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CN109655611A - 微流控芯片免疫诊断试剂盒及其制备方法 - Google Patents

微流控芯片免疫诊断试剂盒及其制备方法 Download PDF

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CN109655611A
CN109655611A CN201811564780.7A CN201811564780A CN109655611A CN 109655611 A CN109655611 A CN 109655611A CN 201811564780 A CN201811564780 A CN 201811564780A CN 109655611 A CN109655611 A CN 109655611A
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CN
China
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micro
fluidic chip
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shaped depressions
antigen
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Application number
CN201811564780.7A
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English (en)
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李守军
付旭彬
鲍恩东
刘海霞
蔡天宁
王艳晓
吕传忠
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Tianjin Ringpu Bio Technology Co Ltd
Original Assignee
Tianjin Ringpu Bio Technology Co Ltd
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Abstract

本发明提供了微流控芯片免疫诊断试剂盒及其制备方法，涉及微流控芯片技术领域。该微流控芯片免疫诊断试剂盒包括微流控芯片基板和抗原，微流控芯片基板具有经管状空腔串联的扇形凹陷，扇形凹陷经多巴胺处理和戊二醛处理；扇形凹陷的数目≥4；抗原包被在微流控芯片基板的部分扇形凹陷表面。该微流控芯片免疫诊断试剂盒缓解了现有技术中缺乏一种灵敏度高，准确度高的微流控芯片免疫诊断试剂盒的技术问题；本发明还提供了该微流控免疫诊断试剂盒的制备方法，该方法抗原包被较为迅速，工艺简单，用时短。

Description

微流控芯片免疫诊断试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及微流控芯片技术领域，具体而言，涉及一种微流控芯片免疫诊断试剂盒及其制备方法。
背景技术
微流控芯片是一种以在微米尺度空间对流体进行操控为主要特征的技术产品，主要通过微机电加工技术，在一块若干平方厘米以硅、石英、玻璃或高分子聚合物等材料的芯片上构建出微管道网络结构，把采样、稀释、加试剂、反应、分离、检测等功能集中到一块芯片上，利用可控流体在芯片中流动，实现常规化学或生物实验室的多功能的技术平台。
