CN109563462B - 检测特定核酸序列的完全集成的手持式设备 - Google Patents

Abstract

提供了一种用于检测靶核酸的完全集成的一次性即时检测设备。该设备包括：适于接受生物样品的提取室，其中所述提取室包括提取和裂解样品以释放核酸的装置；与提取室连通的第一扩增室，其中所述扩增室包括触发靶核酸序列的核酸扩增发生的装置；和与扩增室连通的检测室，其中所述检测室包括可检测地标记靶核酸的装置和检测与标记的靶核酸相关的信号的装置，或用于扩增、检测和鉴定多个核酸序列的单室。

Description

检测特定核酸序列的完全集成的手持式设备

技术领域

本发明涉及需求点(PON)或即时检测(POC)诊断设备领域，例如，所述设备用于检测感染性疾病，以及癌症和其他慢性疾病的生物标志物。

背景技术

传统的感染性疾病测试方法(例如培养和抗原检测)已经向更灵敏的核酸扩增试验(本文称为NAAT)转变。聚合酶链式反应(PCR)扩增为实验室提供了检测感染性疾病的灵敏且特异性的工具，并且已经被全世界的临床实验室所采用。

目前的分子诊断工具被大量的“芯片外”临床样品制备时间和对熟练技术人员的要求所限制。这限制了分子诊断在家里或资源匮乏的环境下的应用。典型的诊断试验可以在3小时至5天的时间内完成。然而，在某些环境下，这不能提供有用的诊断信息。

在过去的十年中，使用微流体装置将诊断分析小型化为“芯片上的实验室”的形式已引起很多关注。微流体装置通常较小且需要非常少的样品体积，这有利于分子诊断。这种技术可用于构建例如用于床边的POC诊断工具，并提供快速的诊断结果。然而，POC设备的成本是重要的，应当尽可能低，尤其是用于资源匮乏的环境。目前，复杂且昂贵的样品制备和DNA检测技术阻碍了廉价的、完全一次性的POC设备的构建。

已经开发了以“芯片上”全自动形式或不需要人工干预的从临床样品(血液、尿液、鼻咽拭子、粪便材料)分离感染性颗粒(病毒、细菌或真菌)的设备。例如，WO110019A1公开了可以将病原体或核酸结合至磁珠，随后将其移动到二级室进行检测的微流体平台。此外，WO122564A2公开了从病原体释放细胞内容物并随后转移一部分内容物用于检测的设备。US2008/0299648A1公开了包括样品收集元件和免疫层析测试条的独立诊断试剂盒。US 8,574,923B2公开了一种样品制备装置，其使用整体吸收剂特异性结合核酸或使用样品过滤器结合任何目标分析物并裂解细胞膜。WO2012/013733A1公开了用于诊断目的的从各种液体基质分离核酸用于制备通用样品的装置。最后，WO2013/158686A1公开了一种核酸样品制备装置，其需要最少的操作时间并且可以从各种细胞混合物中纯化核酸。

在感染性疾病的检测中，首先分离感染性颗粒，然后必须将其裂解以释放细胞内容物，包括DNA、RNA和蛋白质。虽然已经表征了几种从细胞释放核酸和蛋白质的方法，但是将它们整合到诊断POC平台中显著增加了设备的复杂性。对于机械裂解，需要电动机元件，这会增加设备的成本和复杂性。对于化学裂解，难以施用正确量的裂解试剂并随后在下游分析之前除去该试剂。NAAT技术对化学污染特别敏感，所有裂解化学品必须在下一步骤(包括酶促扩增和检测)之前去除。

聚合酶链式反应(PCR)是使用热稳定DNA聚合酶和热循环的组合将致病性DNA序列扩增至高浓度的常用技术。然而，PCR通常需要在约50℃和95℃之间进行热循环以进行扩增，并且将热循环整合到POC诊断平台中将增加开发POC分子诊断设备的复杂性和成本。

在POC诊断中使用一次性系统对于居家测试、资源贫乏的环境或无中心实验室资源的社区医院有吸引力，但是读出所需的辅助系统通常是昂贵且专用的，这限制了它们的一次性使用。这也可能导致独立单元或读取器的昂贵的初始资本投资。

因此，需要开发便携式的、一次性的即时检测设备。

发明简述

现在已经开发了一种独立的即时检测设备，其适于接受原始临床样品(例如血液、尿液、粪便材料、鼻咽拭子等)，释放病原体细胞内容物，扩增和检测特定的核酸序列并显示结果，无需任何外部设备或装置的干预。这种完全集成的独立即时检测设备也是单次使用的可弃置设备。

因此，提供一种用于检测靶核酸序列的完全集成的独立即时检测设备，包括：

提取室，其适于接受用于提取和裂解样品以释放核酸的生物样品；

扩增室，用于接受用于扩增靶核酸序列的扩增试剂；

与所述扩增室连通的检测元件，所述检测元件包含检测剂，所述检测剂产生与扩增的靶核酸相关的可检测信号；和

读取区，用于显示所述可检测信号。

在一个实施方案中，提取和扩增室是单室，并且检测元件包括可以形成扩增室的一部分壁的检测表面。在一个实施方案中，所述设备包括用于多个靶核酸序列的扩增试剂，其中将靶向特定核酸片段的不同核酸捕获探针涂覆到检测表面的特定位置上，使得能够在单室中检测多个靶核酸。

通过参考下面的附图和描述，本发明的这些和其他方面将变得显而易见。

附图说明

图1是本发明实施方案的框图(A)，和包括各种视图的根据本发明实施方案的POC设备的示意图，其具有示例尺寸，其中L是例如2.75”，W是例如1.05”，和D是例如0.25”(B)；以及根据本发明另一实施方案的POC设备的照片(C)。

图2图示说明通过施加电压，自调节加热器可以在不同电阻(3.8ohm、3.5ohm和3.4ohm)下将250μl水加热至95℃持续20分钟。

图3图示说明通过施加电压，自调节加热器可以在8.6ohm的电阻下将250μl水加热到63℃。

图4图示说明使用荧光染料(SYBR Green)在扩增后检测甲型流感病毒、RSV、大肠杆菌(E.coli)和化脓性链球菌(S.pyogenes)。

图5示出了使用Quant-iT PicoGreen DNA结合染料，在扩增之前和之后的视觉颜色变化分析和红色、绿色、蓝色光谱分析。

图6图示说明了使用2种浓度的亚甲蓝对扩增的化脓性链球菌DNA的电化学检测和峰值阳极电流测量。

图7是示出可用于实现本技术的各方面的示例性计算机系统的框图；和

图8是示出可用于实现本技术的各方面的示例性智能手机的框图；

图9a是具有单个裂解室和多个通道的设备的框图，所述多个通道用于扩增和检测特定核酸序列，包括多个洗涤步骤。

图9b显示单个或多个通道设备的裂解和扩增室中的温度曲线，包括洗涤步骤。

图10是具有单个裂解室和多个平行通道的设备的框图，所述多个平行通道用于扩增和检测多种特定类型的核酸，其中不包括洗涤步骤。

图11图示了用于裂解、扩增和采用特定的核酸捕获位置来检测多种病原体的单室设备的设计。

图12显示通过总核酸捕获或特异性靶标捕获除去扩增抑制剂后，粪便样品中靶标的扩增和检测。

图13显示通过总核酸捕获或特异性靶标捕获去除扩增抑制剂后，尿液样品中靶标的扩增和检测。

发明详述

提供了用于检测靶核酸的完全集成的、独立的、单次使用的即时检测设备(参见例如图1A)。该设备包括提取室12，其适于接受生物样品并裂解样品以释放核酸；与提取室12连通的第一扩增室20，其从提取室12接受样品的等分试样，并包括扩增样品中的靶核酸的装置；和检测室，在一个实施方案中是与扩增室20相同的室，而在另一个实施方案中，是与扩增室12连通的单独的检测室50，其包括标记靶核酸用于检测的装置和检测标记的装置。如本文所用，术语“提取室”是指其中进行样品提取和裂解的腔室。

在一个方面，术语“核酸”没有特别限制，包括但不限于脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)(包括例如与疾病相关的特定的mRNA转录物或siRNA)，且核酸可以来自不同的来源，例如细菌、病毒、动物(特别是人)和真菌。在一个实施方案中，来源是病原体。

可以使用用于将样品转移到设备的提取室中的任何合适的载体来获得生物样品。在本发明的一个实施方案中，拭子8用于收集含核酸的生物或临床样品(例如血液、尿液、鼻咽拭子、粪便样品、阴道拭子、泪液、在伤口部位或炎症部位分泌的液体，或任何其他含核酸的临床材料)。如本领域技术人员将理解的，可以通过拭子之外的方式获得生物样品，例如通过其中可以浸入拭子的注射器或收集容器。将含有样品的拭子放置在设备提取室中的拭子接受开口中。使用的拭子可以是标准拭子，或专门为该设备设计的拭子。例如，拭子的尺寸可以设计成与提取室内部匹配，以允许用帽或盖子密封腔室的开口。当使用标准拭子时，可以在腔室的开口处打断拭子柄，以允许用盖子密封腔室开口。拭子可具有较小的头部，其有利于收集某些样品，例如阴道和鼻咽样品。或者，拭子可包括沿其柄的塞子，其用于密封提取室的开口并防止从设备泄漏。一旦提取室关闭，它就在设备内形成封闭的容纳环境。用于样品转移的其他合适的载体包括能够吸附生物样品以转移到设备的棒、泡沫尖端柄或其他载体。

