CN109562379A

CN109562379A - 用于染料共轭试剂的干燥过程

Info

Publication number: CN109562379A
Application number: CN201780047903.7A
Authority: CN
Inventors: 斯里达尔·拉马纳坦; 巴德里·纳拉亚南·纳塔拉詹
Original assignee: Baker Menkolt Co
Current assignee: Baker Menkolt Co
Priority date: 2016-06-20
Filing date: 2017-06-19
Publication date: 2019-04-02
Also published as: WO2017222998A1; US11249075B2; US20220091108A1; US11774443B2; US20190242882A1

Abstract

该方法涉及将染料‑共轭试剂在反应容器中的不同位置干燥，使得染料在干燥期间不会彼此非特异性地相互作用。因此，本发明通过消除染料在一起干燥时非特异性地彼此附着而引起的错误结果，改善了多重结合测定。

Description

用于染料共轭试剂的干燥过程

与其他应用的关系

本申请要求2016年6月20日提交的印度申请201611021054的权益，其全部内容在此以引用方式并入本文以用于所有目的。

技术领域

本发明涉及用于检测和分析液体样品中的靶分析物的方法、制品和组合物。

背景技术

生物测定对于检测或定量某些感兴趣的分子或分析物是重要的。这些分析物对于医学诊断或其他一些研究目的可能很重要。该测定可以是酶促测定或结合测定，诸如免疫测定。测定通常需要标记的试剂以使目标或所感兴趣分析物可视化。使用标记时，重要的是标记仍然与单一试剂相关联，以准确测量特定目标。

生物测定，诸如免疫测定，通常使用生物试剂，例如抗体或其他蛋白质来检测和任选地定量靶分析物。可使用附着于试剂例如荧光染料、非荧光染料或酶的标记物来检测和测量分析物与生物试剂的结合。

多重测定允许在单个测定中同时检测多种分析物。对于免疫测定，多重测定涉及抗体混合物，每种抗体用不同的染料标记。每种抗体与样品中的特定分析物结合。以这种方式，可基于不同的染料区分和定量不同的分析物。

为方便起见，多重测定试剂可作为单个结合分子(例如抗体)的预混合混合物提供。其他反应组分可包含在混合物中，例如缓冲液、盐、表面活性剂等。最方便的是含有所有必需组分(单一分析试剂)的混合物。在这种情况下，可通过简单地将样品添加到含有混合物的反应容器中来进行测定。

提供稳定的测定试剂是方便的，特别是在室温下稳定的试剂。这允许在不冷藏的情况下运输和储存试剂。这对于在农村地区进行的测定尤为重要，农村地区的资源(包括电力)可能有限。

在现有技术中，通过干燥试剂的水溶液或通过冷冻干燥提供稳定的试剂。但是一些标记试剂存在问题。这些试剂在干燥过程中变得交联。它们在重新悬浮在液体溶液中后保持交联，因此标记不再与单个分子结合，导致错误的结果。这在例如流式细胞术领域尤其成问题，其中通过仅使用一个波长进行激发，多个聚合染料用于产生10个或更多个荧光通道。然而，这些聚合物染料的化学性质阻止了多种染料制剂在同一溶液中的储存。已经观察到聚合物实体在溶液中彼此结合(可能是疏水键)。这导致错误的补偿设置或实际上不存在的异常细胞群。因此，与这些染料共轭的抗体通常分开储存并在实验前配制。在进行多参数多站点研究时，这会带来额外的可变性。此外，由于配制的试剂不能长时间储存，因此也会导致浪费。

