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CN109633165B - 抗hspa4自身抗体作为乳腺癌诊断或预后评估标志物的应用 - Google Patents

抗hspa4自身抗体作为乳腺癌诊断或预后评估标志物的应用 Download PDF

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CN109633165B CN201811552785.8A CN201811552785A CN109633165B CN 109633165 B CN109633165 B CN 109633165B CN 201811552785 A CN201811552785 A CN 201811552785A CN 109633165 B CN109633165 B CN 109633165B
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Abstract

本发明公开提供了抗HSPA4自身抗体作为乳腺癌诊断或预后评估标志物的应用。具体而言，本发明公开涉及检测抗热休克蛋白(HSPA4)自身抗体的物质在制备用于乳腺癌诊断或预后评估的产品中的应用，抗热休克蛋白HSPA4自身抗体作为乳腺癌诊断或预后评估标志物的应用，以及相关的产品及其应用。本发明所涉及的技术在乳腺癌医学诊断领域具有良好的临床应用前景。

Description

抗HSPA4自身抗体作为乳腺癌诊断或预后评估标志物的应用
技术领域
本发明涉及生物技术和医学诊断领域，具体涉及血清抗热休克蛋白HSPA4自身抗体作为诊断标志物在制备乳腺癌诊断或患者预后评估试剂盒中的应用。
背景技术
随着人口增长、衰老及社会经济发展，恶性肿瘤正日益成为全球性的重大健康问题，对经济及社会发展、人民健康都造成极大影响。因此，肿瘤的预防与控制已成为全球卫生防控的重点。根据肿瘤学权威期刊《临床肿瘤杂志》(CA Cancer J Clin)发布的最新数据，2018年全球预计增加1810万癌症新病例，960万人因癌症死亡，而我国癌症患病率在国际中位于中等偏上水平(Siegel RL等,Cancer statistics,2018.CA Cancer JClin.2018；68(1):7-30.)。
以乳腺癌为例，其是女性中发病率最高的恶性肿瘤。近年来，全球女性乳腺癌的发病率和死亡率呈逐年上升的态势，并且占女性恶性肿瘤发病、死亡的比例也有所增加(Picon-Ruiz M等，Obesity and adverse breast cancer risk and outcome:Mechanistic insights and strategies for intervention.Ca Cancer J Clin,2017,67(5))。根据《临床肿瘤杂志》统计结果，乳腺癌是女性最常见的癌症类型(24.2％)，其还是女性癌症患者的头号杀手(15％)。2014年，全国女性乳腺癌新发病例约27.89万例，占女性恶性肿瘤发病的16.51％，位居女性恶性肿瘤发病的首位。而且，我国乳腺癌的疾病负担依然呈现逐年加重的趋势(李贺等，2014年中国女性乳腺癌发病与死亡分析.中华肿瘤杂志,2018,40(3))。
因此，对于肿瘤的早期诊断及预后判断对于癌症治疗方式的选择和治疗疗效具有重要的意义。
目前，肿瘤诊断主要是依靠影像学手段(CT、MRI等)和血清标志物检测。然而，对于许多类型的癌症而言，目前仍缺乏好的诊断指标和筛查技术。尽管医学影像技术的普及提高了早期检测肿瘤的能力，然而部分肿瘤患者确诊时已是晚期疾病。因此，发展基于血液的检测及预后判断的策略具有必要性。
自身抗体是指针对自身组织、器官、细胞及细胞成分的抗体，正常人体血液中可以有低滴度的自身抗体，一旦自身抗体结合靶抗原，引起组织器官的功能障碍，即诱发自身免疫性疾病等，这样的抗体也称为病理性抗体(Pagan J D等.Cell,2017；172(3):564-577)。肿瘤也因为特异性抗原和相关性抗原的存在，诱导抗体产生，这是机体抗肿瘤的重要机制，也是目前临床肿瘤血液学检测最重要的手段。
一方面，检测特定抗原的自身抗体可间接反应肿瘤相关抗原的存在。研究表明，肿瘤抗原产生的自身抗体是肿瘤早期诊断的较好指标，并亦可用于肿瘤的复发、疗效监控及用药伴随诊断等。目前已有较多肿瘤自身抗体的检测用于肿瘤的诊断，如用于肺癌诊断的NY-SEO-1、p53、LAMR1等自身抗体；用于肝癌诊断的p62、HCC1等自身抗体(Caron M等.MolCell Proteomics,2007,6(7):1115)。然而，目前已知的自身抗体检测的特异性和灵敏度不高。因此，寻找新的肿瘤自身抗体，检测其在肿瘤发生发展中的变化趋势，对于肿瘤的诊断及预后判断具有重要价值。
