CN109679836A - 应用于对虾病原高通量检测的玻片微量检测系统 - Google Patents
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Abstract
本发明属微生物检测领域，尤其涉及一种应用于对虾病原高通量检测的玻片微量检测系统。该系统包括设有检测扩增池的微量检测玻片、微量移液器以及用于可视化核酸扩增检测的成像设备；其中，所述检测池设有预包被的反应试剂和特定病原的特异性引物。本发明在已建立的对虾病原核酸恒温扩增新技术的基础上，开发了一款玻片微量检测系统，具有检测试剂低耗化、设备微型化、操作便捷化等优势；是一种快速便携、低耗低廉、灵敏特异以及高通量检测分析手段。
Description
技术领域
本发明属微生物检测领域，尤其涉及一种应用于对虾病原高通量检测的玻片微量检测系统。
背景技术
截止2018年，被世界动物卫生组织(World Organization for Animal Health，OIE)《水生动物卫生法典》收录的甲壳类疫病共有11种，未收录的其他对虾疾病10余种，新发对虾疫病2种。2018年，本课题组在我国广东、广西、海南等主要养殖对虾的9个省市开展了对虾的流行病学调查，其中，主要疫病阳性检出率依次为偷死野田村病毒(Covertmortality nodavirus,CMNV)(29.15％)、对虾肠孢子虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)(17.07％)、致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(Acute hepatopancreas necrosisdisease-causing Vibrio parahaemolyticus,VpAHPND)(13.21％)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus，IHHNV)(8.70％)、对虾白斑综合症病毒(White spot syndrome virus,WSSV)(6.82％)、桃拉综合征病毒(Taura syndrome virus,TSV)(6.82％)、虾血细胞虹彩病毒(Shrimp hemocyteiridescent virus,SHIV)(5.66％)、黄头病毒(Yellow head virus,YHV)(0.0％)和传染性肌坏死病毒(Infectious myonecrosis virus,IMNV)(0.0％)，威胁对虾养殖的病原多，且呈混合感染。当前，对虾病原监测主要是采用收集样品后在实验室基于核酸分析的检测，聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)、实时定量荧光PCR(Real-time PCR)及基因芯片等技术以其灵敏度高、检测快速、多目标分析而被广泛应用。然而此类分析需要特殊的仪器设备，如PCR仪以及配套的电泳仪和凝胶成像仪、实时荧光PCR仪、基因芯片扫描仪等，耗时费力，成本昂贵，不适合简便快速分析。因此，开发高通量、高灵敏、低成本的适用于现场即时分析的新型病原检测技术势在必行。
基于核酸恒温扩增技术(Nucleic acid isothermal amplificationtechnology,NAIAT)的核酸检测方法能够实现快速、简单、高效的扩增，且对仪器依赖性低，非常适用于现场快速检测(Point-of-care test,POCT)中，是一种极具应用潜力的核酸分析手段。本课题组近年来致力于对虾病原快速检测技术的研究，将NAIAT应用于对虾病原检测中，目前已成功研制出对虾WSSV、IHHNV、TSV、YHV、SHIV等一系列现场快速灵敏检测技术和检测试剂盒，但在实际应用中，存在一定的局限性：(1)基于肉眼判读的可视化结果的精确性存在局限性；(2)一次样本仅单重检测，很难实现多重目标的同时检测且检测成本过高；(3)操作流程的便捷性还有待进一步提高。