发明内容

本发明提供了包含干反应物组合物的基底和制备它们的方法。该组合物包含稳定的多重标记试剂，其在干燥过程中不会交联。稳定的试剂可用于改善多重结合测定。

在第一方面，本发明提供了一种反应容器，其包括主体，所述主体含有设置在第一基底上的第一干反应物点。出于本公开的目的，点可以是任何形状并且可以任何形式存在于基底上。第一干反应物点包含与第一聚合物染料共轭的第一结合配偶体。反应容器主体另外含有设置在第二基底上的第二干反应物点。第二干反应物点包含与第二聚合物染料共轭的第二结合配偶体。反应容器被配置成接收液体样品，所述液体样品接触第一干反应物点和第二干反应物点。这种接触导致第一结合配偶体和第二结合配偶体溶解，以在反应容器中形成包含第一结合配偶体和第二结合配偶体的液体反应混合物。在一些实施方案中，反应容器包含含有多个，例如两个、三个或更多个干反应物点的主体，每个干反应物点设置在不同的基底上并包含与不同聚合物染料共轭的不同结合配偶体。反应容器被配置成接收液体样品，所述液体样品接触多个干反应物点，并且这种接触导致不同结合配偶体溶解在各个反应物点中以形成包含不同结合配偶体的液体反应混合物。

在一个实施方案中，第一基底和第二基底中的至少一者是膜或珠。在一个实施方案中，第一基底和第二基底中的至少一者是反应容器的主体的内表面。在一个实施方案中，第二基底层叠在第一基底上方。在一个实施方案中，第一基底和第二基底中的至少一者结合到反应容器的主体的内表面。

在一个实施方案中，将第一干反应物点和第二干反应物点中的至少一者固定到基底。在一个实施方案中，第一干反应物点和第二干反应物点中的至少一者是膜的形式，其中膜将第一结合配偶体或第二结合配偶体固定到基底。

在一个实施方案中，第一点中的与第一染料共轭的第一结合配偶体和第二点中的与第二染料共轭的第二结合配偶体在室温下稳定至少一个月。

在一个实施方案中，第一点中的与第一染料共轭的第一结合配偶体和第二点中的与第二染料共轭的第二结合配偶体在室温下稳定至少一年。

在一个实施方案中，反应容器是微量滴定板的孔。

在第二方面，本发明提供了一种反应容器，其包括主体，所述主体含有设置在基底上的第一干反应物点。第一干反应物点包含与第一染料共轭的第一结合配偶体。反应容器主体另外含有设置在基底上的第二干反应物点，并且第二干反应物点包含与第二染料共轭的第二结合配偶体。第一干反应物点和第二干反应物点在基底上至少基本上物理分离。反应容器被配置成接收液体样品，其接触第一干反应物点和第二干反应物点。这种接触导致第一结合配偶体和第二结合配偶体溶解，在反应容器中形成包含第一结合配偶体和第二结合配偶体的液体反应混合物。

在一个实施方案中，第一干反应物点和第二干反应物点不重叠。在一个实施方案中，第一干反应物点和第二干反应物点部分重叠。在一个实施方案中，反应容器还包括设置在第一干反应物点和第二干反应物点之间的隔离器。在一个实施方案中，隔离器被配置成在接收液体样品之前将第一结合配偶体与反应容器中的第二结合配偶体隔离。

在一个实施方案中，基底是反应容器的主体的内表面。在一个实施方案中，基底是膜或珠。

在一个实施方案中，第一染料和第二染料中的至少一者是聚合物染料。

在一个实施方案中，反应容器是微量滴定板的孔。

在第三方面，本发明提供了制备两个或更多个干反应物点的方法。该方法包括：将包含与第一染料共轭的第一结合配偶体的第一反应物以液相分配到第一基底上，其中第一染料是聚合物染料。该方法还包括：将包含与第二染料共轭的第二结合配偶体的第二反应物以液相分配到第二基底上，其中第二染料是聚合物染料。该方法还包括干燥液相的第一反应物和第二反应物，以在第一基底上形成第一干反应物点，并且在第二基底上形成第二干反应物点。

在一个实施方案中，该方法还包括将第一基底和第二基底放置在反应容器内。在一个实施方案中，第一基底和第二基底中的至少一者是膜。在一个实施方案中，该方法还包括将第一基底和第二基底中的至少一者结合到反应容器的内表面。

