CN109627236A - 用于活体检测硝基还原酶的光声探针及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种用于活体检测硝基还原酶的光声探针及其制备方法与应用，属于肿瘤标志物检测与成像领域。该用于活体检测硝基还原酶的光声探针的结构式如式I所示。该探针主要是以苯并Cy7‑Cl为原料通过亲核取代，克脑文盖尔缩合反应，氯甲酸酯亲核取代反应得到。本发明克服了荧光探针在活体检测中荧光信号的散射和组织吸收的问题，制备的探针具有光声信号穿透深度大，实现深层组织的成像，反应速度快，特异性好，比率检测更准确。该探针可以用于活体检测硝基还原酶，从而监控肿瘤的乏氧情况；或用于细胞中、生物样品中的硝基还原酶检测。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤标志物检测与成像领域，特别涉及一种用于活体检测硝基还原酶的光声探针及其制备方法与应用。
背景技术
现在癌症己经成为影响人类健康的头号杀手，因此关于癌症的研宄是目前科研工作者工作中的重中之重。缺氧是实体肿瘤的特征之一。临床研究表明缺氧能够阻断许多种抗癌药物的新陈代谢过程，进而影响。抗癌药物的药效，且缺氧能够促进肿瘤细胞的转移。在宫颈癌及头颈部鱗状癌研究方面，缺氧在检测中甚至被认为是无进展生存信号，因此研究肿瘤细胞的缺氧状态具有很重要的临床意义(Kizaka-Kondoh,S.；Inoue,M.；Harada,H.；Hiraoka,M.T.Cancer Sci.2003,94,1021-1028.(5)Rofstad,E.K.；Rasmussen,H.；Galappathi,K.；Mathiesen,B.；Nilsen,K.；Graff,B.A.Hypoxia promotes lymph nodemetastasis in human melanoma xenografts by up-regulating the urokinase-typeplasminogen activator receptor.Cancer Res.2002,62,1847-1853.)。
细胞中氧含量的降低将会促进还原应激效应，进而促进一些还原酶类的过表达，比如醌还原酶，硝基还原酶，偶氮还原酶。在它们之间，硝基还原酶的活性与肿瘤细胞的缺氧水平成正相关，因此在实际研宄中，研究人员往往将硝基还原酶作为代表研究肿瘤细胞的缺氧状态。硝基还原酶属于黄素酶的一员，它在电子供体NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)或者NADPH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)存在的情况下，能够将硝基芳香化合物中的硝基还原为相应的羟胺或氨基，这种还原行为为生物传感器的设计开辟了新的方向(Brown,J.M.；William,W.R.Nat.Rev.Cancer 2004,4,437.)。此外，硝基还原酶还被用在了基因或者病毒导向的酶前体药物的癌症治疗及药物筛选方面，因此缺氧及硝基还原酶的检测对于药物研宄及肿瘤诊断具有重要的作用(Wilson,W.R.；Hay,M.P.Nat.Rev.Cancer 2011,11,393.Chen,Y.；Hu,L.Med.Res.Rev.2009,29,29.)。
