CN109633149A - 一种氨基残留物检测的通用中间体以及免疫层析检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种氨基残留物检测的通用中间体以及免疫层析检测方法，所述通用中间体为生物素标记的乙醛酸，所述生物素连接在乙醛酸的羧基上。检测方法包括以下步骤：（1）制备生物素修饰的乙醛酸；（2）制备氨基残留物抗体修饰的金纳米粒子和质控抗体修饰的金纳米粒子；（3）生物素修饰的乙醛酸与氨基残留物反应，并与氨基残留物抗体修饰的金纳米粒子孵育后；将质控抗体修饰的金纳米粒子与上述待检测物进行混合，制得混合待检测物；（4）试纸条组装与免疫层析检测。该方法借助中间体的作用，将竞争法改为夹心法检测，以生物素作为间接检测对象，通过生物素与亲和素的放大效应，从而提高目标物检测的灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于食品安全检测领域，具体涉及一种氨基残留物检测的通用中间体以及免疫层析检测方法。
背景技术
随着科技的进步以及人民生活水平的提高，对食品安全的要求日益严格，因此对食品安全检测技术的有效性研究显得更加迫切。要达到这一目的除了提高人们防范的意识之外，更多的是我们必须选择一种方便普及的检测方法进行监督，免疫学检测技术的发展为这一目标的达到提供了技术上的可能。
免疫学方法相对于传统和经典的化学检测与仪器检测而言的，其特点是需要的检测速度快，对仪器设备等条件的要求不高，尤其是免疫层析检测方法，能够携带到交易（生产）现场（或在线）实施检测。随着我国食品安全问题受到政府和老百姓的广泛关注，仅靠常规的化学检测已不能满足现场、快速判定的需要，尤其是对于大批量的样品常规检测耗费时间长、成本高、要求相关条件复杂。免疫层析方法在现场用十几分钟甚至几十分钟即可判定该食品是否食用安全，既快速方便、又省钱。再者，即使政府监管部门对市场上产品的日常监测，由于样品量大，也可先用免疫层析方法对其筛选，发现有问题的食品再上仪器定量分析，这样可以节省大量的人力物力。因此，免疫层析技术近几年发展很快，在日常监测领域发挥了越来越重要的作用，广泛应用于农药残留、兽药残留、食源性病原菌和真菌毒素等方面的检测。
然而，现有的免疫层析检测方法已经成为一种比较成熟的技术，随着对危害物检测灵敏度的要求越来越高，在现有设计原理的基础上，需要不断开发新的检测方法，才能满足日益增长的检测需求。
发明内容
为了解决以上现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种氨基残留物检测的通用中间体以及免疫层析检测方法。
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
一种氨基残留物检测的通用中间体，所述通用中间体为生物素标记的乙醛酸，所述生物素连接在乙醛酸的羧基上。
进一步的，所述生物素为氨基聚乙二醇生物素，生物素通过氨基与乙醛酸的羧基相连接。
进一步的，所述氨基残留物包括金刚烷胺、磺胺类、克仑特罗、或抗生类，所述磺胺类包括磺胺甲基嘧啶（磺胺甲嘧啶）、磺胺甲恶唑（磺胺甲鯻唑）、磺胺二甲嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶（磺胺地索辛）、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹恶啉（磺胺喹沙啉），所述抗生类包括庆大霉素、卡那霉素、安普霉素、链霉素、氟苯尼考胺或新霉素。
一种氨基残留物的免疫层析检测方法，包括以下步骤：
（1）乙醛酸上的羧基与生物素进行连接，制得生物素修饰的乙醛酸；
（2）分别制备氨基残留物抗体修饰的金纳米粒子和质控抗体修饰的金纳米粒子，并按照比例混合好分装于96孔板的微孔中；
（3）将生物素修饰的乙醛酸加入含有氨基残留物的组织样本中并与氨基残留物发生化学交联，通过水性缓冲液震荡离心提取交联有氨基残留物的衍生物，或者有机溶剂提取后氮吹后复溶得到待检测液，然后取100μL将其与步骤（2）制得的混合物在37℃的条件下孵育，孵育完成后插入试纸条进行检测；