另一方面，肿瘤患者存在的自身抗体亦参与到肿瘤的发生发展过程中。临床研究表明，人乳腺、泌尿生殖道和头颈部癌症等肿瘤患者血清中存在高浓度的自身抗体，且与肿瘤分级、转移和低生存率密切。进一步研究表明，抗体能够激活髓系细胞上的FcRγ受体促进鳞状细胞癌的发生(Andreu P等Cancer Cell2010,17(2):121-134.)。最新研究进一步揭示了浆细胞和抗体在肿瘤免疫中的负向调控功能：人IgG4诱导的Th2型炎症反应可拮抗抗体介导的抗肿瘤免疫(Karagiannis P等.J Clin Invest.2013,123(4):1457-74.)；表达IgA的免疫抑制性浆细胞抑制T细胞依赖的肿瘤化疗反应(Shalapour S等.Nature 2015,521(7550):94-98.)。因此，对于肿瘤患者自身抗体及其靶抗原的寻找，不但有利于寻找疾病诊断的重要靶标，还有助于阐明疾病的发生发展机制，对肿瘤患者的预后进行及时预判，选择合适的肿瘤治疗方案。
利用自身抗体作为肿瘤诊断标志物具有如下优势：①极低的肿瘤抗原即可诱导自身抗体产生，因此自身抗体在肿瘤抗原表达很低的时候也能够被检测到，具有很好的灵敏度；②自身抗体能够在肿瘤患者出现临床症状之前检测到，因此可作为早期诊断肿瘤标志物；③自身抗体反应与肿瘤细胞的恶变进程密切相关，其亦可用于肿瘤进展和细胞恶性转化的评估；④自身抗体的稳定性好，存在于血清中的时间较长，便于长期存放及大规模筛查。因此，利用肿瘤诱导产生的自身抗体来反应患者肿瘤发生机疾病进展过程，正成为寻找用于肿瘤早期诊断及预后判断新靶标的重要方向。
然而，诱导自身抗体产生的靶抗原的寻找是其研究及应用的难点，因其直接决定了自身抗体的检测。自身抗体的产生，容易受到机体内外环境的影响，尤其是炎症因素，从而影响到检测的特异性和灵敏度。而且，人外周血中本身也存在着高水平的抗体。因此，寻找到肿瘤特异的靶抗原及其诱导产生的自身抗体，对于自身抗体应用于肿瘤的检测至关重要，也是该领域研究的重点和难点。
热休克蛋白(heat shock protein，HSP)是细胞在应激状态下表达的一组蛋白质，能够修复或降解受损的蛋白质，具有分子伴侣活性，协助蛋白质的正确折叠，保护细胞适应外界环境的刺激，参与到细胞的生长、代谢及信号转导等过程中。根据其相对分子大小，HSP可分为六个家族，即HSP27家族、HSP40家族、HSP60家族、HSP70家族、HSP90家族和其他HSP家族(HSP110和GRP170)(Chatterjee S等，Targeting Heat Shock Proteins in Cancer:APromising Therapeutic Approach.Int J Mol Sci.2017；18(9))。
研究发现HSP在多种肿瘤组织中高表达并发挥了重要功能，HSP能够通过促进肿瘤细胞增殖、侵袭以及抑制肿瘤细胞凋亡而促进肿瘤的发生发展。例如，HSP70参与多种肿瘤发生发展，与胆管癌、软骨肉瘤、黑色素瘤、结肠、膀胱等肿瘤的预后差密切相关(Court K A等.HSP70inhibition synergistically enhances the effects of magnetic fluidhyperthermia in ovarian cancer.Mol Cancer Ther.,2017,16(5).)。HSP90在多种肿瘤类型中高表达，其高表达与肺癌、食管癌、膀胱癌、黑色素瘤和白血病的预后不良有关，目前多种HSP90抑制剂应用于临床肿瘤研究中(Isaacs J S.Hsp90as a"Chaperone"of theEpigenome:Insights and Opportunities for Cancer Therapy.Adv Cancer Res.,2016,129:107-140.)。
然而，HSP作为肿瘤抗原诱导自身抗体产生参与肿瘤发生发展过程尚未见报道。目前，国内外尚无有关抗HSPA4自身抗体用于肿瘤诊断以及患者预后评估的的研究报道。
而本领域迫切需要寻找到可有效用于肿瘤诊断、肿瘤治疗方案选择、肿瘤预后评估的指标，并将其用于这些用途中。
发明内容
本申请的目的之一在于寻找到可有效用于乳腺癌诊断以及患者预后评估的自身抗体及其应用。
在本文的第一方面中，提供了用于检测抗HSPA4自身抗体水平的物质在制备用于对象乳腺癌诊断或预后评估的产品中的应用。
在本申请的一些实施方式中，所述检测针对罹患或疑似罹患乳腺癌或具有患乳腺癌风险或曾罹患乳腺癌但已治愈的哺乳动物或获自所述哺乳动物的样品进行。
在一些实施方式中，所述哺乳动物选自：灵长类动物、啮齿类动物、畜牧类哺乳动物、哺乳动物宠物等，例如人、猿、猩猩、猴、牛、羊、马、骆驼、猪、狗、猫、兔、鼠等。
在一些实施方式中，所述哺乳动物已采用本领域已知的方式鉴定为罹患乳腺癌或已治愈乳腺癌。
在本申请的一些实施方式中，所述样品选自获自所述哺乳动物的：血液样品，例如血浆、血清、全血；组织或细胞样品，如乳腺组织或细胞样品、癌组织或细胞样品、癌旁组织或细胞样品。