提取室12包括能够根据需要进行样品提取和裂解以从样品中释放核酸的装置。因此，提取室12包含或可获得适于从递送载体中提取样品并裂解样品的裂解液，例如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、0.1％Triton-X100溶液、0.1％SDS溶液、用于提取和裂解的其他合适的洗涤剂，或这些的任何组合。在一个实施方案中，提取室12包括一定量的适于提取和裂解的裂解液，例如体积为约0.2-0.5mL的裂解液，以浸没含有样品的载体并促进从中提取/裂解样品。在这种情况下，提取室12设置有单向入口点(在设备的开口处或附近)，例如膜，其允许经由载体(例如拭子等)将样品输入到提取室12中，但是防止裂解液从提取室12泄漏。在另一个实施方案中，提取室12与缓冲释放装置152连通，所述缓冲释放装置152用于在样品进入提取室12时将提取和裂解液释放到提取室12中。例如，裂解液可以包含在提取室12内部的或与提取室12相邻的袋、泡罩包装或其他贮存器中，将其激活以在样品进入时将溶液释放到提取室中。在这方面，袋或泡罩包装可以在进入时被含有样品的载体(例如拭子)刺穿，在腔室密封或盖子关闭时通过腔室内的装置刺穿，或者在腔室密封时通过腔室内的压力使其破裂。通过类似的将连接贮存器和提取室的膜刺穿或破裂，可以使相邻的贮存器将裂解液释放到提取室中。如本领域技术人员所理解的，也可以使用从袋或贮存器释放裂解液的其他方法。

在密封提取室时，例如通过用盖子关闭提取室的开口，该设备通过完成一个或多个电路被激活，如下所述。因此，加热器、泵和其他电气部件(如上所述)通过经由任何适当的适配器(DC适配器)和/或转换器(D/A转换器)与机载(on-board)或机外(off-board)(通过与外部电源连接)的控制单元(包括电池)连接来适当地供电。该连接可以是到电源(例如电池)的标准电连接(DC适配器)，或该连接可以通过端口(例如USB)连接到外部电源，例如处理设备，诸如计算机、手机、平板电脑或其他外部设备。因此，该设备可以设置与电源连接的装置。

提取室包括促进样品提取和裂解以从其释中放核酸的装置。在一个实施例中，加热装置，例如可以通过其设计自动调节的自调节加热器或激光/光/超声波搅拌金属表面加热器，用于将提取室加热到适于促进样品提取和裂解的温度(例如，约88℃-100℃之间的温度)足够长的时间，例如至少约2-3分钟。自调节加热器可包括但不限于PTC(正温度系数)陶瓷加热器、蒸发温度控制加热器或散热器温度控制加热器。当提取室的盖子关闭时，加热器被激活，从而完成将加热器与电源(例如电池)连接的电路。

或者，提取室可包括产生机械力的装置(例如小马达)，以促进从拭子中释放样品并裂解存在的任何病原体。马达可以与放置于提取室内的玻璃或陶瓷珠结合使用，以加速裂解。马达可以位于提取室的底部，并且以对加热器所述的方式供电。该实施方案可以另外包括或不包括加热器以促进裂解。

在某些样品中，例如鼻咽样品，可以用热裂解病原体，并且可以直接扩增核酸而无需核酸纯化。

在其他样品中，例如含有核酸扩增抑制剂(例如胆汁盐、血红素、蛋白酶、尿素或血红蛋白)的血液或尿液，可能需要在提取或扩增室内纯化核酸。在这种情况下，腔室可以涂覆有固定的寡核苷酸捕获探针，其具有与靶核酸的互补序列(例如，以约10⁴至10⁵个拷贝的量)(例如，如表1中举例的那些)。该设备可任选地在提取室内包括带正电的电极，其在设备的盖子闭合时被供电或激活，以促进核酸结合到捕获探针上。一旦核酸与探针结合，例如在短时间(诸如约2分钟)内，可以从提取或扩增室除去扩增抑制剂。可以通过抽吸或泵送到与提取室连接的废物室或贮存器154中来完成抑制剂的去除，或者可以用从第二缓冲室释放的缓冲液将污染物洗涤到废物室154中。除了去除潜在的扩增抑制剂，该步骤还在扩增前浓缩核酸，例如DNA或RNA。该核酸捕获步骤在95℃至63℃之间进行，因为裂解混合物在不需要加热器的情况下冷却。在捕获靶标之后，将用于从提取室12中去除污染物的装置(例如，之前所述的微泵和/或缓冲释放装置)激活，并且可以利用计时器，以便在捕获全部或足够量的核酸后去除废物。随后可以如前所述洗脱核酸。

如本文所用，捕获珠是指在其上固定有捕获探针、或具有允许捕获核酸(例如DNA)的电荷或结合结构的微珠。可以将这些捕获珠预装到裂解室、扩增室和/或检测室中。捕获珠可以设计成例如通过具有电荷捕获任何核酸(例如DNA)。捕获珠也可以设计成通过使用其上具有对靶核酸(例如DNA)特异的捕获探针的微珠捕获特定DNA片段，以捕获例如扩增的核酸(例如DNA)片段。在存在多个扩增的核酸(例如DNA)片段的实施方案中，具有不同性质的微珠的捕获珠可用于检测不同的扩增核酸(例如DNA)。具有特定性质的每个微珠子集可以在其上固定有用于特定扩增核酸(例如DNA)片段的捕获探针。这些不同的性质(例如，大小、磁性与非磁性)使微珠能够基于这些性质分离，并且反过来允许检测不同的扩增核酸(例如DNA)。

在一个实施方案中，将生物素标记的核酸捕获探针固定在可商购的链霉亲和素包被的微珠(Invitrogen)上，如上所述预装微珠。

在一些实施方案中，可以基于尺寸分离捕获珠。微珠的尺寸合适地在直径1-200微米的范围内，并且可以例如由聚合物材料制成。微珠可以各种尺寸和性质商购获得。微珠的实例包括但不限于Thermo Fisher Scientific Dynabeads。通过收集与DNA结合的沉降捕获珠来收集捕获的核酸(例如DNA)。在一些实施方案中，捕获珠基于微珠的不同尺寸沉降在不同层中，从而允许检测不同的扩增核酸(例如DNA)片段和指标。优选地，使用相应尺寸的过滤器选择性地收集具有不同尺寸的捕获珠。在一个实施方案中，使用至多三种不同的微珠尺寸。在另一个实施方案中，使用两种不同的微珠尺寸。

在一些实施方案中，使用磁珠，其允许通过施加磁场来磁性分离并从非磁珠中收集磁珠。这些磁珠和非磁珠可以进一步具有不同的尺寸，以允许检测其他指标。还可以基于其他特征区分和分离捕获珠。

或者，在其他实施方案中，使用例如用于核酸的碳二亚胺交联方法(ThermoFisher Scientific)将核酸捕获探针涂覆并固定在裂解室、扩增室和/或检测室的壁上。通过将不同的捕获探针定位到腔室的不同位置，该方法允许检测比使用捕获珠更多数量的指标或不同的扩增DNA片段。在其他实施方案中，可以使用本领域技术人员已知的固定方法将捕获珠(包括磁珠)固定在腔室的壁上。这种固定方法包括例如共价键合方法。还在其他实施方案中，使用核酸捕获珠和壁涂层两者。例如，捕获珠可捕获任何核酸以允许扩增，而壁涂层设计为捕获特定核酸以允许检测，或反之亦然。或者在另一个实例中，捕获珠和/或壁涂层都可以设计成捕获特定的扩增核酸。其他组合也是可能的。

