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CN109666067A - 一种重组病毒样颗粒及其制备方法和用途 - Google Patents

一种重组病毒样颗粒及其制备方法和用途 Download PDF

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CN109666067A
CN109666067A CN201910013184.8A CN201910013184A CN109666067A CN 109666067 A CN109666067 A CN 109666067A CN 201910013184 A CN201910013184 A CN 201910013184A CN 109666067 A CN109666067 A CN 109666067A
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hepatitis
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virus core
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刘永东
苏志国
张耀
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Institute of Process Engineering of CAS
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Abstract

本发明提供了一种重组病毒样颗粒及其制备方法和用途，所述方法包括如下步骤：将表达重组病毒衣壳蛋白的细胞进行发酵后收集发酵产物，采用2‑6M的脲溶液溶解解聚，胞外二次组装得到重组病毒衣壳蛋白的完整病毒样颗粒。本发明的重组乙肝病毒核心抗原颗粒的制备方法，将硫酸铵沉淀的重组衣壳蛋白在相对温和条件下溶解并解聚、纯化、最后胞外二次组装形成具有天然结构的病毒样颗粒。该方法简单、高效，所制备的重组乙肝病毒核心抗原颗粒具有结构完整、均一且不含宿主核酸和杂蛋白的优点，具有重要意义和广阔的应用前景。

Description

一种重组病毒样颗粒及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种重组病毒样颗粒及其制备方法和用途，主要涉及一种可溶形式表达的重组病毒样颗粒及其制备方法和用途，具体涉及一种重组乙肝病毒核心抗原颗粒及其制备方法和用途。
背景技术
乙肝病毒核心抗原(HBc)是单链衣壳蛋白，可独自组成无核酸的正二十面体结构，具有与天然病毒类似的形态，大小约28nm。其主要免疫显性区域(MIR)位于颗粒的表面形成刺突，能够有效的递呈抗原，激发强烈的体液免疫和细胞免疫。此外在其MIR区插入或替换为一段其它抗原，并不会影响其形成病毒样球形颗粒结构。这些优点使得HBc成为病毒样颗粒(VLP)中最具有用途前景的疫苗载体。另一方面不含核酸的HBc-VLP纳米尺寸的空心结构能够高效装载小分子药物或者显影剂，在药物递送和临床诊断方面具有广阔的用途前景。
目前，HBc-VLP已经在重组真核细胞和原核细胞中成功获得表达，前者如非洲爪蟾蛙卵母细胞、植物本氏烟以及毕赤酵母等，后者如大肠杆菌。由于病毒样颗粒结构的复杂性，传统制备多采用真核表达系统进行培养表达，利用高等细胞自身的蛋白加工能力，在胞内完成颗粒组装，然后以组装体的形式与宿主的其它杂质分离。但这种制备策略存在以下问题：一是胞内组装的颗粒存在结构不均一、颗粒不完整的现象，无论是由非洲爪蟾蛙细胞、植物还是酵母细胞表达，其产物除完整颗粒外，还存在大量的二聚体、组装中间体甚至是错误组装的结构，导致直接纯化后的疫苗质量低，活性低，且易于聚集稳定性低。二是纯化过程容易破坏颗粒组装体结构，由于颗粒组装体蛋白间的作用力较弱，与介质吸附洗脱的相互作用会对组装体的结构造成破坏，使部分颗粒解聚，导致纯化收率及活性大幅降低。三是部分杂质不易除去，直接纯化的疫苗产品存在安全隐患，无论对哺乳动物细胞还是昆虫细胞，在胞内进行组装时很容易将宿主DNA或RNA以及宿主蛋白包裹于内部，胞内组装的蛋白颗粒还可能和宿主蛋白结合在一起。为了去除此类杂质，均需要打开宿主蛋白与颗粒的结合以及打开原有颗粒结构，这必然会对完整组装体的结构带来改变和破坏，以至于颗粒完全解聚。
与一级氨基酸序列决定蛋白空间构象相同，病毒衣壳蛋白的独特理化性质决定了衣壳蛋白具有在胞外自组装成病毒样颗粒的能力。采用先纯化亚基单元后组装颗粒能避免层析过程对组装体结构的破坏，能彻底去除宿主核酸等杂质，通过胞外二次组装还能显著改善颗粒形貌，提高均一性等，因此采用胞外自组装方法有望解决传统疫苗制备出现的上述问题。已有文献报道，大肠杆菌表达的重组HBc蔗糖梯度密度离心结果显示超离样品中HBc沉降系数呈现非常宽的分布，存在大量的二聚体等未组装结构，表明产物结构的严重不均一。因此HBc-VLP的制备采取胞外自组装技术是非常必要的，以期达到高效、纯净、颗粒完整、结构均一的目的。
“Wizemann,H.and Brunn,A.V.,Purification of E.coli-expressed HIS-tagged hepatitis B core antigen by Ni2+-chelate affinity chromatography,Journal of Virological Methods,1999,189-197”公开了一种体外组装病毒样颗粒的方法，截短的HBc-VLP能够在2M脲，pH 9.5条件下解聚，Ni FF纯化后组装得到VLP，遗憾的是，这种方法无论是纯化还是组装均收率较低，最后的产品质量也不高。