低体积PCR技术已被用于单细胞分离和检验，基于NAIAT的低体积扩增主要集中于研究微流控芯片技术。近年来，基于微流控芯片的核酸研究技术发展势头强劲，如，微流控芯片数字PCR技术和基于NAIAT的微流控芯片系统；然而基于微流控芯片技术的扩增检测，一般需要高精密的仪器设备，芯片的研发成本和生产成本均很昂贵，限制了其在临床快速检测中的应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是基于微流控芯片技术的扩增检测，一般需要高精密的仪器设备，芯片的研发成本和生产成本均很昂贵，限制了其在临床快速检测中的应用。
基于上述不足，本发明在已建立的对虾病原核酸恒温扩增新技术的基础上，开发了一款玻片微量检测系统，具有检测试剂低耗化、设备微型化、操作便捷化等优势；是一种快速便携、低耗低廉、灵敏特异以及高通量检测分析手段。
为实现上述目的，本发明具体采用以下技术方案：
应用于对虾病原高通量检测的玻片微量检测系统，包括设有检测扩增池的微量检测玻片、微量移液器以及用于可视化核酸扩增检测的成像设备；微量检测玻片经丝网印刷疏水、疏油涂层，预留出检测扩增池，检测扩增池经超亲水改性，且设有预包被的反应试剂和特定病原的特异性引物，检测扩增池在检测时设置封堵件；微量移液器由2～8根专用移液针组成，移液针为圆柱体，直径为1mm，移液针侧表面涂布超疏水超疏油涂层(ZXL-WNS超疏水超疏油，子西莱科技)，底面经超亲水处理；成像设备内设有电池、LED恒流驱动IC和蓝色LED，三者之间通过线路连接，成像设备内还设有玻片槽，玻片槽的侧面开口，由此放入玻片，玻片槽上方设有金黄色的滤光片，玻片槽两侧等间距、对称的各设置有4个蓝色LED，蓝色的光从玻片的两侧均匀照射，金黄色滤光片有效过滤蓝色和紫色的杂散光，从而促进检测池内激发光的识别。
进一步的，所述微量检测玻片共设置有48组相同的检测池，所述各检测池呈4×12布置，每12个检测池1行，分别对应设置4列；更进一步地，所述微量检测玻片为长方形，尺寸为25×75mm；所述玻片的材质为玻璃。
进一步的，所述封堵件为二甲基硅油。
进一步的，专用移液针的数量为4根，针间距为4.10mm(即与检测扩增池的纵向间隔相同)，操作时沿ABCD的方向纵向点样。
一种微量检测玻片的制备方法，其包括以下步骤：
(1)制版：菲林——曝光——硬化——显影：①根据微量检测玻片的结构示意图制作菲林；②用300目的丝网制作网版，等干燥后备用；③将做成的空白网版进行脱脂清洗处理，备用；④在洁净的网版上涂布感光胶，必要的时候多次涂布；⑤在鼓风干燥箱中烘干上胶的网版，多次涂布多次烘干；⑥将菲林感光面向上放置在晒版台玻璃上，放上涂布好的网版，真空抽气使菲林与丝网版紧密贴牢，打开晒版灯进行感光制版；⑦把感光结束的网版在水里冲洗显影，观察制版效果，达到质量要求就放入烘箱中烘干；
(2)丝网印刷疏水、疏油涂层：①调配专用油墨，该产品要求疏水疏油，在基础油墨中添加不同比例的聚四氟乙烯专用树脂、氟碳添加剂、二氧化硅等成分；②把做好的网版装入丝印台，作准定位；③将调配好的油墨倒入丝网，进行丝网印刷，印完的玻片插入专用合金架子；
(3)玻片固化：将玻片连架子一起放入鼓风干燥箱，200℃烘烤90min，使油墨充分固化；
(4)玻片清洁处理：把固化后的成品载玻片放入清洗剂浸泡80min，然后在清洗机进行后道清洗，对清洗干净的玻片检验；
(5)检测池超亲水处理：将超亲水ZXL-CQS纳米自洁液(莱阳子西莱环保科技有限公司)均匀涂抹或喷洒于各检测池内，固化干燥后即可；
(6)检测池预包被检测试剂：微量检测玻片设置48孔相同的检测池，每8孔为一组检测单元，共6组；其中，4组为样品检测单元，剩余2组分别为阴、阳性对照检测单元；每组检测单元共有8个检测池，各自检测不同的病原体核酸；
(7)将检测池预包埋好检测试剂的微量检测玻片置于LY0-0.5型东富龙冷冻干燥机(上海东富龙科技有限公司)中进行冻干处理：①预冻1小时(前箱两个探头为-40℃以下，后箱-45℃以下)；②对前后箱进行抽真空，当前箱真空度显示达到所需真空度0.08～0.10mbar即可；调整界面手动加热温度-5℃，当制品温度逐渐接近导油温度，真空度曲线有明显弯曲后，一次升华结束；③一次升华结束，对产品进行加热提温；前箱温度升至-10℃时，开始提温；调整界面手动加热温度-5℃，当制品温度升至-5℃时，保温计时1.5小时。
(8)玻片真空包装得到合格品：成品真空包装，置于-20度以下保存。
进一步的，所述微量检测玻片质地为常规载玻片，尺寸为25×75mm；所述检测池直径为2.25mm，检测池之间的间距为3.00mm。
