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CN109576392A - 一种辅助选择高千粒重小麦品种的引物对及其应用 - Google Patents

一种辅助选择高千粒重小麦品种的引物对及其应用 Download PDF

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CN109576392A CN201910033908.5A CN201910033908A CN109576392A CN 109576392 A CN109576392 A CN 109576392A CN 201910033908 A CN201910033908 A CN 201910033908A CN 109576392 A CN109576392 A CN 109576392A
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杜晨阳
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王晨阳
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Henan Agricultural University
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Abstract

本发明涉及一种辅助筛选具有不同千粒重性状小麦/品种的方法及其专用引物。一种辅助选择高千粒重小麦品种的引物对325F/R，由序列表的序列3所示的单链DNA片段和序列表4所示的单链DNA片段组成。利用所述引物对325F/R辅助鉴定具有不同千粒重性状小麦/品种的方法，以小麦基因组DNA为模板，用引物对325F/R进行PCR扩增，若扩增产物长度为275bp，则待测小麦的基因型为TaMGD‑B1a，具有较高千粒重；若扩增产物长度为325bp，则待测小麦的基因型为TaMGD‑B1b，具有较低千粒重。本发明方法及引物对用于小麦育种材料的早代选择，不受环境和栽培条件的限制，选择目标清晰准确，节省时间和资源，有利于高产小麦的选育，加快育种进程。

Description

一种辅助选择高千粒重小麦品种的引物对及其应用
技术领域
本发明涉及一种辅助筛选具有不同千粒重性状小麦的方法及其专用引物。
背景技术
小麦是世界第一大粮食作物，在我国为仅次于水稻的第二大粮食作物，其产量高低和品质优劣直接影响到人类食物供应程度和营养水平。淀粉是小麦籽粒中含量最多而且也是最重要的碳水化合物，约占粒重70%以上，籽粒淀粉含量、直/支比例、淀粉粒度分布以及淀粉糊化特性等决定小麦的产量和品质。
淀粉的生物合成在造粉体中通过一系列酶促反应完成。研究表明造粉体不仅仅是合成和储藏淀粉的场所，同时具有广阔的代谢功能，可能通过调控碳氮代谢等来影响淀粉的合成。李三峰（2017）认为造粉体的发育直接影响到淀粉含量和复合淀粉颗粒的形态，最终影响稻米产量。Myers（2011）对玉米opaque5突变体的研究发现编码MGDG合酶基因的突变影响胚乳的发育，表明造粉体在淀粉粒形成中起重要的调控功能。在水稻上的研究表明，叶片中MGDG与光合作用关系紧密，可以提高叶片的光合速率。
造粉体膜与淀粉含量及特征形成有关，而糖脂是造粉体膜的主要成分，其中单半乳糖甘油二酯（MGDG）、双半乳糖甘油二酯（DGDG）占淀粉表面总极性脂的95%左右。单半乳糖甘油二酯合成酶（MGD）是合成MGDG的关键酶。关于TaMGD与籽粒粒重的关系未见相关报道。
功能标记（Functional marker）是一类基于基因特征序列开发的标记，与目标基因共分离，大大提高了选择的准确性，在MAS中有着广泛应用前景。而小麦千粒重是一个数量性状，受基因型、环境及其互作的影响。因此，克隆和开发小麦TaMGD基因对小麦高产育种具有重要意义。
发明内容
本发明针对现有技术不足，提出一种辅助选择高千粒重小麦品种的引物，并将之用于辅助筛选具有不同千粒重性状小麦及小麦育种。
本发明采用的技术方案：
一种辅助选择高千粒重小麦品种的引物对325F/R，由序列表的序列3所示的单链DNA片段和序列表4所示的单链DNA片段组成。
所述引物对325F/R的应用如下：
（1）鉴定待测小麦携带基因型是TaMGD-B1a基因还是TaMGD-B1b基因；