图9a示意性地显示了具有单个裂解室12和多个扩增室20a、20b和20c的示例性实施方案，每个扩增室包含单个固定的捕获探针和扩增前的两次洗涤步骤。适当地，在使用中，将扩增室保持在>90℃以将DNA维持在单链状态，然后允许冷却至约63℃，使DNA结合至预装的DNA捕获珠和/或壁涂层。在例如血液样品的情况下，然后用洗涤液适当地洗涤两次(21a、21b、23a、23b、25a、25b)以除去血液中的抑制剂。然后，将引物液(30a、30b、30c)引入扩增室20a、20b、20c。然后将腔室加热至63℃±5的温度范围，更优选63℃±2的目标范围，扩增至少18分钟。在一个实施方案中，提取室12适当地具有250μl±20％的体积，目标体积是100μl±20％。在一个实施方案中，扩增室的体积是25μl±20％，并且预装有DNA捕获珠或DNA捕获壁涂层。例如，扩增室20a可以加载有用于检测第一指标的引物30a，扩增室20b可以加载有用于检测第二指标的引物30b，扩增室20c可以加载有例如质量控制引物30c，其允许用户确认诊断设备的适当运作。尽管图9a所示的示例性设备具有三个扩增室20a、20b和20c，设备可以具有更多或更少的扩增室，并且没有特别限制，设备适当地具有1-50个扩增室。扩增室20a、20b和20c显示与检测室50a、50b和50c连接，尽管如前所述，在另外一个实施方案中，检测可以在扩增室20a、20b和20c中进行。尽管图9a所示的示例性设备具有三个检测室50a、50b和50c，设备可以具有更多或更少的检测室，并且没有特别限制，设备适当地具有1-50个检测室。更优选的，设备具有10-20个腔室，以在进行多种病原体分析时允许充分检测不同指标。例如，标准的流感诊断通常涉及检测7-8种不同病原体。尽管数量多的腔室使微流体通道的结构复杂化，但其反过来增加生产成本并降低设备的便携性。在一个实施方案中，检测室适当地具有50μl±20％的体积范围，并且预装有用于核酸检测的25μl±20％染料。如上所述，在使用中，一旦核酸与探针结合，可以通过洗涤、抽吸或泵送将扩增抑制剂去除到废物室154中。在一个实施方案中，废物室154具有的贮存体积为150μl-3ml。

图9b示出了如图9a所示的进行两次洗涤的提取室和扩增室中的示例性温度曲线。当进行以下步骤时，腔室中的温度变化：步骤01-拭子洗脱；步骤02-裂解；步骤03-裂解后，液体于90℃进入扩增室以维持单链DNA相；步骤04-扩增室冷却以允许DNA结合至珠或腔室壁(洗涤中DNA不能离开腔室)；步骤05-X2洗涤结合DNA；步骤06-引物进入扩增室，并被加热至63℃(通过扩增过程DNA去结合)；步骤07-扩增结束时，液体移动至检测室。

在裂解和核酸释放后，将测量体积(例如约5-10μl)的该裂解材料例如通过微型泵经由通道(例如微流体通道)转移至扩增室。如所描述的，微型泵可以由机载电源(例如电池)供电，或者通过与外部电源连接来供电。泵在适当的时间启动，例如，一旦样品提取和裂解完成，将裂解的材料转移到扩增室。在一个实施方案中，通过与电源连接的计时器延迟泵的启动，以确保样品经历提取和裂解，从而防止未裂解的材料转移到扩增室。关于测量体积的裂解材料的转移，这可以由微控制器控制。或者，转移到扩增室中的裂解材料的体积可以通过扩增室的大小来控制(例如，调整大小以包含足够量的扩增混合物和所需量的裂解材料)。在这种情况下，扩增室的入口可以被疏水膜覆盖，所述疏水膜允许在填充时从扩增室内输出气体，并且将液体输入腔室中直到腔室被填满。

扩增室包含能够进行核酸扩增的扩增混合物。存在于扩增室中的扩增混合物可以是冻干的(任选地用pullanan或海藻糖稳定)，在这种情况下，向孔中加入约25-50μl的裂解液。扩增也可以是液体形式，在这种情况下，向孔中加入约5-10μl裂解液。扩增混合物包含用于扩增靶核酸序列的寡核苷酸引物(例如约0.2-1.8μM)，链置换DNA聚合酶，例如嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)聚合酶或Taq聚合酶(例如约8个单位)，脱氧核苷三磷酸盐或dNTP(例如每种约15至30mM)，缓冲液(例如约1X终浓度)，阳离子如镁(例如约2.0至8.0mM)。当靶核酸是RNA时，扩增混合物另外包括逆转录酶。如本领域技术人员将理解的，选择寡核苷酸引物以扩增来自靶微生物的特定靶DNA序列。因此，为了扩增靶序列，使用与靶微生物内的DNA序列互补的引物(例如包含约10至约100个碱基)。如本领域技术人员将理解的，扩增混合物中寡核苷酸引物的数量将随所用的扩增技术而变化，并且可以使用5'-3'方向以及3'-5'方向的引物。在一个实施方案中，靶微生物是致病性生物，例如但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)、单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、肺炎支原体(Mycoplasmapneumonia)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhea)、链球菌属(Streptococcus)包括A组或B组链球菌感染、疱疹、乳头瘤病毒、葡萄球菌属(Staphylococcus)包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、流感病毒、呼吸道合胞病毒、诺如病毒、西尼罗河病毒、登革热病毒、SARS Co-V、埃博拉病毒、拉沙热病毒、肺结核、HIV、中东呼吸综合症冠状病毒和基孔肯雅热病毒。用于扩增这些病原体中的一些的引物的实例可以在表1中找到。

在一个实施方案中，扩增通过等温扩增技术完成，包括但不限于基于核酸序列的扩增(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)、环介导的等温扩增(LAMP)、交叉-引物扩增(CPA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、滚环扩增(RCA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、信号介导的RNA技术扩增(SMART)、切口酶介导的扩增(NEMA)、等温链扩增(ICA)、Smart扩增(Smart-AMP)、指数扩增反应(EXPAR)或分枝扩增(RAM)。在扩增期间，使用加热器(例如可以通过其设计自动调节的自调节加热器或激光/光/超声波搅拌金属表面加热器)将腔室加热到适于扩增的温度(例如约58℃至66℃之间的温度)足够长的时间，例如(约15-20分钟)。加热器在适当的时间激活，例如，在将裂解材料转移到扩增室时或略提前。在一个实施方案中，通过与电源连接的计时器延迟加热器的激活，以防止扩增室内过早加热。

在另一个实施方案中，扩增可以通过pH循环依赖性扩增来完成。在这种情况下，使溶液的pH循环，例如从约pH 3到约pH 8，以使核酸变性和复性，从而允许聚合酶进入和随后的扩增。例如，扩增室可以包括将扩增室分成两个部分的加氢板。由板两侧的两个电极产生的电场来回拉动氢离子，使pH循环。这由电子或机械计时器控制，以激活板两侧的电极。

电场扩增(EFA)也可以用于核酸扩增，其中施加电场以使DNA变性，从而允许聚合酶进入而不需要热循环。在这种情况下，通过使用合适的电源在位于扩增室对侧的电极上施加电压来产生约0.01至0.1mV的电场。使用机械或电子计时器以10至20秒的特定间隔启动和停用电压(以引起变性，然后复性和扩增)。

在另一个实施方案中，该设备适用于在扩增室中进行热循环PCR扩增。对于这种方法，使用机械或电子计时器以特定的时间间隔(例如20-40s)启动和停用扩增室内的自调节加热器，以加热到变性温度，例如94-96℃，并冷却至退火/扩增温度，例如约70℃。用与微处理器连接的热敏电阻监测温度。如本领域技术人员所理解的，所用温度和它们的时间间隔可随所用聚合酶、反应中二价离子和dNTP的浓度以及引物的熔融温度而变化。

所述设备可任选地包括第二(平行)扩增室，以扩增样品内的核酸序列作为扩增对照。因此，第二扩增室将包括扩增混合物，以及针对对照核酸序列的寡核苷酸引物，从而当设备被激活时，扩增对照序列。虽然可以使用任何合适的对照序列，但是如本领域技术人员将理解的，对照序列的实例包括人基因(例如人β-肌动蛋白)，以及来自共生细菌(例如化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)或表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis))的核酸序列。因此，对照序列的扩增将确认样品被正确获得、提取和裂解，并且设备内的扩增适当进行，并且缺乏靶微生物的信号是由于样品内缺乏靶序列，而不是设备故障。

扩增后，可以使用多种方法检测靶核酸的存在，包括但不限于：电化学检测、基于侧流的检测、荧光检测或比色检测。该步骤在扩增室内或在单独的检测室中完成，其中使用如前所述驱动的微型泵将一部分流体输送到检测室，并使用计时器延迟流体输送到检测室直到扩增完成。DNA扩增的检测可以在检测传感器如电化学检测器(例如恒电位仪)、光检测器(例如光电二极管、荧光计)、比色检测器(例如光度计)等存在下直接在扩增室中进行。或者，检测可以在包括检测传感器的单独的检测室中进行。对于比色检测，检测传感器可以是允许观察检测室内的颜色变化的窗口。

为了能够检测扩增的核酸，将其用DNA结合的可检测标记进行标记，包括但不限于荧光、化学发光、发色标记和电化学可检测标记。合适的DNA结合的可检测标记的实例包括亚甲蓝染料、白色结晶紫、Quant-iT PicoGreen、荧光染料钙黄绿素或花青DNA结合染料。图5显示了在阳性和阴性样品扩增后Quant-iT Pico Green染料颜色变化的红色、绿色、蓝色光谱分析。集成在POC设备中的比色检测电子器件将获取阳性和阴性样品的不同RGB读数，然后显示样品是阳性或阴性。

在一个实施方案中，DNA结合的可检测标记存在于扩增混合物中，并且当DNA浓度通过插入DNA双螺旋中而增加时与DNA结合。添加到扩增室中的DNA结合的可检测标记的量是约5-10μl的量。标记的DNA(例如DNA/亚甲蓝复合物)在电场存在下以不同的方式迁移至未结合的标记(例如单独的亚甲蓝)，这用于测量DNA浓度。电场由存在于扩增室内并浸没在样品中的电极提供。电极与提供电压的恒电位器连接，之后测量峰值阳极电流并将其传递到机载或外部微处理器。

