2018将哮喘分为以下几种表型：过敏性哮喘、非过敏性哮喘、迟发型哮喘、哮喘伴固定气流受限、哮喘伴肥胖。不同表型的哮喘人群对于药物尤其是吸入性糖皮质激素(ICS)的治疗反应也不尽相同。哮喘的反复发作还会引起各种并发症，比如肺气肿，肺心病，心衰等。

传统的哮喘诊断主要依靠临床表现，肺功能检查，峰流速检测，但上述技术不易检测到症状不明显的哮喘患者，随着生物技术的发展，生物标志物为哮喘的诊断提供了一种新的途径。

PPM1A(镁离子依赖的蛋白磷酸酶1Aα异构体)：PPM1A是丝素蛋白磷酸酶PP2C的家族成员，胞核与胞浆中均有分布，能够与多种蛋白结合使其去磷酸化。过往在肿瘤领域对PPM1A的研究比较多，被认为是一种抑癌因子，目前为止，还没有人发现PPM1A与哮喘的关系。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供PPM1A作为哮喘生物标志物的应用。

本发明的另一目的是提供一种PPM1A作为治疗靶点在制备或筛选治疗支气管哮喘的药物中的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

PPM1A作为检测靶点在制备支气管哮喘诊断试剂中的应用。

检测PPM1A的试剂在制备支气管哮喘诊断试剂中的应用。

其中，所述的检测PPM1A的试剂为检测PPM1A表达量的Elisa试剂盒。

PPM1A作为治疗靶点在制备或筛选治疗支气管哮喘的药物中的应用。

抑制PPM1A表达的物质在制备治疗支气管哮喘的药物中的应用。

所述的抑制PPM1A表达的物质优选miR-1165-3p((AGCAGGCGCAGGGGGUGGUGUGGU(SEQ ID NO.1)))或促进miR-1165-3p表达的物质。

有益效果：

本发明公开了检测支气管患者血浆患者的PPM1A的应用，首次发现PPM1A在哮喘以及正常人的表达差异，该指标可作为支气管哮喘的分子标志物。血浆是比较容易获得的，属于无创性检查，可辅助哮喘的早期诊断。因此，检测PPM1A表达量的试剂可以应用于制备支气管哮喘诊断试剂。

本发明通在Th2细胞过表达PPM1A后，其STAT1以及Akt磷酸化水平降低，STAT5磷酸化水平升高，但STAT2、STAT3、STAT6则无明显变化。流式检测结果显示，Th2细胞过表达PPM1A后，其GATA3+比例升高，T-bet+比例下降。表明PPM1A通过STAT1、STAT5、Akt通路促进Th2分化，导致哮喘的发生。通过在Th2细胞过表达miR-1165-3p，发现其PPM1A表达降低，PPM1A在Th2以及哮喘小鼠的CD4+ T细胞高表达PPM1A，进一步表明通过miR-1165-3p抑制PPM1A表达可以抑制哮喘中的Th2分化，从而改善哮喘症状。因此，PPM1A可以作为治疗靶点，在制备或筛选治疗哮喘的药物中应用。而能够抑制PPM1A表达的物质也可以在制备治疗支气管哮喘的药物中应用。