（2）辅助筛选携带TaMGD-B1a基因或是TaMGD-B1b基因的小麦品种；
（3）辅助鉴定/测定待测小麦的千粒重；
（4）辅助比较不同待测小麦品种的千粒重；
（5）用于制作辅助鉴定具有不同千粒重性状小麦的试剂盒；
所述等位基因TaMGD-B1a如序列表的序列 1 所示；所述等位基因TaMGD-B1b如序列表的序列 2 所示。
以待测小麦的基因组DNA为模板，用权利要求1所述引物对325F/R扩增得到的DNA片段：所述DNA片段为序列表1自5’末端2508-2782所示的核苷酸或序列表2中自5’末端2506-2830所示的核苷酸；
所述DNA片段的应用，为如下（a）或（b）：
（a）辅助鉴定待测小麦的千粒重；
（b）辅助比较不同待测小麦品种的千粒重。
序列表1所示的DNA分子；序列表2所示的DNA分子。
等位基因TaMGD-B1a和TaMGD-B1b的应用，为如下：
（a）辅助鉴定待测小麦的千粒重；（b）辅助比较不同待测小麦品种的千粒重。
所述等位基因TaMGD-B1a如序列表的序列1所示；所述等位基因TaMGD-B1b如序列表的序列2所示。
一种利用所述引物对325F/R辅助鉴定具有不同千粒重性状小麦/品种的方法，包括以下步骤：以小麦基因组DNA为模板，用引物对325F/R进行PCR扩增，若扩增产物长度为275bp，则待测小麦的基因型为TaMGD-B1a，具有较高千粒重；若扩增产物长度为325bp，则待测小麦的基因型为TaMGD-B1b，具有较低千粒重。
发明有益效果：
本发明首次公开了普通小麦TaMGD基因的等位变异序列TaMGD-B1a和TaMGD-B1b，提供了鉴定TaMGD-B1a和TaMGD-B1b等位变异的功能标记及其与粒重的关系。
本发明还开发了辅助选择高千粒重小麦品种的引物对325F/R，通过该分子标记对小麦DNA进行PCR扩增，用于鉴定和筛选具有较高千粒重的小麦品种或品系。
本发明标记可用于小麦育种材料的早代选择，不受环境和栽培条件的限制，选择目标清晰准确，节省时间和资源，加快育种进程，有利于高产小麦的选育，同时高千粒重小麦籽粒有利于磨粉品质的改善。
附图说明
图1为来源于普通小麦的2个籽粒粒重相关基因TaMGD-B1a与TaMGD-B1b的序列对比；图中下划线部分为外显子，加粗部分为差异片段，加粗且加下划线部分为引物序列；
图2为引物对325F/R对16个不同粒重材料的多态性检测，M：500bp DNA Maker。
具体实施方式
下面通过具体实施方式，对本发明技术方案做进一步的详细描述。以下各实施例仅用于说明本发明，不应当构成对本发明保护范围的限定。本领域技术人员在现有技术范围内，采用惯用技术手段的置换以及和现有技术进行简单组合，均不脱离本发明保护范围。
实施例1
一种辅助选择高千粒重小麦品种的引物对325F/R，所述引物对325F/R由：上游引物325F所示单链DNA片段：5’-CCCTTGTCTATTCATTACTGCC-3’（序列表3）以及下游引物325R所示单链DNA片段：5’-ACCACAAATGACAACAAGCTG-3’组成（序列表4）。
所述引物对325F/R的可应用于：
（1）鉴定待测小麦携带基因型是TaMGD-B1a基因还是TaMGD-B1b基因；
（2）辅助筛选携带TaMGD-B1a基因或是TaMGD-B1b基因的小麦品种；
（3）辅助鉴定/测定待测小麦的千粒重；
（4）辅助比较不同待测小麦品种的千粒重；
（5）用于制作辅助鉴定具有不同千粒重性状小麦的试剂盒；
实施例2
本实施例为利用前述引物对325F/R辅助鉴定具有不同千粒重性状小麦/品种的方法，包括以下步骤：以小麦基因组DNA为模板，用引物对325F/R进行PCR扩增，若扩增产物长度为275bp，则待测小麦的基因型为TaMGD-B1a，具有较高千粒重；若扩增产物长度为325bp，则待测小麦的基因型为TaMGD-B1b，具有较低千粒重。
实施例3
本实施例公开了获得基因型TaMGD-B1a和TaMGD-B1b基因的方法，采用小麦品种许科316和郑麦366进行DNA提取及MGD序列分析：
1、TaMGD-B1a与TaMGD-B1b基因的获得
根据中国春MGD基因序列（GeneID:TRIAE_CS42_6BL_TGACv1_499471_AA1583540.1）
设计特异性引物MGD-BF/R（表1），分别扩增许科316和郑麦366小麦籽粒MGD基因。引物设计采用Primier Primer5软件。
表1 用于扩增小麦MGD基因全长的引物序列