进一步的，所述步骤(2)中，在基础油墨中添加有聚四氟乙烯专用树脂、氟碳添加剂、二氧化硅中的一种或一种以上的混合物，以满足疏水疏油的特性；其中聚四氟乙烯专用树脂、氟碳添加剂、二氧化硅占比依次为2％～4％(g/mL)、1％～2％(g/mL)、0.3％～0.5％(g/mL)。
进一步的，所述各检测池分别预包埋检测试剂：Bst 2.0DNA聚合酶、RTx反转录酶、10×Bst buffer、10mM dNTPs、5M Betaine、100mM MgSO4、350mMMnCl2、3.5mM Caclein、ddH2O以及对虾8种病原的特异性引物，所述对虾8种病原包括对虾WSSV、IHHNV、SHIV、AHPND、EHP、YHV-8、TSV、CMNV。
上述8种病原的特异性引物序列具体如下表所示：
进一步的，所述检测池预包埋检测试剂的冻干保护剂分别为明胶、海藻糖、牛血清白蛋白(BSA)、硫脲，占比依次为2％～3％(g/mL)、10％～15％(g/mL)、1％～2％(g/mL)、1％～2％(g/mL)。
进一步地，所述用于检测WSSV、IHHNV、SHIV、AHPND和EHP这5种DNA病原的各检测池预包埋检测试剂包括：Bst 2.0DNA聚合酶0.042μL、10×Bst buffer 0.15μL、25mM dNTPs 0.084μL、5M Betaine 0.33μL、100mM MgSO4 0.09μL、350mM MnCl2 0.0018μL、3.5mM Caclein 0.0102μL、ddH2O 0.267μL、明胶(g/mL)0.045μL、海藻糖(g/mL)0.225μL、BSA(g/mL)0.03μL、硫脲(g/mL)0.015μL以及相对应的对虾5种DNA病原的特异性引物；所述特异性引物包括：40μM FIP 0.06μL、40μM BIP 0.06μL、40μM LF 0.03μL、40μM LB 0.03μL(无LB的用等量ddH2O替代)、20μM F3 0.015μL、20μM B3 0.015μL。
进一步地，所述用于检测YHV-8、TSV和CMNV这3种RNA病原的各检测池预包埋检测试剂包括：Bst 2.0DNA聚合酶0.042μL、RTx反转录酶0.042μL、10×Bst buffer 0.15μL、25mM dNTPs 0.084μL、5M Betaine 0.33μL、100mM MgSO4 0.09μL、350mM MnCl2 0.0018μL、3.5mM Caclein 0.0102μL、ddH2O 0.225μL、明胶(g/mL)0.045μL、海藻糖(g/mL)0.225μL、BSA(g/mL)0.03μL、硫脲(g/mL)0.015μL以及相对应的对虾3种RNA病原的特异性引物；所述特异性引物包括：40μM FIP 0.06μL、40μM BIP 0.06μL、40μM LF 0.03μL、40μM LB 0.03μL、20μM F3 0.015μL、20μM B3 0.015μL。
进一步地，所述微量移液器移取体积为1.525μL。
与现有技术相比，本发明具有以下优势：
本发明设计和制作了一款玻片微量检测系统，其包括设有48孔检测池并在其中预包被了除样品核酸外的所有检测试剂的微量检测玻片、微量移液器以及用于可视化扩增检测结果的成像设备。在微量检测玻片制作过程中主要结合疏水疏油和超亲水材料，实现了检测的独立空间，并以油包水的形式杜绝气溶胶污染；微量移液器同样结合超疏水、超疏油和超亲水材料并精准的计算出加入至反应体系的量，实现了操作的简便性和计量的精准性；成像设备设计小巧、便携，可实现检测结果的可视化判读。该玻片微量检测系统能够对4组样品、对虾8种重要病原进行同步即时检测，是一种真正意义上的低成本、便携式、高通量的核酸(RNA和DNA)检测技术。
附图说明
图1是微量检测玻片的结构示意图；检测池A1、A3、A5、A7、A9、A11均包被能够检测WSSV所需试剂；检测池B1、B3、B5、B7、B9、B11均包被能够检测IHHNV所需试剂；检测池C1、C3、C5、C7、C9、C11均包被能够检测SHIV所需试剂；检测池D1、D3、D5、D7、D9、D11均包被能够检测AHPND所需试剂；检测池A2、A4、A6、A8、A10、A12均包被能够检测EHP所需试剂；检测池B2、B4、B6、B8、B10、B12均包被能够检测YHV-8所需试剂；检测池C2、C4、C6、C8、C10、C12均包被能够检测TSV所需试剂；检测池D2、D4、D6、D8、D10、D12均包被能够检测CMNV所需试剂；
