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CN109627336A - 一种表达pd-l1单链抗体的新城疫溶瘤病毒的制备方法及应用 - Google Patents

一种表达pd-l1单链抗体的新城疫溶瘤病毒的制备方法及应用 Download PDF

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CN109627336A
CN109627336A CN201811560794.1A CN201811560794A CN109627336A CN 109627336 A CN109627336 A CN 109627336A CN 201811560794 A CN201811560794 A CN 201811560794A CN 109627336 A CN109627336 A CN 109627336A
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Nanjing Ang Keli Pharmaceutical Technology Innovation Research Institute Co Ltd
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Abstract

本发明公开了一种表达PD‑L1单链抗体的新城疫溶瘤病毒的制备方法及应用，其突变型重组LaSota株新城疫病毒的F蛋白第112‑117位氨基酸残基突变为112‑R‑R‑Q‑R‑R‑F‑117，使其具备独立感染能力；将PD‑L1单链抗体基因通过同源重组插入至新城疫病毒LaSota株全长克隆P基因和M基因之间，获得最终改造后的全长克隆pBRN‑FL(112‑RRQRRF‑117)‑PDL1(ScFV)；通过鸡胚增殖和超速离心纯化重组病毒。本发明制备的rNDV‑LaSota(112‑RRQRRF‑117)‑PDL1(ScFV)重组病毒具有媲美LaSota原始毒株的安全性，同时具有强毒株的肿瘤杀伤能力和免疫检查点抑制功能。

Description

一种表达PD-L1单链抗体的新城疫溶瘤病毒的制备方法及 应用
技术领域
本发明涉及一种用于治疗肺癌的表达PD-L1单链抗体的新城疫溶瘤病毒，属于生物医药领域。
背景技术
溶瘤病毒能够感染肿瘤细胞，并在肿瘤细胞中进行复制和增殖，最终导致宿主肿瘤细胞死亡，溶瘤病毒释放出来继续感染并杀死其它肿瘤细胞，发挥清除肿瘤的作用。现有溶瘤病毒包括单纯疱疹病毒、腺相关病毒、禽呼肠孤病毒和新城疫病毒。这四类病毒各有优缺点，但是现有溶瘤病毒杀伤肿瘤的能力还存在多种问题，比如嗜肿瘤谱窄、溶瘤能力不强、易引发宿主免疫清除等。因而研发人员寻求各种方法对溶瘤病毒进行改造，以扬长避短，开发溶瘤能力强、副作用小和嗜肿瘤谱广的溶瘤病毒。
新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)属副黏病毒科禽腮腺炎病毒属的成员，为单股负链RNA病毒，基因组全长约15kb，编码6个基因，依次为3’-NP-P-M-F-HN-L-5’。研究表明，新城疫病毒溶瘤株73-T可以杀死多种人癌症细胞。在裸鼠模型中，肿瘤内注射73-T能明显抑制多种异种移植的肿瘤，包括纤维肉瘤和神经胶质瘤。溶瘤型MTH-68株能明显部分或全部抑制癌细胞转移型肿瘤。一期临床试验表明，溶瘤新城疫PV701株具有广谱的抗肿瘤功能。LaSota株为疫苗株，溶瘤能力较低，仅可局部感染，可作为制备新型溶瘤病毒的优选载体。
单链抗体(single-chain variable fragment，ScFV)是将抗体重链可变区和轻链可变区通过一个柔性基团连接到一起，制备的一种特殊抗体。ScFV与原抗体相比，与抗原的结合能力变化不大，但是稳定性显著降低，易降解。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术中抗PD-L1单链抗体易降解的缺陷，提供一种表达PD-L1单链抗体的新城疫溶瘤病毒的制备方法及应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
一种重组LaSota株新城疫病毒蛋白，其蛋白序列如SEQ ID NO.1所示。
一种PD-L1单链抗体基因，它编码SEQ ID NO.1所示的多肽。
优选的，考虑该蛋白最终将在人体肿瘤组织中表达，根据人蛋白质翻译过程中的密码子偏好性，将PD-L1单链抗体的基因序列优化为
ATGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGAGGACTGGTGCAGCCAGGAGGCAGCCTGAGGCTGTCCTGCGCAGCCTCTGGCTTCACCTTTAGCGACTCCTGGATCCACTGGGTGAGACAGGCACCAGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGGCATGGATCAGCCCATACGGAGGATCCACCTACTATGCCGACTCTGTGAAGGGCAGGTTTACAATCAGCGCCGATACCTCCAAGAACACAGCCTATCTGCAGATGAATAGCCTGCGCGCCGAGGACACAGCCGTGTACTATTGCGCACGGAGACACTGGCCAGGAGGATTCGATTACTGGGGACAGGGCACCCTGGTGACAGTGAGCTCCGGCGGCGGCGGCTCTGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCGATATCCAGATGACCCAGAGCCCTTCTAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACATGTCGCGCCTCTCAGGATGTGAGCACAGCCGTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACTCCGCCTCTTTCCTGTATTCCGGAGTGCCATCTCGGTTTAGCGGATCCGGATCTGGAACCGACTTCACCCTGACAATCTCCTCTCTGCAGCCTGAGGATTTTGCCACATACTATTGTCAGCAGTACCTGTATCACCCAGCCACCTTCGGCCAGGGCACAAAGGTGGAGATCAAGCGGACCGTGCACCACCACCACCACCACTGA
一种表达PD-L1单链抗体的新城疫溶瘤病毒的制备方法，包括以下步骤：
1)、将PD-L1单链抗体基因通过同源重组插入至新城疫病毒LaSota株全长克隆中，获得全长克隆pBRN-FL(112-RRQRRF-117)-PDL1(ScFV)；
2)、将改造后的全长克隆与辅助质粒pCI-NP、pCI-P、pCI-L共转染BSR-T7/5细胞，2～4天后收集细胞和培养液，反复冻融数次后接种SPF鸡胚传代，进行重组病毒的纯化；培养3天后进行HA试验，取HA阳性的尿囊液，即为含重组新城疫病毒的rNDV-LaSota(112-RRQRRF-117)-PDL1(ScFV)溶液；
3)、经高速离心纯化后得即得。
优选的，将将PD-L1单链抗体基因通过同源重组插入至新城疫病毒LaSota株全长克隆P基因和M基因之间。但是，在其它任何两个基因之间或者在起始NP蛋白之前以及L蛋白之后插入PD-L1单链抗体制备的重组毒株可达到相似的肿瘤杀伤效果，这些都应该列在本发明的保护范围之内。
新城疫病毒LaSota株本身不具备溶瘤能力，本发明以新城疫病毒LaSota为模板，通过将F蛋白112-117位点突变为强毒株的112-RRQRRF-117，使其具备溶瘤能力，同时在P和M蛋白基因之间插入PD-L1的单链抗体基因，制备重组病毒rNDV-LaSota(112-RRQRRF-117)-PDL1(ScFV)，从而增加该病毒治疗肿瘤的临床效果；
本发明所达到的有益效果是：
1)本发明所得的rNDV-LaSota(112-RRQRRF-117)-PDL1(ScFV)同时具有溶瘤能力和免疫检查点抑制功能；其表达的PD-L1单链抗体仅在肿瘤局部高表达，扩散后易被降解，理论上副作用较PD-L1抗体疗法小；
2)本发明提供的方案因为溶瘤病毒将PD-L1单链抗体基因携带至肿瘤局部表达，预期其在临床应用的时候效果将优于普通溶瘤病毒和PD-L1抗体联用。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是本发明的实施例中pBRN-FL(112-RRQRRF-117)的电泳图
图2是重组溶瘤病毒rNDV-LaSota(112-RRQRRF-117)-PDL1(ScFV)和原始毒株LaSota株分别感染后的电泳结果；
图3重组病毒rNDV-LaSota(112-RRQRRF-117)-PDL1(ScFV)的细胞活力测试结果。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
1)pBRN-FL(112-RRQRRF-117)的制备
通过突变PCR，将pBRN-FL全长克隆F蛋白112-117位氨基酸残基突变为112-R-R-Q-R-R-F-117：以pBRN-FL为模板，用表1引物进行PCR，反应体系为：
加ddH2O补齐至20ul
反应程序为：①98℃，5min；②98℃，20sec；③68℃，90sec；④步骤2～3循环18次；⑤68℃，15min；反应结束降至4℃。
反应完成后取9ul反应产物，加入1ulDNA限制性内切酶DpnI，37℃反应2h；反应结束后，取100ul感受态DH5α大肠杆菌冰浴解冻，然后将酶切产物与之混合，冰浴20min；然后42℃热击90sec；再冰浴2min，之后加入500ul无抗生素LB培养基，37℃恒温震荡培养箱180rpm复苏30min；涂至含氨苄抗生素LB固体培养基平板，37℃温箱培养过夜，挑取单克隆至5ml含氨苄抗生素扩大培养，取1ml培养后的菌液送测序分析；经测序分析，取突变成功的菌株，按照试剂盒(AxyGen质粒小量提取试剂盒，货号：AP-MN-P-250)说明书，提取质粒，即rNDV-LaSota(112-RRQRRF-117)突变株全长克隆，命名为pBRN-FL(112-RRQRRF-117)。LaSota株F蛋白112-117位氨基酸位点的基因序列和氨基酸序列均突变为与强毒株一致，其中碱基序列为：AGGAGACAAAAACGCTTT，氨基酸序列为RRQRRF，与预期一致。