微流控芯片技术目前虽然具有节省样品、可一次性检测多种抗原或抗体等诸多优势，但是技术尚不成熟。首先，微流控芯片的微型和便携化限制了芯片微通道的尺寸，导致了芯片中流体仅能靠分子扩散进行混合，混合效果不好，进而影响反应的灵敏性和充分性，并导致检测结果的准确性降低；第二，现有的用于免疫诊断的微流控芯片往往存在抗原或抗体固定效果差的现象，其主要表现在不同批次芯片之间以及同一芯片上各点的固定均一度差，以及非特异性吸附导致的检测结果准确率降低，固定后抗原或抗体对靶蛋白捕捉效率低的进而影响检测结果的现象；此外，现有用于免疫诊断的微流控芯片抗原包被耗时长，间接影响了抗原或抗体固定后的活性和捕捉靶蛋白的效率，从而影响了检测结果的灵敏性和准确性。因此，开发一种检测灵敏性高、准确性高的微流控免疫诊断试剂盒，具有重要的实用价值。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种微流控芯片免疫诊断试剂盒，该试剂盒具有灵敏度高、准确度高的优点。
本发明目的之二在于提供上述微流控芯片免疫诊断试剂盒的制备方法，该方法抗原包被较为迅速，工艺简单，用时短。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
第一方面，一种微流控芯片免疫诊断试剂盒，微流控芯片免疫诊断试剂盒包括微流控芯片基板和抗原，微流控芯片基板具有经管状空腔串联的扇形凹陷，扇形凹陷经多巴胺处理和戊二醛处理；扇形凹陷的数目≥4；抗原包被在微流控芯片基板的部分扇形凹陷表面。
优选地，在本发明方案基础上，扇形凹陷数目为5-50个，扇形凹陷包括未经抗原包被的扇形凹陷和经抗原包被的扇形凹陷，经抗原包被的扇形凹陷中，每个扇形凹陷中仅包被1种抗原；
优选地，微流控芯片基板上还设有加样孔，加样孔与扇形凹陷经管状空腔连通，加样孔的容积是扇形凹陷容积的5-40倍，加样孔的数目为3-20个。
优选地，在本发明方案基础上，微流控芯片免疫诊断试剂盒还包括连有标签的二抗，标签包括催化底物产生显色反应的酶或颜色标签。
优选地，在本发明方案基础上，微流控芯片免疫诊断试剂盒还包括包被液、稀释液、清洗液、缓冲液、封闭液、显色液或终止液中的一种或几种。
优选地，在本发明方案基础上，抗原包括牛口蹄疫A型病毒、牛口蹄疫O型病毒、牛口蹄疫亚洲Ⅰ型病毒、牛传染性鼻炎菌、牛病毒性腹泻病毒、布氏杆菌或牛型结核分枝杆菌中的一种或几种。
第二方面，一种微流控芯片免疫诊断试剂盒的制备方法，包括如下步骤：将依次经多巴胺处理和戊二醛处理的具有经管状空腔串联的扇形凹陷的微流控芯片本体进行抗原包被，得到微流控芯片。
优选地，在本发明方案基础上，包括如下步骤：将经多巴胺处理的具有经管状空腔串联的扇形凹陷的微流控芯片本体进行戊二醛处理，得到微流控芯片基板，然后包被抗原，得到微流控芯片。
优选地，在本发明方案基础上，戊二醛处理包括如下步骤：将多巴胺处理过的具有经管状空腔串联的扇形凹陷的微流控芯片本体放入体积分数为8-20％的戊二醛的无水乙醇溶液，温度为10-30℃条件下，保温60-120min，然后清洗2-3次并干燥，得到微流控芯片基板。
优选地，在本发明方案基础上，多巴胺处理包括如下步骤：用12-15mM的Tris-HCl多巴胺溶液浸泡微流控芯片本体，浸泡时间为8-10h，浸泡过程中向盐酸多巴胺溶液中通入空气，浸泡后清洗1-3次并干燥。
优选地，在本发明方案基础上，包被抗原包括如下步骤：
将抗原溶液分别加入扇形凹陷中，15-30℃保温30-120min，然后清洗1-3次，再用封闭液封闭5-12h，重复清洗2-4次，在温度为10-30℃下干燥。
与已有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的微流控芯片免疫诊断试剂盒包括微流控芯片基板和抗原，微流控芯片基板具有经管状空腔串联的扇形凹陷，由于扇形凹陷的结构特点，可以使其内部的液体混合更迅速均匀，经管状空腔进行串联，能够保证液体集中向一个方向流动，有利于微力泵对液体的泵入和排出，不易造成液体残留，避免分支过多导致的液体排出不充分进而影响检测结果的现象，有利于提高检测结果的准确性。扇形凹陷经多巴胺处理和戊二醛处理过；多巴胺处理能够使微流控芯片表面形成聚多巴胺涂层，然后经戊二醛处理能够在聚多巴胺涂层上形成一层醛基基团，有利于抗原的与其进行供价连接，连接更牢固更迅速，均一性更好，从而有效屏蔽后续加样过程中的非特异性结合，进一步提高检测结果的准确性；扇形凹陷的数目≥4，其中至少包括阴性对照、阳性对照和特定抗原包被的扇形凹陷，抗原包被在微流控芯片基板的部分扇形凹陷表面，用于与待测样品和连有标签的二抗的复合物进行结合，从而产生信号，对信号进行读取能够对检测结果进行定性或定量分析；综上，本发明的微流控免疫诊断试剂盒灵敏度高，检测准确度高。