附图说明

图1哮喘患者和正常人的血浆PPM1A水平:A是小样本数据；B是大样本数据

图2Th2细胞过表达miR-1165-3p后，其分化受到抑制，并促进Th1分化

(A)miR-1165-3p过表达慢病毒转染效果

(B)qPCR检测Th1类细胞因子(IFN-γ、IL-12)和Th2类细胞因子(IL-4、IL-5、IL-13)变化

(C)Elisa检测细胞因子的变化

(D)qPCR检测Th1主转录因子(T-bet)和Th2主转录因子(GATA3)的变化

(E)Western blot检测转录因子的变化及其统计学分析

(F)核转录因子检测Th2分化受到抑制，并促进Th1分化

图3Th1细胞沉默miR-1165-3p后，其分化受到抑制，并促进Th2分化

(A)miR-1165-3p沉默慢病毒转染效果

(B)qPCR检测Th1(IFN-γ、IL-12)和Th2类细胞因子(IL-4、IL-5、IL-13)变化

(C)Elisa检测细胞因子的变化

(D)qPCR检测Th1转录因子(T-bet)和Th2主转录因子(GATA3)的变化

(E)Western blot检测转录因子的变化及其统计学分析

(F)核转录因子检测Th1分化受到抑制，并促进Th2分化

图4哮喘小鼠过表达miR-1165-3p,可以改善哮喘症状

(A)哮喘模型，在第0天致敏，第7-11天激发，并在第7天尾静脉注射miR-1165-3p过表达慢病毒或者空白对照病毒

(B)miR-1165-3p过表达慢病毒体内效果

(C)各组肺功能情况

(D)各组血清IgE水平

(E)小鼠肺泡灌洗液的炎症细胞分类计数

(F)反映炎症的HE染色及半定量分析

(G)反映杯状细胞化生以及粘液分泌的PAS染色及半定量分析

图5哮喘小鼠过表达miR-1165-3p,Th2分化受到抑制

(A)Elisa检测BALF中的细胞因子

(B)核转录因子标记脾和淋巴结细胞中CD4+ T淋巴细胞的Th1和Th2细胞比例

图6IL-13和PPM1A是miR-1165-3p的靶基因

(A)biotin-miRNA pull down实验差异mRNA的热图

(B)biotin-miRNA pull down实验差异mRNA的火山图

(C)差异mRNA与生信分析靶基因的交集

(D)IL-13的双荧光素酶实验

(E)PPM1A在正常和哮喘小鼠的CD4+ T细胞的表达差异

(F)PPM1A在体外诱导分化的Th1和Th2细胞的表达差异

(G)PPM1A的双荧光素酶实验

(H)qPCR检测Th2细胞转染miR-1165-3p过表达慢病毒后，PPM1A表达变化

(I)Western blot检测Th2细胞转染miR-1165-3p过表达慢病毒后，PPM1A表达变化

图7PPM1A通过STAT以及Akt通路调控Th2分化

(A)Th2细胞电转PPM1A过表达质粒，其下游通路的变化

(B)补救实验，核转录因子标记检测PPM1A可以补救miR-1165-3p对Th2分化的抑制

具体实施方式

实施例1哮喘患者外周血中PPM1A的蛋白水平检测

主要试剂

人PPM1A Elisa检测试剂盒(武汉Bio-swamp)

主要仪器

酶标仪，离心机

主要方法

外周血样本的采集和冻存

20例哮喘患者的外周血标本来自于江苏省人民医院，20例健康人的标本来自于南京医科大学在校大学生。采集正常人以及哮喘患者的外周血与抗凝管中，1000rpm/min离心5分钟，收集上层血浆，冻存于-80℃

运用酶联免疫吸附实验检测人血浆中PPM1A的表达

本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人Mg2+/Mn2+依赖性蛋白磷酸酶1A(PPM1A)水平。用纯化的人Mg2+/Mn2+依赖性蛋白磷酸酶1A(PPM1A)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入血浆样品(PPM1A)，再与HRP标记的Mg2+/Mn2+依赖性蛋白磷酸酶1A(PPM1A)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的Mg2+/Mn2+依赖性蛋白磷酸酶1A(PPM1A)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准

曲线计算样品中人Mg2+/Mn2+依赖性蛋白磷酸酶1A(PPM1A)浓度。

(1)标准品的稀释：准备小试管6只，依次编好号码，先在各小试管中加入标准品稀释液100ul，然后取原浓度标准品100ul加入一只已编好号的试管中，充分混匀；再在该试管中取100ul加入第二支试管中，充分混匀；再在该试管中取100ul加入第三只试管中，充分混匀；再在该试管中取100ul加入第四只试管中，充分混匀；再在该试管中取100ul加入第五只试管中，充分混匀；然后在该试管中取100ul，弃掉。第六只试管作为0号标准品。稀释后各管浓度分别是：20ng/ml,10ng/ml,5ng/ml,2.5ng/ml,1.25ng/ml,0ng/ml。在酶标包被板上设标准品孔，依次加入不同浓度的标准品50ul(建议每个浓度做2个平行孔)。