图2是微量移液器的结构示意图；
图3是微量移液器的操作示意图；
图4是成像设备的结构示意图；
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
应用于对虾病原高通量检测的玻片微量检测系统，包括设有检测扩增池11的微量检测玻片1、微量移液器2以及用于可视化核酸扩增检测的成像设备3；微量检测玻片1涂布疏水、疏油涂层，预留出检测扩增池11，检测扩增池11经超亲水改性，且设有预包被的反应试剂和特定病原的特异性引物，检测扩增池11在检测时设置封堵件；微量移液器2由2～8根专用移液针组成，移液针为圆柱体，直径为1mm，其侧表面涂布超疏水涂层，底面经超亲水处理；成像设备3内设有电池31、LED恒流驱动IC32和蓝色LED33，三者之间通过线路连接，位于左侧，成像设备3右侧还设有玻片槽，其右侧开口，由此放入玻片，玻片槽上设有金黄色滤光片34，玻片槽两侧对称、等间距的各设有4个蓝色LED33。
所述微量检测玻片共设置有48组相同的检测池，所述各检测池呈4×12布置，每12个检测池1行，分别对应设置4列；更进一步地，所述微量检测玻片为长方形，尺寸为25×75mm；所述玻片的材质为玻璃。
所述封堵件为二甲基硅油。
专用移液针的数量为4根。
一种微量检测玻片的制备方法，其包括以下步骤：
(1)制版：菲林——曝光——硬化——显影：①根据微量检测玻片的结构示意图制作菲林；②用300目的丝网制作网版，等干燥后备用；③将做成的空白网版进行脱脂清洗处理，备用；④在洁净的网版上涂布感光胶，必要的时候多次涂布；⑤在鼓风干燥箱中烘干上胶的网版，多次涂布多次烘干；⑥将菲林感光面向上放置在晒版台玻璃上，放上涂布好的网版，真空抽气使菲林与丝网版紧密贴牢，打开晒版灯进行感光制版；⑦把感光结束的网版在水里冲洗显影，观察制版效果，达到质量要求就放入烘箱中烘干；
(2)丝网印刷疏水、疏油涂层：①调配专用油墨，该产品要求疏水疏油，在基础油墨中添加不同比例的聚四氟乙烯专用树脂、氟碳添加剂、二氧化硅等成分；②把做好的网版装入丝印台，作准定位；③将调配好的油墨倒入丝网，进行丝网印刷，印完的玻片插入专用合金架子；
(3)玻片固化：将玻片连架子一起放入鼓风干燥箱，200℃烘烤90min，使油墨充分固化；
(4)玻片清洁处理：把固化后的成品载玻片放入清洗剂浸泡80min，然后在清洗机进行后道清洗，对清洗干净的玻片检验；
(5)检测池超亲水处理：将超亲水ZXL-CQS纳米自洁液(莱阳子西莱环保科技有限公司)均匀涂抹或喷洒于各检测池内，固化干燥后即可；
(6)检测池预包被检测试剂：微量检测玻片设置48孔相同的检测池，每8孔为一组检测单元，共6组；其中，4组为样品检测单元，剩余2组分别为阴、阳性对照检测单元；每组检测单元共有8个检测池，各自检测不同的病原体核酸；具体为检测池中分别包埋了用于检测WSSV、IHHNV、SHIV、AHPND和EHP等5种DNA病原的试剂(1.5μL体系)包括：Bst 2.0DNA聚合酶0.042μL、10×Bst buffer 0.15μL、25mM dNTPs 0.084μL、5M Betaine 0.33μL、100mM MgSO4 0.09μL、350mM MnCl2 0.0018μL、3.5mM Caclein 0.0102μL、ddH2O 0.267μL、明胶(g/mL)0.045μL、海藻糖(g/mL)0.225μL、BSA(g/mL)0.03μL、硫脲(g/mL)0.015μL，以及相对应的对虾5种DNA病原的特异性引物包括：40μM FIP0.06μL、40μM BIP 0.06μL、40μM LF0.03μL、40μM LB 0.03μL(无LB的用等量ddH2O替代)、20μM F3 0.015μL、20μM B3 0.015μL；分别包埋了用于检测YHV-8、TSV和CMNV等3种RNA病原的试剂(1.5μL体系)包括：Bst 2.0DNA聚合酶0.042μL、RTx反转录酶0.042μL、10×Bst buffer 0.15μL、25mM dNTPs 0.084μL、5M Betaine 0.33μL、100mM MgSO4 0.09μL、350mM MnCl2 0.0018μL、3.5mM Caclein 