（4）以底板、样品垫、层析膜、吸水垫和外壳构建成免疫层析试纸条，层析膜上设有检测线和质控线，检测线上固定有链霉亲和素，质控线上固定有识别质控抗体的二抗，所述层析膜、底板和外壳均没有荧光特性；
（5）将混合待检测物滴加于试纸条的样品垫处，进行免疫层析，当混合待检测物流经检测线和质控线后，检测线和质控线的位置将会出现指示信号，根据检测线的信号强度，实现目标物的定量检测。
进一步的，所述质控抗体为与残留物抗体不产生交叉反应且不同种属的抗体。
进一步的，所述金纳米粒子的粒径为15-25nm。
本发明的工作原理为：乙醛酸上的羧基与氨基聚乙二醇生物素上的氨基进行化学交联，乙醛酸上的醛基与带有氨基的残留物发生化学交联，将修饰了生物素的乙醛酸加入均质的组织样本中，乙醛酸上的醛基即可与组织样本中氨基残留物的氨基发生反应形成带有氨基残留物的衍生物；通过萃取提取该衍生物，氮吹并复溶，并与氨基残留物抗体修饰的金纳米粒子发生亲和反应，通过加入质控抗体修饰的金纳米粒子作为对照线显色成分；试纸条上的检测线标记链霉亲和素，质控线标记识别质控抗体的二抗；当检测样本滴加到样品垫时，随着样本溶液的层析，带有生物素的金纳米粒子滞留在检测线的位置，带有质控抗体的金纳米粒子则滞留在质控线的位置。
有益效果：本发明提供了一种氨基残留物检测的通用中间体以及免疫层析检测方法，本发明以生物素标记的乙醛酸作为用于氨基残留物检测的通用中间体，其能够与带有氨基的残留物发生化学交联，从而实现组织样本中氨基残留物以带有生物素标记的衍生物的形式分离出来。本发明以与氨基残留物同时连接在乙醛酸上的生物素作为间接检测对象，通过生物素与亲和素的结合将金纳米粒子的检测信号呈现在检测线的位置，从而间接实现对目标物的检测。与目标物和抗体一一识别的方式相比，这种检测方法能够通过生物素与亲和素的放大效应，在待检测物于检测线位置的停留时间相同的情况下，增加检测线位置滞留金纳米粒子的含量，从而提高目标物检测的灵敏度。
本发明的方法，不同于其他小分子的竞争法，其信号随待检测浓度的增加而增加，灵敏度更高，更有利于多重待检测物质的合并检测。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
以下实施例所述的生物素修饰的乙醛酸的制备方法如下：
（1）醛基的保护：在干燥洁净的100mL两口瓶中，加入10mg乙醛酸，然后以1：2的摩尔比加入乙二醇，2mg对甲苯磺酸催化剂，50mL甲苯做溶剂，装上油水分离器分离出反应过程中生成的水，升温至160℃回流过夜。TLC示踪，待反应完全后，停止加热，将反应体系冷却至常温，加入饱和NH4Cl溶液淬灭反应，用乙酸乙酯萃取，每次100mL，萃取3次，合并有机相，无水Na2SO4干燥后，将有机相置于旋转蒸发仪上旋干，即得醛基保护的乙醛酸9.8mg。
（2）连接氨基聚乙二醇生物素：将醛基保护的乙醛酸用1mL二甲亚砜进行溶解，然后加入pH7.4 0.01M的磷酸盐缓冲液9mL，在室温条件下加入5mg N-羟基琥珀酰亚胺搅拌反应10-20min，然后再加入10mg碳二亚胺，继续搅拌反应8h，然后将20mg氨基聚乙二醇生物素加入到反应体系中继续搅拌反应6h，使用截留分子量为1000的超滤管对反应后的溶液进行超滤，然后用水溶液对超滤管进行吹打冲洗，每次用1mL的水溶液，共吹打5次，得到浓缩后的反应产物。
（3）醛基的脱保护：向上述5mL浓缩后的反应产物中加入5mL丙酮，再加入2mg对甲苯磺酸作为催化剂，在搅拌的条件下回流3h，同时在反应过程中不断补加丙酮，TLC示踪，待反应完全后，停止加热，拆去冷凝回流装置，将反应体系冷却至室温后加入饱和NH4Cl溶液淬灭反应，蒸干溶剂，即得生物素修饰的乙醛酸。
以下实施例所用的质控抗体修饰的金纳米粒子的制备方法为：
在室温条件下，向1mL 10nM金纳米粒子中加入100μL 1mg/mL的兔IgG，在室温条件下振荡混合1h，然后再加入100μL 1mg/mL的BSA振荡混合1h，对修饰了抗体的金纳米粒子进行封闭，通过离心去除上清液，将金纳米粒子用1mL pH 7.4的含有1%BSA、0.05%tween 20 0.01M磷酸盐缓冲液进行重悬，将其置于4℃温度下备用。
实施例1 金刚烷胺的检测
（1）制备金刚烷胺抗体修饰的金纳米粒子