在一个实施方案中，第一基底和第二基底中的至少一者是珠。在一个实施方案中，第一基底和第二基底中的至少一者是反应容器的内表面。在一个实施方案中，第一染料和第二染料中的至少一者是聚合物染料。在一个实施方案中，同时干燥第一反应物和第二反应物。

在第四方面，本发明提供了制备两个或更多个干反应物点的方法。该方法包括将液相的第一反应物干燥到基底上以形成第一干反应物点；将液相的第二反应物干燥到基底上，以形成第二干反应物点。第一反应物包括与第一染料共轭的第一结合配偶体，第二反应物包括与第二染料共轭的第二结合配偶体。第一干反应物点和第二干反应物点在基底上至少基本上物理分离，并且第一染料和第二染料中的至少一者是聚合物染料。

在一个实施方案中，该方法还包括在干燥期间保持第一反应物和第二反应物的物理分离，使得第一干反应物点和第二干反应物点不重叠。在一个实施方案中，该方法还包括将基底放置在反应容器内。在一个实施方案中，同时干燥第一反应物和第二反应物。

在一个实施方案中，基底是膜或珠。在一个实施方案中，基底是反应容器的内表面。在一个实施方案中，该方法还包括将基底结合到反应容器的内表面。

定义

如本文所用，以下术语及其变体具有下文给出的含义，除非在使用该术语的上下文中明确意图不同的含义。

“分析物”是指样品中的分子、化合物或其他组分。分析物包括但不限于肽、蛋白质、多核苷酸、有机分子、糖和其他碳水化合物以及脂质。

“抗体”是指免疫球蛋白或其特异性结合分析物的片段或衍生物。抗体包括免疫球蛋白的各种类别和同种型，例如IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM。抗体片段包括分子，例如Fab、scFv、F(ab′)2和Fab′分子。抗体衍生物包括具有添加或取代的抗体或其片段，例如嵌合抗体。抗体可源自人或动物来源，来自杂交瘤，通过重组方法，或本领域已知的任何其他方式。

“结合配偶体”是指能够特异性结合分析物的分子。结合配偶体可以是许多不同类型的分子中的任何一种，包括抗体或其他蛋白质、肽、多糖、脂质、核酸或核酸类似物，例如寡核苷酸或PNA(肽核酸)。

“标记的结合配偶体”是指与染料共轭的结合配偶体。

“反应物溶液”是指包含标记的结合配偶体的溶液。在一些实施方案中，除了标记的结合配偶体之外，反应物溶液还包含稳定剂、盐、缓冲剂、表面活性剂和/或其他试剂。

“干反应物点”是指通过干燥沉积在其上的反应物在反应容器的基底上形成的点。

“至少基本上物理分离”是指两个干反应物点之间的空间关系，其通常彼此不接触或可部分重叠，使得显著减少或消除由染料交联导致的错误结果。

本文的“多路复用”是指可同时测定多种分析物的测定或其他分析方法。

附图说明

图1示出了聚合物染料彼此相互作用，导致流式细胞仪显示实际上不存在的异常细胞群。来自干燥BV染料(CD19-BV 421和CD4-BV711)的直方图显示Q2中的异常群体。这在干燥后始终如一地发生，表明在干燥过程中聚合物染料的相互作用。

图2显示了使用抗原-抗体共轭物的流式细胞术结果，将其干燥，然后在应用于样品之前重构。

图3A至图3C显示了使用两种抗原-抗体共轭物的流式细胞术结果。在施加到样品上之前，将共轭物在相同的膜上，但在不同的位置进行干燥。

具体实施方式

概述

本发明提供了最小化结合测定中的错误结果的方法，所述结合测定可能是由染料在一起干燥时彼此非特异性附着(“粘附”)引起的。对于使用用聚合染料标记的试剂的测定，非特异性附着通常是一个问题。本发明通过在一个或多个基底上的不同位置干燥染料-共轭试剂来解决该问题，使得染料在干燥期间不相互作用。染料共轭的试剂(标记的结合配偶体)可独立地结合要分析的液体样品中的靶分析物，并且显著减少或消除由交联引起的错误结果。