在一些实施方式中，所述样品是新鲜样品、冻存样品、固定样品(例如福尔马林固定样品)、包埋样品(例如石蜡包埋样品)。
在本申请的一些实施方式中，所述乳腺癌选自如下分型：浸润性导管癌、非侵润性导管癌；或者，管腔A型、管腔B型、管腔-HER2型、HER2过表达型、基底细胞样型、TNP-非基底型；或者，激素受体阳性型、HER2/neu受体阳性型、三阴性型。
在本申请的一些实施方式中，所述用于检测抗HSPA4自身抗体水平的物质是用于在基因水平和/或蛋白质水平上检测抗HSPA4自身抗体的物质；例如，所述物质是用于选自下组的一种或多种检测技术或方法中的物质：免疫组织化学法(如免疫荧光分析、反向酶联免疫吸附、免疫胶体金法)、Western印迹法、Northern印迹法、PCR、生物芯片法。
在本申请的一些实施方式中，所述物质选自：对抗HSPA4自身抗体具有特异性的物质，例如其抗抗体(优选单克隆抗体)；HSPA4抗原或其具有与抗HSPA4自身抗体结合特异性的片段或类似物，例如抗原表位、包含其抗原表位的片段或其类似物；抗HSPA4自身抗体特异性的探针、基因芯片、PCR引物、gRNA等。
在一些实施方式中，所述物质带有可检测标记物，例如，所述选自下组的可检测标记物：放射性同位素、荧光团、化学发光部分、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、胶体发色标记、染料、金属离子、或配体(如，生物素或半抗原)。
在一些实施方式中，所述物质经固定化，例如固定于固相基质上。
在一些实施方式中，所述固相基质为平面或曲面固相基质。
在一些实施方式中，所述的固相基质包括微孔板、微球体和多孔膜构成的基质。
在本申请的一些实施方式中，与正常对照值相比，所述对象或获自所述对象的样品中抗HSPA4自身抗体水平提高，表明所述对象易于或已发生癌症转移，或表明所述对象的癌症预后不良，或表明所述对象已患有癌症。
在一些实施方式中，抗HSPA4自身抗体的水平用于评估患者的无病生存时间和/或总体生存时间。
在一些实施方式中，抗HSPA4自身抗体的水平高于对照则指示对象的无病生存时间和/或总体生存时间缩短。例如，抗HSPA4自身抗体的水平高于对照时，指示对象的无病生存时间可为少于40个月，例如少于24个月，少于12个月，少于9.8个月，总体生存时间可为少于40个月，例如少于24个月，少于12个月，少于9.8个月。
在一些实施方式中，抗HSPA4自身抗体的水平低于对照则指示对象的无病生存时间和/或总体生存时间长。例如，抗HSPA4自身抗体的水平低于对照时，指示对象的无病生存时间可为至少40个月，例如至少50个月，至少60个月，总体生存时间可为至少40个月，例如至少50个月，至少60个月。
在一些实施方式中，所述正常对照值获自未罹患乳腺癌对象的样品、获自所述对象正常组织的样品、正常对象的抗HSPA4自身抗体水平。
在一些实施方式中，所述正常对照值为：由非乳腺癌的正常生物样品(如获自健康人或待测对象正常组织的样品)中测得的抗HSPA4自身抗体水平、通过统计学确定的群体标准水平、或经标准化的水平。
在本申请的一些实施方式中，所述产品为检测试剂盒。
在一些实施方式中，所述检测试剂盒还包含选自下组的一种或多种物质：容器、缓冲剂、助剂、溶剂、阴性对照物、阳性对照物、使用说明书。
在一个实施方式中，所述的检测试剂盒是基于反向酶联免疫吸附测定法检测生物样品中抗HSPA4自身抗体的试剂盒。
在本申请的另一个方面中，还提供了用于在对象中预测乳腺癌转移、对乳腺癌预后评估或诊断乳腺癌的方法，所述方法包括：检测对象或获自对象的样品中抗HSPA4自身抗体的水平的步骤。
在一些实施方式中，与正常对照相比，所述对象或获自所述对象的样品中抗HSPA4自身抗体水平提高，表明所述对象易于或已发生乳腺癌转移，或表明所述对象的乳腺癌患者预后不良，或表明所述对象已患有癌症。
在一些实施方式中，本申请方法所涉及的各特征如前述应用中所限定或阐述。
在本申请的另一方面中，还提供了一种用于乳腺癌诊断或预后评估的产品(例如试剂盒)，其包含：用于检测抗HSPA4自身抗体水平的物质；以及可任选的用于乳腺癌诊断或预后评估的其他物质，例如现有乳腺癌标志物的检测物质，如针对血清学CA15-3、CEA检测、病理免疫组织化学检测(如Ki-67、ER、PR、CerbB2)的检测物质。在一些实施方式中，本申请产品所涉及的各特征可如前文中所限定或阐述。
在本申请的另一方面中，还提供了筛选治疗乳腺癌、缓解或防止乳腺癌转移和/或改善乳腺癌预后的候选药物的方法，所述方法包括检测所述候选药物对对象或获自对象的样品中抗HSPA4自身抗体水平的影响，其中，在使用所述候选药物后，抗HSPA4自身抗体水平降低则表明所述候选药物具有治疗乳腺癌、缓解或防止乳腺癌转移和/或改善乳腺癌预后的效果。
在本申请的一些实施方式中，对抗HSPA4自身抗体水平的检测采用如本文所述的产品进行。