可以使用DNA结合的荧光染料监测DNA扩增。合适的DNA结合荧光染料的实例包括但不限于SYBR green、SYTO 9、SYTO 80、羟基萘酚蓝或Quant-iT PicoGreen，在扩增室或单独的检测室中。用于检测的DNA结合的荧光染料的量是约5-10μl的量。该设备可以配备有与扩增室或检测室连接的荧光检测器，以及提供处理后输出的处理单元。或者，可以将来自检测器的信号传送到外部处理单元以提供处理后输出。

如上所述，可以使用在DNA存在下引发颜色变化的纳米金颗粒、DNA酶、pH指示剂染料或DNA结合染料来比色检测DNA的扩增。该颜色变化可以通过以下检测：通过允许观察到检测室的窗口人工(通过眼睛)检测，使用与检测或扩增室连接的机载比色检测器，或使用如所描述的与检测室连接的板外检测装置，以例如通过分析颜色变化(例如RGB分析)来分析与比色标记反应后的溶液的颜色图像。这也可以通过将匹配的彩色光照射到最终的扩增反应混合物上并用光度计监测作为输出的颜色强度来实现。

可以使用扩增室或检测室中的侧流测定来检测扩增的DNA。使用侧流测定的多种检测布置是可能的。在一个实施方案中，扩增的DNA用配体(例如生物素或另一种配体)和标记的寡核苷酸引物标记到靶核酸(例如用荧光素标记如6-羧基荧光素或异硫氰酸荧光素(FITC)或另一种标记来标记)，随后使用结合剂将其与配体(例如抗生物素蛋白或链霉亲和素)复合并通过固定的抗体(例如抗FITC抗体)捕获。如上所述，然后基于所用的标记检测捕获的扩增DNA，例如通过如上所述的荧光或比色信号。

在该设备的另一个实施方案中，在含有DNA结合染料的单独的检测室中进行检测，所述DNA结合染料在扩增过程中不能存在，例如赫斯特染料。用于检测的DNA结合染料的量是约5-10μl的量。如在亚甲蓝DNA结合中所述，在电场存在下通过电化学检测来监测DNA结合。

检测室可以是连接在设备外部的、可拆卸的小瓶，其适于后续的分析。

在一个实施方案中，可以调整所述设备，使得裂解和扩增在单室中发生，而检测在单独的检测室中进行。在这种情况下，裂解-扩增室适当地包括自调节加热器，该加热器使用机械或电子计时器以特定的时间间隔启动和停用，以允许加热到变性温度(例如95℃)，并冷却至扩增温度(例如约70℃)。然后可以将扩增的DNA例如通过泵输送到单独的检测室中进行如前所述的检测。

在另一个实施方案中，该设备可以适于检测两种或更多种病原体或基因靶标。在该实施方案中，该设备可包含两个或更多个扩增室，每个扩增室适于扩增不同靶生物的核酸。因此，该实施方案的设备的每个扩增室将包括靶向不同微生物或基因靶标的扩增混合物，包括寡核苷酸引物。例如，第一扩增室可包括用于大肠杆菌的寡核苷酸引物，而第二扩增室包括用于单核细胞增生李斯特菌的寡核苷酸引物，和第三扩增室包括用于化脓性链球菌的寡核苷酸引物。在另一个实例中，该设备可包括靶向各种皮肤感染(例如疱疹、乳头瘤病毒和沙眼衣原体)的扩增室。该设备可以适用于第三世界国家，并且包括扩增室，每个扩增室适于鉴别相关的靶生物，例如但不限于登革热病毒、SARSCo-V、埃博拉病毒、拉沙热病毒、结核病和/或HIV或抗生素抗性基因，如β-内酰胺酶、超广谱β-内酰胺酶(ESBL)或碳青霉烯酶。

图10示意性地显示了具有单个裂解室212和多个扩增室220a、220b和220c的示例性实施方案，每个扩增室预装有用于扩增特定DNA片段的特异性引物。这种简化的实施方案不需要多次洗涤来去除扩增抑制剂，其最适合用于缺乏扩增抑制剂的样品或对扩增抑制剂更耐受的扩增过程。例如，血液样品通常含有与酶和用于扩增的引物结合的蛋白质和/或微生物，从而抑制所需DNA片段的扩增。另一方面，例如，咽喉拭子倾向于具有较少的扩增抑制剂。首先提取样品并在>93℃下裂解至少2.5分钟以提取DNA。一旦裂解的生物样品移入扩增室，将腔室加热至63℃±5，更优选加热至63℃±2的目标范围内用于至少18分钟的扩增。在一个实施方案中，提取室12适当地具有250μl±20％的体积范围，其中目标体积在100μl±20％的范围内。在一个实施方案中，扩增室具有25μl±20％的体积，并预装有特异性引物。例如，扩增室220a可装载有用于检测第一指标的引物，扩增室220b可装载有用于检测第二指标的引物，并且扩增室220c可装载有使用户能够确认诊断设备适当运行的质量控制引物。虽然图10所示的示例性设备具有三个扩增室220a、220b和220c，但该设备可具有更多或更少的扩增室，并且虽然没有特别限制，但该设备适当地具有1至50个扩增室数量。扩增室220a、220b和220c显示为与检测室250a、250b和250c连接，尽管如前所述，在另一个实施方案中，可以在扩增室220a、220b和220c中进行检测。虽然图10所示的示例性设备具有三个检测室250a、250b和250c，但该设备可具有更多或更少的检测室，并且虽然没有特别限制，但该设备适当地具有1至50个检测室数量。更优选地，该设备具有10至20个腔室。在一个实施方案中，检测室合适地具有50μl±20％范围内的体积，并且预装有用于核酸检测的25μl±20％的染料。

在另一个实施方案中，可以调整所述设备，使得裂解、扩增和检测在单室中进行。为此，将含有临床样品的拭子或其他载体浸入含有扩增混合物(例如热稳定DNA聚合酶和/或用于RNA靶标的逆转录酶、镁、核苷酸、用于特定靶标的核酸引物，和DNA结合染料)的单室中。包括自调节加热器的腔室由计时器启动以加热至约95℃的温度，从而裂解病原体。或者，扩增游离DNA/RNA而无需加热至95℃。在这种情况下，可以省略加热步骤。然后停用加热器以使整个样品冷却至约50-70℃的温度以进行DNA扩增。在DNA扩增后，DNA结合染料将与任何扩增的DNA反应并导致单室内可以如前所述进行检测的颜色变化。

图11示意性地显示了用于裂解的单室设计，其包含多个启动扩增的核酸捕获位点和多个捕获扩增产物用于检测的核酸捕获位点。裂解、扩增和检测室312适当地具有1ml的体积，其中目标载量为500μl。一旦插入样品拭子，将缓冲液311(具有化学裂解剂)加载到腔室中以提取DNA。或者，缓冲液不含裂解剂，适当地将腔室加热至93℃或更高以启动裂解。该腔室预装有用于捕获DNA的核酸捕获珠和/或壁涂层(在腔室壁上示意性地显示为328)。在扩增之前，用洗涤液322a和322b冲洗腔室以除去任何抑制剂。用于捕获扩增DNA片段的核酸片段捕获壁涂层(在腔室壁上示意性地显示为331a、331b和331c)设置在不同的位置，用于不同的指标和/或多种病原体的检测。然后引入染料混合物340以与捕获的DNA片段结合用于检测。在该实施方案中，废物贮存器的合适体积可以是例如3ml或更多。裂解、扩增和检测室312适当地与另外一个洗涤液、缓冲液、引物混合物330和染料混合物的贮存器连接。在该实施方案中，核酸捕获珠和/或壁涂层328、331a、331b和331c显示为位于球形单室312内，当液体填充腔室时，其被同时浸没。或者，单室312可具有细长形状，其中核酸捕获珠和/或壁涂层328、331a、331b和331c沿着腔室的纵轴定位，并且在优选的实施方案中，捕获珠和/或壁涂层串联排列。这允许核酸捕获珠和/或壁涂层328、331a、331b和331c依次被液体浸没。在其他实施方案中，单室312可包括其他形状。在所有情况下，捕获珠的尺寸设计成允许液体通过腔室。

在其中样品提取、裂解、扩增和检测在单室中完成的实施方案中，可以采用使用两个DNA捕获步骤的方法。在第一步中，在扩增前捕获完整的DNA链。该第一步可以是非特异性的，并且可以使用例如二氧化硅珠。在一个实施方案中，使用两种类型的DNA捕获探针：第一种类型在扩增前捕获完整的DNA链，第二种类型捕获由DNA扩增产生的小DNA片段。在收集样品并将其引入单室后，通过在约95℃下裂解释放DNA。第一种类型的DNA探针(例如图11所示的328)捕获靶DNA，然后通过用洗涤液冲洗腔室将未结合的污染物从腔室移除到废液池中。然后将引物和酶引入腔室，并将捕获的DNA在63℃下扩增约20分钟。然后第二种类型的DNA捕获探针捕获由扩增产生的小DNA片段。