具体实施方案

反应容器

本文公开的反应容器可以是任何容器，其中可发生结合配偶体和靶分析物之间的反应。例如，反应容器可以是管、板、微量滴定板的孔、室和载玻片。在优选的实施方案中，反应容器具有封盖或顶盖，使得结合反应可在封闭的环境中发生。

基底

反应容器包含一个或多个基底。基底可以是任何合适的表面，包括但不限于塑料、硝化纤维素、醋酸纤维素和玻璃。在一些实施方案中，基底是膜。基底可以是反应容器的主体的内表面，例如塑料管或微量滴定板的孔。基底也可以是珠。在一些实施方案中，接收标记的结合配偶体(例如膜)的基底中的至少一者结合到反应容器的主体的内表面。在一些实施方案中，膜基底是片材或辊，这使得更容易沉积溶液并且更容易干燥。在一些实施方案中，可切割膜以分离各个干燥的反应物点。在一些实施方案中，将切割的膜简单地滴入反应容器中。在一些优选的实施方案中，切割的膜与反应容器的表面结合，使得当液体移入或移出反应容器时，点不会从容器中逸出。

液体样品

反应容器被配置成接收液体样品。用于本发明的液体样品通常包含作为或分散在主要含水介质中的靶分析物。样品可以是任何生物材料来源，其包含可直接或间接从活生物体获得的多核苷酸。样品可包括例如细胞、组织或液体，以及该生物留下的沉积物，包括病毒、支原体和化石。样品可包含通过合成方法全部或部分地制备的靶分析物。样品的非限制性示例包括血液、尿液、精液、乳汁、痰、粘液、口腔拭子、阴道拭子、直肠拭子、抽吸物、针吸活组织检查、例如通过手术或尸检获得的一段组织、血浆、血清、脊髓液、淋巴液、皮肤外部分泌物、呼吸道、肠道和泌尿生殖道、泪液、唾液、肿瘤、器官、体外细胞培养成分样品(包括但不限于由细胞培养基中细胞的生长产生的条件培养基、推定病毒感染的细胞、重组细胞和细胞成分)。

目标分析

设计本发明以检测特定靶分析物的存在，并且在一些情况下检测特定靶分析物的量。本文所公开的靶分析物是指要检测的靶分子，例如肽、蛋白质、多核苷酸、有机分子、糖和其他碳水化合物，以及脂质。本发明的一个重要方面是，靶分析物包含在液体样品中，并且可在某一点可触及或使其可触及，以结合本发明的分析物特异性结合配偶体。

靶分析物可存在于珠中，或存在于细胞表面上并且在细胞表面上可触及。可用的分析物的例示性示例包括但不限于以下：1)特定细胞表面大分子和抗原(包括激素、蛋白质复合物和由细胞受体识别的分子)和2)细胞蛋白、透化细胞中的DNA或RNA，包括异常的DNA或RNA序列或异常量的某些信使RNA。这些分析物的检测在它们包含在稀有细胞中和/或是稀有细胞的标识符的情况下特别有用，例如在各种癌症的早期阶段中发现的稀有细胞。

结合配偶体

本文所公开的结合配偶体特异性结合靶分析物。许多不同类型的结合配偶体可用于本系统和方法中。在一个实施方案中，结合配偶体是抗体。用于结合特定分析物的抗体优选是单克隆的，因此针对分析物的单个表位。单克隆抗体可使用本领域已知的技术制备，并且通常通过使用产生具有所需结合特征的抗体的B细胞系产生杂交瘤来制备。针对单个表位的抗体也可以其他方式产生，例如通过重组方法。在一些实施方案中，多克隆抗体可用作本系统和方法中的特异性结合配偶体。例如，结合配偶体可以是针对分析物的表位产生的多克隆抗体。多克隆抗体可以本领域已知的方式制备，例如通过免疫宿主并从宿主收集血浆或血清。保留其特异性结合特征的抗体片段也可用作本发明中的特异性结合配偶体，包括缺少抗体的Fc部分的片段，例如Fab、Fab′和F(ab′)2片段。F(ab′)2片段可通过本领域已知的方法产生，例如通过用蛋白水解酶如木瓜蛋白酶和胃蛋白酶切割单克隆抗体。Fab′片段可通过用诸如二硫苏糖醇或巯基乙醇的试剂还原裂解F(ab′)2片段来产生。另选地，可使用重组方法来产生抗体片段，例如通过使用噬菌体展示文库。