传统的检测硝基还原酶的方法主要是电化学法，但是这种方法往往需要酶固定，不能够进行原位分析，因此不适用于活细胞成像。最近很多研究小组开始基于硝基芳烃设计荧光探针用于硝基还原酶检测和缺氧状态检测，并且成功实现了肿瘤活细胞的缺氧成像[(a)Cui,L.；Zhong,Y.；Zhu,W.；Xu,Y.；Du,Q.；Wang,X.；Qian,X.；Xiao,Y.Org.Lett.2011,13,928.(b)Guo,T.；Cui,L.；Shen,J.；Zhu,W.；Xu,Y.；Qian,X.Chem.Commun.2013,49,10820.(c)Yuan,J.；Xu,Y.；Zhou,N.；Wang,R.；Qian,X.；Xu,Y.RSC Adv.2014,4,56207.(d)Li,Z.；Li,X.；Gao,X.；Zhang,Y.；Shi,W.；Ma,H.Anal.Chem.2013,85,3926.(e)Li,Z.；He,X.；Wang,Z.；Yang,R.；Shi,W.；Ma,H.Biosens.Bioelectron.2015,63,112.(f)Xu,J.；Sun,S.；Li,Q.；Yue,Y.；Li,Y.；Shao,S.Analyst 2015,140,574.]。
此类方法的主要缺点是在活体检测中，生物组织对人体的生理组织对对超声信号的散射要比一般的光学信号低3～4个数量级，也就是说光声成像能提供更深成像深度和更高的成像分辨率。因此，合成一种特异性的硝基还原酶光声探针能够检测深层乏氧肿瘤组织中硝基还原酶，将实现了对生理组织中硝基还原酶更精确，无损，高分辨的检测具有重要意义。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种用于活体检测硝基还原酶的光声探针。
本发明的另一目的在于提供所述用于活体检测硝基还原酶的光声探针的制备方法。该制备方法主要是以苯并Cy7-Cl为原料通过亲核取代，克脑文盖尔缩合反应，氯甲酸酯亲核取代反应得到。
本发明的又一目的在于提供所述用于活体检测硝基还原酶的光声探针的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种用于活体检测硝基还原酶的光声探针，其结构式如式I所示：
所述的用于活体检测硝基还原酶的光声探针的制备方法，包括如下步骤：
①在氮气保护下，将DMF溶于二氯甲烷中，得到DMF溶液；
②将三氯氧磷溶于冰浴下的二氯甲烷中，然后将获得的三氯氧磷溶液加入到步骤①中得到的DMF溶液中，氮气保护下搅拌均匀，得到混合溶液；
③将环己酮加入步骤②中得到的混合溶液中，进行回流反应，再将反应后获得的混合物倒入冰水中过夜，得到化合物A；
④将1,2,2-三甲基苯并吲哚和碘甲烷溶于甲苯中，搅拌反应，反应结束后冷却至室温，过滤、洗涤，得到化合物B；
⑤将步骤③中得到的化合物A、步骤④中得到的化合物B，以及乙酸钠溶于乙酸酐中，搅拌反应，反应结束后冷却至室温，过滤、洗涤、真空干燥，过硅胶柱纯化，得到苯并Cy7-Cl；
⑥先将间苯二酚，碳酸钾加入无水乙腈中室温搅拌，再将苯并Cy7-Cl加入乙腈中加热搅拌，反应结束后，减压蒸干溶剂，过硅胶柱纯化，得到蓝绿色固体苯并Cy7-OH；
⑦取过柱纯化后的苯并Cy7-OH溶于乙腈中，再加入对硝基苄基氯甲酸酯和三乙胺，室温搅拌，得到蓝紫色溶液，减压蒸干溶剂得到粗产物探针苯并Cy7-NO2，过硅胶柱纯化得到蓝紫色固体苯并Cy7-NO2，即用于活体检测硝基还原酶的光声探针。
步骤①中所述的DMF优选为冰冻的DMF；DMF是指N,N-二甲基甲酰胺。
步骤①中所述的DMF与二氯甲烷的体积比优选为1:1～1:2；更优选为1:1。