(2)本发明的微流控芯片免疫诊断试剂盒的制备方法抗原包被较为迅速，工艺简单，用时短。
附图说明
图1为具有经管状空腔串联的扇形凹陷的微流控芯片基板简示图；
图标：1-扇形凹陷；2-管状空腔。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
根据本发明的第一个方面，提供了一种微流控芯片免疫诊断试剂盒，微流控芯片免疫诊断试剂盒包括微流控芯片基板和抗原，微流控芯片基板具有经管状空腔串联的扇形凹陷，扇形凹陷经多巴胺处理和戊二醛处理；扇形凹陷的数目≥4；抗原包被在微流控芯片基板的部分扇形凹陷表面。
微流控芯片基板，该装置的主要特征是其容纳流体的有效结构(通道、反应室和其他某些功能部件)至少在一个维度上为微米级尺度，操控微小体积的流体在微小空间中活动，在微小的芯片上构建化学或生物实验室。本发明中，微流控免疫诊断试剂盒中的微流控芯片是微流控芯片本体经过多巴胺处理和戊二醛处理，并经过包被抗原以后得到，微流控芯片本体的材质为市场常用的玻璃或高分子聚合物。典型但非限制性的高分子聚合物包括：热塑性聚合物、固化型聚合物和溶剂挥发型聚合物。典型但非限制性的热塑性聚合物例如为：聚酰胺、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯等；典型但非限制性的固化型聚合物例如为：聚二甲基硅氧烷、环氧树脂或聚氨酯等；将它们与固化剂混合后，经过一段时间固化变硬后得到微流控芯片本体。典型但非限制性的溶剂挥发型聚合物例如为：丙烯酸、橡胶或氟塑料等；将它们溶于适当的溶剂后，经过缓慢的挥发溶剂得到芯片。上述多种材料中，以聚二甲基硅氧烷(PDMS)在微流控芯片的综合性能较好，研究和应用的较为广泛。
微流控芯片免疫诊断试剂盒，即基于微流控芯片的免疫诊断试剂盒，该微流控芯片上的凹陷处包被有抗原物质可以进行抗体检测。需要说明的是，本发明中所提及的抗原或抗体，均为相对概念，可以理解为互为抗原抗体的相应物质。
多巴胺处理，即用Tris-HCl多巴胺溶液中对微流控芯片本体进行处理，这个过程中，发生了多巴胺的聚合反应，在微流控芯片本体的表面形成一层聚多巴胺涂层，聚多巴胺涂层具有良好的生物和细胞相容性，从而使其有利于后续试验过程中的抗原附着。
扇形凹陷，不限于完全严谨的扇形，即也包括近似扇子形状或半圆弧状的扇形，该形状有利于流体在其内部保持更好的流动性，从而使混合更为均匀，反应更充分，流体的流动更顺畅。
戊二醛处理，在聚多巴胺涂层上形成一层醛基基团的过程，形成醛基基团有利于抗原的附着，能够使接触到的抗原物质迅速而均匀地固着在微流控芯片基板的表面，加速包被抗原的进程，有利于缩短包被所用的时间，更好地保持抗原的活性，使其在后续与一抗和具有标签的二抗的复合物进行反应的时候，能够以较高的活性，更灵敏、更迅速地捕获目标，使检测的灵敏度和准确度得到提高。
扇形凹陷的数目≥4，典型但非限制性的扇形凹陷的数目例如为：30、35、40、45或50等。抗原包被在微流控芯片基板的部分扇形凹陷表面，用于捕获一抗和具有标签的二抗的复合物。
综上所述，本发明首先利用具有特定微结构的微流控芯片，即具有经管状空腔串联的扇形凹陷的微流控芯片，促进了流体的流动性，有利于流体混合的充分性，进而有利于反应的灵敏性和充分性，提高了检测结果的准确性，同时微流控芯片本体经多巴胺处理，使微流控芯片基板表面附着一层聚多巴胺涂层，提高了其的生物相容性，有利于抗原的结合，然后进行戊二醛处理，使聚多巴胺涂层表面形成一层醛基，有利于包被抗原与其进行迅速而牢固地结合，使抗原包被更为充分，减少后续使用过程中的非特异性反应，提高了检测的灵敏度和检测结果的准确性。
在一种优选的实施方式中，扇形凹陷数目为5-50个，扇形凹陷包括未经抗原包被的扇形凹陷和经抗原包被的扇形凹陷，经抗原包被的扇形凹陷中，每个扇形凹陷中仅包被1种抗原。