第二种类型的DNA捕获探针可具有多种亚型，每种亚型靶向与特定病原体相关的特定类型的DNA片段。在一些实施方案中，每种不同的亚型可以靶向与每种不同病原体相关的DNA片段。将这些DNA捕获探针的亚型涂覆在室壁的不同位置，例如图11中的331a、331b和331c，因此将不同的DNA片段浓缩并固定在室壁的不同位置。这种位置的差异使得后续检测变得容易。在检测步骤期间，引入着色染料混合物，其与在不同位置捕获的特定DNA片段反应。然后，该设备在每个位置检测结合染料，以获得每种病原体或基因靶标的阳性或阴性结果。检测方法可包括但不限于比色测量和光谱分析。图11示出了用于裂解的单室设计，其包含多个启动扩增的核酸捕获位点和多个捕获扩增产物用于检测的核酸捕获位点。通常，第一种类型的DNA探针(珠和/或壁涂层)位于更靠近样品拭子插入的位置，而第二种类型的DNA探针(珠和/或壁涂层)位于更靠近检测观察窗或检测传感组件。

在一个实施方案中，腔室可具有用于显示比色结果的读取区域。该区域可包括例如一个或多个半透明或透明窗口，其形成其上涂覆捕获探针的腔室壁或腔室壁的一部分。适当地，该窗口将具有内表面和外表面，在内表面上涂覆有捕获探针，外表面适当地可以具有向用户指示与每个捕获探针位置相关联的病原体位置的标记。观察窗的外表面可以例如被不透明层覆盖，该不透明层具有对应于捕获探针的位置的孔，其中这种孔中的比色信号向用户指示阳性结果。例如，这种不透明层可以是容纳腔室的设备外壳的一部分，或者例如是可定位在观察窗上的贴纸。或者，观察窗的外表面可以具有印在其上的标记，所述标记表示捕获探针的位置并且向用户指示关于病原体的阳性结果(例如但不限于标记的网格系统)。在一个实施方案中，观察窗适当地是便于视觉读取结果的放大窗。可以对部分或全部窗口进行着色或染色以增强检测所用的染料的颜色。如上所讨论，该设备可以包括对照扩增，因此，在一个实施方案中，可以向用户提供扩增和检测对照的标记(即，该设备起作用并且DNA扩增成功进行的标记)。

在另一个实施方案中，将着色染料涂覆到单室上。在该实施方案中，可以使用单组捕获探针。该设备检测每个位置的染料颜色变化，以获得每种病原体的阳性或阴性结果。染料斑点可以是相同类型的染料或可以是不同类型的(例如，可识别为不同的颜色)。在其中对不同核酸进行筛选的一个实施方案中，可以用不同分子标签来标记与筛选的每个核酸对应的每个引物组，所述分子标签与给定染料斑点上的相应标记特异性互补。

表1提供了用于等温扩增和检测各种病毒和细菌病原体的寡核苷酸引物。

表1

表1示出的引物已经根据以下通过引用并入本文的参考文献使用：

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因此，在一个实施方案中，该设备是不需要外部装置来读取结果的独立设备。然而，如下面进一步讨论的，在一些实施方案中，该设备可以适于与用于发送或显示结果的设备连接。

设备的检测传感器可以适于与信号处理单元连接，该信号处理单元可操作以接收由检测传感器提供的信号并将信号转换成期望的输出。因此，信号处理单元可操作以将检测传感器提供的输出数字化为可记录的输出(如果需要)，该可记录的输出可以例如在显示器(例如监测器等)上呈现。例如，在一个实施方案中，可以将诊断分析的结果传输到机载智能读取器以供用户查看结果。信号处理单元可以以微处理器(例如数字信号处理器)的形式或将来自检测传感器的信号数字化的数字采集板的形式包括在设备内，该微处理器包括任何所需的转换器以转换来自检测传感器(模数转换器)的输出。或者，信号处理单元可以是外部处理系统。在这样的实施方案中，该设备配备有用于与外部处理系统通信的端口。端口可以是物理端口(例如USB端口)，其可以用于从外部处理系统向设备传输电力，并且将来自检测传感器的输出传输到外部处理系统以进行信号处理。或者，端口可以是无线通信端口，例如使用WiFi或蓝牙协议，其用于将来自检测传感器的输出传输到外部处理系统以进行信号处理。外部处理系统的实例包括个人计算机、个人数字助理、联网移动无线电信计算设备(诸如智能电话)和内容播放器。

用于实现信号处理单元的本技术的各方面可以体现在系统、方法、计算机程序产品或其任何组合中。计算机程序产品可以包括计算机可读存储介质或其上具有计算机可读程序指令的介质，用于使处理器执行本技术的各方面。计算机可读存储介质可以是有形设备，其可以保留和存储指令以供指令执行设备使用。计算机可读存储介质可以是，例如但不限于，电子存储设备、磁存储设备、光存储设备、电磁存储设备、半导体存储设备，或前述的任何合适的组合。

计算机可读存储介质的更具体实例的非详尽列表包括以下：便携式计算机磁盘、硬盘、随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、可擦除可编程只读存储器(EPROM或闪存)、静态随机存取存储器(SRAM)、便携式光盘只读存储器(CD-ROM)、数字通用光盘(DVD)、记忆棒、软盘、机械编码的设备，例如其上记录有指令的穿孔卡或凹槽中的凸起结构，以及前述的任何合适的组合。本文使用的计算机可读存储介质不应被解释为暂时性信号本身，例如无线电波或其他自由传播的电磁波、通过波导或其他传输介质传播的电磁波(例如，通过光纤电缆的光脉冲)、或通过电线传输的电信号。

本文描述的计算机可读程序指令可以经由网络(例如，因特网、局域网、广域网和/或无线网络)从计算机可读存储介质下载到相应的计算/处理设备，或下载到外部计算机或外部存储设备。网络可以包括铜传输电缆、光传输光纤、无线传输、路由器、防火墙、交换机、网关计算机和/或边缘服务器。每个计算/处理设备中的网络适配器卡或网络接口从网络接收计算机可读程序指令，并转发计算机可读程序指令以存储在相应计算/处理设备内的计算机可读存储介质中。

用于执行本技术操作的计算机可读程序指令可以是汇编指令、指令集架构(ISA)指令、机器指令、机器相关指令、微代码、固件指令、状态设置数据，或以一种或多种编程语言(包括面向对象的编程语言或传统的程序性编程语言)的任意组合编写的任一源代码或目标代码。计算机可读程序指令可以完全在用户的计算机上、部分在用户的计算机上、作为独立的软件包、部分地在用户的计算机上且部分地在远程计算机上或完全在远程计算机或服务器上执行。在后一种情况下，远程计算机可以通过任何类型的网络连接到用户的计算机，包括局域网(LAN)或广域网(WAN)，或者可以(例如，使用互联网服务提供商通过互联网)连接到外部计算机。在一些实施方案中，为实现本技术的各方面，包括例如可编程逻辑电路、现场可编程门阵列(FPGA)或可编程逻辑阵列(PLA)的电子电路可以通过利用计算机可读程序指令的状态信息来执行计算机可读程序指令，以使电子电路个性化。

这些计算机程序指令还可以存储在计算机可读介质中，该计算机可读介质可以指示计算机、其他可编程数据处理装置或其他设备以特定方式起作用，使得存储在该计算机可读介质中的指令产生一件制品，所述制品包括实现流程图和/或框图块中指定的功能/动作的指令。计算机程序指令还可以被加载到计算机、其他可编程数据处理装置或其他设备上，以使得在计算机、其他可编程装置或其他设备上执行一系列操作步骤，产生计算机执行的进程，使得在计算机或其他可编程装置上执行的指令提供用于执行在流程图和/或框图块中指定的功能/动作的进程。

图7的框图示出了可以实施本文描述的技术的各方面的示例性计算机系统(例如，其可以用作信号处理单元)。示例性计算机系统通常表示为参考号800，其包括显示器802、键盘804A和指针设备804B形式的输入设备、计算机806和外部设备808。虽然将指针设备804B描绘为鼠标，但是应当理解，也可以使用其他类型的指针设备。计算机806可以包含一个或多个处理器或微处理器，例如中央处理单元(CPU)810。CPU 810执行算术计算和控制功能，以执行存储在内部存储器812(优选随机存取存储器(RAM)和/或只读存储器(ROM))和可能的附加存储器814中的软件。附加存储器814可包括例如大容量存储器、硬盘驱动器、光盘驱动器(包括CD和DVD驱动器)、磁盘驱动器、磁带驱动器(包括LTO、DLT、DAT和DCC)、闪存驱动器、程序盒和盒式磁带接口(如在视频游戏设备中发现的那些)、可移动存储器芯片(如EPROM或PROM)、新兴存储介质(如全息存储)或本领域所知的类似存储介质。附加存储器814可以在计算机806的物理内部，或者如图7所示在外部，或两者。