在室温条件下，向1mL 10nM金纳米粒子中加入10μL 0.2M的K2CO3，混匀后再逐滴加入100μL 1mg/mL的金刚烷胺抗体，在室温条件下振荡混合1h，然后再加入100μL 1mg/mL的BSA振荡混合1h，对修饰了抗体的金纳米粒子进行封闭，通过离心去除上清液，将金纳米粒子用1mL pH 7.4的含有1%BSA、0.05%tween 20 0.01M磷酸盐缓冲液进行重悬，将其置于4℃温度下备用。
（2）试纸条的组装
将样品垫、硝酸纤维膜、吸水纸按照2mm宽度重叠依次黏贴在底衬上，并用切条机切条，包装后干燥室温保存。
检测线用1mg/mL的链霉亲和素以3cm/s速度画线制备，质控线用1mg/mL的羊抗兔二抗以3cm/s速度画线制备。
（3）样本前处理与检测
称取2g均质好的阴性猪肉组织样本于离心管中，分别加入0、0.1、0.2、0.5、1μg/kg的金刚烷胺标准品，然后加入5mL的超纯水、1mL 1M的HCl和0.1 mL 1mg/mL生物素修饰的乙醛酸搅拌均匀，于65℃条件下振荡反应1-2h，然后通过乙酸乙酯萃取得到交联有金刚烷胺的生物素修饰的乙醛酸衍生物，氮吹复溶后得到待检测液；将待检测液加入到含有待检测物质抗体标记的金纳米粒子和质控抗体标记金纳米粒子的96孔板微孔中，混合均匀并反应3min，插入试纸条，5-10min观察检测线和质控线的颜色变化。其检测结果如图1所示。
实施例2 磺胺二甲嘧啶的检测
（1）制备磺胺二甲嘧啶抗体修饰的金纳米粒子
在室温条件下，向10mL 10nM金纳米粒子中加入100μL 0.2M的K2CO3，混匀后再逐滴加入100μL 1mg/mL的磺胺二甲嘧啶单克隆抗体，在室温条件下振荡混合0.5h；然后再加入100μL 50mg/mL的聚乙二醇振荡混合1h，对修饰了抗体的金纳米粒子进行封闭；然后通过离心去除上清液，用1mL pH 8.0的含有0.5%BSA的0.01M磷酸盐缓冲液重悬金纳米粒子，将其置于4℃温度下备用。
（2）试纸条的组装
将样品垫、硝酸纤维膜、吸水纸按照2mm宽度重叠依次黏贴在底衬上，并用切条机切条，包装后干燥室温保存。
检测线用1mg/mL的链霉亲和素以3cm/s速度画线制备，质控线用1mg/mL的羊抗兔二抗以3cm/s速度画线制备。
（3）样本前处理与检测
称取2g均质好的阴性猪肉组织样本于离心管中，分别加入0、0.2、0.5、1.0、2.0μg/kg的磺胺二甲嘧啶标准品，然后加入5mL的超纯水、1mL 1M的HCl和0.1 mL 1mg/mL生物素修饰的乙醛酸搅拌均匀，于65℃条件下振荡反应1-2h，然后通过乙酸乙酯萃取得到交联有磺胺二甲嘧啶的生物素修饰的乙醛酸衍生物，氮吹复溶后得到待检测液；将待检测液加入到含有待检测物质抗体标记的金纳米粒子和质控抗体标记金纳米粒子的96孔板微孔中，混合均匀并反应3min，插入试纸条，5-10min观察检测线和质控线的颜色变化。其检测结果如图2所示。
实施例3 克仑特罗的检测
（1）制备克仑特罗抗体修饰的金纳米粒子
在室温条件下，向10mL 10nM金纳米粒子中加入50μL 0.2M的K2CO3，混匀后再逐滴加入300μL 1mg/mL的克仑特罗抗体，在室温条件下振荡混合1h，然后再加入100μL 1mg/mL的BSA振荡混合1h，对修饰了抗体的金纳米粒子进行封闭，然后通过离心去除上清液，将金纳米粒子用1mL pH 7.4的含有0.5%BSA的0.01M磷酸盐缓冲液进行重悬，再次离心用1mL pH 7.4的含有2%BSA的0.01M磷酸盐缓冲液重悬金纳米粒子，将其置于4℃温度下备用。
（2）试纸条的组装
将样品垫、硝酸纤维膜、吸水纸按照2mm宽度重叠依次黏贴在底衬上，并用切条机切条，包装后干燥室温保存。
检测线用1mg/mL的链霉亲和素以3cm/s速度画线制备，质控线用1mg/mL的羊抗兔二抗以3cm/s速度画线制备。
（3）样本前处理与检测
称取2g均质好的阴性猪肉组织样本于离心管中，分别加入0、0.1、0.2、0.5、1μg/kg的克仑特罗标准品，然后加入5mL的超纯水、1mL 1M的HCl和0.1 mL 1mg/mL生物素修饰的乙醛酸搅拌均匀，于65℃条件下振荡反应1-2h，然后通过乙酸乙酯萃取得到交联有克仑特罗的生物素修饰的乙醛酸衍生物，氮吹复溶后得到待检测液；将待检测液加入到含有待检测物质抗体标记的金纳米粒子和质控抗体标记金纳米粒子的96孔板微孔中，混合均匀并反应3min，插入试纸条，5-10min观察检测线和质控线的颜色变化。其检测结果如图3所示。