步骤②中所述的三氯氧磷与二氯甲烷的体积比优选为1.05:1～1.3:1；更优选为1.05:1。
步骤②中所述的三氯氧磷与所述DMF的体积比优选为1.05～1.3:2～2.7；更优选为1.05:2。
步骤②中所述的搅拌的时间优选为30min。
步骤③中所述的环己酮与所述混合溶液中三氯氧磷的体积比优选为1:2～2.5；更优选为1:2。
步骤③中所述的回流反应的条件优选为于80℃条件下进行回流反应3h。
步骤④中所述的1,2,2-三甲基苯并吲哚和碘乙烷的体积比优选为1:0.9～1.2；更优选为1:0.9。
步骤④中所述的1,2,2-三甲基苯并吲哚用量为按每毫升甲苯配比0.2mL1,2,2-三甲基苯并吲哚计算。
步骤④中所述的搅拌反应的条件优选为于100℃条件下搅拌反应20h。
步骤④中所述的洗涤为采用乙酸乙酯进行洗涤。
步骤⑤中所述的化合物A、化合物B和乙酸钠的摩尔比为0.6：1.3：0.6。
步骤⑤中所述的化合物A用量为按每毫升乙酸酐配比0.2mmol化合物A计算。
步骤⑤中所述的搅拌反应的条件优选为于60℃条件下搅拌反应3h。
步骤⑤中所述的洗涤为依次用饱和碳酸氢钠溶液和水进行洗涤；优选为通过如下步骤实现：先用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，直至无气泡出现，然后再用水洗涤两次。
步骤⑤中所述的硅胶柱纯化的洗脱剂优选为二氯甲烷：甲醇＝25：1。
步骤⑥中所述的间苯二酚与碳酸钾，苯并Cy7-Cl三者间的当量比优选为2.6～3.5：2.6～3.5：1；更优选为2.6：2.6：1。
步骤⑥中所述的中间苯二酚与碳酸钾在室温下搅拌的时间优选为10～20min；更优选为10min。
步骤⑥中所述的加热搅拌的温度优选为50～60℃；更优选为50℃。
步骤⑥中所述的硅胶柱纯化的洗脱剂优选为二氯甲烷：甲醇＝10：1～13：1；更优选为二氯甲烷：甲醇＝10：1。
步骤⑦中所述的苯并Cy7-OH与对硝基苄基氯甲酸酯和三乙胺的当量比为1：2.6：2.6。
步骤⑦中所述的室温搅拌的时间优选为2～2.5h；更优选为2h。
步骤⑦中所述的硅胶柱纯化的洗脱剂优选为二氯甲烷：甲醇＝25：1～30：1；更优选为二氯甲烷：甲醇＝25：1。
所述的用于活体检测硝基还原酶的光声探针在检测领域中的应用。
所述的检测为硝基还原酶在活体肿瘤体中的检测。
具体的，所述的检测为肿瘤细胞或肿瘤组织中硝基还原酶的检测。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明克服了荧光探针在活体检测中荧光信号的散射和组织吸收的问题，提供了一种光声成像探针用于检测活体肿瘤中硝基还原酶的。该探针的响应机理基于在缺氧条件下硝基还原酶可以利用NADH提供的电子将芳香硝基化合物还原为芳香氨基化合物，使探针整体的共轭体系电子云密度增大，从而导致探针反应前后吸收光谱发生红移，因此利用其反应前后吸收光谱在730nm处吸收的变化，将其设计为一种硝基还原酶响应的光声成像探针。
(2)本发明获得的探针的具有如下优点：光声信号穿透深度大，实现深层组织的成像，反应速度快，特异性好，比率检测更准确。该探针可以用于活体肿瘤中检测硝基还原酶，从而监控肿瘤的乏氧情况；或用于细胞中、生物样品中的硝基还原酶检测。
附图说明
图1是本发明实施例1中用于活体检测肿瘤内硝基还原酶的光声探针的制备合成路线图。
图2是本发明实施例1中所述探针的核磁共振氢谱图。
图3是本发明实施例1中所述探针的电感耦合等离子体质谱图。