(2)加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品、酶标试剂及生物素标记的抗PPM1A抗体，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品40μl，然后再加生物素标记的抗PPM1A抗体10μl。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

(3)加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

(4)温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

(5)配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。

(6)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

(7)显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。

(8)终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。

(9)测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

结果

哮喘患者的血浆PPM1A水平高于正常人，有统计学意义。(图1A)

实施例2加大样本量重新检测PPM1A表达

主要试剂

人PPM1A Elisa检测试剂盒(武汉Bio-swamp)

主要仪器

酶标仪，离心机

主要方法

外周血样本的采集和冻存

50例哮喘患者的外周血标本来自于江苏省人民医院，50例健康人的标本来自于南京医科大学在校大学生。采集正常人以及哮喘患者的外周血与抗凝管中，1000rpm/min离心5分钟，收集上层血浆，冻存于-80℃

运用酶联免疫吸附实验检测人血浆中PPM1A的表达

同实施例1

结果

哮喘患者的血浆PPM1A水平高于正常人，有统计学意义(图1B)。

实施例3miR-1165-3p对Th2细胞分化的调控(细胞水平)

主要试剂：

细胞因子(peprotech)、功能抗体(ebioscience)、血清(Gibco)、引物(金斯瑞)，sybr green(takara)、miRNA逆转录试剂(takara),1640培养基(Gibco),Elisa试剂盒(Biolegend)Western抗体(Abcam,CST),流式抗体及试剂(ebioscience)，Trizol以及小RNA提取试剂(Thermo)，磁珠分选试剂盒

主要仪器

细胞培养箱、磁架、流式检测机器、电泳转膜仪、曝光仪、PCR仪以及qPCR仪，酶标仪

主要方法

Th1/Th2细胞体外诱导分化

1.包被：每孔加入100ul 5ug/ml的anti-CD3e，4℃过夜。

2.小鼠Naive CD4+ T细胞分离。(第0天)

①取6～8周雌性C57/B6小鼠颈椎脱臼处死，75％乙醇浸泡3分钟，取出小鼠置于无菌皿上，取小鼠脾脏、两侧腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结及两侧腹主动脉旁淋巴结，放入40μm上置于盛有1640无血清培养液的培养皿中用研杵轻轻研压，1640无血清培养液冲洗获细胞悬液，约为10ml，用淋巴细胞分离液分理处淋巴细胞

②等待期间，配好相应Th1、Th2等培养基及换液的培养基(换液培养基不需要加anti-CD3e和anti-CD28)

③磁珠分选naive CD4⁺T细胞，用配好的培养基重悬细胞，细胞密度为1-2*10^⁵/孔

3.Th1细胞则在第一天加入1ul lentil-III-mir-Off-Control virus(scramble)(为沉默病毒的对照病毒)(1.47*10^9IU/ml)/LentimiRa-off-miRNA-1165-3p Virus(inhibitor)(为miR-1165-3p沉默病毒)(6.25*10^9IU/ml),Th2细胞则在第一天加入1ulLentimiRa-GFp-miR-1165-3p virus(enhancer)(为miR-1165-3p过表达病毒)(4.4*10^9IU/ml)/Lenti-III-mir-GFP control virus(blank)(为miR-1165-3p过表达载体对照病毒)(5.9*10^9IU/ml)

4.在培养的第三天对细胞进行半换液

5.第5天收获细胞，收集上清，做qPCR、western blotting、Elisa、以及流式核转录因子标记。

RNA提取以及实时定量pCR

用trizol或者small RNA提取总RNA以及miRNA.取等量RNA反转录后得到cDNA，用相应体积的RNase free水稀释后，SYBR Green方法进行荧光定量PCR检测，每个样品3个复孔。不同转录因子以及细胞因子的表达量采用β-actin作为内参标准的ΔΔCT值做统计,miR-1165-3p的表达量采用U6作为内参标准的ΔΔCT值做统计。