0.0102μL、ddH2O 0.225μL、明胶(g/mL)0.045μL、海藻糖(g/mL)0.225μL、BSA(g/mL)0.03μL、硫脲(g/mL)0.015μL以及相对应的对虾3种RNA病原的特异性引物包括：40μM FIP 0.06μL、40μM BIP 0.06μL、40μM LF 0.03μL、40μM LB 0.03μL、20μM F3 0.015μL、20μM B3 0.015μL；此外，上述微量检测玻片48孔相同的检测池可自由包被1、2、4、6、8、12种病原进行同步即时检测，上述病原体亦可替换为其他任一合适的可采用恒温扩增检测的病原体；
(7)将检测池预包埋好检测试剂的微量检测玻片置于LY0-0.5型东富龙冷冻干燥机(上海东富龙科技有限公司)中进行冻干处理，包括以下步骤：
步骤一预冻：①点击启动手动(变绿色)，打开压缩机COM1 5s后，打开循环泵CP130s后，打开掺冷阀SV1，对板层降温；②当进箱温度降至-16℃时，关闭掺冷阀SV1，打开后箱制冷阀SV21，点击界面手动，点击加热控制，将其开启(加热控制显示为绿色)；保温计时30min；③开始调温继续向下拉制品温度；点击界面手动，点击加热温度设定-45℃；点击加热控制，将其开关反复2次(加热控制显示绿色)保温计时1小时(前箱两个探头为-40℃以下，后箱-45℃以下)；
步骤二一次升华：①依次打开真空泵VP1，FV32，1min后打开中隔阀FV1，对前后箱进行抽真空；②当前箱真空度显示达到所需真空度0.08～0.10mbar即可；调整界面手动加热温度-5℃；点击加热控制将其开关反复2次(加热控制显示绿色)；升华时，注意观察制品形态，并注意制品温度以及升华界面是否清晰，控制制品温度不超过共熔点，以免制品温度过高导致制品融化；③当制品温度逐渐接近导油温度，真空度曲线有明显弯曲后，一次升华结束；
步骤三解析阶段：①一次升华结束，根据制品冻干工艺要求，对产品进行加热提温；前箱温度升至-10℃时，开始提温；调整界面手动加热温度-5℃；点击加热控制将其开关反复2次(加热控制显示绿色)；②当制品温度升至-5℃时，要保温；调整界面手动加热温度-5℃；点击加热控制将其开关反复2次(加热控制显示绿色)；保温计时1.5小时；冻干结束。
(8)玻片真空包装得到合格品：成品真空包装，置于-20度以下保存。
所述微量检测玻片质地为常规载玻片，尺寸为25×75mm；所述检测池直径为2.25mm，检测池之间的间距为3.00mm。
所述检测池预包埋检测试剂的冻干保护剂分别为明胶、海藻糖、牛血清白蛋白(BSA)、硫脲，占比依次为2％～3％(g/mL)、10％～15％(g/mL)、1％～2％(g/mL)、1％～2％(g/mL)；
所述微量移液器移取体积为1.525μL，其测算方法如下：
步骤一标准曲线的建立：以卡尔科弗卢尔荧光增白剂与10％的KOH等体积配置为标准液，精确取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8μL标准液，应用酶标仪读取355nm处的荧光值，以荧光值为X轴，浓度为Y轴，得到标准曲线为：y＝44.702x-0.0081；R2＝0.9978。
步骤二微量移液器移取体积的测算：微量移液器每次移取的荧光值0.0368减去残留荧光值0.0025等于0.0343，将荧光值代入标曲公示得出移取体积为1.525μL。
由上述实施例可知，本发明提供了一款微体系玻片检测系统，利用该系统的检测方法具有简便、低成本、无需特殊仪器、高通量等特点，可应用于采用恒温扩增检测的各类病原体核酸的现场即时检测。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110> 中国水产科学研究院黄海水产研究所
<120> 应用于对虾病原高通量检测的玻片微量检测系统
<130> 64
<160> 46
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtcccgtcct catctcagaa 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctttaccggc aggctctg 18
<210> 3