PCR反应以郑麦366和许科316基因组DNA为模板，50 µl PCR反应体系为：模板DNA200ng，Phanta® Max Super-Fidelity DNA Polymerase（南京诺唯赞生物科技有限公司）1µl，上下游引物（10 μmol·L-1）各2µl，2×buffer 25µl，ddH2O补充反应体系至50 µl。引物对MGD-BF/R PCR反应的退火温度为62℃（除预变性和变性温度修改为98℃外，其余程序均参照说明书设置）。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后切胶纯化回收克隆至ZT4-Blunt载体（北京庄盟国际生物基因科技有限公司），测序由北京六合华大基因完成。
图1所示为来源于普通小麦的2个籽粒粒重相关基因TaMGD-B1a与TaMGD-B1b的序列对比。图中，TaMGD-B1a为许科316系列，TaMGD-B1b为郑麦366序列；下划线所在碱基部分为外显子，加粗部分为差异片段，加粗且加下划线部分为引物序列。
2、郑麦366与许科316 MGD基因差异分析
许科316品种扩增出的基因型定义为TaMGD-B1a（序列如序列表1所示），郑麦366品种扩增出的基因型定义为TaMGD-B1b（序列如序列表2所示）。
所述等位基因TaMGD-B1a和/或TaMGD-B1b，可应用于：（a）辅助鉴定待测小麦的千粒重；（b）辅助比较不同待测小麦品种的千粒重。
实施例4
本实施例以实验的方式，通过对小麦千粒重性状与基因型的相关性分析，具体阐述了利用引物对325F/R辅助鉴定具有不同千粒重性状小麦的方法。
一、功能标记引物设计
根据序列表中的序列1、序列2设计引物对325F/R，PCR产物包含上述50bp InDel。
325F(上游引物)：5’-CCCTTGTCTATTCATTACTGCC-3’（序列3）
325R(下游引物)：5’-ACCACAAATGACAACAAGCTG-3’（序列4）
用引物对325F/R扩增小麦基因组DNA，会得到两种PCR产物类型，类型TaMGD-B1a长度为275bp，类型TaMGD-B1b长度为325bp，参见图2。
二、小麦千粒重性状与基因型的相关性分析
试验材料包括136份中国冬小麦栽培品种（2017年种植于河南荥阳）；
1、小麦籽粒千粒重的测定
2、小麦基因型的测定
提取小麦基因组DNA，按照以下步骤进行基因型鉴定：
①以小麦基因组DNA为模板，用引物对325F/R进行PCR扩增。
PCR反应体系：模板DNA 200ng，2×T5 Super PCR Mix（北京擎科新业生物技术有限公司）1µl，上下游引物（10μmol·L-1）各0.5µl ，用ddH2O补充反应体系至20ul。
PCR反应程序：首先98℃、3min；然后98℃、10s，57℃、10s，72℃、10s，共34个循环；最后72℃、5min。扩增产物于4℃保存。
②将PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳检测。
图2为16个品种检测结果图。依次为中国春、郑麦366、平安8号、洛麦23、洛麦24、驻麦305、丰德存10号、宁麦9号、许科316，花培8号、周麦22、周麦23、平安0658、西农364、豫农186、新麦2111。
材料Ⅰ136个样本中，74个样本扩增出275bp片段，基因型为TaMGD-B1a类型，62个样本扩增出325bp片段，基因型为TaMGD-B1b。136个小麦品种，千粒重测定结果和基因型鉴定结果见表2。
表2：136份中国冬小麦的品种、千粒重测定结果和基因型测定结果
编号 品种名称 千粒重 片段长度
1 泰禾麦2号 58.73 275bp
2 中保麦1号 58.23 275bp
3 泉麦29 57.80 275bp
4 西农916 57.30 275bp
5 鄂麦170 57.20 275bp
6 中农875 56.81 275bp
7 周麦22 56.74 275bp
8 涡麦66 56.72 275bp
9 泛麦7073 56.62 275bp
10 郑麦7698 56.52 275bp
11 新麦2111 56.52 275bp
12 中新16 56.33 275bp
13 赛德麦601 56.08 275bp
14 郑麦1860 55.93 275bp
15 豫农502 55.88 275bp
16 赛德麦3号 55.86 275bp