图4是本发明实施例2中所述探针与不同浓度硝基还原酶反应后的吸收光谱图；其中，硝基还原酶的浓度以箭头的方向依次为0，5，10，15，20，25，30，35，40，50μg/mL。
图5是本发明实施例3中探针Ⅰ与不同浓度硝基还原酶反应后光声成像图及光声强度。
图6是本发明实施例4中探针Ⅰ在细胞中的荧光成像图；其中，氯化钴溶液的浓度从左至右依次为0，5，10，20μM。
图7是本发明实施例5中探针Ⅰ在活体中的光声成像图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1：一种用于活体检测肿瘤内硝基还原酶的光声探针的制备。
本发明所提供的一种用于活体检测肿瘤内硝基还原酶的光声探针的具体合成步骤如图1所示，具体如下：
①将冰冻的DMF 20mL在氮气保护下溶于20mL二氯甲烷中，得到DMF溶液；
②将10.5mL三氯氧磷溶于冰浴下的10mL二氯甲烷中，然后将三氯氧磷的二氯甲烷溶液逐滴加入步骤①中得到的DMF溶液中，氮气保护下搅拌30min，得到混合溶液；
③将5.26mL环己酮加入步骤②中得到的混合溶液中，混合物在80℃搅拌，回流3h；
④然后将步骤③中得到的混合物倒入冰水中，过夜，过滤得到黄色固体；
⑤将1,2,2-三甲基苯并吲哚2mL和1.8mL碘甲烷溶于10mL甲苯中，在100℃下搅拌20h；
⑥反应冷却至室温后，过滤，固体用乙酸乙酯洗涤得到蓝灰色固体；
⑦取0.21g 1.2mmol步骤④中得到的黄色固体，和0.81g 2.6mmol步骤⑥中得到的蓝灰色固体，以及0.1632g 1.2mmol乙酸钠，溶于6mL乙酸酐中；
⑧将步骤⑦中得到的混合物在60℃下搅拌3h；冷却至室温，过滤，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，直至无气泡出现，然后将固体用水洗涤两次，真空干燥得到墨绿色固体I；
⑨将墨绿色固体I过硅胶柱(二氯甲烷与甲醇的体积比＝100：4)，纯化得到产物苯并Cy7-Cl。
⑩先将间苯二酚248mg 2.25mmol，碳酸钾311mg 2.25mmol加入5mL无水乙腈中室温搅拌10min，再将苯并Cy7-Cl 526mg 0.9mmol加入乙腈中搅拌加热50℃，反应结束后，减压蒸干溶剂，过硅胶柱纯化(二氯甲烷与甲醇的体积比＝10：1)，得到蓝绿色固体苯并Cy7-OH。
取过柱纯化后的苯并Cy7-OH 100mg 0.23mmol溶于5mL乙腈中，再加入对硝基苄基氯甲酸酯129mg 0.6mmol和三乙胺0.6mmol，室温搅拌2h，点板监控，反应过程，待反应完全后减压出去溶剂，减压蒸干溶剂得到粗产物探针苯并Cy7-NO2，过硅胶柱纯化(二氯甲烷：甲醇＝25:1)，得到蓝紫色固体苯并Cy7-NO2，命名为探针I。
表征数据：
1HNMR(图2)：(600MHz,CDCl3)δ＝8.66(d,J＝13.3Hz,1H),8.31(m,1H),8.16(d,J＝8.5Hz,1H),8.03(m,1H),7.69(d,J＝8.5,3H),7.36(d,J＝8.5,1H),7.23(s,1H),7.09(dd,J＝2.11,8.48Hz,2H),6.99(s,2H),6.68(d,J＝2.14,1H),6.37(s,2H),5.44(s,2H),4.21(m,3H),2.76(d,J＝9.8Hz,2H),2.69(m,2H)2.03(s,6H),1.52(t,J＝7.43Hz,1H),1.3(d,J＝7.19,1H),
LC-MS(图3):calcd.for[M+]434.4,,found:434.