典型但非限制性的扇形凹陷的数目例如为：5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个或50个等。为了便于理解本发明，给出了具有经管状空腔串联的扇形凹陷的微流控芯片基板简示图，见附图1，图标：1-扇形凹陷；2-管状空腔。应当理解的是附图1仅作为象征简示了5个扇形凹陷，但不能理解为对本发明扇形凹陷或管状空腔数目的限定。微流控芯片基板具有经管状空腔串联的扇形凹陷，扇形凹陷中包括未经抗原包被的扇形凹陷，用于作为阴性对照或者用于随机进行灵活使用，因此，作为一种优选的实施方式，可以根据实际需求进行任意种类的抗原包被，并进行相应的抗体检测。
优选地，微流控芯片基板上还设有加样孔，加样孔与扇形凹陷经管状空腔连通，加样孔的容积是扇形凹陷容积的5-40倍，加样孔的数目为3-20个。
加样孔用于添加样品、洗涤液、显色液或终止液等，体积通常大于扇形凹陷，这是由于实际应用过程中，例如，洗涤液往往在试验过程中反复使用，其用量通常要大于样品量，因此设计了较大的容积。典型但非限制性的加样孔的容积例如为扇形凹陷的容积的10倍、20倍、30倍或40倍。典型但非限制性的加样孔的数目例如为：3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个或20个等。
在一种优选的实施方式中，微流控芯片免疫诊断试剂盒还包括连有标签的二抗，标签包括催化底物产生显色反应的酶或颜色标签。
连有标签的二抗，标签包括催化底物产生显色反应的酶或颜色标签。典型但非限制性的催化底物产生显色反应的酶例如为：辣根过氧化酶(Horseradish Peroxidase，HRP)或碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)等。典型但非限制性的颜色标签例如为：绿色荧光蛋白等。标签的作用是在一抗与二抗结合后形成复合物后，该复合物在后续被抗原捕获以后，根据捕获与否或捕获的量来确定抗原的含量，其可通过发光或者显色的作为待检测信号，用以对待测样品进行定性评价或定量分析。
在一种优选的实施方式中，微流控芯片免疫诊断试剂盒还包括包被液、稀释液、清洗液、缓冲液、封闭液、显色液或终止液中的一种或几种。
包被液，可以根据实际需要，例如在扇形凹陷中未包被抗原的情况下，用于抗原浓度的调节，然后进行抗原包被，以便包被后抗原能够在后续试验中捕获相应抗体，典型但非限制性的包被液例如为：磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline，PBS)或碳酸盐缓冲液；稀释液，用于稀释，典型但非限制性的例如用于稀释抗原、一抗或二抗等，典型但非限制性的稀释液例如为：磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液；清洗液，是指用于试剂盒使用过程中对未结合的抗原或抗体进行洗涤去除的液体，典型但非限制性的清洗液例如为：磷酸盐吐温缓冲液；缓冲液，用于平衡反应体系；封闭液，用于封闭未结合区域，避免非特异性结合造成的检测结果准确性差；典型但非限制性的封闭液例如为：5％脱脂乳、10％BSA封闭液或0.5％鸡卵清蛋白等。
在一种优选的实施方式中，抗原包括牛口蹄疫A型病毒、牛口蹄疫O型病毒、牛口蹄疫亚洲Ⅰ型病毒、牛传染性鼻炎菌、牛病毒性腹泻病毒、布氏杆菌或牛型结核分枝杆菌中的一种或几种。
牛口蹄疫A型病毒、牛口蹄疫O型病毒、牛口蹄疫亚洲Ⅰ型病毒、牛传染性鼻炎菌、牛病毒性腹泻病毒、布氏杆菌或牛型结核分枝杆菌均为各品种牛的易患病，传染性强，是牛养殖业的重点防控疾病，因此以上述病毒或细菌作为抗原，根据实际需要进行相应抗原的包被，制成上述某一种或任几种疾病的微流控免疫诊断试剂盒，用于上述疾病的检测，能够实现上述疾病的快速诊断和相应抗体的快速检测。
根据本发明的第二方面，一种微流控芯片免疫诊断试剂盒的制备方法，包括如下步骤：将依次经多巴胺处理和戊二醛处理的具有经管状空腔串联的扇形凹陷的微流控芯片本体进行抗原包被，得到微流控芯片。