17 轮选166 55.56 275bp
18 泛麦803-1 55.48 275bp
19 轮选66 55.39 275bp
20 洛麦32 55.34 275bp
21 存麦18号 55.12 275bp
22 周麦27 55.00 275bp
23 郑麦936 54.91 275bp
24 濮麦1165 54.41 275bp
25 中育1152 54.35 275bp
26 中麦170 54.03 275bp
27 济麦22 53.99 325bp
28 宁08-30 53.89 325bp
29 锦绣21 53.74 325bp
30 濮兴8号 53.73 275bp
31 中育1428 53.71 275bp
32 泛育麦17 53.56 275bp
33 豫农186 53.50 275bp
34 金丰205 53.43 275bp
35 周麦18 53.39 275bp
36 西农188 53.23 275bp
37 郑麦618 52.91 275bp
38 盛农2号 52.79 325bp
39 中农麦4007 52.78 275bp
40 周麦16 52.73 275bp
41 郑麦119 52.71 325bp
42 良星66 52.64 275bp
43 农大2011 52.48 325bp
44 豫农211 52.36 325bp
45 鄂麦526 52.35 275bp
46 周麦23 52.29 275bp
47 郑麦1342 52.13 275bp
48 郑品麦22号 52.09 275bp
49 郑麦136 52.04 325bp
50 平安0602 52.04 275bp
51 良星99 51.78 325bp
52 平安0518 51.74 275bp
53 郑168 51.71 275bp
54 丰德存麦20 51.62 275bp
55 光泰68 51.54 325bp
56 兰考380 51.52 325bp
57 徐9074 51.48 275bp
58 瑞泉麦168 51.34 325bp
59 郑育麦16 51.34 325bp
60 存麦12 51.06 325bp
61 郑99515 50.93 325bp
62 平安0658 50.90 275bp
63 郑品麦24号 50.84 275bp
64 西农585 50.75 325bp
65 郑麦103 50.74 325bp
66 中育12 50.66 275bp
67 泛区麦16 50.62 275bp
68 淮核12013 50.29 325bp
69 矮抗58 50.17 325bp
70 洛麦29 50.17 325bp
71 中农895 50.12 275bp
72 百农金光588 50.11 325bp
73 新科麦169 49.90 325bp
74 农大2011 49.88 275bp
75 郑品麦25号 49.66 275bp
76 豫丰11 49.41 275bp
77 百农307 49.37 325bp
78 百农418 49.32 325bp
79 中育9398 49.10 325bp
80 中泛159 49.09 325bp
81 中麦247 49.01 325bp
82 郑麦369 48.87 325bp
83 轮选21 48.79 325bp
84 濮兴5号 48.79 275bp
85 龙科1221 48.54 325bp
86 郑麦1354 48.46 275bp
87 西农529 48.24 275bp
88 瑞华1426 48.23 325bp
89 瑞华1101 48.21 275bp
90 益科麦5号 47.95 325bp
91 中泛7039 47.90 275bp
92 西农364 47.74 275bp
93 瑞华055 47.71 325bp
94 百农416 47.63 325bp
95 中金13 47.53 275bp
96 中育9307 47.52 325bp
97 西农167 47.33 275bp
98 龙科1211 47.23 325bp
99 新麦45 47.14 325bp
100 西农524 47.11 275bp
101 百农207 47.10 325bp
102 中泛428 47.06 275bp
103 资0821（R.toPM） 46.94 275bp
104 泛麦8号 46.90 325bp
105 丹麦118 46.90 325bp
106 扬辐麦9144 46.84 275bp