CN 101848730 A公开了将上述方法用于融合HBc-VLP的制备，主要是在变性剂尿素或盐酸胍存在条件下纯化，然后再重组装形成VLP，但现有方法不能得到与天然结构相似的类病毒样HBc颗粒。
病毒样颗粒的结构对其应用有着重要的影响，因此，提供一种操作简单、收率高、纯化效果好，病毒样颗粒结构均一完整的重组病毒样颗粒制备方法具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种重组病毒样颗粒及其制备方法和用途，本发明的重组病毒样颗粒不含宿主核酸，纯度高且结构完整均一，与天然病毒形态完全相同，制备方法简单，收率高，纯化效果好，具有重要意义和广泛应用前景。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种重组病毒样颗粒的制备方法，所述方法包括如下步骤：
将表达重组病毒衣壳蛋白的细胞进行发酵后收集发酵产物，采用2-6M的脲溶液溶解解聚，胞外二次组装得到重组病毒衣壳蛋白的完整病毒样颗粒。
本发明中，通过基因重组技术表达乙肝病毒核心抗原，发酵产物中包含完整病毒样颗粒的同时也包含大量不完整的病毒样颗粒，直接纯化发酵产物收率低，得到的病毒样颗粒活性差，包含核酸存在安全隐患，严重影响后续应用，本发明采用2-6M的脲溶液，溶解解聚发酵产物中完整及不完整的病毒样颗粒，在所述脲浓度范围内既可以重悬解聚所有病毒样颗粒，同时不会引起抗原蛋白的二三级空间构象破坏，为胞外二次组装做准备。脲浓度过低不能有效解聚病毒样颗粒，而脲浓度过高，容易改变蛋白的二级、三级结构，产生疏水聚集，不能再进行胞外组装，或者组装成的颗粒结构不同于天然病毒颗粒，丧失其应用意义。
优选地，所述重组病毒衣壳蛋白包括重组乙肝病毒核心抗原。
本发明的方法适用于所有以可溶形式表达的重组病毒样颗粒，尤其适用于重组乙肝病毒核心抗原颗粒。
优选地，所述重组乙肝病毒核心抗原包括重组乙肝病毒核心抗原的截短体和/或含有其他抗原的重组乙肝病毒核心抗原全长。
优选地，所述截短体与其他抗原融合表达。
优选地，所述重组乙肝病毒核心抗原全长与其他抗原融合表达。
本发明的方法尤其适用于胞外二次组装重组乙肝病毒核心抗原颗粒，其中，可以直接将乙肝病毒核心抗原截短后进行表达，也可以将乙肝病毒核心抗原的全长或其截短体与其他抗原表位进行基因融合后表达。
优选地，所述重组使用的重组蛋白表达系统包括真核表达系统和/或原核表达系统。
优选地，所述真核表达系统包括非洲爪蟾蛙卵母细胞、植物本氏烟或毕赤酵母中的任一种或至少两种的组合。
优选地，所述原核表达系统包括大肠杆菌。
优选地，所述脲溶液的浓度为3.5-4.5M，优选为4M。
本发明中，脲溶液的终浓度在3.5-4.5M范围内，可有效解聚发酵产物中的病毒样颗粒，有利于提高后续蛋白的纯化收率和纯度，而且不影响胞外二次组装的效率。
优选地，所述脲溶液的pH值为7.0-9.0，例如可以是7.0、7.2、7.5、7.8、8.0、8.2、8.5、8.8或9.0。
本发明中，脲溶液的pH为中性或弱碱性，pH值过低不能有效解聚发酵产物，pH值过高容易引起蛋白变性，只有在所述pH值范围内，配合本发明的制备工艺，才能得到结构完整均一的病毒样颗粒。
优选地，所述收集发酵产物具体包括如下步骤：
(1)破碎细胞，离心收集上清；
(2)上清中加入硫酸铵溶液，搅拌，离心收取沉淀，得到所述发酵产物。
优选地，步骤(1)所述破碎细胞的方式包括超声破碎和/或高压匀浆。
优选地，步骤(2)所述的硫酸铵溶液终浓度为0.05-4M，例如可以是0.05M、0.1M、0.2M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M、1M、1.5M、2M、2.5M、3M、3.5M或4M，优选为0.1-1M。
优选地，步骤(2)所述硫酸铵溶液pH值为7.0-8.0，例如可以是7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0。
优选地，步骤(2)所述搅拌的温度为1-6℃，例如可以是1℃、2℃、3℃、4℃、5℃或6℃，优选为4℃。
优选地，所述胞外二次组装包括如下步骤：
(1’)纯化解聚后的组装单元；
(2’)透析降低脲浓度，调节组装缓冲溶液的pH值、离子强度、蛋白质浓度、温度和时间，通过胞外组装得到重组病毒衣壳蛋白的完整病毒样颗粒。
优选地，步骤(1’)所述纯化方法包括亲和层析、离子交换或凝胶过滤，优选为亲和层析。
优选地，所述亲和层析包括镍离子金属螯合亲和层析(Ni Sepharose FFcOmplete)和/或肝素亲和层析(Heparin Sepharose 6 Fast Flow)。
优选地，步骤(2’)所述降低脲浓度采用梯度透析的方式。
本发明中，经过解聚后的溶液中包含解组装单元以及4M的脲，组装前需要去除变性剂-脲，可以直接透至组装缓冲液中，一步去除脲的同时开始组装；也可以梯度透析，先将溶液透析至Tris透析缓冲液中，降低原溶液中的脲浓度，Tris透析缓冲液中的低浓度脲可以更好地维持组装单元的稳定性，当溶液中脲浓度透析至2M时，再将其透析至组装缓冲液中进行组装，有利于高效组装出完整重组病毒样颗粒，组装效率高达95％。
优选地，所述梯度透析具体包括如下步骤：将步骤(1’)得到的解聚后的样品透析至Tris透析缓冲液中，再透析至组装缓冲液中。
优选地，所述Tris透析缓冲液包括Tris-HCl和脲。
优选地，所述Tris透析缓冲液中的脲的终浓度不大于2M，例如可以是0.5M、1M、1.5M或2M。