实施例4 链霉素的检测
（1）制备链霉素抗体修饰的金纳米粒子
在室温条件下，向10mL 10nM金纳米粒子中加入100μL 1mg/mL的链霉素抗体，在室温条件下振荡混合1h，然后再加入100μL 10mg/mL的BSA振荡混合1h，对修饰了抗体的金纳米粒子进行封闭，然后通过离心去除上清液，将金纳米粒子用1mL pH 7.4的含有0.5%BSA的0.01M磷酸盐缓冲液进行重悬，再次离心用1mL pH 7.4的含有0.5%BSA、0.05%tween的0.01M磷酸盐缓冲液重悬金纳米粒子，将其置于4℃温度下备用。
（2）试纸条的组装
将样品垫、硝酸纤维膜、吸水纸按照2mm宽度重叠依次黏贴在底衬上，并用切条机切条，包装后干燥室温保存。
检测线用1mg/mL的链霉亲和素以3cm/s速度画线制备，质控线用1mg/mL的羊抗兔二抗以3cm/s速度画线制备。
（3）样本前处理与检测
称取2g均质好的阴性鸡肉组织样本于离心管中，分别加入0、10、20、50、100μg/kg的链霉素标准品，然后加入2mL的超纯水、1mL 1M的HCl和0.1 mL 1mg/mL生物素修饰的乙醛酸搅拌均匀，于65℃条件下振荡反应1-2h，加入1 mL 1M的NaOH 溶液和1mL 1M的磷酸氢二钾调节pH和离子强度，离心取上清，即为待检测液体；将待检测液加入到含有待检测物质抗体标记的金纳米粒子和质控抗体标记金纳米粒子的96孔板微孔中，混合均匀并反应3min，插入试纸条，5-10min观察检测线和质控线的颜色变化。其检测结果如图4所示。
综上所述，从实验结果得知，随着目标物浓度的增加，试纸条上检测线位置的条带颜色逐渐加深，根据条带颜色的变化趋势来看，对以上四种目标物的检测均能达到较低的检测浓度。
Claims (6)
1.一种氨基残留物检测的通用中间体，其特征在于，所述通用中间体为生物素标记的乙醛酸，所述生物素连接在乙醛酸的羧基上。
2.根据权利要求1所述的一种氨基残留物检测的通用中间体，其特征在于，所述生物素为氨基聚乙二醇生物素，生物素通过氨基与乙醛酸的羧基相连接。
3.根据权利要求1所述的一种氨基残留物检测的通用中间体，其特征在于，所述氨基残留物包括金刚烷胺、磺胺类、克仑特罗、或抗生类，所述磺胺类包括磺胺甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹恶啉，所述抗生类包括庆大霉素、卡那霉素、安普霉素、链霉素、氟苯尼考胺或新霉素。
4.一种氨基残留物的免疫层析检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）乙醛酸上的羧基与生物素进行连接，制得生物素修饰的乙醛酸；
（2）分别制备氨基残留物抗体修饰的金纳米粒子和质控抗体修饰的金纳米粒子，并按照比例混合好分装于96孔板的微孔中；
（3）将生物素修饰的乙醛酸加入含有氨基残留物的组织样本中并与氨基残留物发生化学交联，通过水性缓冲液震荡离心提取交联有氨基残留物的衍生物，或者有机溶剂提取后氮吹后复溶得到待检测液，然后取100μL将其与步骤（2）制得的混合物在37℃的条件下孵育，孵育完成后插入试纸条进行检测；
（4）以底板、样品垫、层析膜、吸水垫和外壳构建成免疫层析试纸条，层析膜上设有检测线和质控线，检测线上固定有链霉亲和素，质控线上固定有识别质控抗体的二抗，所述层析膜、底板和外壳均没有荧光特性；
（5）将试纸条插入微孔中进行免疫层析，当混合待检测物流经检测线和质控线后，检测线和质控线的位置将会出现指示信号，根据检测线的信号强度，实现目标物的定量检测。
5.根据权利要求4所述的一种氨基残留物的免疫层析检测方法，其特征在于，所述质控抗体为与残留物抗体不产生交叉反应且不同种属的抗体。
6.根据权利要求4所述的一种氨基残留物的免疫层析检测方法，其特征在于，所述金纳米粒子的粒径为15-25nm。
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