除抗体或抗体片段或衍生物之外的结合配偶体也可用于本系统和方法中。例如，结合配偶体可以是核酸或核酸类似物，例如寡核苷酸或PNA探针。在一个实施方案中，核酸配体可用作特异性结合配偶体。核酸配体是单链DNA或RNA(ssDNA或ssRNA)分子，其可利用高亲和力和特异性来结合预先选择的靶标，包括蛋白质和肽。也可使用能够与靶分析物结合形成受体-配体、酶-基底、酶-抑制剂和酶-辅因子对的其他结合配偶体。这种特异性结合配偶体对的具体示例包括碳水化合物和凝集素、生物素和亲和素或链亲和素、叶酸和叶酸结合蛋白、维生素B12和内在因素、蛋白A和免疫球蛋白，以及蛋白G和免疫球蛋白。还包括与靶分析物形成共价键的结合配偶体。

染料

染料是提供可检测信号的部分，其可直接或间接附着或结合到结合配偶体中。用于本发明中的染料可以是有色的、荧光的或发光的，并且通常通过检测器，例如流式细胞仪来检测。荧光染料可以是单体的或聚合的。单体染料的非限制性示例包括荧光剂、若丹明和花菁。

聚合物染料特别可用于化学和生物靶标的分析。它们是高响应性光学报告物和有效的光吸收剂，由于它们包含多种发色团。聚合物染料的示例包括但不限于具有发色团重复单元的共轭聚合物、共轭分子的聚集体、通过侧链连接到饱和聚合物的发光染料、半导体量子点和树枝状结构。

美国专利7,214,489、8,354,239、8,575,303中公开的聚合物和单体染料也可用于本发明。

标记的结合配偶体

染料可通过位于结合配偶体中的反应性对与标记之间的各种连接化学与结合配偶体共轭。反应对可包括但不限于马来酰亚胺/硫醇、琥珀酰亚胺酯(NHS酯)/胺、叠氮化学、羧基/EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐)/胺、胺/磺基-SMCC(磺基琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺基乙基]环己烷-1-羧酸酯)/硫醇、和胺/BMPH(N-[～-氨基亚氨基丙酸]酰肼.TFA)/硫醇。进行共轭的方法是本领域熟知的。用于进行共轭的商业试剂盒也是容易获得的，例如来自Innova biosciences(Cambridge，UK)，Novus Biologicals(Littleton，CO)，Thermo Fisher Scientific(Waltham，MA)。

反应物溶液

包含标记的结合配偶体的反应物溶液不是本发明的关键方面。此类溶液通常将是包含稳定剂、盐、缓冲剂、表面活性剂和/或本领域技术人员熟知的其他试剂的水溶液。本发明溶液中使用的稳定剂可以是蛋白质(例如，牛血清白蛋白、明胶、牛奶)、碳水化合物(例如海藻糖、右旋糖、蔗糖)或有机聚合物(例如聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮)。在一些实施方案中，稳定剂可促进干反应物点附着到基底上，使得点保留在管的底部，并且当反应容器打开时不会被吹走或粘到盖子。

将反应物溶液沉积并干燥到基底上

将包含标记的结合配偶体分子的反应物溶液沉积在基底上的所需位置上。沉积的反应物溶液的体积可变化。在一些实施方案中，体积为1μl-20μl。在一些实施方案中，体积为2μl-10μl。在优选的实施方案中，体积为2μl-5μl。