优选地，所述Tris透析缓冲液的pH值为8.0-9.0，例如可以是8.0、8.2、8.5、8.8或9.0。
优选地，步骤(2’)所述组装缓冲液包括Tris-HCl。
优选地，所述组装缓冲液还包括NaCl。
优选地，所述NaCl的终浓度为0.2-1.5M，例如可以是0.2M、0.5M、0.8M、1M、1.2M或1.5M，优选为0.5M。
本发明中，所述范围内的NaCl可有效抑制二次组装形成的病毒样颗粒间的聚集，替代表面活性剂的作用，同时加速组装单元的胞外组装效率和速率，NaCl浓度过低则组装速率变慢且容易产生颗粒间的聚集，浓度过高则会导致蛋白的沉淀，影响收率。
优选地，步骤(2’)所述组装缓冲液的pH值为7.0-8.0，例如可以是7.0、7.2、7.4、7.5、7.8或8.0，优选为7.4。
本发明中，通过组合配比组装缓冲液中的组成成分、离子强度、pH值、组装单元的蛋白质浓度、温度和时间，得到最适于重组病毒样颗粒胞外二次组装的条件，本发明所述的条件范围内可以有效提高组装单元的组装效率，得到完整的重组病毒样颗粒。
优选地，步骤(2’)所述蛋白质浓度为0.8-500μM，例如可以是0.8μM、1μM、2μM、3μM、5μM、8μM、10μMμM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、100μM、120μM、150μM、180μM、200μM、250μM、300μM、350μM、400μM、450μM或500μM，优选为0.8-100μM。
本发明中，经解聚后的组装单元的蛋白质浓度大于0.8μM才能满足组装要求，实现胞外组装，得到完整病毒样颗粒。
优选地，步骤(2’)所述温度为1-6℃，例如可以是1℃、2℃、3℃、4℃、5℃或6℃，优选为4℃。
优选地，步骤(2’)所述时间不少于24h，例如可以是24h、26h、28h、32h、40h、45h、48h、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天或30天，优选为24h-3天。
本发明中，通过组合调控各种条件，加入适合浓度的NaCl显著促进组装单元的胞外组装，在24h后即可收获大量完整的重组病毒核心抗原颗粒，且通过本发明的方法制备的体外组装病毒样颗粒可以稳定存在于缓冲液中至少30天。
优选地，所述胞外组装的条件为包含NaCl的Tris-HCl缓冲液，缓冲液pH7.4，NaCl终浓度0.5M，蛋白质终浓度大于0.8μM，透析温度4℃，透析时间大于24h。
本发明中，通过调整适当的胞外组装条件，在各种条件的配合下，可以实现病毒抗原颗粒在胞外的高效二次组装，形成完整的病毒样颗粒。
优选地，一种重组乙肝病毒核心抗原颗粒的制备方法，具体包括如下步骤：
1)通过基因重组技术表达乙肝病毒核心抗原；
2)离心收集发酵产物，通过超声破碎或者高压匀浆的方式破碎细胞，离心收集上清；
3)上清中加入终浓度0.1-1M，pH值为7.0-8.0的硫酸铵溶液，4℃搅拌，离心收取沉淀；
4)沉淀中加入终浓度为4M的脲溶液，溶解并解聚完整以及不完整的乙肝病毒核心抗原组装结构，同时不破坏抗原蛋白的二三级空间构象；
5)纯化解聚后的组装单元；
6)透析降低脲浓度至2M以下，再透析至组装缓冲液，彻底清除脲，其中组装单元的蛋白质浓度大于0.8μM，组装缓冲液包括20mM的Tris-HCl，终浓度0.2-1.5M的NaCl、pH值7.0-8.0、透析温度1-6℃、透析时间大于24h，通过胞外组装得到重组乙肝病毒核心抗原的完整病毒样颗粒。
本发明中，利用中性低浓度的硫酸铵溶液，可以有效沉淀目标蛋白，与杂蛋白起到分离效果，且该沉淀易于重悬解聚。利用合适浓度的弱碱性脲溶液，才能达到重悬解聚完整和不完整的颗粒结构，又不导致重组蛋白变性，产生不可逆的疏水聚集。利用高浓度蛋白在低温条件下透析至弱碱性，NaCl浓度0.2-1.5M的Tris-HCl缓冲溶液中，能够实现重组乙肝病毒核心抗原的胞外高效二次组装。本方面的方法通过组合调控硫酸铵、脲以及NaCl的浓度与pH条件，综合提高乙肝病毒核心抗原颗粒的胞外组装效率，同时提高所得重组乙肝病毒核心抗原颗粒的结构完整度以及均一性，有利于其后期应用。
本发明通过不断摸索，调整硫酸铵溶液、脲溶液、透析缓冲液和组装缓冲液的pH值，在本发明所述硫酸铵溶液、脲溶液的浓度以及缓冲液中离子强度范围内，更好地实现重组病毒样颗粒的沉淀、解聚和组装，使整个过程更加温和，最大程度保持组装单元的结构稳定性，高效地进行胞外二次组装，获得大量完整的重组病毒样颗粒。
第二方面，本发明提供一种重组乙肝病毒核心抗原颗粒，由第一方面所述的方法制备得到。
优选地，所述重组乙肝病毒核心抗原颗粒包括乙肝病毒核心抗原的截短体。
优选地，所述截短体为乙肝病毒核心抗原N端起的至少140个氨基酸，例如可以是140个、141个、142个、143个、144个、145个、146个、147个、148个、149个、150个、151个、152个、153个、154个、155个、156个、157个、158个、159个、160个、161个、162个、163个、164个、165个、166个、167个、168个、169个、170个、171个、172个、173个、174个、175个、176个、177个、178个、179个、180个、181个、182个或183个，优选为144-149个。
优选地，所述截短体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列：
MDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDPASRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPIL.