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caagggcatc tcctgcatcc aatttttctg cgtgcagcac ctaa 44
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aattccgaga agcccaattg gt 22
Claims (10)
1.应用于对虾病原高通量检测的玻片微量检测系统，其特征在于：包括设有检测扩增池的微量检测玻片、微量移液器以及用于可视化核酸扩增检测的成像设备；微量检测玻片经丝网印刷疏水、疏油涂层，预留出检测扩增池，检测扩增池经超亲水改性，并且设有预包被的反应试剂和特定病原的特异性引物，检测扩增池在检测时设置封堵件；微量移液器由2～8根专用移液针组成，移液针为圆柱体，直径为1mm，移液针侧表面涂布超疏水疏油涂层，底面经超亲水处理；成像设备内设有电池、LED恒流驱动IC和蓝色LED，三者之间通过线路连接，成像设备内还设有玻片槽，玻片槽上方设有金黄色的滤光片，玻片槽两侧等间距、对称的各设置有4个蓝色LED。
2.如权利要求1所述的应用于对虾病原高通量检测的玻片微量检测系统，其特征在于：所述微量检测玻片共设置有48组相同的检测池，所述各检测池呈4×12布置，每12个检测池1行，分别对应设置4列。
3.如权利要求1所述的应用于对虾病原高通量检测的玻片微量检测系统，其特征在于：所述封堵件为二甲基硅油。
4.一种权利要求1中的微量检测玻片的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)制版：菲林——曝光——硬化——显影；
(2)丝网印刷疏水、疏油涂层；
(3)玻片固化；
(4)玻片清洁处理；
(5)检测池超亲水处理；
(6)检测池预包被检测试剂；
(7)玻片检测池预包埋检测试剂冻干处理；
(8)玻片真空包装得到合格品。
5.如权利要求4所述的微量检测玻片的制备方法，其特征在于：微量检测玻片质地为常规载玻片，尺寸为25×75mm；检测池直径为2.25mm，检测池之间的间距为3.00mm。
6.如权利要求4所述的微量检测玻片的制备方法，其特征在于：步骤(1)为①根据微量检测玻片的结构示意图制作菲林；②用300目的丝网制作网版，等干燥后备用；③将做成的空白网版进行脱脂清洗处理，备用；④在洁净的网版上涂布感光胶，必要的时候多次涂布；⑤在鼓风干燥箱中烘干上胶的网版，多次涂布多次烘干；⑥将菲林感光面向上放置在晒版台玻璃上，放上涂布好的网版，真空抽气使菲林与丝网版紧密贴牢，打开晒版灯进行感光制版；⑦把感光结束的网版在水里冲洗显影，观察制版效果，达到质量要求就放入烘箱中烘干。
7.如权利要求4所述的微量检测玻片的制备方法，其特征在于：步骤(2)为①调配专用油墨，要求疏水疏油，为在基础油墨中添加聚四氟乙烯专用树脂、氟碳添加剂、二氧化硅中的一种或一种以上的混合物；②把做好的网版装入丝印台，作准定位；③将调配好的油墨倒入丝网，进行丝网印刷，印完的玻片插入专用合金架子。
8.如权利要求4所述的微量检测玻片的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)为将玻片连架子一起放入鼓风干燥箱，200℃烘烤90min，使油墨充分固化；步骤(4)为把固化后的成品载玻片放入清洗剂浸泡80min，然后在清洗机进行后道清洗，对清洗干净的玻片检验；步骤(5)为将超亲水ZXL-CQS纳米自洁液(莱阳子西莱环保科技有限公司)均匀涂抹或喷洒于各检测池内，固化干燥后即可。
9.如权利要求4所述的微量检测玻片的制备方法，其特征在于：所述步骤(6)各检测池分别预包埋检测试剂：Bst 2.0DNA聚合酶、RTx反转录酶、10×Bstbuffer、10mM dNTPs、5M Betaine、100mM MgSO4、350mM MnCl2、3.5mM Caclein、ddH2O以及对虾8种病原的特异性引物，所述对虾8种病原包括对虾WSSV、IHHNV、SHIV、AHPND、EHP、YHV-8、TSV、CMNV。
10.如权利要求4所述的微量检测玻片的制备方法，其特征在于：所述步骤(7)检测池预包埋检测试剂的冻干保护剂分别为明胶、海藻糖、牛血清白蛋白BSA、硫脲，占比依次为质量体积比2％～3％、10％～15％、1％～2％、1％～2％。
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