酶联免疫吸附实验

将细胞上清收集，根据试剂盒说明书，进行包被、封闭、加样、检测等，根据吸光度计算上清中IL-4、IL-5、IL-13以及IFN-γ浓度。

蛋白免疫印迹实验

用RIPA裂解液提取蛋白，煮沸变性，进行电泳、转膜、封闭、敷一抗、洗膜、敷二抗、洗膜、曝光，以β-actin作为内参蛋白，比较转录因子的表达变化

核转录因子标记

收获细胞，死活染料标记死活，标记CD4细胞，破膜破核后标记主转录因子，检测Th1/Th2分化的变化

结果

Th2细胞miR-1165-3p过表达后，Th1类细胞因子IFN-γ、IL-12表达增加，Th2类细胞因子IL-4、IL-5、IL-13的表达降低，而Th1主转录因子T-bet表达增加，Th2主转录因子GATA3表达降低(图2)，Th1细胞mir-1165-3p沉默后，其变化趋势则相反(图3)，表明miR-1165-3p抑制Th2细胞的分化。

实施例4miR-1165-3p改善哮喘(整体水平)

主要试剂

屋尘螨(HDM)(Greer)，miR-1165-3p过表达慢病毒(爱必梦)，乙酰甲胆碱、ELISA试剂盒(Biolegend))、流式抗体(Thermo)、PAS染料、HE染料，计数微球(Thermo)等

主要仪器

肺功能仪、酶标仪，PCR仪以及qPCR仪、酶标仪，流式检测仪

主要方法

小鼠HDM急性哮喘模型

32只SPF级C57/B6雌性小鼠随机分为4组，每组8只。对照组(control)、HDM组(HDM)、HDM+blank组(HDM+Lenti-III-mir-GFP control virus)、HDM+enhancer组(HDM+LentimiRa-GFp-miR-1165-3p virus)。HDM处理组：第0天开始气管给予100ug/40ul的HDM溶液气管给药以致敏，第7、8、9、10、11连续5天给予10ug/40ul的HDM溶液气管给药以激发。其中HDM+enahncer组和HDM+blank组在第7天尾静脉注射100ul配好的慢病毒稀释液。各组小鼠在第14天作后续检测。

小鼠肺功能检测

打开FinePointe RC小鼠肺功能仪，连接仪器，检查气密性并校零，设置仪器至检测肺阻力和动态肺顺应性模块。用新配制好的1％戊巴比妥腹腔麻醉小鼠(每只鼠150ul)，将麻醉后的小鼠固定于手术操作台上，用剪刀剪开小鼠颈部皮肤，再用手术镊钝性分离后暴露气管。先用一细针头将气管戳一小口，顺小口置入小鼠气管插管管芯，缝线固定插管，将气管插管的小鼠连接于肺功能仪，再次检测装置密闭性。启动软件，PBS清洗雾化。待基线数值稳定后，分别记录小鼠雾化吸入0、3.125、6.25、12.5、乙酰甲胆碱后，小鼠肺阻力数值，记录3min，后取平均值为该浓度的肺阻力值。

眼球取血

4组小鼠在肺功能检查后心脏采血，静置30min以上，1000rpm，4℃，离心15min，收集血清分装后置于-80℃保存。

收取肺泡灌洗液(BALF)

4组小鼠心脏采血后，在环状软骨上用血管钳固定气管，其下作横行切口，置入连接注射器的硅胶管，用细线将气管和硅胶管扎紧，分三次缓慢注入PBS，每次注入量为O.4mL，每次灌洗后立即回收置于离心管中，计量，于4℃储存，2h内作细胞分离。BALF于1000g离心5min，上清液分装-80℃冻存留作细胞因子水平的ELISA测定。细胞沉淀作流式分类计数。

细胞分类计数

细胞沉淀用FVD染死活后，加入流式染料和计数微球，CD45+Ly6G+中性粒细胞、CD45+F4/80+siglecF+单核巨噬细胞，CD45+CD3+淋巴细胞、CD45+Anti-SiglecF+F4/80-嗜酸性粒细胞。进行细胞绝对计数。

酶联免疫吸附实验

将BALF收集，根据试剂盒说明书，进行包被、封闭、加样、检测等，根据吸光度计算上清中IL-4、IL-5、IL-13以及IFN-γ浓度，同时检测血清免疫球蛋白E(IgE)的浓度。