然后将具有沉积的反应物溶液的基底以非冷冻形式(即未冻干)干燥，直到反应物基本上不含水并形成干点。用于干燥过程的合适温度和大气压根据结合配偶体的性质而变化。

通过保持至少基本上物理分离，防止具有不同标记的标记结合配偶体彼此相互作用。这个目标可通过多种方式实现。例如，包含不同标记的结合配偶体的反应物溶液可在同一基底(例如反应容器内部)上的不同位置上干燥。在一些实施方案中，将包含不同标记的结合配偶体的反应物溶液干燥到不同的基底上并置于相同的反应容器中。在一些实施方案中，反应容器包含多层基底(例如膜)，每层包含不同的反应物。在一些实施方案中，隔离壁设置在其中反应物溶液沉积在同一基底上的不同位置之间。隔离壁被配置成在接收液体样品之前在基底(例如，反应容器的内壁)上将第一标记的结合配偶体与第二标记的结合配偶体分离。隔离壁可以是井、凹坑的形式或从表面突出的某种形式，并且它可用于在干燥期间保持反应物的分离。

可同时或依次沉积和干燥不同的反应物溶液。当依次沉积和干燥两种反应物溶液时，在沉积第二反应物溶液之前，第一反应物溶液不必完全干燥。

干反应物点

干反应物点可采用任何几何形状，例如圆形或椭圆形。干反应物点的尺寸可根据各种因素而变化，例如，沉积在基底上的反应物的体积和基底的性质。在一些实施方案中，干反应物点的直径为1mm-8mm，或1mm-5mm。通常，2ul-5ul的反应物溶液形成直径为2mm的干反应物点。

干反应物点通常是不重叠的，但是可允许一些重叠，只要它不会导致染料的显著交联即可。在一些实施方案中，干反应物点是物理分离的。在一些实施方案中，它们部分重叠。在一些实施方案中，它们分开，使得任何两个干反应物点之间的中心间隔至少10mm、至少50mm或至少100mm。为了本发明的目的，确定干反应物点之间的可接受的重叠程度或合适的分离程度在本领域技术人员的技能范围内。

在一些实施方案中，第二干反应物点位于第一干反应物点上方，例如，第二点形成在基底上的位于形成有第一反应物的基底层上方的层中。

在一些实施方案中，反应物点中的至少一个是膜的形式，其中将结合配偶体固定到基底。固定到基底可能需要在结合配偶体和基底之间形成非化学键，这允许结合配偶体在一段时间内保留在基底上。这通常通过在基底上形成薄膜来完成，然后由于物理粘合力而将薄膜保留在基底上。

其他测定组分(缓冲液、盐、表面活性剂、裂解、透化或固定剂)也可沉积并干燥到与具有干反应物点的基底相同的基底上。这些测定组分可作为单独的点或与标记的结合配偶体组合沉积。这些测定组分的点可重叠或甚至叠加在干燥的反应物点上，因为它们不包含染料，因此不与标记的结合配偶体中的染料相互作用。

标记的结合配偶体的稳定性

在容器的身体内的干反应物点中保留结合配偶体显著提高了它们的稳定性。结合配偶体的稳定性通过其在储存一段时间后结合其靶分析物的能力来测量。与保存在溶液中的结合配偶体的混合物(其具有相对短的保质期)不同，保存在反应容器中的单独干反应物点中的结合配偶体在长时间内是稳定的。在某些情况下，这些标记的结合配偶体在42℃下储存至少2年后，在结合其靶分析物时没有显示出可测量的活性损失。为了本发明的目的，在它们各自的干反应物点中的标记的结合配偶体在室温下稳定至少一个月、或至少六个月、或至少一年。

使用反应容器进行多重结合测定

为了进行多重结合测定，将包含靶分析物的合适量的液体样品加入到含有两个或更多个如上所述制备的干反应物点的反应容器中。接触点后，液体样品溶解标记的结合配偶体以形成反应混合物。来自液体样品的靶分析物与它们各自的结合配偶体结合。可使用检测与结合配偶体共轭的染料的装置来检测结合。因此，本发明可用于改进许多多重测定平台，包括但不限于流式细胞术、免疫分析、Western印迹、PCR或使用标记探针或蛋白质的结合分析。