乙肝病毒核心抗原的氨基酸序列全长183个氨基酸(SEQ ID NO.2)，经实验证实，截短体包含至少140个氨基酸，就可通过本发明的方法制备得到与天然病毒衣壳蛋白相同形态的重组乙肝病毒核心抗原颗粒，本发明优选乙肝病毒核心抗原N端起144-149个氨基酸的截短体制备重组病毒样颗粒，避免富含精氨酸的序列与宿主核酸的结合，所述144个氨基酸的序列如SEQ ID NO.3所示，149个氨基酸的序列如SEQ ID NO.4所示。但乙肝病毒核心抗原全长蛋白并不适用本方法，因其结构稳定，需要更强烈的解聚条件如6M盐酸胍才能打开，不易进行二次组装。
乙肝病毒核心抗原全长蛋白HBc183(SEQ ID NO.2)：MDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDPASRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC.
乙肝病毒核心抗原的截短体HBc144(SEQ ID NO.3)：MDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDPASRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLP.
乙肝病毒核心抗原的截短体HBc149(SEQ ID NO.4)：MDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDPASRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVV.
优选地，所述重组乙肝病毒核心抗原颗粒包括含有至少一种其他抗原表位的乙肝病毒核心抗原全长蛋白或截短体。
优选地，所述乙肝病毒核心抗原与其他抗原表位的连接方式为融合。
优选地，所述重组乙肝病毒核心抗原颗粒与天然病毒衣壳蛋白具有相同形态。
第三方面，本发明提供一种如第二方面所述的重组乙肝病毒核心抗原颗粒的用途，所述用途包括装载药物和/或制备疫苗。
优选地，所述药物包括小分子抗癌药物、核酸药物或显影剂。
优选地，所述疫苗还包括其他抗原。
优选地，所述其他抗原与乙肝病毒核心抗原融合或偶联。
本发明中，由第一方面所述方法制备得到的重组乙肝病毒核心抗原颗粒可以融合或偶联其他抗原作为预防性或治疗性的疫苗。
优选地，所述其他抗原包括流感病毒膜蛋白M2e、手足口病病毒VP1、乙肝病毒PreS1、乙肝病毒PreS2、乙肝病毒HBsAg或人乳头瘤病毒E7中的任一种或至少两种的组合。
本发明中，重组乙肝病毒核心抗原颗粒属于纳米级颗粒，在体内能够靶向并持续高效刺激淋巴结，可作为疫苗载体，通过将其他抗原表位插入乙肝病毒核心抗原的主要免疫显性区域，提高其他抗原的免疫原性，生物相容性好，无需佐剂即可刺激机体产生免疫应答，可用于预防性或治疗性疫苗的制备。可融合或偶联的抗原典型但非局限的包括流感病毒膜蛋白M2e、手足口病病毒(FMDV)的结构蛋白VP1、乙肝病毒(HBV)包膜蛋白PreS1、PreS2、乙肝病毒表面抗原HBsAg或人乳头瘤病毒(HPV)的结构蛋白E7。
优选地，所述装载药物的方法包括如下步骤：
(A)采用脲溶液解聚由第二方面所述的重组乙肝病毒核心抗原颗粒；
(B)将药物加入到步骤(A)解聚后的乙肝病毒核心抗原溶液中；
(C)将步骤(B)所得溶液在缓冲液中透析，分离纯化得到装载药物的重组乙肝病毒核心抗原颗粒并检测分析。
优选地，步骤(A)所述脲溶液的终浓度为2-4M，例如可以是2M、2.5M、3M、3.5M或4M。
优选地，步骤(C)所述组装缓冲液包括Tris-HCl。
优选地，步骤(C)所述组装缓冲液还包括NaCl。
优选地，所述NaCl的终浓度为0.2-1.5M，例如可以是0.2M、0.5M、0.8M、1M、1.2M或1.5M，优选为0.5M。
优选地，步骤(C)所述透析的温度为1-6℃，例如可以是1℃、2℃、3℃、4℃、5℃或6℃，优选为4℃。
优选地，步骤(C)所述透析的时间大于24h，例如可以是24h、26h、28h、32h、40h、45h、48h、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天或30天，优选为24h-3天。
优选地，步骤(C)所述组装缓冲液的pH值为7.0-8.0，例如可以是7.0、7.2、7.4、7.6、7.8或8.0，优选为7.4。
优选地，步骤(C)所述检测分析包括SDS-PAGE、CD、FL、DLS、TEM、凝胶过滤层析、Native-agarose gel electrophoresis或MALDI-TOF-MS中的任一种或至少两种的组合。
本发明中，SDS-PAGE为十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳、CD为圆二色光谱、FL为荧光光谱、DLS为动态光散射、TEM为透射电镜、Native-agarose gel electrophoresis为琼脂糖凝胶电泳、MALDI-TOF-MS为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱。
优选地，凝胶过滤层析介质包括Superdex 200 10/300GL和/或TSK G4000 SWxl。
优选地，所述SDS-PAGE的分离胶浓度为8-15％，例如可以是8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％。
优选地，步骤(C)所述分离纯化的方式为凝胶过滤层析。
优选地，所述融合其他抗原的方法包括如下步骤：
(a)将其他抗原表位与乙肝病毒核心抗原进行基因融合；
(b)采用如第一方面所述的方法制备重组乙肝病毒核心抗原颗粒；
(c)检测分析重组融合乙肝病毒核心抗原颗粒。
优选地，步骤(a)所述乙肝病毒核心抗原包括乙肝病毒核心抗原截短体和/或乙肝病毒核心抗原全长蛋白。
优选地，步骤(c)所述检测分析包括SDS-PAGE、CD、FL、DLS、TEM、凝胶过滤层析、Native-agarose gel electrophoresis或MALDI-TOF-MS中的任一种或至少两种的组合。