RNA提取以及实时定量pCR

用small RNA提取总小鼠肺组织miRNA.取等量RNA反转录后得到cDNA，用相应体积的RNasefree水稀释后，SYBR Green方法进行荧光定量PCR检测，每个样品3个复孔。miR-1165-3p的表达量采用U6作为内参标准的ΔΔCT值做统计。

小鼠肺组织病理染色

行支气管肺泡灌洗后，打开胸腔，右心房冲PBS，至肺变白。取右肺下叶组织，4％中性福尔马林固定过夜。取出肺叶，浸入无水乙醇脱水5分钟，二甲苯中透明化，石蜡包埋。分别进行HE以及PAS染色。

CD4+ T淋巴细胞转录因子标记

取小鼠脾脏、两侧腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结及两侧腹主动脉旁淋巴结，放入40μm上置于盛有1640无血清培养液的培养皿中用研杵轻轻研压，1640无血清培养液冲洗获细胞悬液，约为10ml。

500g 4℃离心5min,弃液，加入5ml 1X红细胞裂解液，室温孵育5min.再加入20-30mlPBS,500g离心5min。之后标死活，标CD4，破核标转录因子。

结果(图4-5)

哮喘小鼠尾静脉注射miR-1165-3p过表达慢病毒后，其肺功能、血清IgE，BALF炎症细胞计数、炎症细胞浸润、杯状细胞粘液分泌均受到抑制，而Th2类细胞因子以及Th2细胞比例下降，Th1类细胞因子以及Th1细胞比例升高。表明miR-1165-3p可以抑制哮喘中的Th2分化，从而改善哮喘症状。

实施例5 PPM1A和IL-13是miR-1165-3p的靶基因

主要试剂

脂质体(翊圣)、蛋白裂解液(millipore)、磁珠(Thermo)，RNA提取试剂盒(QIAGEN)等

主要仪器

细胞培养箱、磁架，360°旋转仪，高速离心机

主要方法

生物素标记的miRNA-pull down实验

小鼠胚胎成纤维细胞(NIH-3T3)作为工具细胞，将其接种于10cm细胞培养皿中，待其密度达到90％时，脂质体转染生物素标记的miR-1165-3p以及相应的对照(NC)，转染48小时后，收获细胞，紫外交联，裂解细胞，将裂解上清与磁珠孵育，用RNA提取试剂盒提取与之结合的RNA，送给广州锐博公司进行测序。

测序结果生信分析

将Biotin-miR-1165-3p以及NC对照组筛选的差异mRNA(P<0.05,Fold change>2)做成热图以及火山图(5A-5B)，并将差异结果与miRanda、PITA及RNAhybrid三个软件进行miRNA的靶基因预测的结果取交集(5C)，猜测PPM1A以及IL-13可能为其靶标。

双荧光素酶实验

运用Bibiserv2(https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/sessionTimeout.jsf)预测靶基因Ppm1a以及IL-13与miR-1165-3p的结合位点，委托镇江爱必梦公司合成PPM1A,IL-13 3’UTR WT以及相应结合位点缺失突变的3’UTR MUT质粒，委托上海吉马公司合成miR-1165-3p mimics以及NC mimics，将质粒以及mimic共转人胚胎肾上皮(HEK297T)细胞，共转48h后，用Promega双荧光素酶实验报告试剂盒检测荧光变化，进行统计学分析。

RNA提取以及实时定量pCR

用trizol总取正常或者哮喘小鼠的RNA、Th1/Th2的RNA、以及TH2细胞过表达miR-1165-3p的RNA取等量RNA反转录后得到cDNA，用相应体积的RNasefree水稀释后，SYBRGreen方法进行荧光定量PCR检测，每个样品3个复孔。PPM1A表达量采用β-actin作为内参标准的ΔΔCT值做统计

结果(图6)

通过生物学预测以及生物素标记的miRNA-pull down实验筛选靶基因，并通过双荧光素素酶实验，确认IL-13以及PPM1A是miR-1165-3p的靶基因，并发现Th2细胞过表达miR-1165-3p后，其PPM1A表达降低，PPM1A在Th2以及哮喘小鼠的CD4+ T细胞高表达PPM1A，进一步miR-1165-3p通过PPM1A调控Th2分化。