实施例2：探针Ⅰ与硝基还原酶反应前后的吸收。
配置实施例1中获得的探针Ⅰ溶液以及硝基还原酶水溶液，然后将探针Ⅰ溶液与硝基还原酶水溶液混合反应五分钟后测定其吸收；其中，反应体系中探针Ⅰ的浓度为100μM，硝基还原酶的浓度从0到50μg/mL(0，5，10，15，20，25，30，35，40，50μg/mL)。吸收光谱如图4所示，从图中可以看出探针在与硝基还原酶反应后吸收光谱发生红移。
实施例3：探针Ⅰ与不同浓度硝基还原酶反应后光声成像图。
配置浓度为100μM探针Ⅰ溶液共6组，以及浓度为0，10，20，30，40，50μg/mL的硝基还原酶水溶液，5mmol/L的NADH溶液，然后将探针Ⅰ溶液与硝基还原酶水溶液，NADH溶液，混合后37℃进行反应(探针Ⅰ溶液的用量为40μL，硝基还原酶水溶液的用量均为1μL，NADH用量为5μL)，每组各自反应5分钟后，用光声计算机断层扫描仪测定6组溶液的光声信号，以及光声二维图(图5)。从图中可以看出光声信号随浓度的增加730nm的光声信号强度逐渐增强，表明探针可以作为检测硝基还原酶的比率光声探针。
实施例4：探针Ⅰ在细胞中的荧光成像图。
将探针10μM和提前与不同浓度(0，5，10，20μM)氯化钴溶液孵育的A549细胞(购买于北京北纳创联生物技术研究院)孵育30min。用激光共聚焦荧光显微镜进行成像。结果如图6所示，结果证明探针能够用于检测不同乏氧程度细胞中的硝基还原酶。
实施例5：探针Ⅰ在活体中的光声成像图及比率成像图。
将探针Ⅰ(2mg/kg)尾静脉注射到小鼠(3～4周BABc鼠，平均2体重20g，购买于南方医科大学)体内后1，4，6，8，12，24h后利用光声计算机断层扫描仪对小鼠肿瘤部位进行成像，在730nm脉冲激光照射下进行成像。结果如图7所示，从图中可以看出随着探针在小鼠体内代谢到肿瘤部位后对内源性硝基还原酶的光声成像。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于活体检测硝基还原酶的光声探针，其特征在于：该光声探针的结构式如式I所示：
2.权利要求1所述的用于活体检测硝基还原酶的光声探针的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
①在氮气保护下，将DMF溶于二氯甲烷中，得到DMF溶液；
②将三氯氧磷溶于冰浴下的二氯甲烷中，然后将获得的三氯氧磷溶液加入到步骤①中得到的DMF溶液中，氮气保护下搅拌均匀，得到混合溶液；
③将环己酮加入步骤②中得到的混合溶液中，进行回流反应，再将反应后获得的混合物倒入冰水中过夜，得到化合物A；
④将1,2,2-三甲基苯并吲哚和碘甲烷溶于甲苯中，搅拌反应，反应结束后冷却至室温，过滤、洗涤，得到化合物B；
⑤将步骤③中得到的化合物A、步骤④中得到的化合物B，以及乙酸钠溶于乙酸酐中，搅拌反应，反应结束后冷却至室温，过滤、洗涤、真空干燥，过硅胶柱纯化，得到苯并Cy7-Cl；
⑥先将间苯二酚，碳酸钾加入无水乙腈中室温搅拌，再将苯并Cy7-Cl加入乙腈中加热搅拌，反应结束后，减压蒸干溶剂，过硅胶柱纯化，得到蓝绿色固体苯并Cy7-OH；
⑦取过柱纯化后的苯并Cy7-OH溶于乙腈中，再加入对硝基苄基氯甲酸酯和三乙胺，室温搅拌，得到蓝紫色溶液，减压蒸干溶剂得到粗产物探针苯并Cy7-NO2，过硅胶柱纯化得到蓝紫色固体苯并Cy7-NO2，即用于活体检测硝基还原酶的光声探针。
3.根据权利要求2所述的用于活体检测硝基还原酶的光声探针的制备方法，其特征在于：
步骤①中所述的DMF与二氯甲烷的体积比为1:1～1:2；
步骤②中所述的三氯氧磷与二氯甲烷的体积比为1.05:1～1.3:1；
步骤②中所述的三氯氧磷与所述DMF的体积比为1.05～1.3:2～2.7；
步骤③中所述的环己酮与所述混合溶液中三氯氧磷的体积比为1:2～2.5；