优选地，所述SDS-PAGE的分离胶浓度为8-15％。
优选地，所述偶联其他抗原的方法包括如下步骤：
(I)将乙肝病毒核心抗原突变不少于1个特定位点；
(II)采用如第一方面所述的方法制备重组乙肝病毒核心抗原颗粒；
(III)在乙肝病毒核心抗原颗粒表面或内部连接其他抗原或显影剂；
(IV)将步骤(III)所得偶联其他抗原的重组乙肝病毒核心抗原颗粒分离纯化并检测分析。
优选地，步骤(III)所述检测分析包括SDS-PAGE、CD、FL、DLS、TEM、凝胶过滤层析、Native-agarose gel electrophoresis或MALDI-TOF-MS中的任一种或至少两种的组合。
优选地，所述SDS-PAGE的分离胶浓度为8-15％。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的方法首次明确了解聚条件对于蛋白质的收率、结构、纯化以及二次组装的影响，提供合适的脲浓度，高效地完成HBc-VLP的解聚、纯化以及二次组装；
(2)本发明利用合适浓度以及pH值的硫酸铵溶液进行蛋白沉淀，解聚条件下纯化，纯化方法简单，纯度高；
(3)本发明操作简单，制备效率高，采用本领域常规的方法即可完成；
(4)本发明适用于所有以可溶形式表达的重组病毒样颗粒；
(5)本发明所制备的重组乙肝病毒核心抗原颗粒，与天然病毒具有类似的结构，颗粒完整，结构均一，不含宿主核酸或杂蛋白。
附图说明
图1A是本发明实施例1中HBc149重组E.coli在20L发酵罐中的生长曲线；图1B是IPTG诱导后SDS-PAGE的结果图，其中M为marker，泳道1为诱导前全菌，泳道2为诱导后全菌，泳道3为破菌上清，泳道4为破菌沉淀；图1C为诱导后产物的TEM结果图；
图2是本发明实施例2中不同解聚条件蛋白溶解的SDS-PAGE图，其中S为不同解聚条件溶解的上清，P为不同解聚条件未能溶解的沉淀；
图3A是本发明实施例2中不同解聚条件蛋白Ni FF纯化层析色谱图；图3B是对应的SDS-PAGE图，其中S为不同解聚条件对应的Ni FF上柱样品，P1-P5为不同解聚条件对应的NiFF洗脱峰；
图4A是本发明实施例2中4M脲条件下蛋白亲和纯化层析放大色谱图；图4B是对应的SDS-PAGE图，其中S为Ni FF上柱样品，FT为流穿，P1为0.15M咪唑阶跃洗脱峰，P 2为0.5M咪唑阶跃洗脱峰，M为marker；
图5A是本发明实施例2中HBc VLP的Superdex 200表征结果；图5B是HBc VLP的TEM表征结果；图5C是不同解聚条件下荧光光谱图；图5D是不同解聚条件下Superdex 200的结果图；图5E是HBc VLP的TEM结果图；图5F是2M脲浓度条件下的TEM结果图；图5G是4M脲浓度条件下的TEM结果图；图5H是6M脲浓度条件下的TEM结果图；图5I是8M脲浓度条件下的TEM结果图；图5J是6M盐酸胍条件下的TEM结果图；
图6A是本发明实施例2中不同解聚条件后蛋白二次组装的凝胶色谱图；图6B是2M脲浓度条件下蛋白二次组装的TEM图；图6C是4M脲浓度条件下蛋白二次组装的TEM图；图6D是6M脲浓度条件下蛋白二次组装的TEM图；图6E是8M脲浓度条件下蛋白二次组装的TEM图；图6F是6M盐酸胍条件下蛋白二次组装的TEM图；
图7A是本发明实施例3中溶液微环境的温度对HBc VLP组装的影响；图7B是pH对HBc VLP组装的影响；图7C是表面活性剂对HBc VLP组装的影响，其中PBST为吐温实验组，PBS为对照组；图7D是时间对HBc VLP组装的影响；图7E是离子强度对HBc VLP组装的影响；图7F是最优组装策略条件下TEM检测组装效果图；
图8A是本发明实施例4中pET28a-HBc-MHCⅠ的诱导表达SDS-PAGE鉴定图，其中M为Maker，泳道1为未诱导全菌，泳道2为诱导后全菌，泳道3为破菌上清，泳道4为破菌沉淀；图8B是TEM结果图；
图9A是本发明实施例4中pET28a-HBc-MHCⅠ破碎上清硫酸铵沉淀的SDS-PAGE图，其中M为Maker，泳道1为破菌上清，泳道2为破菌沉淀，泳道3为加入硫酸铵后的上清，泳道4为4M脲未溶解部分，泳道5为4M脲解聚样品；图9B是解聚条件下Heparin 6 FF纯化层析色谱图；图9C是解聚条件下Heparin 6 FF纯化的SDS-PAGE结果；
图10A是本发明实施例4中pET28a-HBc-MHCⅠ的二次组装的TSK G4000 SWxl结果图；图10B是pET28a-HBc-MHCⅠ的二次组装的TEM表征结果图；图10C是Capto core纯化层析色谱图；图10D是Capto core纯化后的TEM表征结果图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例1重组乙肝病毒核心抗原的表达及鉴定
全基因合成的HBc149片段通过BamHⅠ和HindⅢ位点插入至载体pET28a中，命名为pET28a-HBc149，亚克隆至感受态细胞BL21(DE3)，HBc149片段氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。接种至20L发酵罐发酵，待OD600至5-8时，加入1mM IPTG诱导4h(菌体生长曲线见图1A)，离心收取菌体(诱导表达鉴定结果见图1B)。按照1:10的比例加入破菌液(20mM Tris-HCl，3mM EDTA，0.5％Triton X-100，1mM PMSF，pH 8.0)，在800MPa的压力下，通过高压匀浆的方式循环破碎三次，离心收取上清，即重组乙肝病毒核心抗原，透射电子显微镜(TEM)鉴定结果见图1C。
SEQ ID NO.4：
MDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDPASRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVV.