实施例6PPM1A通过Akt以及STAT通路调控Th2分化

主要试剂

电转液(Thermo)、PPM1A过表达质粒(Origene)，流式抗体(ebioscience)、固定破膜液(ebioscience)分选磁珠试剂盒等

主要仪器

电转仪(Thermo)，磁架，流式检测仪

主要方法

T细胞电转

预热Th2培养基以及D-PBS，将配好的无抗生物的培养基加入100ul,96孔里,放在培养箱预热。将分选出来的naive CD4+ T细胞用D-PBS清洗，100-400g室温离心5min，Resuspension Buffer T重悬细胞，细胞密度2*10^7/ml，此步在15min内解决在Tube加入2.5mL Electrolytic Buffer E，没过电极，设定好电转条件，进行电转，第3天重复上述步骤，第五天收获细胞，进行后续试验。

蛋白免疫印迹实验

用RIPA裂解液提取蛋白，煮沸变性，进行电泳、转膜、封闭、敷一抗、洗膜、敷二抗、洗膜、曝光，以β-actin作为内参蛋白，比较通路蛋白的表达变化

核转录因子标记

收获细胞，死活染料标记死活，标记CD4细胞，破膜破核后标记主转录因子，检测Th1/Th2分化的变化

结果(图7)

Th2细胞过表达PPM1A后，其STAT1以及Akt磷酸化水平降低，STAT5磷酸化水平升高，但STAT2、STAT3、STAT6则无明显变化。流式检测结果显示，Th2细胞过表达PPM1A后，其GATA3+比例升高，T-bet+比例下降。表明PPM1A通过STAT1、STAT5、Akt通路促进Th2分化。

以上实施例中涉及的序列信息

β-actin—F	GAGAAGCTGTGCTATGTTGCT
		β-actin—R	CTCCAGGGAGGAAGAGGATG
GATA3-F	GAACCGCCCCTTATCAAG
		GATA3-R	CAGGATGTCCCTGCTCTCCTT
T-bet-F	AATCGACAACAACCCCTTTG
		T-bet-R	AACTGTGTTCCCGAGGTGTC
IL-4F	AACTCCATGCTTGAAGAAGAACTC
		IL-4R	CCAGGAAGTCTTTCAGTGATGTG
IL-5F	GCAATGAGACGATGAGGCTTC
		IL-5F	GCAATGAGACGATGAGGCTTC
IL-13F	TGAGCAACATCACACAAGACC
		IL-13R	GGCCTTGCGGTTACAGAGG
IFN-γ-F	ACAATGAACGCTACACACTGC
		IFN-γ-R	CTTCCACATCTATGCCACTTGAG
IL-12F	GATGACATGGTGAAGACGGC
		IL-12R	AGGCACAGGGTCATCATCAA
PPM1A-F	CGCACGTTAGCCAGTGAGAA
		PPM1A-R	CGCAGAATCAGTGTCGTCATT
U6-F	CTCGCTTCGGCAGCACA
		U6-R	AACGCTTCACCAATTGCGT
miR-1165-3p-5'	AGCAGCGCAGGGGGTGGTGTGGT

序列表

<110> 江苏省人民医院

<120> PPM1A在哮喘治疗及诊断中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 24

<212> RNA

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 2

agcaggcgca ggggguggug uggu 24

Claims (6)

1.PPM1A作为检测靶点在制备支气管哮喘诊断试剂中的应用。

2.检测PPM1A的试剂在制备支气管哮喘诊断试剂中的应用。

3.根据权利要求3所述的应用，其特征在于检测PPM1A的试剂为检测PPM1A表达量的Elisa试剂盒。

4.PPM1A作为靶点在制备或筛选治疗支气管哮喘的药物中的应用。

5.抑制PPM1A表达的物质在制备治疗支气管哮喘的药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的抑制PPM1A表达的物质为miR-1165-3p或促进miR-1165-3p表达的物质。