在一些实施方式中，所述降低相对于获自未罹患乳腺癌对象的样品、获自所述对象正常组织的样品、正常对象的抗HSPA4自身抗体水平。在一些实施方式中，所述降低相对于正常对照值而言，所述正常对照值为：由非乳腺癌的正常生物样品(如获自健康人或待测对象正常组织的样品)中测得的抗HSPA4自身抗体分子水平、通过统计学确定的群体标准水平、或经标准化的水平。
在一些实施方式中，本申请候选药物筛选方法所涉及的各特征如前述应用中所限定或阐述。
本领域的技术人员可对前述的技术方案和技术特征进行任意组合而不脱离本发明的发明构思和保护范围。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步说明，其中这些显示仅为了图示说明本发明的实施方案，而不是为了局限本发明的范围。
图1：乳腺癌荷瘤小鼠血清自身抗体的特异性结合配偶体的筛选：
A：正常及肿瘤小鼠血清中抗体(IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3)的量，P值使用SPSS17.0中的Unpaired Student’s t-tests计算；
B：免疫印迹(Western blot)检测血清抗体与HSPA4的结合(蛋白NCL和ITGB3为对照)。
图2：SDS-PAGE分析洗脱液中人目标蛋白(HSPA4)的表达：
Marker：分子量标记；泳道1：缓冲液对照；泳道2：洗脱液1；泳道3：洗脱液2。
图3：血清抗热休克蛋白HSPA4自身抗体水平与患者无病生存时间及总体生存时间的相关性：
A：血清抗热休克蛋白HSPA4自身抗体水平与患者无病生存时间的Kaplan-Meier生存曲线；
B：血清抗热休克蛋白HSPA4自身抗体水平与患者总体生存时间的Kaplan-Meier生存曲线。
图4：血清抗热休克蛋白HSPA4自身抗体水平与患者淋巴结转移的相关性：
正常血清(来自正常人献血，n＝60)；淋巴结阴性(LN-，n＝52)；淋巴结阳性(LN+，n＝56)。P值使用SPSS 17.0中的unpaired two-tailed Student’s t-tests计算。
具体实施方式
本文涉及抗热休克蛋白HSPA4自身抗体作为乳腺癌预后、诊断、药物筛选等分子标记物的应用，以及相关产品及其用途。
具体而言，本发明人应用蛋白质组学技术，鉴定出乳腺癌患者样品中存在的抗HSPA4自身抗体。通过纯化HSPA4蛋白，采用反向酶联免疫吸附测定分析，检测血清中的抗HSPA4自身抗体的表达水平，结果显示乳腺癌患者血清中抗HSPA4自身抗体水平显著高于正常人，并与乳腺癌患者淋巴结转移相关，其高表达与患者的总生存时间短、预后差显著相关，可以作为独立的预后判断因素。本文基于此提供了以抗热休克蛋白HSPA4自身抗体水平为乳腺癌诊断、预后评估、药物筛选的分子标记物，并提供了相应的产品，具有一定的临床和制药应用前景。
本文中提供的所有数值范围旨在清楚地包括落在范围端点之间的所有数值及它们之间的数值范围。可对本发明提到的特征或实施例提到的特征进行组合。本说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
抗HSPA4自身抗体及其检测物质
如本文所用，术语“抗HSPA4自身抗体”与“抗HSPA4自身抗体基因编码的蛋白质或多肽”可互换使用，均是指由抗HSPA4自身抗体基因编码的蛋白质或多肽、它们的保守性变异多肽、或其同源蛋白或多肽、或其活性片段。
如本文所用，涉及抗HSPA4自身抗体的术语“检测物质”、“检测试剂”或“检测抗HSPA4自身抗体分子的试剂”或“检测抗HSPA4自身抗体表达量的试剂”可互换使用，均是指特异性针对抗HSPA4自身抗体分子，且可用于直接或间接检测出抗HSPA4自身抗体分子的存在和/或含量的物质。这些检测物质可在基因水平或蛋白质水平上检测抗HSPA4自身抗体。
抗HSPA4自身抗体的检测物质可包括但不限于：对抗HSPA4自身抗体具有特异性的物质，例如其抗抗体(优选单克隆抗体)；HSPA4抗原或其具有与抗HSPA4自身抗体结合特异性的片段或类似物，例如抗原表位、包含其抗原表位的片段或其类似物；抗HSPA4自身抗体特异性的探针、基因芯片、PCR引物、gRNA等。
如本文所用，术语“自身抗体特异性结合配偶体”是指能特异性结合抗HSPA4抗体的配偶物，例如HSPA4(包括其全长序列)或其具有与抗HSPA4自身抗体结合特异性的片段或类似物，例如抗原表位、包含其抗原表位的片段或其类似物。
本申请所用的针对HSPA4自身抗体的特异性结合配偶体可以采用本领域技术人员所知晓的基因工程方法合成。例如，采用基因工程的方法进行合成，可以依据需要选择原核表达系统或者真核表达系统，原核表达系统主要以大肠杆菌表达系统为代表，真核表达系统则以酵母、昆虫细胞、哺乳动物表达系统为代表。
如本文所用，术语“HSPA4抗原”、“HSPA4蛋白或多肽”与“HSPA4基因编码的蛋白质或多肽”可互换使用，均是指由HSPA4基因编码的蛋白质或多肽、它们的保守性变异多肽、或其同源蛋白或多肽、或其活性片段。HSPA4蛋白在本领域中是已知热休克蛋白家族成员，例如人HSPA4的序列可如Gene ID:3308所示；小鼠HSPA4序列可如Gene ID:15525所示。由于抗原HSPA4的序列在本领域中是已知的，本领域普通技术人员可基于常规手段制备或通过市售获得特异性针对HSPA4的自身抗体。
