CN109647555A - 微流控芯片纳米信号增强结构加工方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种微流控芯片纳米信号增强结构加工方法，包括：步骤一：利用倾斜角沉积的方法在固相载体玻璃片上制备集成金属纳米结构，所述金属纳米结构为金纳米结构或银纳米结构；步骤二：在集成有金属纳米结构的玻璃片表面加入DSP溶液，在室温下反应，得到金属纳米结构表面键合有DSP的集成金属纳米结构玻璃载体。本发明提供的微流控芯片纳米信号增强结构加工方法，加工工艺简单，通过在固相载体的指定区域蒸镀金属纳米结构，通过局部表面等离子体共振效应实现荧光增强，大大提高了蛋白质芯片的荧光检测灵敏度，对疾病的早期检测与诊断具有重要参考价值，可以很好地满足实际应用的需要。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种微流控芯片纳米信号增强结构加工方法。
背景技术
微流控芯片技术是把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析全过程的技术。由于它在生物、化学、医学等领域的巨大潜力，已经发展成为一个生物、化学、医学、流体、电子、材料、机械等学科交叉的崭新研究领域。蛋白质芯片是微流量为零的点阵列型杂交芯片，属于微流控芯片(micro-chip)的特殊类型。传统蛋白质芯片一般是对固相载体整体进行特殊的化学处理，再将已知的蛋白分子固定其上捕获能与之特异性结合的待测蛋白从而实现生物分子检测与分析，为抗原抗体检测和药物筛选等领域提供有力的技术支持。然而，传统蛋白质芯片固相载体蛋白质浓度较低时荧光检测信号很弱，蛋白质芯片的检测灵敏度太低，且加工工艺复杂。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种可避免出现上述技术缺陷的微流控芯片纳米信号增强结构加工方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供的技术方案如下：
一种微流控芯片纳米信号增强结构加工方法，包括：
步骤一：利用倾斜角沉积的方法在固相载体玻璃片上制备集成金属纳米结构，所述金属纳米结构为金纳米结构或银纳米结构；
步骤二：在集成有金属纳米结构的玻璃片表面加入DSP溶液。
进一步地，在所述步骤二中：在集成有金属纳米结构的玻璃片表面加入浓度为3～5mg/ml的DSP溶液，在室温下反应1.8～2.2h；清洗干净后，得到金属纳米结构表面键合有DSP的集成金属纳米结构玻璃载体。
进一步地，所述微流控芯片纳米信号增强结构加工方法还包括：
步骤三：在该玻璃载体上进行ELISA实验。
进一步地，所述步骤三包括：
步骤(1)在该玻璃载体表面加入18～22μg/ml的cTnI单克隆抗体溶液室温下反应1.8～2.2h，实现cTnI捕获；
步骤(2)清洗该玻璃载体后，再加入4～6％的牛血清蛋白溶液室温下反应0.8～1.2h；
步骤(3)清洗该玻璃载体后，再加入不同浓度的cTnI溶液室温下反应1.8～2.2h；
步骤(4)清洗该玻璃载体后，加入18～22μg/ml的cTnI多克隆抗体溶液室温下反应1.8～2.2h；
步骤(5)清洗该玻璃载体后，加入1.8～2.2μg/ml的荧光标记的兔抗山羊IgG溶液室温下反应0.8～1.2h；
步骤(6)清洗该玻璃载体后，在荧光显微镜下测得各浓度cTnI对应的荧光强度，得到荧光免疫曲线，并与未经过化学处理的干净玻璃片进行对比。
进一步地，在所述步骤(3)中，cTnI溶液的浓度取值范围为1pg/ml-1μg/ml。
进一步地，所述室温的温度范围是22℃～26℃。
进一步地，在所述步骤一中，在利用倾斜角沉积的方法蒸镀金属纳米结构时，在固相载体玻璃片表面固定一层金属模具来实现将金属纳米结构集成在载体指定区域。
进一步地，在所述步骤一中，制备得到的金属纳米结构为平均直径为50nm-150nm、厚度为200nm-300nm、间距为100nm-200nm的金属纳米阵列。
本发明提供的微流控芯片纳米信号增强结构加工方法，加工工艺简单，通过在固相载体的指定区域蒸镀金属纳米结构，通过局部表面等离子体共振效应实现荧光增强，大大提高了蛋白质芯片的荧光检测灵敏度，对疾病的早期检测与诊断具有重要参考价值，可以很好地满足实际应用的需要。