107 兰考198 46.82 325bp
108 轮选33 46.72 275bp
109 赛德麦4号 45.90 325bp
110 PIC447 45.89 275bp
111 丰德存10号 45.81 325bp
112 西农511 45.77 275bp
113 新麦31 45.61 325bp
114 09M20 45.58 325bp
115 NMAS020 45.08 325bp
116 濮麦8062 44.46 325bp
117 新麦26 43.86 275bp
118 瑞华1426 43.27 325bp
119 周麦24 43.25 325bp
120 望水白 43.24 325bp
121 中麦66 42.94 275bp
122 封麦6号 42.88 275bp
123 新麦35 42.19 275bp
124 南农0686 41.58 325bp
125 洛麦24 41.55 325bp
126 10M20 41.55 325bp
127 驻麦305 41.10 325bp
128 泛麦803 40.96 275bp
129 宁麦9号 40.20 325bp
130 洛麦23 40.16 325bp
131 平安8号 39.48 325bp
132 节燕2000-1 38.39 325bp
133 网93 38.34 325bp
134 苏麦3号 37.00 325bp
135 苏夫 35.00 325bp
136 NMAS001 34.26 325bp
表3：小麦TaMGD基因等位变异与籽粒粒重高低关系的统计分析结果
试验材料 等位变异 检测材料数目 平均千粒重（g） 标准差
І TaMGD-B1a 74 51.86 A 4.19
TaMGD-B1b 62 47.09 B 4.76
通过对小麦千粒重与基因型的相关性分析，得出以下结论：以小麦基因组DNA为模板，用引物对325F/R进行PCR扩增，若产物长度为275bp，说明该小麦材料基因型为TaMGD-B1a，具有较高千粒重；若产物长度为325bp，则该小麦材料基因型为TaMGD-B1b，具有较低千粒重。
本发明引物对325F/R，除了用于小麦基因型的测定，用于辅助鉴定/测定/比较待测小麦/品种的千粒重，还可用于制作辅助鉴定具有不同千粒重性状小麦的试剂盒。采用该引物对325F/R辅助鉴定具有不同千粒重性状小麦，用于小麦育种，可提高选择效率，加快育种进程。

Claims (8)

1.一种辅助选择高千粒重小麦品种的引物对325F/R，由序列表的序列3所示的单链DNA片段和序列表4所示的单链DNA片段组成。
2.权利要求1所述引物对325F/R的如下应用：
（1）鉴定待测小麦携带基因型是TaMGD-B1a基因还是TaMGD-B1b基因；
（2）辅助筛选携带TaMGD-B1a基因或是TaMGD-B1b基因的小麦品种；
（3）辅助鉴定/测定待测小麦的千粒重；
（4）辅助比较不同待测小麦品种的千粒重；
（5）用于制作辅助鉴定具有不同千粒重性状小麦的试剂盒；
所述等位基因TaMGD-B1a如序列表的序列 1 所示，等位基因TaMGD-B1b如序列表的序列 2 所示。
3.以待测小麦的基因组DNA为模板，用权利要求1所述引物对325F/R扩增得到的DNA片段：所述DNA片段为序列表1自5’末端2508-2782所示的核苷酸或序列表2中自5’末端2506-2830所示的核苷酸。
4.权利要求3所述DNA片段的应用，为如下（a）或（b）：
（a）辅助鉴定待测小麦的千粒重；
（b）辅助比较不同待测小麦品种的千粒重。
5.序列表1所示的DNA分子。
6.序列表2所示的DNA分子。
7.等位基因TaMGD-B1a和/或TaMGD-B1b的如下应用：
（a）辅助鉴定待测小麦的千粒重；
（b）辅助比较不同待测小麦品种的千粒重；
所述等位基因TaMGD-B1a如序列表的序列1所示，等位基因TaMGD-B1b如序列表的序列2所示。
8.一种利用权利要求1所述引物对325F/R辅助鉴定具有不同千粒重性状小麦/品种的方法，包括以下步骤：以小麦基因组DNA为模板，用引物对325F/R进行PCR扩增，若扩增产物长度为275bp，则待测小麦的基因型为TaMGD-B1a，具有较高千粒重；若扩增产物长度为325bp，则待测小麦的基因型为TaMGD-B1b，具有较低千粒重。
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