计算机系统800还可以包括其他类似装置以允许加载计算机程序或其他指令。这种装置可以包括例如通信接口816，其允许软件和数据在计算机系统800和外部系统和网络之间传输。通信接口816的实例可以包括调制解调器、网络接口(诸如以太网卡)、无线通信接口，或串联或并联通信端口。经由通信接口816传输的软件和数据是信号的形式，其可以是电子、声学、电磁、光学或能够由通信接口816接收的其他信号。当然，可以在单个计算机系统800上提供多个接口。

通过输入/输出(I/O)接口818管理进出计算机806的输入和输出。I/O接口818管理计算机系统800的显示器802、键盘804A、外部设备808和其他这种组件的控制。计算机806还包括图形处理单元(GPU)820。后者也可以用作计算目的，作为用于数学计算的(CPU)810的附件或代替。

计算机系统800的各种组件直接或通过耦合到合适的总线彼此耦合。

在另一个实施方案中，可以使用联网的移动无线电信计算设备(例如，编程有特定应用的智能手机)来解释结果。图8示出了智能手机900形式的示例性联网的移动无线电信计算设备；智能手机900可以用作信号处理单元。智能手机900包括显示器902、键盘形式的输入设备904和机载计算机系统906。显示器902可以是触摸屏显示器，从而用作附加输入设备，或者作为键盘904的替代。机载计算机系统906包括具有一个或多个处理器或微处理器的中央处理单元(CPU)910，用于执行算术计算和控制功能，以执行存储在内部存储器912中的软件，优选随机存取存储器(RAM)和/或只读存储器(ROM)与通常包括闪存的附加存储器914耦合，所述附加存储器914可以集成到智能收手机900中，或者可以包括可移动闪存卡，或两者。智能手机900还包括通信接口916，其允许软件和数据在智能手机900和外部系统和网络之间传输。通信接口916与一个或多个无线通信模块924耦合，其通常包括用于与一个或多个蜂窝网络、无线数字网络或Wi-Fi网络连接的无线电台。通信接口916通常还能够将智能手机900与外部计算机系统有线连接。麦克风926和扬声器928与机载计算机系统906耦合，以支持由机载计算机系统906管理的电话功能，并且GPS接收器硬件922也可以与通信接口916耦合，以支持机载计算机系统906的导航操作。来自机载计算机系统906的输入和输出由输入/输出(I/O)接口918管理，其管理显示器902、键盘904、麦克风926和扬声器928的控制。机载计算机系统906也可以包括单独的图形处理单元(GPU)920。各种组件直接或通过耦合到合适的总线彼此耦合。

本文使用的术语“计算机系统”和相关术语不限于任何特定类型的计算机系统，并且包括服务器、台式计算机、便携式电脑、联网移动无线电信计算设备(诸如智能手机)、平板计算机以及其他类型的计算机系统。

因此，用于实施本文描述的技术的各方面的计算机可读程序代码可以包含或存储在智能手机900的机载计算机系统906的存储器912或计算机806的存储器812中，或者存储在智能手机900的机载计算机系统906或计算机906外部的计算机可用或计算机可读介质上，或其任何组合。

因此，在设备的一个实施方案中，使用有线或无线连接将诊断结果发送到智能手机、便携式电脑或任何合适的计算机设备。计算机设备将包括可以为用户解释和呈现诊断信息的软件。此外，PON诊断平台可以使用机载电池电源、通过DC电源适配器，或通过智能手机、计算机或其他设备通过USB或其他合适的连接供电。

在该设备的另一个实施方案中，将提供机载读取器，其将为用户直接分析/解释/显示POCT结果。

在一个实施方案中，每个设备将包括射频识别(RFID)标签以允许跟踪和数据分析。

如上所述，本发明的设备优选地是一次性的。在一个实施方案中，用于制造本发明设备的材料没有特别限制，包括例如：玻璃、二氧化硅、硅和其他材料。然而，在各种实施方案中，设备至少部分由可生物降解的塑料或其他聚合物制造。该设备还可以包括金属组件，特别是但不限于，与加热组件有关。用于制造微流体装置的方法是已知的，并且特别地，用于制造塑料微流体装置的热压花工艺是已知的。

潜在的应用

提供一种一次性的廉价POC设备，其在广泛的学科和领域中具有应用。首先，该设备有利地制成一次性的，以保持制造成本易于管理，避免在使用后清洁设备的必要性，并且通过进一步处理用过的设备避免可能的病原体感染的传播。使用后，可以使用为避免感染传播而建立的方案处置该设备。

该POC设备的一个用途是快速检测病原微生物。例如，POC设备可用于检测病原微生物，例如但不限于大肠杆菌、单核细胞增生李斯特菌、艰难梭菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、沙眼衣原体、嗜肺军团菌、淋病奈瑟氏球菌、链球菌、葡萄球菌、流感病毒、呼吸道合胞病毒、诺如病毒、西尼罗河病毒、登革热病毒、SARS Co-V、埃博拉病毒、拉沙热病毒，结核病、HIV或中东呼吸综合征冠状病毒。

因此，本发明的POC设备特别适用于在资源贫乏的环境中检测感染性疾病，而无需进入用于分子测试的中心实验室。例如，该设备可用于检测非洲的感染性疾病(例如使用直肠拭子检测腹泻病)或HIV。POC设备可用于在食品加工厂中表面测试李斯特菌或大肠杆菌污染。POC设备可用于食品加工厂的实时污染监测，并确保清洁过程中的灭菌，并防止与食品相关的胃肠道疾病爆发。POC设备的另一个应用是兽医对动物疾病(例如严重影响猪产业的猪的猪呼吸道病毒)的检测。该设备还可用于预防医院和其他临床环境(包括护理和养老院以及步入式诊所)中的急诊室或候诊室的院内或医院获得性感染。该设备的另一个应用是用于性传播感染(包括沙眼衣原体)的家庭测试。女性可以使用对衣原体检测非常敏感的阴道拭子，并使用这种POC设备测试阴道拭子的沙眼衣原体。该设备还可用于大量人群的实时监控和爆发控制。此外，它还可用于对上下飞机的乘客进行呼吸道病毒测试。

该设备的另一个用途是检测抗生素或抗病毒耐药性。赋予耐药性的基因是已知的，包括例如赋予青霉素耐药性的β-内酰胺酶基因、ESBL和碳青霉烯酶、赋予粘菌素耐药性的MCR-1基因。可以根据如上所述的方法并使用设备扩增这些基因。该设备可用于测试细菌的存在和赋予耐药性的特定基因两者。在一个实施方案中，该设备可用于测试利福平耐药性结核病。

该POC设备的另一个用途是快速检测疾病的生物标志物，包括但不限于乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、糖尿病、冠心病、慢性阻塞性肺病、肝炎、肾病、多发性硬化、阿尔茨海默病和帕金森病。分子生物标志物可包括特定mRNA转录物或微RNA。用于疾病的分子生物标志物的POC设备可以是如上所述或下文实施例中所述的多通道或单通道设备。用于扩增mRNA或微RNA种类的特异性引物将包括在扩增混合物中。扩增和检测与用于检测感染因子的POC设备相同。

对于本领域技术人员显而易见的是，该设备可以类似地用于兽医应用中。

在以下具体实施例中描述了本发明的实施方案，但不应将其解释为限制性的。

具体实施方式

实施例1-用于病原体检测的PON设备

设备设计

提供手持式一次性设备10(图1B)。设备10包括第一提取室12，其具有约250μl的最大体积。提取室12包括具有0.1％TritonX-100的PBS裂解剂。提取室12包括用于接受含有样品的拭子的头部的开口11，并且腔室12的尺寸适于接纳拭子。提供盖子13以密封提取室12的开口11。盖子13的关闭通过使缓冲液从泡罩包装释放到提取室12中而启动设备10。提取室12配备有在盖子13关闭时启动的第一自调节加热器14，其将提取室12加热至约95℃的温度并例如通过使用计时器将该温度保持至少2分钟。加热器14与控制单元30连接并由电池34供电。

提取室12通过微流体通道16与扩增室20连接。泵装置18(例如微型泵)位于微流体通道16内，用于将裂解材料从提取室12移动到扩增室20。泵18与控制单元30连接并由电池34供电。控制单元还包括用于温度和/或电位控制的D/A转换器15，以及用于将模拟检测信号转换为数字信号的A/D转换器25。计时器在适当的时间启动泵18。扩增室20包括由所述计时器启动的第二自调节加热器22，其将扩增室20内的温度维持在55-70℃20分钟以允许等温扩增，包括环介导的等温扩增(LAMP)、交叉-引物扩增(CPA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、滚环扩增(RCA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、信号介导的RNA技术扩增(SMART)、切口酶介导的扩增(NEMA)、等温链扩增(ICA)、Smart扩增(Smart-AMP)、指数扩增反应(EXPAR)、分枝扩增(RAM)、切口末端扩增反应(NEAR)或PCR。