附图说明
图1为利用倾斜角沉积的方法在玻璃片上制备集成金纳米结构的流程示意图；
图2所示为不同厚度的银纳米结构SEM图对比图；
图3为银纳米结构的厚度与荧光增强的关系图；
图4为荧光入射方向与增强因素的关系图；
图5为波长与散射及反射的关系图；
图6为银纳米结构增强系数仿真图；
图7为距离与电场增强关系图；
图8为荧光不同入射方向示意图；
图9为使用集成有金纳米结构的芯片时，荧光素浓度与荧光增强系数关系图；
图10为集成有金纳米结构的芯片检测cTnI时cTnI浓度与荧光强度关系图；
图11为集成有金纳米结构的芯片检测DNA时DNA浓度与荧光强度关系图；
图12为集成有金纳米结构的芯片检测DNA时，50℃时DNA杂交与荧光强度关系图；
图13为金纳米结构SEM图侧视图；
图14为金纳米结构SEM图俯视图；
图15为本发明的微流控芯片检测蛋白质的效果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种微流控芯片纳米信号增强结构加工方法，包括：
步骤一：利用倾斜角沉积(oblique angle deposition，OAD)的方法在固相载体玻璃片上制备集成金属纳米结构，所述金属纳米结构为金纳米结构或银纳米结构。
OAD是一种物理气相沉积方法，其原理为通过阴影效应和吸附原子的扩散作用在基底上生长可控纳米阵列。在利用OAD方法蒸镀金纳米结构或银纳米结构时，在固相载体玻璃片表面固定一层金属模具(shadow mask)来实现将金纳米结构或银纳米结构集成在载体指定区域，如图1所示为制备集成金纳米结构的流程示意图。
对所述载体指定区域，固定PDMS模具与集成金纳米结构或银纳米结构的固相载体，用于在固相载体指定区域进行化学处理。
本发明中制备得到的金属纳米结构为平均直径为50nm-180nm、厚度为200nm-3000nm、间距为100nm-200nm的金属纳米阵列(金纳米阵列或银纳米阵列)，优选平均直径为50nm-150nm、厚度为200nm-300nm、间距为100nm-200nm的金属纳米阵列(金纳米阵列或银纳米阵列)，用于荧光增强，能达到极高的检测灵敏度。
步骤二：在集成有金属纳米结构(金纳米结构或银纳米结构)的玻璃片表面加入浓度为3～5mg/ml(优选4mg/ml)的DSP溶液，在室温下反应1.8～2.2h(优选2h)。
将溶解在二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)中的3,3'-二硫代二丙酸二氮-羟基丁二酰亚胺酯(3,3'-Dithiodipropionic acid di(N-hydroxysuccinimide ester)，DSP)在室温下与集成有金属纳米结构(金纳米结构或银纳米结构)的玻璃片表面反应2h。
清洗干净后，得到金属纳米结构(金纳米结构或银纳米结构)表面键合有DSP的集成金属纳米结构玻璃载体。
步骤三：在该玻璃载体上进行ELISA实验；具体包括以下步骤：
步骤(1)在该玻璃载体表面加入18～22μg/ml(优选20μg/ml)的心肌钙蛋白I(cTnI)单克隆抗体溶液室温下反应1.8～2.2h(优选2h)，实现cTnI捕获；
步骤(2)清洗该玻璃载体后，再加入4～6％(优选5％)的牛血清蛋白(BSA)溶液室温下反应0.8～1.2h(优选1h)；
步骤(3)清洗该玻璃载体后，再加入不同浓度(浓度取值范围为1pg/ml-1μg/ml)cTnI溶液室温下反应1.8～2.2h(优选2h)；
步骤(4)清洗该玻璃载体后，加入18～22μg/ml(优选20μg/ml)的cTnI多克隆抗体(山羊属)溶液室温下反应1.8～2.2h(优选2h)；
步骤(5)清洗该玻璃载体后，加入1.8～2.2μg/ml(优选2μg/ml)的荧光标记的兔抗山羊IgG溶液室温下反应0.8～1.2h(优选1h)；
步骤(6)清洗该玻璃载体后，在荧光显微镜下测得各浓度cTnI对应的荧光强度，得到荧光免疫曲线，并与未经过化学处理的干净玻璃片进行对比。
本实施例中提到的室温指的是22℃～26℃的温度范围。