在一种优选的实施方式中，包括如下步骤：将经多巴胺处理的具有经管状空腔串联的扇形凹陷的微流控芯片本体进行戊二醛处理，得到微流控芯片基板，然后包被抗原，得到微流控芯片。
在一种优选的实施方式中，戊二醛处理包括如下步骤：将多巴胺处理过的具有经管状空腔串联的扇形凹陷的微流控芯片本体放入体积分数为8-20％的戊二醛的无水乙醇溶液，温度为10-30℃条件下，保温60-120min，然后清洗2-3次并干燥，得到微流控芯片基板。
以无水乙醇为溶剂，无水乙醇为市售无水乙醇，其纯净度不限于100％。在戊二醛的无水乙醇溶液中，典型但非限制性的戊二醛的体积分数例如为：8％、10％、12％、14％、16％、18％或20％等。典型但非限制性的温度例如为：10℃、12℃、14℃、16℃、18℃或20℃等。典型但非限制性的保温时间例如为：60min、70min、80min、90min、100min、110min或120min等。典型但非限制性的清洗次数例如为：2次或3次。戊二醛处理的过程，将多巴胺处理过的具有经管状空腔串联的扇形凹陷的微流控芯片放入戊二醛的无水乙醇溶液中，在适宜的温度下保温相应的时间，能够在其表面形成一层醛基，这样有利于后续抗原包被过程中对抗原的固定，抗原固定更迅速、更致密，更均一，结合更牢固。抗原的迅速固定，有利于抗原活性的保持，有利于后续反应过程中迅速灵敏地捕获抗体；由于抗原结合的更致密更均一，更有利于减少后续的非特异性结合，检测结果也更准确。
在一种优选的实施方式中，多巴胺处理包括如下步骤：用12-15mM的Tris-HCl多巴胺溶液浸泡微流控芯片本体，浸泡时间为8-10h，浸泡过程中向盐酸多巴胺溶液中通入空气，浸泡后清洗1-3次并干燥。
以浓度为1M，pH为8.5的Tris-HCl为溶剂，配制相应浓度的多巴胺溶液，典型但非限制性的Tris-HCl多巴胺溶液浓度例如为：12mM、13mM、14mM或15mM等。典型但非限制性的浸泡时间例如为8h、9h或10h等。典型但非限制性的浸泡时间例如为：8h、9h或10h等。典型但非限制性的浸泡后清洗次数例如为：1次、2次或3次等。微流控芯片本体是未经表面修饰的玻璃或高分子聚合物制成的，或市售的未经抗原包被的微流控芯片本体，经过Tris-HCl多巴胺溶液浸泡以后，其表面会形成一层聚多巴胺涂层，聚多巴胺涂层具有良好的生物相容性，更易与抗体或细胞结合，有利于抗原的快速包被。
在一种优选的实施方式中，包被抗原包括如下步骤：
将抗原溶液分别加入扇形凹陷中，15-30℃保温30-120min，然后清洗1-3次，再用封闭液封闭5-12h，重复清洗2-4次，在温度为10-30℃下干燥。
本发明中，对抗原溶液的浓度和抗原种类不做限定，抗原的种类和浓度可以根据实际需要进行调整。典型但非限制性的保温时间例如为：30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min、100min、110min或120min等；典型但非限制性的清洗次数例如为：3次或4次；典型但非限制性的封闭时间例如为：5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h或12h等。典型但非限制性的清洗次数例如为：2次、3次或4次等。典型但非限制性的干燥温度例如为：10℃、15℃、20℃、25℃或30℃等。抗原溶液加入到扇形凹陷中后，以适宜的温度保温相应的时间，能够是扇形凹陷中充分包被抗原，然后清洗去除未包被的抗原，再用封闭液封闭，有效避免非特异性结合，提高检测结果的准确性，封闭后清洗去除封闭液残留，然后在适宜的温度下干燥，制成了微流控芯片。
下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1
微流控免疫诊断试剂盒的制备：
刻蚀法制备具有经管状空腔串联的扇形凹陷的未经处理的微流控芯片共计10个，每个均设计6个加样孔。
多巴胺处理：用12mM的Tris-HCl多巴胺溶液对微流控芯片本体进行浸泡，浸泡时间为8h，在浸泡过程中向体系内通入空气，浸泡后用水清洗3次，然后自然风干。