由图1A可知，当菌体密度OD600达到6.2，此时菌体已进入对数生长期，加入1mMIPTG诱导HBc149蛋白的表达，诱导4h后结束发酵。对发酵液进行离心处理后，收集菌体约200g。SDS-PAGE检测诱导前后全菌和破菌后上清与沉淀中HBc149的表达情况。HBc149的理论分子量是19kDa，由图1B可知，诱导后可以看到该位置处蛋白量明显增加。破菌后目标蛋白(黑色框区域)都位于上清中，说明HBc149蛋白以可溶形式表达。对破碎上清进一步通过TEM观察，由图1C可知，上清中存在结构完整的病毒样颗粒(白色箭头所指)，但与此同时存在大量的不完整的颗粒或中间结构(深灰色箭头所指)。
大肠杆菌上清中虽然表达有完整颗粒的HBc，但绝大部分还是以不完整的颗粒或者中间结构的形式存在，此外病毒样颗粒理化性质与普通蛋白不同，其表面电荷、疏水性质均与其球形结构有关，通过常规层析难于进行有效纯化，因此，先将所有颗粒解聚为统一结构再进行纯化，继而胞外二次组装，制备病毒样颗粒。
实施例2解聚条件对蛋白收率、纯化、结构以及VLP胞外再组装的影响
1、解聚条件对蛋白收率的影响
将破碎上清用1M硫酸铵沉淀，利用不同类型和浓度的变性剂对蛋白解聚，之后用Bradford法测蛋白浓度(蛋白收率见表1)，解聚后的溶液进行SDS-PAGE鉴定(结果见图2)。
表1不同类型和浓度的变性剂对蛋白收率的影响
解聚条件 蛋白浓度mg/ml 蛋白收率
2M urea 3.64 72.8％
4M urea 4.59 91.8％
6M urea 4.83 96.6％
8M urea 4.94 98.8％
6M GdnHCl 4.99 99.8％
由表1和图2可知，变性剂大于4M脲以上浓度时，沉淀中几乎无目标蛋白。因此可以认为4M及以上浓度的脲可将目标蛋白完全溶解解聚。
2、解聚条件对蛋白纯化的影响
不同类型和浓度的变性剂重悬解聚的蛋白经Ni FF层析纯化，洗脱方式均采取0.15M咪唑阶跃洗脱，纯化后的对应色谱图见图3A，纯化后的对应SDS-PAGE图见图3B。
如图3A-3B所示，在脲浓度低于6M时蛋白能够更好的与介质结合，其中在脲浓度为4M的解聚条件下蛋白纯化收率最高，SDS-PAGE结果也显示这些条件下蛋白纯度较高，均大于95％。在确定4M脲作为解聚条件的基础上，对HBc进行亲和层析放大实验。在4M脲存在的情况下，200mg蛋白样品经Ni FF纯化，得到26.35mg蛋白，收率为13.2％，纯度大于95％，结果如图4A-4B所示。
3、解聚条件对蛋白结构的影响
采用逆向方法验证，即先获得纯净的、结构均一的组装体，之后将其解聚至不同程度，再利用凝胶过滤层析、荧光光谱以及TEM对其进行分析。具体为：验证组装好的VLP，验证结果见图5A-5B，各取2mg组装好的VLP，加入1M硫酸铵溶液，所有蛋白均沉淀，向沉淀中加入不同浓度和类型的变性剂至终浓度为1mg/mL。Bradford法测蛋白浓度，结果显示蛋白完全被硫酸铵沉淀，且全部被重悬溶解。将重悬溶解的溶液进行荧光检测，荧光结果(图5C)显示随着变性强度的增加，蛋白最大吸收峰从组装体的325.8nm红移至6M盐酸胍样品的343nm，说明蛋白的疏水区暴露程度增加。结合Superdex 200(图5D)结果，组装体在外水出峰；2M脲不能完全将其解聚，存在部分VLP结构，与此同时出现部分中间体；4M、6M和8M脲层析行为基本类似，蛋白以中间体形式存在，脲浓度增加，蛋白结构进一步打开，分子间疏水聚集逐渐增加；6M盐酸胍解聚样品疏水区充分暴露，完全以疏水聚集形式存在。TEM结果(图5E-5J)也类似。
4、解聚条件对蛋白二次组装的影响
上述各变性解聚样品首先透析至20mM Tris-HCl，2M脲，pH 8.0再分别透析至组装buffer(20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，pH 7.4)，采用Superdex 200和TEM检测其组装效果。Superdex 200结果见图6A，相应的TEM结果见图6B-6F。由图6A-6F可知，脲变性的蛋白能够再次组装成VLP，而盐酸胍变性的蛋白不能，仅以聚集形式存在；脲浓度大于4M时，随着变性剂浓度增加，组装效率降低，不完整颗粒增加。
因此，解聚条件对HBc蛋白的收率、纯化、结构以及二次组装都有明显的影响。在2M脲这种低浓度变性剂条件下，HBc VLP无法被完全打开，部分VLP结构还存在，影响了其收率和与介质的结合；4M脲以上时蛋白完全溶解，但随着变性剂浓度的增大，尤其是8M脲和6M盐酸胍条件下，蛋白疏水区暴露程度增加，分子间极易产生不可逆的聚集，影响与介质的结合，当变性剂移除时也不能有效的进行的组装。综合分析，在4M脲的条件下HBc蛋白既能够充分的溶解，又不破坏其天然的低级结构，与介质结合好，脱除变性剂也能够完全获得再组装，是最适宜的解聚条件。
实施例3胞外组装条件对HBc的类病毒颗粒组装的影响
病毒样颗粒的胞外组装主要受温度、溶液pH值、表面活性剂、反应时间以及离子强度的影响，本实验对其进行一一考察。将4M脲解聚的样品经Ni FF纯化后，首先透析至2M脲中，之后透析至各组装缓冲液。