对不同参数的银纳米结构芯片进行实验，测试其荧光增强效果，不同参数的银纳米结构芯片实验数据如下：
实验结果请参照图2～图8所示，其中，图2所示为不同厚度的银纳米结构SEM图对比图；图3为银纳米结构的厚度与荧光增强的关系图；图4为荧光入射方向与增强因素的关系图；图5为波长与散射及反射的关系图；图6为银纳米结构增强系数仿真图；图7为距离与电场增强关系图；图8为荧光不同入射方向示意图。
使用集成有金纳米结构的芯片进行实验，实验内容及结果参考图9～图15所示，图9为使用集成有金纳米结构的芯片时，荧光素浓度与荧光增强系数关系图；图10为集成有金纳米结构的芯片检测cTnI时cTnI浓度与荧光强度关系图；图11为集成有金纳米结构的芯片检测DNA时DNA浓度与荧光强度关系图；图12为集成有金纳米结构的芯片检测DNA时，50℃时DNA杂交与荧光强度关系图；图13为金纳米结构SEM图侧视图；图14为金纳米结构SEM图俯视图；图15为本发明的微流控芯片检测蛋白质的效果图。
本发明提供的微流控芯片纳米信号增强结构加工方法，加工工艺简单，通过在固相载体的指定区域蒸镀金属纳米结构(金纳米结构或银纳米结构)，通过局部表面等离子体共振效应实现荧光增强，大大提高了蛋白质芯片的荧光检测灵敏度，对疾病的早期检测与诊断具有重要参考价值，可以很好地满足实际应用的需要。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (8)
1.一种微流控芯片纳米信号增强结构加工方法，其特征在于，包括：
步骤一：利用倾斜角沉积的方法在固相载体玻璃片上制备集成金属纳米结构，所述金属纳米结构为金纳米结构或银纳米结构；
步骤二：在集成有金属纳米结构的玻璃片表面加入DSP溶液。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片信号增强结构加工方法，其特征在于，在所述步骤二中：在集成有金属纳米结构的玻璃片表面加入浓度为3～5mg/ml的DSP溶液，在室温下反应1.8～2.2h；清洗干净后，得到金属纳米结构表面键合有DSP的集成金属纳米结构玻璃载体。
3.根据权利要求1-2所述的微流控芯片信号增强结构加工方法，其特征在于，所述微流控芯片纳米信号增强结构加工方法还包括：
步骤三：在该玻璃载体上进行ELISA实验。
4.根据权利要求1-3所述的微流控芯片信号增强结构加工方法，其特征在于，所述步骤三包括：
步骤(1)在该玻璃载体表面加入18～22μg/ml的cTnI单克隆抗体溶液室温下反应1.8～2.2h，实现cTnI捕获；
步骤(2)清洗该玻璃载体后，再加入4～6％的牛血清蛋白溶液室温下反应0.8～1.2h；
步骤(3)清洗该玻璃载体后，再加入不同浓度的cTnI溶液室温下反应1.8～2.2h；
步骤(4)清洗该玻璃载体后，加入18～22μg/ml的cTnI多克隆抗体溶液室温下反应1.8～2.2h；
步骤(5)清洗该玻璃载体后，加入1.8～2.2μg/ml的荧光标记的兔抗山羊IgG溶液室温下反应0.8～1.2h；
步骤(6)清洗该玻璃载体后，在荧光显微镜下测得各浓度cTnI对应的荧光强度，得到荧光免疫曲线，并与未经过化学处理的干净玻璃片进行对比。
5.根据权利要求1-4所述的微流控芯片信号增强结构加工方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，cTnI溶液的浓度取值范围为1pg/ml-1μg/ml。
6.根据权利要求2或4所述的微流控芯片信号增强结构加工方法，其特征在于，所述室温的温度范围是22℃～26℃。
7.根据权利要求1所述的微流控芯片信号增强结构加工方法，其特征在于，在所述步骤一中，在利用倾斜角沉积的方法蒸镀金属纳米结构时，在固相载体玻璃片表面固定一层金属模具来实现将金属纳米结构集成在载体指定区域。
8.根据权利要求1所述的微流控芯片信号增强结构加工方法，其特征在于，在所述步骤一中，制备得到的金属纳米结构为平均直径为50nm-150nm、厚度为200nm-300nm、间距为100nm-200nm的金属纳米阵列。
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