实施例

提供以下实施例用于说明，但不限制要求保护的发明。

实施例1

该实验证明，干燥包含多个标记的结合配偶体的混合物产生错误的结果，这是由标记的结合配偶体之间的非特异性连接引起的。将包含两个标记的结合配偶体的混合物在标准12×75管中干燥：与Brilliant Violet(BV)421(BD Biosciences)共轭的抗CD19抗体和与BV 711共轭的抗CD4抗体(BD Biosciences)。将血液样品加入管中。在足以溶解干燥的抗体-BV结合物并用这些共轭物标记细胞一段时间后，然后对标记的细胞进行流式细胞术分析。结果如图1所示，显示了CD19和CD4阳性的异常细胞群。由于大多数淋巴细胞是表达CD4但不表达CD19的T细胞；或者是表达CD19但不表达CD4的B细胞，结果显示CD19和CD4均为大量阳性细胞，这很可能是由于两个抗体-BV结合物非特异性地相互连接，因此两者都结合同一个细胞。

实施例2

该实验证明，可将标记的结合配偶体干燥然后重构，并且重构的标记配偶体保持其对其靶分析物的结合活性。

将标记的结合配偶体，AmCyan共轭的抗CD3抗体分配在膜上，例如硝酸纤维素或乙酸纤维素，并干燥。然后将膜置于标准的12×75管中。将血液样品加入管中。在足以重构和结合配偶体与靶分析物结合的一段时间后，对标记的血细胞进行流式细胞术分析。结果显示CD3阳性的细胞群，表明重构的抗体-染料共轭物保留其对血液样品中T淋巴细胞中表达的CD3标记的结合活性。参见图2。

实施例3

该实验证明，在不同位置干燥两个标记的结合配偶体消除了假双阳性细胞群。

将两个标记的结合配偶体(BV711共轭的抗CD3抗体和BV421共轭的抗CD19抗体)在相同膜(硝酸纤维素或乙酸纤维素)上的不同位置上干燥。将具有干燥的标记的结合配偶体的膜连接到标准12×75管的表面上。将血液样品加入管中。在足以重构和结合配偶体与靶分析物结合的一段时间后，对标记的细胞进行流式细胞术分析。结果显示CD19阳性，CD3阳性，双阳性(对于CD3和CD4都呈阳性)群体，分别表明存在B细胞，T细胞和CD4T细胞。图3A和图3B。每个细胞群的百分比与它们在血液中的表现一致。在图3A中，各种标记的细胞群的百分比示于表1中。当用BV711共轭的抗CD3抗体和BV421共轭的抗CD19抗体染色时，没有错误的双阳性细胞-对于CD19和CD3都呈阳性的细胞。这表明在同一基底上的不同位置上干燥标记的结合配偶体解决了具有错误的双阳性结果的问题。图3C显示当用单一标记的结合配偶体：BV711-共轭的抗CD3抗体染色时，CD3阳性细胞。

表1标记细胞群的百分比

应当理解，本文描述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且本领域技术人员可提出对其进行各种修改或改变，并且包括在本申请的实质和范围内以及所附权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请均据此全文以引用方式并入以用于所有目的。

Claims

1.一种反应容器，包括主体，所述主体含有：

设置在第一基底上的第一干反应物点，所述第一干反应物点包含与第一染料共轭的第一结合配偶体，其中所述第一染料是聚合物染料；

设置在第二基底上的第二干反应物点，所述第二干反应物点包含与第二染料共轭的第二结合配偶体，其中所述第二染料是聚合物染料，

其中所述反应容器被配置成接收液体样品，使得所述液体样品接触所述第一干反应物点和所述第二干反应物点并溶解所述第一结合配偶体和所述第二结合配偶体以在所述反应容器中形成包含所述第一结合配偶体和所述第二结合配偶体的液体反应混合物。