表征手段主要采取TSK G4000SWxl，流速0.6ml/min，通过与TEM结果对应，确定出峰时间9.5min为聚集体，10.6min为组装体以及19.4min为未组装结构。
1、反应温度对组装的影响：反应温度主要影响反应速率，如图7A所示，在室温条件下蛋白折叠速度过快，绝大部分沉淀，而在4℃条件下蛋白基本无沉淀，且根据凝胶出峰时间推算主要以VLP形式存在。
2、pH对组装的影响：理论上改变pH值会改变蛋白表面的净电荷及电荷分布，从而影响蛋白亚基间的静电相互作用，从而影响组装体结构。如图7B所示，蛋白在pH 6.4时，绝大部分蛋白沉淀；而在pH 8.4条件下，蛋白未发生组装；只有在中性稍偏碱的条件下，蛋白大量发生组装。
3、表面活性剂对组装的影响：由于病毒样颗粒的组装主要靠静电作用和疏水作用等弱相互作用维持，VLP之间容易产生聚集的现象，因此加入一定量的表面活性剂，如Tween80有助于VLP的分散。与预想的一样，加入0.1％Tween80，VLP之间聚集明显减少，且组装效率有所增加(图7C)。
4、时间对组装的影响：病毒样颗粒的组装是一个相对缓慢的过程，需要一定的时间来完成，在6h时约80％蛋白发生组装，而到24h超过95％的蛋白发生组装(图7D)。
5、离子强度对组装的影响：在病毒样颗粒的组装过程中，静电排斥作用是最主要的相互作用，离子强度不同则蛋白表面电荷强度和密度不同，离子强度的增加，有助于HBc的组装。如图7E所示，随着NaCl浓度的增加，组装效率增加，但NaCl大于1M时，蛋白会发生沉淀，0.5M NaCl条件下蛋白不会发生沉淀且组装效率大于95％，于此同时较高浓度的NaCl的引入可以替代表面活性剂的作用，即降低VLP之间的聚集和提高组装效率，这可能与离子强度高时，蛋白相互之间静电排斥作用增加有关。
在综合考察了温度、溶液pH值、表面活性剂、反应时间以及离子强度的基础上，确定最优组装策略：20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，pH 7.4为组装buffer，4℃下透析24h以上。得到组装效率大于95％，颗粒完整，结构均一的VLP，如图7F所示。
实施例4融合抗原的重组乙肝病毒核心抗原(HBc)颗粒的纯化和组装
将人黑色素瘤相关抗原MAGE A3基因中一种MHC I类抗原插入至HBc MIR区，连接入pET28a中，命名为pET28a-HBc-MHC I。转化至感受态细胞BL21(DE 3)后发酵表达，离心收集菌体。超声破碎后对发酵产物进行表征，SDS-PAGE和TEM结果分别如图8A、8B所示，pET28a-HBc-MHC I在上清中表达，以病毒样颗粒形式少量存在。
与HBc149制备方式类似，破菌上清先用中性pH的1M硫酸铵沉淀(沉淀的SDS-PAGE结果见图9A)，再加入弱碱性pH的4M脲解聚，在解聚条件下进行Heparin 6 FF纯化，收取流穿峰，获得较纯的组装单元，解聚条件下Heparin 6 FF纯化层析色谱图和SDS-PAGE结果分别如图9B和9C所示。
纯化后的组装单元透析至20mM Tris-HCl，pH 7.4中放置于4℃冰箱3天，凝胶结果显示大量重组VLP产生(图10A-10B)。利用Capto core对透析后的样品进行精致纯化，组装体流穿，未组装或错误组装的结构与介质结合，达到精致纯化的目的。收集穿透峰，利用TEM表征，Capto core纯化的色谱图及TEM表征结果分别如图10C和10D所示，结果表明，本发明的方法可以得到结构均一的组装体。
综上所述，本发明的重组病毒样颗粒不含宿主核酸，纯度高且结构完整均一，与天然病毒形态完全相同，制备方法简单，收率高，纯化效果好，具有重要意义和广泛应用前景。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种重组病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
将表达重组病毒衣壳蛋白的细胞进行发酵后收集发酵产物，采用2-6M的脲溶液溶解解聚，胞外二次组装得到重组病毒衣壳蛋白的完整病毒样颗粒。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组病毒衣壳蛋白包括重组乙肝病毒核心抗原；
优选地，所述重组乙肝病毒核心抗原包括重组乙肝病毒核心抗原的截短体和/或含有其他抗原的重组乙肝病毒核心抗原全长；
优选地，所述截短体与其他抗原融合表达；
优选地，所述重组乙肝病毒核心抗原全长与其他抗原融合表达；
优选地，所述重组使用的重组蛋白表达系统包括真核表达系统和/或原核表达系统；
优选地，所述真核表达系统包括非洲爪蟾蛙卵母细胞、植物本氏烟或毕赤酵母中的任一种或至少两种的组合；
优选地，所述原核表达系统包括大肠杆菌。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述脲溶液的浓度为3.5-4.5M，优选为4M；