并且，为了便于检测，本发明的检测试剂还可带有可检测标记，所述可检测标记包括但不限于：放射性同位素、荧光团、化学发光部分、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、染料、胶体发色标记、金属离子、配体(如，生物素或半抗原)等。例如，通过医学设备检测可获得可检测物质相应的定量光信号、电信号或放射信号的化学基团，因获得的定量信号同自身抗体的存在/含量存在函数关系，从而表征出样品中自身抗体的存在/含量。酶标记可采用辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶等及其底物溶液，检测仪器采用可见光酶标仪等。荧光标记可采用本领域人员所知晓的各类荧光染料或时间分辨荧光染料，如FITC、PE、Cy3、Cy5、稀土金属等。胶体发色标记可采用胶体金标记，结果可肉眼观察。
本文所述的检测试剂可存在于溶液中、固定于载体(如基片、吸附物)上或以其它本领域中常规的方式存在，只要该存在方式适于对生物样品中抗HSPA4自身抗体检测即可。例如，当本文所述的检测试剂为核苷酸探针时，其可以生物芯片(或称“微阵列”)的形式存在。
在本文的一个实施方式中，提供了一种检测血清/血浆中抗HSPA4自身抗体的试剂盒，其主要构成为固相基质，上述自身抗体的特异性结合配偶体，第二种特异性结合配偶体和可检测基团；其中，固相基质与特异性结合配偶体结合，第二种特异性结合配偶体与可检测基团结合。
在一些实施方式中，本文所述的检测试剂可经固定化，例如固定于固相基质上。适用于本文的固相基质可为平面或曲面固相基质，包括但不限于：微孔板、微球体和多孔膜构成的基质。本发明所述的固相基质为平面或曲面固相基质。常见的固相基质是微孔板的聚苯乙烯底面，硝酸纤维素、尼龙膜，PVDF膜的表面，玻璃基质的表面，及各种有机聚合物或无机微球的表面等，可作为试剂盒的固相基质。特异性结合配偶体与固相基质的结合可通过物理吸附、静电吸附或共价结合等多种结合形式，此类结合/缀合方法是本领域技术人员所知晓的应用方法。
乳腺癌诊断和/或预后评估产品
在本文中提供了一种用于乳腺癌诊断和/或预后评估的产品(例如试剂盒)，其包含：用于检测抗HSPA4自身抗体水平的物质(例如，如尚未所述)；以及可任选的用于乳腺癌诊断或预后评估的其他物质，例如现有乳腺癌标志物的检测物质，如针对血清学CA15-3、CEA检测、病理免疫组织化学检测(如Ki-67、ER、PR、CerbB2)的检测物质。
根据所用检测方法的需要，可选择适当的抗HSPA4自身抗体检测物质，并将其制成适于所用检测方法的试剂盒。本领域普通技术人员可根据实际条件和需要对检测方式和试剂盒中所含试剂进行调整和改变。
由此，本文中还提供了一种检测试剂盒，其包含：(i)检测有效量的用于检测抗HSPA4自身抗体的一种或多种试剂；(ii)可任选地，选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂，例如用于混悬或固定细胞的溶液，可检测的标签或标记，使核酸易于杂交的溶液，用于裂解细胞的溶液，或用于核酸纯化的溶液。
在一个示例中，本文提供了一种适于通过反向酶联免疫吸附测定法检测生物样品中抗HSPA4自身抗体的表达的检测试剂盒。该检测试剂盒可包含：包被缓冲液；自身抗体特异性结合配偶体，例如或其具有与抗HSPA4自身抗体结合特异性的片段或类似物，例如抗原表位、包含其抗原表位的片段或其类似物；封闭液；二抗，例如抗人IgG-HRP标记二抗；底物缓冲液，例如DAB底物缓冲液；显色液；以及可选的装有上述试剂的容器及使用说明书。
本文的检测试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，以及如何利用检测结果对乳腺癌转移及预后情况进行判断、对治疗方案进行选择。
当然，试剂盒还可包含临床上用于对象中乳腺癌发展的判断、治疗方案的选择和/或预后评估的其它试剂，以辅助或验证通过检测抗HSPA4自身抗体所得到的结果。本领域普通技术人员可根据具体需要进行常规选择。
抗HSPA4自身抗体在乳腺癌转移预测、预后评估、诊断以及药物筛选中的应用和相 应检测评估方法
根据本申请中所公开的内容，抗HSPA4自身抗体的水平与乳腺癌的转移、预后和诊断密切相关，从而可作为乳腺癌转移预测、预后评估以及诊断的指标。
如本文所用，术语“预后”是指预测疾病的可能病程和结局，其包括判断疾病的特定后果(如康复，某种症状、体征和并发症等其它异常的出现或消失及死亡)。本文中所述的预后不良包括但不限于：生存期缩短、易发乳腺癌转移、乳腺癌数量增加快、乳腺癌变大加快、TNM分级上升等。在预测了患者预后情况后，可结合降低抗HSPA4自身抗体分子的量的治疗方法改善患者的预后。