戊二醛处理：用体积分数为10％的戊二醛无水乙醇溶液对多巴胺处理后的微流控芯片本体进行浸泡，浸泡温度为室温25℃，保温60min，然后取出并用水清洗3次，然后自然风干，得到微流控芯片基板。
包被抗原：将牛口蹄疫A型病毒、牛口蹄疫O型病毒、牛口蹄疫亚洲Ⅰ型病毒、牛传染性鼻炎菌、牛病毒性腹泻病毒、布氏杆菌或牛型结核分枝杆菌用微量加样器点至微流控基板的扇形凹陷处，25℃保温120min，清洗3次，然后用0.5％脱脂乳封闭12h，重复清洗3次，25℃干燥。
实施例2
一抗：点刺法对实验牛进行采血，制备阴性血清样本500μl，然后用自制的牛流行性腹泻+牛口蹄疫A型病毒灭活苗进行免疫，免疫后28天，点刺法采血，制备待测血清样本500μl，用PBS稀释2500倍作为一抗待用。
取已经制好的微流控芯片，在不同加样孔中分别加入待测血清200μl、PBST清洗液800μl，2000倍稀释的HRP-山羊抗牛IgG 200μl。
将自动检测仪按照下述程序进行预先设置，按程序依次进行如下程序的泵送：泵送待测血清进入微流控芯片25℃孵育2h，然后泵送PBST清洗液，清洗3次，泵出清洗液。二抗：泵送2000倍稀释的山羊抗牛IgG二抗，25℃孵育2h，然后泵送PBST清洗3次，再次泵出清洗液。
将微流控芯片从自动检测仪中取出，在加样孔加入H2O2活化的OPD，37℃孵育，15min后，放入自动检测仪中，泵入2mol/L的H2SO4终止反应。
用阴性血清作为替换待测样本按上述步骤进行相同试验。
实施例3
实施例3与实施例2的区别仅在于，一抗：牛流行性腹泻+传染性鼻炎二联灭活疫苗免疫后28天的牛的血清，阴性血清为该牛免疫前点刺法采血后制得的阴性血清。
实施例4
实施例4与实施例2的区别仅在于，一抗：用自制的牛布氏杆菌灭活苗进行免疫，免疫后28天，点刺法采血，制备待测血清样本500μl；阴性血清为该牛免疫前点刺法采血后制得的阴性血清。
实施例5
实施例5与实施例2的区别仅在于，一抗：口蹄疫O型+亚洲Ⅰ型+A型病毒三价灭活疫苗免疫后28天的牛血清，阴性血清为该牛免疫前点刺法采血后制得的阴性血清。
实施例6
实施例6与实施例2的区别仅在于，一抗：用自制的牛结核分枝杆菌灭活苗进行免疫，免疫后28天，点刺法采血，制备待测血清样本500μl；阴性血清为该牛免疫前点刺法采血后制得的阴性血清。
对比例1
对比例1与实施例2的区别仅在于微流控芯片不同，微流控芯片：刻蚀法制备具有经管状空腔串联的正方形凹陷的未经处理的微流控芯片2个，每个均设计6个加样孔，按实施例1的抗原包被方法进行抗原包被，制得微流控芯片。
对比例2
对比例1与实施例2的区别仅在于微流控芯片不同，微流控芯片：刻蚀法制备具有经管状空腔串联的扇形凹陷的未经处理的微流控芯片2个，每个均设计6个加样孔，不进行多巴胺处理和戊二醛处理，直接按实施例1的抗原包被方法进行抗原包被，制得微流控芯片。
对比例3-6
对比例3-6采用的微流控芯片与实施例2采用的微流控芯片不同，区别在于，微流控芯片未经多巴胺处理和戊二醛处理。
对比例3用实施例3的待测血清和阴性血清进行检测，检测方法与实施例3相同。
对比例4用实施例4的待测血清和阴性血清进行检测，检测方法与实施例4相同。
对比例5用实施例5的待测血清和阴性血清进行检测，检测方法与实施例5相同。
对比例6用实施例6的待测血清和阴性血清进行检测，检测方法与实施例6相同。
试验例
将实施例2-6和对比例1-6的微流控芯片放入酶标仪进行数据读取，检测结果见下表1。
表1实施例2-6与对比例1-6的待测血清检测结果
由上表1的检测结果可见，实施例2-6的待测血清样品，在稀释2500倍以后，应用本发明的微流控芯片进行抗体检测，其检测结果依然显示阳性。由此可见，本发明的微流控芯片具有较高的灵敏性和准确性。
由实施例2和对比例1的检测结果对比可见，对比例1在同样的血清稀释倍数下，并未检测到牛流行性腹泻抗体，由此可见，应用扇形凹陷相比应用正方形凹陷提高了微流控芯片的检测灵敏度和准确度。