表1
2)PD-L1单链抗体序列设计和基因合成：根据PD-L1人源化抗体atezolizumab株IgG重链和轻链可变区以及加入的lingker和标签序列设计PD-L1单链抗体，最终设计结果下：
氨基酸序列(人工序列1)：
其中下划线位置氨基酸为lingker序列，其之前为重链可变区，之后为轻链可变区，斜体加粗为His标签序列。
考虑该蛋白最终将在人体肿瘤组织中表达，根据人蛋白质翻译过程中的密码子偏好性，将PD-L1单链抗体的基因序列优化为(人工序列2)：
ATGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGAGGACTGGTGCAGCCAGGAGGCAGCCTGAGGCTGTCCTGCGCAGCCTCTGGCTTCACCTTTAGCGACTCCTGGATCCACTGGGTGAGACAGGCACCAGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGGCATGGATCAGCCCATACGGAGGATCCACCTACTATGCCGACTCTGTGAAGGGCAGGTTTACAATCAGCGCCGATACCTCCAAGAACACAGCCTATCTGCAGATGAATAGCCTGCGCGCCGAGGACACAGCCGTGTACTATTGCGCACGGAGACACTGGCCAGGAGGATTCGATTACTGGGGACAGGGCACCCTGGTGACAGTGAGCTCCGGCGGCGGCGGCTCTGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCGATATCCAGATGACCCAGAGCCCTTCTAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACATGTCGCGCCTCTCAGGATGTGAGCACAGCCGTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACTCCGCCTCTTTCCTGTATTCCGGAGTGCCATCTCGGTTTAGCGGATCCGGATCTGGAACCGACTTCACCCTGACAATCTCCTCTCTGCAGCCTGAGGATTTTGCCACATACTATTGTCAGCAGTACCTGTATCACCCAGCCACCTTCGGCCAGGGCACAAAGGTGGAGATCAAGCGGACCGTGCACCACCACCACCACCACTGA
将该序列交由南京金斯瑞公司进行人工合成并连接至pcDNA3.1(+)载体，构建质粒pcDNA3.1-PDL1-ScFV，进行单克隆扩增和测序分析，确定是否正确。测序结果与设计序列结果完全一致。
3)克隆抗PD-L1单链抗体基因并插入到pBRN-FL(112-RRQRRF-117)上P和M基因之间。
1.PD-L1单链抗体基因两端添加同源臂：根据pBRN-FL全长克隆P基因和M基因之间Pme1酶切位点上游和下游的序列，以及添加GE和GS序列，设计同源重组引物，设计结果见表2，以PD-L1单链抗体基因为目标进行PCR反应，反应体系为：
加ddH2O补齐至50ul
反应程序为：①98℃，5min；②98℃，10sec；③58℃，30sec；④72℃，60sec；⑤步骤2～4循环30次；⑥72℃，10min；反应结束降至4℃。
反应完成后用1％琼脂糖凝胶进行电泳，切胶回收830bp大小的DNA片段，用胶回收试剂盒(康为世纪：快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，货号cw2302s)，按照说明书步骤操作，回收目的片段并用nanodrop测定浓度。结果如图1示，PCR扩增产物大小约800bp，与预期大小相近，切胶回收后测定浓度，为43ng/ul。
2.线性化pBRN-FL(112-RRQRRF-117)
取2ug全长克隆质粒pBRN-FL(112-RRQRRF-117)，加入Pme1限制性内切酶2ul和Cutsmart缓冲液2ul，并加水补齐至20ul，16℃酶切过夜；然后用胶回收试剂盒(康为世纪：快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，货号cw2302s)回收线性化的质粒并用nanodrop测定浓度。
3.重组质粒pBRN-FL(112-RRQRRF-117)-PDL1(ScFV)制备
根据浓度，取1ul线性化载体pBRN-FL(112-RRQRRF-117)，根据浓度和片段长度，将线性化载体与含同源臂的PD-L1单链抗体基因片段按摩尔比1:7混匀，转化至感受态细胞DH5α，进行同源重组，制备重组质粒；挑取10个单克隆菌落，分别用含氨苄抗生素的LB液体培养基进行扩大培养，然后提取质粒，用Pme1单酶切鉴定，然后取酶切鉴定正确的质粒进行测序分析核对，选取序列正确的质粒(即pBRN-FL(112-RRQRRF-117)-PDL1(ScFV))进行病毒制备。保证-L1单链抗体基因正确插入pBRN-FL(112-RRQRRF-117)，且序列与原始模板完全一致。