优选地，所述脲溶液的pH值为7.0-9.0。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述收集发酵产物具体包括如下步骤：
(1)破碎细胞，离心收集上清；
(2)上清中加入硫酸铵溶液，搅拌，离心收取沉淀，得到所述发酵产物。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述破碎细胞的方式包括超声破碎和/或高压匀浆；
优选地，步骤(2)所述的硫酸铵溶液终浓度为0.05-4M，优选为0.1-1M；
优选地，步骤(2)所述的硫酸铵溶液pH值为7.0-8.0；
优选地，步骤(2)所述搅拌的温度为1-6℃，优选为4℃。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述胞外二次组装包括如下步骤：
(1’)纯化解聚后的组装单元；
(2’)透析降低脲浓度，调节组装缓冲溶液的pH值、离子强度、蛋白质浓度、温度和时间，通过胞外组装得到重组病毒衣壳蛋白的完整病毒样颗粒。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1’)所述纯化的方法包括亲和层析、离子交换或凝胶过滤，优选为亲和层析；
优选地，所述亲和层析的介质包括镍离子金属螯合亲和层析介质和肝素亲和层析介质；
优选地，步骤(2’)所述降低脲浓度采用梯度透析的方式；
优选地，所述梯度透析具体包括如下步骤：将步骤(1’)得到的解聚后的样品透析至Tris透析缓冲液中，再透析至组装缓冲液中；
优选地，所述Tris透析缓冲液包括Tris-HCl和脲；
优选地，所述Tris透析缓冲液中的脲的终浓度不大于2M；
优选地，所述Tris透析缓冲液的pH值为8.0-9.0；
优选地，步骤(2’)所述组装缓冲液包括Tris-HCl；
优选地，所述组装缓冲液还包括NaCl；
优选地，所述NaCl的终浓度为0.2-1.5M，优选为0.5M；
优选地，步骤(2’)所述组装缓冲液的pH值为7.0-8.0，优选为7.4；
优选地，步骤(2’)所述蛋白质浓度为0.8μM-500μM，优选为0.8-100μM；
优选地，步骤(2’)所述温度为1-6℃，优选为4℃；
优选地，步骤(2’)所述时间不少于24h，优选为24h-3天。
8.一种重组乙肝病毒核心抗原颗粒，其特征在于，由权利要求1-7任一项所述的方法制备得到；
优选地，所述重组乙肝病毒核心抗原颗粒包括乙肝病毒核心抗原的截短体；
优选地，所述截短体为乙肝病毒核心抗原N端起的至少140个氨基酸，优选为144-149个；
优选地，所述截短体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
优选地，所述重组乙肝病毒核心抗原颗粒包括含有至少一种其他抗原表位的乙肝病毒核心抗原全长蛋白或截短体；
优选地，所述乙肝病毒核心抗原与其他抗原表位的连接方式为融合；
优选地，所述重组乙肝病毒核心抗原颗粒与天然病毒衣壳蛋白具有相同形态。
9.一种如权利要求8所述的重组乙肝病毒核心抗原颗粒的用途，其特征在于，所述用途包括装载药物和/或制备疫苗；
优选地，所述药物包括小分子抗癌药物、核酸药物或显影剂；
优选地，所述疫苗还包括其他抗原；
优选地，所述其他抗原与乙肝病毒核心抗原融合或偶联；
优选地，所述其他抗原包括流感病毒膜蛋白M2e、手足口病病毒VP1、乙肝病毒PreS1、乙肝病毒PreS2、乙肝病毒HBsAg或人乳头瘤病毒E7中的任一种或至少两种的组合。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述装载药物的方法包括如下步骤：
(A)采用脲溶液解聚权利要求8所述的重组乙肝病毒核心抗原颗粒；
(B)将药物加入到步骤(A)解聚后的乙肝病毒核心抗原溶液中；
(C)将步骤(B)所得溶液在组装缓冲液中透析，分离纯化得到装载药物的重组乙肝病毒核心抗原颗粒并检测分析；
优选地，步骤(A)所述脲溶液的终浓度为2-4M；
优选地，步骤(C)所述组装缓冲液包括Tris-HCl；
优选地，步骤(C)所述组装缓冲液还包括NaCl；
优选地，所述NaCl的终浓度为0.2-1.5M，优选为0.5M；
优选地，步骤(C)所述透析的温度为1-6℃；
优选地，步骤(C)所述透析的时间不少于24h；
优选地，步骤(C)所述组装缓冲液的pH值为7.0-8.0，优选为7.4；
优选地，步骤(C)所述检测分析包括SDS-PAGE、圆二色光谱、荧光光谱、动态光散射、透射电镜、凝胶过滤层析、琼脂糖凝胶电泳或基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱中的任一种或至少两种的组合；
优选地，凝胶过滤层析介质包括Superdex 200 10/300GL和/或TSK G4000 SWxl；
优选地，所述SDS-PAGE的分离胶浓度为8-15％；
优选地，步骤(C)所述分离纯化的方式为凝胶过滤层析。
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