步骤④中所述的1,2,2-三甲基苯并吲哚和碘乙烷的体积比为1:0.9～1.2；
步骤④中所述的1,2,2-三甲基苯并吲哚用量为按每毫升甲苯配比0.2mL1,2,2-三甲基苯并吲哚计算；
步骤⑤中所述的化合物A、化合物B和乙酸钠的摩尔比为0.6：1.3：0.6；
步骤⑤中所述的化合物A用量为按每毫升乙酸酐配比0.2mmol化合物A计算；
步骤⑥中所述的间苯二酚与碳酸钾，苯并Cy7-Cl三者间的当量比为2.6～3.5：2.6～3.5：1；
步骤⑦中所述的苯并Cy7-OH与对硝基苄基氯甲酸酯和三乙胺的当量比为1：2.6：2.6。
4.根据权利要求3所述的用于活体检测硝基还原酶的光声探针的制备方法，其特征在于：
步骤①中所述的DMF与二氯甲烷的体积比为1:1；
步骤②中所述的三氯氧磷与二氯甲烷的体积比为1.05:1；
步骤②中所述的三氯氧磷与所述DMF的体积比为1.05:2；
步骤③中所述的环己酮与所述混合溶液中三氯氧磷的体积比为1:2；
步骤④中所述的1,2,2-三甲基苯并吲哚和碘乙烷的体积比为1:0.9；
步骤⑥中所述的间苯二酚与碳酸钾，苯并Cy7-Cl三者间的当量比为2.6：2.6：1。
5.根据权利要求2所述的用于活体检测硝基还原酶的光声探针的制备方法，其特征在于：
步骤②中所述的搅拌的时间为30min；
步骤③中所述的回流反应的条件为于80℃条件下进行回流反应3h；
步骤④中所述的搅拌反应的条件为于100℃条件下搅拌反应20h；
步骤④中所述的洗涤为采用乙酸乙酯进行洗涤；
步骤⑤中所述的搅拌反应的条件为于60℃条件下搅拌反应3h；
步骤⑤中所述的洗涤为依次用饱和碳酸氢钠溶液和水进行洗涤；具体通过如下步骤实现：先用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，直至无气泡出现，然后再用水洗涤两次；
步骤⑥中所述的中间苯二酚与碳酸钾在室温下搅拌的时间为10～20min；
步骤⑥中所述的加热搅拌的温度为50～60℃；
步骤⑦中所述的室温搅拌的时间为2～2.5h。
6.根据权利要求5所述的用于活体检测硝基还原酶的光声探针的制备方法，其特征在于：
步骤⑥中所述的中间苯二酚与碳酸钾在室温下搅拌的时间为10min；
步骤⑥中所述的加热搅拌的温度为50℃；
步骤⑦中所述的室温搅拌的时间为2h。
7.根据权利要求2所述的用于活体检测硝基还原酶的光声探针的制备方法，其特征在于：
步骤⑤中所述的硅胶柱纯化的洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝25：1；
步骤⑥中所述的硅胶柱纯化的洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝10：1～13：1；
步骤⑦中所述的硅胶柱纯化的洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝25：1～30：1。
8.根据权利要求7所述的用于活体检测硝基还原酶的光声探针的制备方法，其特征在于：
步骤⑥中所述的硅胶柱纯化的洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝10：1；
步骤⑦中所述的硅胶柱纯化的洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝25：1。
9.权利要求1所述的用于活体检测硝基还原酶的光声探针在检测领域中的应用，其特征在于：所述的检测为硝基还原酶在活体肿瘤体中的检测。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：
所述的检测为肿瘤细胞或肿瘤组织中硝基还原酶的检测。
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