在本公开的一些方面中，抗HSPA4自身抗体的水平被用于评估患者的无病生存时间和/或总体生存时间。
在一些实施方式中，抗HSPA4自身抗体的水平高于对照则指示对象的无病生存时间和/或总体生存时间缩短。例如，抗HSPA4自身抗体的水平高于对照时，指示对象的无病生存时间可为少于40个月，例如少于24个月，少于12个月，少于9.8个月，总体生存时间可为少于40个月，例如少于24个月，少于12个月，少于9.8个月。
在一些实施方式中，抗HSPA4自身抗体的水平低于对照则指示对象的无病生存时间和/或总体生存时间长。例如，抗HSPA4自身抗体的水平低于对照时，指示对象的无病生存时间可为至少40个月，例如至少50个月，至少60个月，总体生存时间可为至少40个月，例如至少50个月，至少60个月。
在一些实施方式中，抗HSPA4自身抗体的水平高于对照则指示对象的无病生存时间和/或总体生存时间缩短的风险提高。例如，与抗HSPA4自身抗体的水平低于对照的对象相比，抗HSPA4自身抗体的水平高于对照的对象的无病生存时间和/或总体生存时间缩短。例如，与抗HSPA4自身抗体的水平低于对照的对象群体相比，抗HSPA4自身抗体的水平高于对照的对象群体的无病生存时间和/或总体生存时间缩短的比例提高。
通常，可采用如下方法进行乳腺癌转移预测、预后评估和/或诊断：检测待测对象或获自该对象的样品中抗HSPA4自身抗体分子的水平，并将该水平与对照水平相比较；若比较结果显示对象中的抗HSPA4自身抗体分子的水平高于对照水平，则提示所述对象易发生乳腺癌转移、预后不良、或已罹患乳腺癌。在一些实施方式中，本申请的方法还可选地包括：从对象获得待测样品；使待测样品与检测抗HSPA4自身抗体水平的试剂或试剂盒接触。
如本文所用，术语“正常对照”是指用作参照的抗HSPA4自身抗体分子的水平，其包括但不限于：由同一对象的非乳腺癌正常生物样品(例如获自该对象非乳腺癌癌旁组织或正常组织的样品)中测得的抗HSPA4自身抗体分子水平、通过统计学确定的群体标准水平、或经标准化的水平。
本申请的检测试剂盒，可(例如)通过以下步骤可用于肿瘤诊断以及患者预后评估：(a)从对象获得待测样品；(b)使待测样品与本发明检测试剂盒中的检测试剂接触；(c)检测该待测样品中抗HSPA4自身抗体的水平，并将该水平与对照水平相比较；(d)根据检测结果进行肿瘤诊断以及患者预后评估：如检测结果显示对象组织中的抗HSPA4自身抗体的水平高于正常对照水平，则提示所述对象患有乳腺癌可能或肿瘤转移或患者预后不良。
此外，本文还提供了一种筛选治疗乳腺癌、缓解或防止乳腺癌转移和/或改善乳腺癌预后的候选药物的方法，所述方法包括测试所述候选药物对对象或获自对象的样品中热休克蛋白抗HSPA4自身抗体水平的影响，其中，在使用所述候选药物后，热休克蛋白抗HSPA4自身抗体水平降低表明所述候选药物具有治疗乳腺癌、缓解或防止乳腺癌转移和/或改善乳腺癌预后的效果。本申请候选药物筛选方法所涉及的各特征可如本文中所限定或阐述。
本申请的产品，可通过(例如)以下步骤可用于筛选或评估治疗乳腺癌、缓解或防止乳腺癌转移和/或改善乳腺癌预后的候选药物：
(a)对对象施用所述候选药物；
(b)检测所述候选药物对对象或获自对象的样品中抗HSPA4自身抗体水平的影响；
(c)根据检测结果判断所述候选药物是否具有治疗乳腺癌、缓解或防止乳腺癌转移和/或改善乳腺癌预后的效果，
其中，在使用所述候选药物后，热休克蛋白抗HSPA4自身抗体水平降低表明所述候选药物具有治疗乳腺癌、缓解或防止乳腺癌转移和/或改善乳腺癌预后的效果。
此外，本申请通过检测抗HSPA4自身抗体水平在对对象乳腺癌诊断和/或预后评估中具有高灵敏度、高准确性的特点，甚至优于现有的常规乳腺癌诊断和预后评估手段。并且，本申请的产品和方法也可与现有的常规乳腺癌诊断和预后评估手段联合使用，从而更灵敏、更准确地对乳腺癌进行诊断和/或预后评估。这种联合使用可产生一定的叠加甚至加合效果。现有的常规乳腺癌诊断和预后评估手段包括但不限于：血清学CA15-3及CEA检测、影像学诊断(如钼靶等)、超声诊断、细胞学诊断、病理免疫组织化学检测(如Ki-67、ER、PR、CerbB2等)。
实施例
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可采用本领域中的常规方法，例如参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)或按照供应商所建议的条件。DNA的测序方法为本领域常规的方法，也可由商业公司提供测试。
除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1：采用蛋白质谱技术筛选乳腺癌荷瘤小鼠血清自身抗体的特异性结合配偶体
小鼠乳腺癌细胞系4T1购自美国ATCC(DMEM培养基+10％胎牛血清)。Balb/c小鼠购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，在SPF级环境中饲养。