表2
其中小写字母分别为上游和下游同源臂序列，下划线为GE和GS序列，二者连接处为Pme1酶切位点序列，斜体加粗为KOZAK序列。
4)拯救重组新城疫病毒rNDV-LaSota(112-RRQRRF-117)-PDL1(ScFV)
将BSR-T7/5细胞铺于六孔板中生长至80-90％单层，将DMEM换为opti-MEM培养基，将总共10ug全长质粒pBRN-FL(112-RRQRRF-117)-PDL1(ScFV)，pCI-NP，pCI-P和pCI-L用转染试剂LipofectamineTM2000共转染BSR-T7/5细胞，6小时后换液，继续孵育3天。收获培养液及细胞，反复冻融3次后接种9日龄SPF鸡胚，接种后的SPF鸡胚继续培养3天后进行新城疫病毒的HA试验，收获HA阳性的尿囊液，分装后-70℃冻存备用。
5)rNDV-LaSota(112-RRQRRF-117)-PDL1(ScFV)抗PD-L1单链抗体表达检测
将肺癌细胞系A549细胞铺于12孔板中生长至80-90％单层，12h后将重组溶瘤病毒rNDV-LaSota(112-RRQRRF-117)-PDL1(ScFV)和原始毒株LaSota株分别按MOI＝0.1感染细胞；24h收集细胞培养上清，用His标签抗体通过western blot检测PD-L1单链抗体的表达。结果如图2示，与接种重组病毒的细胞在24h，细胞以及细胞培养上清中均存在大量PD-L1单链抗体(PDL1ScFV)存在，而原始毒株感染的细胞中不存在PD-L1单链抗体。
6)rNDV-LaSota(112-RRQRRF-117)-PDL1(ScFV)肿瘤杀伤能力检测
将肺癌细胞系A549细胞铺于12孔板中生长至80-90％单层，12h后将重组溶瘤病毒rNDV-LaSota(112-RRQRRF-117)-PDL1(ScFV)以及原始毒株LaSota株分别按MOI＝0.1感染细胞；36h通过cellTiter试剂盒检测细胞活力。结果如图3示，接种重组病毒rNDV-LaSota(112-RRQRRF-117)-PDL1(ScFV)的细胞活力降至30％左右，而原始亲本毒株仅降至90％左右。与原始毒株相比，重组毒株具有肿瘤杀伤效应。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南京昂科利医药科技创新研究院有限公司
<120> 一种表达PD-L1单链抗体的新城疫溶瘤病毒的制备方法及应用
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<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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1 5 10 15
Gly Ser Leu Ala Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Pro Thr Pro Ser Ala
20 25 30
Ser Thr Ile His Thr Val Ala Gly Ala Pro Gly Leu Gly Leu Gly Thr
35 40 45
Val Ala Thr Ile Ser Pro Thr Gly Gly Ser Thr Thr Thr Ala Ala Ser
50 55 60
Val Leu Gly Ala Pro Thr Ile Ser Ala Ala Thr Ser Leu Ala Thr Ala
65 70 75 80
Thr Leu Gly Met Ala Ser Leu Ala Ala Gly Ala Thr Ala Val Thr Thr
85 90 95
Cys Ala Ala Ala His Thr Pro Gly Gly Pro Ala Thr Thr Gly Gly Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ile Gly Met Thr Gly Ser Pro Ser Ser
130 135 140
Leu Ser Ala Ser Val Gly Ala Ala Val Thr Ile Thr Cys Ala Ala Ser
145 150 155 160
Gly Ala Val Ser Thr Ala Val Ala Thr Thr Gly Gly Leu Pro Gly Leu
165 170 175
Ala Pro Leu Leu Leu Ile Thr Ser Ala Ser Pro Leu Thr Ser Gly Val
180 185 190
Pro Ser Ala Pro Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Pro Thr Leu Thr
195 200 205