一旦裂解材料随时间冷却至约63℃的目标温度，通过泵18将5-10μl裂解材料转移至扩增室20。用第二自调节加热器24将扩增室内的裂解材料保持在约62℃。第二加热器24与控制单元30连接并由电池34供电。扩增室含有盐缓冲液、DNA聚合酶、5mM MgSO₄和靶标特异性引物的扩增混合物母液，例如15μl盐缓冲溶液、1μl聚合酶和4μl特异性引物，以及5-10μl的DNA结合染料(Quant-iTPicoGreen、羟基萘酚蓝和隐色三苯甲烷染料)。

扩增室20包含检测传感器26，其可以是用于RGB分析的色度计、用于检测用荧光染料扩增后的荧光变化的荧光计、用于用亚甲蓝对样品进行电化学分析的电位计、或者用于分析视觉颜色变化的清晰的观察端口。

在图1A所示的另一个实施方案中，扩增室20经由微流体通道28与单独的检测室50连接，并且检测室50包括检测传感器26。

裂解验证

为了确认提取室可以使用自调节加热器达到目标温度(95℃)并保持该温度2-3分钟，使用热电偶监测温度20分钟。测试了不同的电阻(3.8欧姆、3.5欧姆和3.4欧姆)。所有测量均在与导热膏相连并且连接到PTC加热器的锡箔腔中进行。为了进一步证实这些条件足以裂解各种临床样品，将含有呼吸道合胞病毒A(RSV-A)、化脓性链球菌和流感病毒H1的拭子各自置于含有250μl具有0.1％Triton-X100的PBS的提取室内并裂解3分钟，然后使用扩增混合物(Optigene Lamp mastermix)在荧光计(Genie II仪器)上扩增。在每种情况下将扩增时间与未裂解对照进行比较。在每种情况下使用的表1的寡核苷酸引物如下：用于RSV-A的引物具有SEQ ID NO：20、21、22、23和24，用于化脓性链球菌的引物具有SEQ ID NO：32、33、34、35和36的序列，以及用于流感病毒H1的引物具有SEQ IDNO：7、8、9、10和11的序列。

扩增验证

为了确认扩增室20达到了所需温度(63℃)并保持该温度20分钟，使用热敏电阻监测腔室20随时间的温度。使用8.6欧姆的恒定电阻，监测温度20分钟。为了进一步证实样品在这些条件下成功扩增，将RSV-A、化脓性链球菌和流感病毒H1在95℃的热块上热裂解10分钟，并在含有如上所述的15μl Optigene mastermix和5μl特异性引物的扩增室20中扩增15分钟。然后从扩增室中取出样品，与10μl SYBR Green DNA结合染料混合，并且在Genie II仪器上测定500-520nm的终点荧光，与未扩增的阴性对照相比。

检测验证

为了评估是否可以目测或使用电化学检测来检测扩增DNA，使用多种DNA结合染料，包括Quant-iT PicoGreen(Life Technologies)、羟基萘酚蓝、隐色三苯甲烷染料和亚甲蓝。使用如上所述的包括引物的扩增混合物Optigene LAMP mastermix扩增大约100个拷贝的RSV-A、化脓性链球菌或流感病毒H1，之后将扩增材料与10μl的各个DNA结合染料在室温下混合3分钟。对于Quant-iT PicoGreen、羟基萘酚蓝和隐色三苯甲烷染料，至少10个人观察到染料颜色的视觉变化。对于亚甲蓝，使用具有PalmSens恒电位仪的循环伏安法检测到样品中基于峰值阳极电流的变化，并与扩增前的基线读数进行比较。

核酸捕获验证

为了确认核酸可被固定的寡核苷酸捕获探针捕获，将等分试样(0.1mL)的临床标本(例如，粪便或尿液样品或含有化脓性链球菌的样品)与10μL生物素化捕获探针混合，并在95℃加热10分钟。将样品冷却至室温，加入等分试样的链霉亲和素包被的磁珠(10μL)，将混合物在室温下放置5分钟。将珠子用磁铁取出，然后重悬于20μLPBS中，用Genie II实时荧光计中的LAMP测试5μL，并与阴性样品比较。图12显示了使用二氧化硅磁珠上的总核酸捕获或使用与链霉亲和素包被的微珠结合的生物素标记的寡核苷酸探针的特异性靶标捕获从三个粪便样品中除去扩增抑制剂。表2显示在核酸捕获和除去抑制剂后发生扩增。将甲型流感病毒掺入样品中。

表2

图13和表3显示了使用easyMAG提取器(NucliSENS easy

bioMerieux)的总核酸捕获或使用与链霉亲和素包被的微珠结合的生物素标记的寡核苷酸探针的特异性靶标捕获从两个尿液样品(样品2和3)中完全去除扩增抑制剂，并从第三个尿液样品(样品1)中部分去除扩增抑制剂。将无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B组链球菌)掺入尿液样品中。

表3

参见图12：使用总核酸(二氧化硅珠)或特异性靶标捕获(生物素化的寡核苷酸)从三个粪便样品中去除扩增抑制剂允许扩增。线路1，样品1-用二氧化硅珠捕获靶标；线路2-样品1-用生物素引物捕获靶标；线路3-样品1-仅加热；线路4-样品2-用二氧化硅珠捕获靶标；线路5-样品2-用生物素引物捕获靶标；线路6-样品2-仅加热；线路7-样品3-用二氧化硅珠捕获靶标；线路8-样品3-用生物素引物捕获靶标；线路9-样品3-仅加热；图13：使用总核酸(二氧化硅珠)或特异性靶标捕获(生物素化的寡核苷酸)从三个尿液样品中去除扩增抑制剂，允许扩增(样品2和3)或增加到阳性的时间(样品1)。线路1，样品1-easyMAG提取的DNA；线路2，样品1-用二氧化硅珠捕获靶标；线路3，样品1-仅加热；线路4，样品2-easyMAG提取的DNA；线路5，样品2-用二氧化硅珠捕获靶标；线路6，样品2-仅加热；线路7，样品3-easyMAG提取的DNA；线路8，样品3-用二氧化硅珠捕获靶标；线路9，样品3-仅加热。

样品分析

将约500个化脓性链球菌细胞、RSV-A颗粒或流感颗粒H1施用于相应的鼻咽拭子以模拟来自感染患者的临床拭子样品。将拭子置于提取器或设备10的提取室12中。提取室12含有250μl磷酸盐缓冲盐水和0.1％Triton X-100，随后使用自调节加热装置将其加热至95℃。将该温度保持3分钟，之后使用移液管将25μl裂解液转移至设备10的扩增室22。将25μl裂解液与包含以下的LAMP扩增缓冲液混合：来自B.stereothermophius(Bst 2.0NewEngland Biolabs)的链置换DNA聚合酶、靶向特定的化脓性链球菌、RSV-A或流感病毒H1基因的引物(总共5μl)(如上所述)、5μl dNTP、1μl MgSO₄和15μl pH9.2的盐缓冲液。使用自调节加热器将扩增室22维持在63℃20分钟以允许发生扩增。使用荧光染料(10μl SYBRgreen)监测扩增，并且可在14分钟内检测到扩增。从临床拭子检测化脓性链球菌的总时间为19分钟，其中包括5分钟的样品释放和裂解步骤。

还使用DNA扩增的电化学检测。在扩增室22中于63℃孵育20分钟后，使用亚甲蓝检测和PalmSens恒电位仪的循环伏安法分析样品，并与扩增前的基线读数进行比较。峰值阳极电流的减少指示扩增。使用两种不同浓度的亚甲蓝(MB)检测500ng的扩增DNA。单独的亚甲蓝用作对照。

自调节加热的分析

在设备10中确认了用于裂解感染性物质和扩增DNA的准确的温度控制。使用自调节加热器以将提取室中的温度保持在93℃并且将扩增室中的温度保持在63℃。对于裂解温度，测试各种电阻以研究自调节加热器是否可以在室温的各种条件下正常发挥功能。发现在所有测试的电阻下，93℃的温度保持超过20分钟(图2)。对于扩增温度，在8.6ohm下63℃的温度可以保持20分钟(图3)。基于这些结果，确定自调节加热器足以维持裂解和扩增的温度。

评估样品裂解

为了确认设备10足以在93℃下并在3分钟内裂解临床材料并对临床样本灭菌，将呼吸道合胞病毒(RSV)、流感病毒、大肠杆菌和化脓性链球菌分别引入设备10的提取室12中用于后续分析。首先确定病毒和细菌在提取室12中被杀死，以确保该设备在使用后没有生物危害。为此，将10,000个细菌或病毒颗粒引入提取室中，裂解，然后基于平板测定(对于细菌)或通过感染和细胞培养(对于病毒)进行分析。暴露于提取室12后没有活的(感染性)病原体残留，表明于93℃暴露3分钟杀死100％的病毒或细菌。然后确定这些条件释放可用于DNA扩增的胞内DNA和RNA。在裂解每个样品后，用GenieII仪器上的LAMP分析所得DNA或RNA并与阳性裂解对照(珠子裂解)比较。发现LAMP可以检测所有四个样本中释放的核酸，表明可以使用提取室释放用于后续分析的核酸。