由实施例2和对比例2的检测结果对比可见，对比例2在同样的血清稀释倍数下，并未检测到牛口蹄疫A型抗体，由此可见，应用多巴胺处理和戊二醛处理，有助于提高微流控芯片的检测灵敏度和准确度。
由实施例3和对比例3的检测结果对比可见，对比例3并未检测到牛传染性鼻炎抗体，由此可见，经多巴胺处理和戊二醛处理，能够提高微流控芯片检测的灵敏度和准确度。
由实施例4和对比例4的检测结果对比可见，对比例4并未检测到牛病毒性腹泻病毒抗体，由此可见，多巴胺处理和戊二醛处理能够提高微流控芯片检测的灵敏度和准确度。
由实施例5和对比例5的检测结果对比可见，对比例5并未检测到牛口蹄疫亚洲Ⅰ型抗体，由此可见，多巴胺处理和戊二醛处理，能够提高微流控芯片检测的灵敏度和准确度。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以做出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种微流控芯片免疫诊断试剂盒，其特征在于，所述微流控芯片免疫诊断试剂盒包括微流控芯片基板和抗原，所述微流控芯片基板具有经管状空腔串联的扇形凹陷，所述扇形凹陷经多巴胺处理和戊二醛处理；所述扇形凹陷的数目≥4；所述抗原包被在所述微流控芯片基板的部分扇形凹陷表面。
2.按照权利要求1所述的微流控芯片免疫诊断试剂盒，其特征在于，所述扇形凹陷数目为5-50个，所述扇形凹陷包括未经抗原包被的扇形凹陷和经抗原包被的扇形凹陷，所述经抗原包被的扇形凹陷中，每个扇形凹陷中仅包被1种抗原；
优选地，所述微流控芯片基板上还设有加样孔，所述加样孔与所述扇形凹陷经管状空腔连通，所述加样孔的容积是所述扇形凹陷容积的5-40倍，所述加样孔的数目为3-20个。
3.按照权利要求1或2所述的微流控芯片免疫诊断试剂盒，其特征在于，所述微流控芯片免疫诊断试剂盒还包括连有标签的二抗，所述标签包括催化底物产生显色反应的酶或颜色标签。
4.按照权利要求1或2所述的微流控芯片免疫诊断试剂盒，其特征在于，所述微流控芯片免疫诊断试剂盒还包括包被液、稀释液、清洗液、缓冲液、封闭液、显色液或终止液中的一种或几种。
5.按照权利要求1或2所述的微流控芯片免疫诊断试剂盒，其特征在于，所述抗原包括牛口蹄疫A型病毒、牛口蹄疫O型病毒、牛口蹄疫亚洲Ⅰ型病毒、牛传染性鼻炎菌、牛病毒性腹泻病毒、布氏杆菌或牛型结核分枝杆菌中的一种或几种。
6.一种微流控芯片免疫诊断试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将依次经多巴胺处理和戊二醛处理的具有经管状空腔串联的扇形凹陷的微流控芯片本体进行抗原包被，得到微流控芯片。
7.按照权利要求6所述的微流控芯片免疫诊断试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将经多巴胺处理的具有经管状空腔串联的扇形凹陷的微流控芯片本体进行戊二醛处理，得到微流控芯片基板，然后包被抗原，得到微流控芯片。
8.按照权利要求7所述的微流控芯片免疫诊断试剂盒的制备方法，其特征在于，所述戊二醛处理包括如下步骤：将多巴胺处理过的具有经管状空腔串联的扇形凹陷的微流控芯片本体放入体积分数为8-20％的戊二醛的无水乙醇溶液，温度为10-30℃条件下，保温60-120min，然后清洗2-3次并干燥，得到微流控芯片基板。
9.按照权利要求8所述的微流控芯片免疫诊断试剂盒的制备方法，其特征在于，所述多巴胺处理包括如下步骤：用12-15mM的Tris-HCl多巴胺溶液浸泡微流控芯片本体，浸泡时间为8-10h，浸泡过程中向盐酸多巴胺溶液中通入空气，浸泡后清洗1-3次并干燥。
10.按照权利要求6-9任一项所述的微流控芯片免疫诊断试剂盒的制备方法，其特征在于，所述包被抗原包括如下步骤：
将抗原溶液分别加入所述扇形凹陷中，15-30℃保温30-120min，然后清洗1-3次，再用封闭液封闭5-12h，重复清洗2-4次，在温度为10-30℃下干燥。
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