小鼠乳腺癌模型的建立：在小鼠(雌性，8周龄)右下腹部乳腺脂肪垫下注射5×105个/只乳腺癌细胞系4T1细胞，酶联免疫法(ELISA)法检测小鼠血清中抗体水平，观察小鼠淋巴结转移及肿瘤生长情况。
小鼠血清抗体的提纯：采用抗体纯化试剂盒(Melon Gel IgG Spin PurificationKit，美国Pierce公司)从小鼠血清中纯化抗体。具体操作按照说明书进行。
免疫共沉淀后蛋白质谱检测特异性结合配偶体：收集肿瘤细胞4T1，加入细胞裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂)，裂解后取上清。加入纯化的血清抗体到细胞裂解液中，4℃缓慢摇晃孵育过夜。将预处理过的protein A琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中，4℃缓慢摇晃孵育2-4h。
免疫沉淀反应后，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，用裂解缓冲液清洗琼脂糖珠3-4次；最后加入SDS上样缓冲液。将样本送至北京华大蛋白质研发中心有限公司做蛋白质谱检测，筛选特异性结合配偶体。
结果显示：乳腺癌荷瘤小鼠血清中抗体量显著高于正常小鼠(图1A)。对血清抗体结合的特异性结合配偶体进行蛋白质谱检测，我们筛选到肿瘤抗原HSPA4。我们进一步利用免疫印迹(western blot)方法验证了血清抗体与HSPA4的结合(图1B)。
以上结果提示，荷瘤小鼠血清中存在靶向肿瘤抗原HSPA4的抗体，提示该抗体可以作为肿瘤检测的潜在靶标。我们进一步在临床样本中对这一发现进行验证。
实施例2：人特异性结合配偶体(HSPA4)的表达和制备
采用本领域技术人员所知晓的基因工程方法合成筛选出的上述自身抗体的特异性结合配偶体(HSPA4)。因肿瘤抗原具有不同修饰，故HSPA4的表达系统选择常用人乳腺癌细胞系MBA-MD-231(购自美国ATCC)，以获得具有免疫原性的抗原蛋白。
1.克隆质粒构建：采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法，设计全长拼接引物(人HSPA4的序列如Gene ID:3308所示)，连入表达载体pcDNA3.1；获得的重组质粒转入克隆菌株，抗性平板挑选阳性克隆。对阳性克隆进行质粒小抽，经双酶切及测序验证无误；提取阳性克隆质粒，浓缩待用。
2.转染人乳腺癌细胞系MBA-MD-231：MBA-MD-231细胞培养后铺板，密度至40％～60％转染。利用jetPRIME(购自法国Polyplus公司)制备含上述质粒的转染液，缓缓加入培养液中，摇匀，37℃温箱置6小时，换入正常培养液继续培养。48小时细胞长满后，提取细胞蛋白。
3.目标蛋白的蛋白柱亲和纯化：上清溶液上样至Ni-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱。用清洗液冲洗。用Elution-Buffer洗脱目的蛋白，收集流出液。上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用20mMTris-HCl，0.15M NaCl，pH8.0进行透析过夜。
4.进行12％SDS-PAGE检测分析，考马斯亮蓝染色显带。
结果显示，经12％SDS-PAGE分析，在目标条带处(约110kDa)有单一清晰条带，证实目标蛋白(HSPA4)主要存在于洗脱液中(图2)。
实施例3：特异性结合配偶体与固相基质的结合包被
微孔板的包被：用包被缓冲液(0.05mol/L碳酸缓冲液，pH9.6)稀释特异性结合配偶体，分装至96孔酶标板，4℃过夜。去除包被液，用PBS清洗2次。加入封闭液(5％脱脂奶粉-PBS)，室温2-4小时。甩去封闭液，PBS清洗。
实施例4：酶标记法检测靶向抗原HSPA4的血清自身抗体
取患者血清或稀释血清100μL，加入已包被好特异性结合配偶体的96孔板中，室温孵育2小时。PBST清洗3次。采用抗人IgG-HRP标记二抗(购自北京中杉金桥生物技术有限公司，货号ZDR-5301)，用PBST 1:1000稀释后，按每孔100μL加入96孔板，室温孵育1小时后，用PBST清洗3次。加入TMB显色液100μL，反应20分钟后加入2M H2SO4终止反应。在酶标仪上读取OD450。
实施例5：血清抗热休克蛋白HSPA4自身抗体水平与患者预后的相关性
分析血清抗热休克蛋白HSPA4自身抗体水平与患者无病生存时间及总体生存时间的相关性。
选取2011-2012年108例女性乳腺癌患者(来自天津肿瘤医院)，患者在手术前未接受化疗及放疗。所有患者均签署知情同意书。
利用实施例3中的包被好的微孔板，采用实施例4的方法，检测该108例乳腺癌血清抗热休克蛋白HSPA4自身抗体水平，分析与乳腺癌患者无病生存时间及总体生存时间的相关性。P值使用SPSS 17.0中的Chi-square tests。