评估原位等温DNA扩增

为了确认可以在设备10中进行等温扩增，将RSV、流感病毒、大肠杆菌和化脓性链球菌样品在扩增室22内进行珠子裂解和扩增。随后用Syber Green DNA结合染料基于终点荧光分析样品。腔室内的所有样品在10分钟内扩增(图4)。

原位DNA检测

使用Quant-It PicoGreen DNA结合染料的视觉颜色和使用亚甲蓝的电位测定法进行DNA检测。为此，将扩增DNA与Quant-ItPicoGreen或亚甲蓝染料混合，并分别用肉眼或使用电位测定法进行分析。对于肉眼检测，可通过肉眼或通过RGB分析的电子比色检测来检测扩增DNA存在时的颜色变化，以及扩增DNA不存在时的缺乏颜色变化(图5)。对于使用亚甲蓝(MB)的DNA检测，测定存在和不存在扩增DNA时的峰值阳极电流。在扩增DNA存在下观察到峰值阳极电流显著降低20％-25％(图6)。在扩增DNA存在下，较低MB浓度(0.1μM)下的峰值阳极电流与较高MB浓度(1μM)相比降低更大，使得该较低浓度是优选的。

实施例2

临床分析

使用临床流感病毒阳性鼻咽拭子、RSV阳性鼻咽拭子和化脓性链球菌阳性咽拭子测试设备10。根据从基于培养方法已知为阳性的感染患者获得拭子。然后将拭子插入设备10的提取室12中。用250μlPBS填充提取室，并在93℃下加热3分钟。随后，将裂解材料泵入扩增室22，在那里其与LAMP混合物母液混合。然后启动扩增室22 15分钟(加热至63℃)，并在与Quant-It PicoGreen DNA结合染料混合后，在观察窗(图1c中的小瓶)中肉眼检测DNA。使用该设备在20分钟内检测到病原体。

实施例3

在图1C的照片中示出了手持式一次性设备的示例性实施方案，其结合了本文所述的关键功能模块和结构。样品提取和裂解均在提取/裂解室12’内进行，而DNA扩增和观察/检测在随后通过微流体通道16连接的扩增室20中进行，检测室50用于显示结果。在该实施例中，提取/裂解室12’适于在拭子插入点9接受拭子。该实施方案包括由金属合金材料构成的一个(1)提取/裂解室12’，由金属合金材料构成的两个平行的扩增室20、两个平行的微流体通道16和两个由聚合物材料构成的检测室50。因此，该实施方案的设备能够从相同的样品拭子检测两个不同的指标或检测一个指标和一个对照读数。提取/裂解室12和扩增室20各自与一个自调节加热器连接，所述自调节加热器分别在93℃下操作用于裂解和63℃下操作用于扩增。自调节加热器的实施不需要电子控制电路(如热传感器、微控制器等)，这大大降低了设备结构的复杂性和单元的成本，同时提高了设备的可靠性。所示实施方案可以舒服地装入小的人的手中。该设备可以进一步小型化以减少丢弃废物，因为它是完全一次性设备。图1C所示实施方案的主要部件是通过计算机数字控制(CNC，也称为计算机导航切割)工艺用现成材料生产的。在其他实施方案中，该设备的生产采用适当的铸件和/或模具来支持大批量生产。该设备的电源使用一次性电池，并且也完全集成在设备中。设备的简化设计和大批量生产工艺(例如注塑成型)使设备非常经济有效，并使集成设备成为完全一次性的。

本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不是限制性的。如本文所用的，单数形式“一”、“一个”和“所述”也旨在包括复数形式，除非上下文另有明确说明。将进一步理解，当在本说明书中使用时，术语“包括”和/或“包含”指定所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或组件的存在，但不排除存在或者添加一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元件、组件和/或其组合。

以下权利要求中的所有装置或步骤加功能元件的对应结构、材料、动作和等同物旨在包括用于与特定指出的其他要求保护的元件共同执行功能的任何结构、材料或动作。已经出于说明和描述的目的给出了描述，但是并不旨在穷举或限于所公开的形式。在不脱离权利要求范围的情况下，许多修改和变化对于本领域普通技术人员而言是显而易见的。选择和描述实施方案是为了最好地解释技术原理和实际应用，并且使本领域普通技术人员能够理解用于各种实施方案的技术，其具有适合于预期的特定用途的各种修改。

已经通过实施例描述了一个或多个当前优选的实施方案。对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离权利要求范围的情况下，可以进行许多变化和修改。

Claims (27)

1.一种用于检测靶核酸序列的完全集成的独立即时检测设备，包括：

提取室，其适于接受用于提取和裂解样品以释放核酸的生物样品，所述提取室具有开口并且其尺寸为接受携带所述生物样品进入所述提取室的拭子的头部，其中所述提取室包括含有裂解液的袋，用于提取和裂解所述生物样品以释放核酸；

与用于从所述生物样品提取和裂解核酸的所述提取室连接的加热器；

扩增室，用于接受用于扩增靶核酸序列的扩增试剂；

在所述扩增室内的检测元件，其中所述检测元件包括检测表面，所述检测表面是所述扩增室的至少一部分壁且涂覆有用于捕获扩增的靶核酸的多个不同的捕获探针；

其中每个不同的捕获探针都被涂覆到检测表面的不同位置并且适用于捕获来自不同病原体的扩增靶核酸片段，用于在单个腔室中检测多个靶核酸；

读取区，用于在引入检测剂时显示与捕获和扩增的靶核酸片段相关的可检测信号，其中所述读取区包括一个或多个观察窗，所述观察窗被定位成对应所述检测表面的不同位置，所述检测表面涂覆有多个不同的捕获探针；和

用于密封所述开口的盖子，其中所述盖子的关闭启动所述加热器以加热所述提取室，其中将所述拭子插入所述提取室或所述盖子的关闭刺穿袋子，使所述拭子的头部暴露于所述裂解液。

2.根据权利要求1所述的设备，包括用于促进所述提取室中的机械裂解的马达。

3.根据权利要求1或2所述的设备，进一步包括与所述提取室流体连接的废液贮存器。

4.根据权利要求3所述的设备，其中所述废液贮存器与所述提取室直接连接。

5.根据权利要求3所述的设备，其中所述废液贮存器通过所述扩增室与所述提取室流体连接。

6.根据权利要求1或2所述的设备，其中所述扩增室与至少一个洗涤液室连接。

7.根据权利要求1或2所述的设备，包括与所述扩增室流体连接的引物储存室。

8.根据权利要求7所述的设备，其中所述引物储存室包括扩增混合物，所述扩增混合物包含待引入所述扩增室的用于扩增靶核酸序列的寡核苷酸引物、DNA聚合酶、三磷酸脱氧核苷、缓冲液和镁。

9.根据权利要求8所述的设备，其中所述引物包含用于可检测地标记所述靶核酸的可检测标记。

10.根据权利要求1或2所述的设备，其中由选自以下的可检测标记产生可检测信号：荧光标记、化学发光标记、发色标记和电化学可检测标记。

11.根据权利要求1或2所述的设备，其中所述设备包括适于扩增阳性对照核酸序列的与所述提取室连通的对照室，其中所述对照室接受或预装有扩增混合物，所述扩增混合物包含与对照核酸序列互补的寡核苷酸引物。

12.根据权利要求1或2所述的设备，其中所述多个不同的捕获探针包括固定的靶标捕获核酸探针。

13.根据权利要求1或2所述的设备，其中在提取室内、扩增室内或在检测表面使用带正电的电场以加快核酸与多个不同的捕获探针的结合。

14.根据权利要求1或2所述的设备，其中使用另外的加热器将所述扩增室保持在58℃-66℃的温度。

15.根据权利要求1或2所述的设备，其中所述提取室和所述扩增室是同一腔室。

16.根据权利要求1或2所述的设备，包括用于多个靶核酸序列的扩增试剂。

17.根据权利要求1所述的设备，包括微流泵以在腔室之间转移释放的核酸。

18.根据权利要求8所述的设备，其中所述寡核苷酸引物是用于扩增特定致病序列的等温DNA扩增引物。

19.根据权利要求1或2所述的设备，其中诊断信息传输至机载读取器。

20.根据权利要求1或2所述的设备，其中诊断信息通过USB连接或通过直接捕获图形图像传输至手机、便携式电脑或平板电脑。

21.根据权利要求1所述的设备，其中所述设备通过USB连接从手机或便携式电脑供电。

22.根据权利要求1或2所述的设备，其中所述加热器是用于保持预定温度的自调节加热器。

23.根据权利要求1或2所述的设备，其中所述设备是一次性的。

24.根据权利要求1或2所述的设备，其中所述设备是手持式的。

25.根据权利要求1或2所述的设备，其中所述一个或多个观察窗形成所述提取室壁的一部分，并且其中所述一个或多个窗的内表面涂覆有多个不同的捕获探针。

26.根据权利要求25所述的设备，其包括多个观察窗，每个观察窗都涂覆有不同的捕获探针。

27.根据权利要求25所述的设备，其中所述观察窗的外表面被不透明层覆盖，所述不透明层具有对应于每个不同捕获探针的位置的孔。

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