Ile Ser Ser Leu Gly Pro Gly Ala Pro Ala Thr Thr Thr Cys Gly Gly
210 215 220
Thr Leu Thr His Pro Ala Thr Pro Gly Gly Gly Thr Leu Val Gly Ile
225 230 235 240
Leu Ala Thr Val His His His His His His
245 250
<210> 2
<211> 753
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggaggtgc agctggtgga gtccggagga ggactggtgc agccaggagg cagcctgagg 60
ctgtcctgcg cagcctctgg cttcaccttt agcgactcct ggatccactg ggtgagacag 120
gcaccaggca agggactgga gtgggtggca tggatcagcc catacggagg atccacctac 180
tatgccgact ctgtgaaggg caggtttaca atcagcgccg atacctccaa gaacacagcc 240
tatctgcaga tgaatagcct gcgcgccgag gacacagccg tgtactattg cgcacggaga 300
cactggccag gaggattcga ttactgggga cagggcaccc tggtgacagt gagctccggc 360
ggcggcggct ctggaggagg aggaagcgga ggaggaggat ccgatatcca gatgacccag 420
agcccttcta gcctgtctgc cagcgtgggc gacagggtga ccatcacatg tcgcgcctct 480
caggatgtga gcacagccgt ggcctggtat cagcagaagc ccggcaaggc ccctaagctg 540
ctgatctact ccgcctcttt cctgtattcc ggagtgccat ctcggtttag cggatccgga 600
tctggaaccg acttcaccct gacaatctcc tctctgcagc ctgaggattt tgccacatac 660
tattgtcagc agtacctgta tcacccagcc accttcggcc agggcacaaa ggtggagatc 720
aagcggaccg tgcaccacca ccaccaccac tga 753
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggagacaaaa acgctttata ggcgccatta ttggcggtgt g 41
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tttttgtctc ctccctccag atgtagtcac agactcttg 39
<210> 5
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccaaggtcca actctgttta aacttagaaa aaatacgggt agaacgccac catggaggtg 60
cagctgg 67
<210> 6
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aggattgccg cttgggttta aacgctatca gtggtggtgg tggtggtg 48

Claims (6)

1.一种重组LaSota株新城疫病毒蛋白，其特征在于，其蛋白序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种PD-L1单链抗体基因，其特征在于，它编码SEQ ID NO.1所示的多肽。
3.如权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于，其序列如SEQ ID NO.2所示。
4.一种表达PD-L1单链抗体的新城疫溶瘤病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)、将序列为SEQ ID NO.2的PD-L1单链抗体基因通过同源重组插入至新城疫病毒LaSota株全长克隆中，获得全长克隆pBRN-FL(112-RRQRRF-117)-PDL1(ScFV)；
2)、通过鸡胚增殖和超速离心纯化重组病毒。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，将PD-L1单链抗体基因通过同源重组插入至新城疫病毒LaSota株全长克隆P基因和M基因之间。
6.权利要求4或5所述的表达PD-L1单链抗体的新城疫溶瘤病毒在治疗肿瘤中的应用。
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