结果发现：血清高水平抗HSPA4自身抗体的患者(高于平均OD值，n＝49)相比于与低水平患者(低于平均OD值，n＝59)，其无病生存时间及总体生存时间较短(图3A和图3B)。
该结果表明：血清抗HSPA4自身抗体水平可作为乳腺癌患者预后的评估指标，其水平高指示预后较差。
实施例6：血清抗热休克蛋白HSPA4自身抗体水平与患者淋巴结转移的相关性。
淋巴结是乳腺癌患者最常见的转移部位，也是预后判断的重要指标，我们分析血清抗热休克蛋白HSPA4自身抗体水平与患者淋巴结转移的相关性。
利用实施例3中包被好的微孔板，采用实施例4的方法，检测60例正常血清(来自正常人献血)以及108例乳腺癌(52例淋巴结阴性(即LN-)和56例淋巴结阳性(即LN+)))血清抗热休克蛋白HSPA4自身抗体水平，分析与乳腺癌患者淋巴结转移的相关性。
结果发现：与正常人比较，两组乳腺癌患者血清抗热休克蛋白HSPA4自身抗体水平均有所增高；并且，有淋巴结转移的患者血清抗热休克蛋白HSPA4自身抗体水平比淋巴结阴性患者显著增高(图4)。
上述结果表明：患者血清抗热休克蛋白HSPA4自身抗体水平显著高于正常人血清水平，并与淋巴结转移密切相关，且其高表达与患者较差的预后显著相关，该结果提示了患者血清抗热休克蛋白HSPA4自身抗体水平可作为乳腺癌诊断或辅助诊断、预测肿瘤转移或患者预后评估的标志物。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (19)

1.用于检测抗HSPA4自身抗体水平的物质在制备用于对象乳腺癌诊断或预后评估的产品中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其中，所述产品为试剂盒。
3.如权利要求1所述的应用，其中，所述检测针对罹患或疑似罹患乳腺癌或具有患乳腺癌风险或曾罹患乳腺癌但已治愈的哺乳动物或获自所述哺乳动物的样品进行。
4.如权利要求3所述的应用，其中，所述样品选自获自所述哺乳动物的：血液样品；组织或细胞样品。
5.如权利要求4所述的应用，其中，所述血液样品选自：血浆、血清和全血。
6.如权利要求4所述的应用，其中，所述组织或细胞样品选自：乳腺组织或细胞样品、癌组织或细胞样品以及癌旁组织或细胞样品。
7.如权利要求1所述的应用，其中，所述乳腺癌选自如下分型：浸润性导管癌、非侵润性导管癌；或者，管腔A型、管腔B型、管腔-HER2型、HER2过表达型、基底细胞样型、TNP-非基底型；或者，激素受体阳性型、HER2/neu受体阳性型、三阴性型。
8.如权利要求1所述的应用，其中，所述用于检测抗HSPA4自身抗体水平的物质是用于在基因水平和/或蛋白质水平上检测抗HSPA4自身抗体的物质。
9.如权利要求1所述的应用，其中，所述物质是用于选自下组的一种或多种检测技术或方法中的物质：免疫组织化学法、Western印迹法、Northern印迹法、PCR、生物芯片法。
10.如权利要求9所述的应用，其中，所述免疫组织化学法选自：免疫荧光分析、反向酶联免疫吸附和免疫胶体金法。
11.如权利要求1所述的应用，其中，所述物质选自：对抗HSPA4自身抗体具有特异性的物质；HSPA4抗原或其具有与抗HSPA4自身抗体结合特异性的片段或类似物。
12.如权利要求1所述的应用，其中，所述物质选自：抗HSPA4自身抗体的抗抗体、HSPA4抗原的抗原表位或包含所述抗原表位的片段或其类似物。
13.如权利要求12所述的应用，其中，所述抗抗体是单克隆抗体。
14.如权利要求1所述的应用，其中，所述物质选自：抗HSPA4自身抗体特异性的探针、基因芯片、PCR引物和gRNA。
15.如权利要求1所述的应用，其中，与正常对照值相比，所述对象或获自所述对象的样品中抗HSPA4自身抗体水平提高，表明所述对象易于或已发生癌症转移，或表明所述对象的癌症预后不良，或表明所述对象已患有癌症。
16.一种用于乳腺癌诊断或预后评估的产品，其包含：
用于检测抗HSPA4自身抗体水平的物质；以及
用于乳腺癌诊断或预后评估的其他物质，其中，所述其他物质选自：针对血清学CA15-3的检测物质；针对ER、PR和CerbB2的乳腺癌病理免疫组织化学检测物质。
17.如权利要求16所述的产品，其中，所述产品为试剂盒。
18.一种筛选治疗乳腺癌、缓解或防止乳腺癌转移和/或改善乳腺癌预后的候选药物的方法，所述方法包括检测所述候选药物对对象或获自对象的样品中抗HSPA4自身抗体水平的影响，其中，在使用所述候选药物后，抗HSPA4自身抗体水平降低则表明所述候选药物具有治疗乳腺癌、缓解或防止乳腺癌转移和/或改善乳腺癌预后的效果。
19.如权利要求18所述的方法，其中，对抗HSPA4自身抗体水平的检测采用如权利要求1-17中所提及的产品进行。
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