2.根据权利要求1所述的反应容器，其中所述第一基底和所述第二基底中的至少一者是膜。

3.根据权利要求1至2中任一项所述的反应容器，其中所述第二基底层叠在所述第一基底上方。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的反应容器，其中所述第一基底和所述第二基底中的至少一者结合到所述反应容器的所述主体的内表面。

5.根据权利要求1、3或4中任一项所述的反应容器，其中所述第一基底和所述第二基底中的至少一者是珠。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的反应容器，其中所述第一基底和所述第二基底中的至少一者是所述反应容器的所述主体的内表面。

7.一种反应容器，包括主体，所述主体含有：

设置在基底上的第一干反应物点，所述第一干反应物点包含与第一染料共轭的第一结合配偶体；

设置在所述基底上的第二干反应物点，所述第二干反应物点包含与第二染料共轭的第二结合配偶体；

其中所述第一干反应物点和所述第二干反应物点在所述基底上至少基本上物理分离，并且所述反应容器被配置成接收液体样品，使得所述液体样品接触所述第一干反应物点和所述第二干反应物点并溶解所述第一结合配偶体和所述第二结合配偶体以在所述反应容器中形成包含所述第一结合配偶体和所述第二结合配偶体的液体反应混合物。

8.根据权利要求7所述的反应容器，其中所述第一干反应物点和所述第二干反应物点不重叠。

9.根据权利要求7所述的反应容器，其中所述第一干反应物点和所述第二干反应物点部分重叠。

10.根据权利要求7至8中任一项所述的反应容器，还包括设置在所述第一干反应物点和所述第二干反应物点之间的隔离壁。

11.根据权利要求10所述的反应容器，其中所述隔离壁被配置成在接收所述液体样品之前将所述第一结合配偶体与所述反应容器中的所述第二结合配偶体分离。

12.根据权利要求7至11中任一项所述的反应容器，其中所述基底是所述反应容器的所述主体的内表面。

13.根据权利要求7至11中任一项所述的反应容器，其中所述基底是膜。

14.根据权利要求7至11中任一项所述的方法，其中所述基底是珠。

15.根据权利要求7至14中任一项所述的反应容器，其中所述第一染料和所述第二染料中的至少一者是聚合物染料。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的反应容器，其中将所述第一干反应物点和所述第二干反应物点中的至少一者固定到所述基底。

17.根据权利要求16所述的反应容器，其中所述第一干反应物点和所述第二干反应物点中的至少一者是膜的形式。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的反应容器，其中所述第一点中的与所述第一染料共轭的所述第一结合配偶体和所述第二点中的与所述第二染料共轭的所述第二结合配偶体在室温下稳定至少一个月。

19.根据权利要求1至17中任一项所述的反应容器，其中所述第一点中的与所述第一染料共轭的所述第一结合配偶体和所述第二点中的与所述第二染料共轭的所述第二结合配偶体在室温下稳定至少一年。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的反应容器，其是微量滴定板的孔。

21.一种制备两个或更多个干反应物点的方法，所述方法包括：

将第一反应物以液相分配到第一基底上，所述第一反应物包括与第一染料共轭的第一结合配偶体，其中所述第一染料是聚合物染料；

将第二反应物以液相分配到第二基底上，所述第二反应物包括与第二染料共轭的第二结合配偶体，其中所述第二染料是聚合物染料；以及

将所述第一反应物和所述第二反应物以液相干燥，以在所述第一基底上形成第一干反应物点且在所述第二基底上形成第二干反应物点。

22.根据权利要求21所述的方法，还包括将所述第一基底和所述第二基底放置在反应容器内。

23.根据权利要求21至22中任一项所述的方法，其中所述第一基底和所述第二基底中的至少一者是膜。

24.根据权利要求21至23中任一项所述的方法，还包括将所述第一基底和所述第二基底中的至少一者结合到所述反应容器的内表面。

25.根据权利要求21至24中任一项所述的方法，其中所述第一基底和所述第二基底中的至少一者是珠。

26.根据权利要求21至25中任一项所述的方法，其中所述第一基底和所述第二基底中的至少一者是反应容器的内表面。

27.根据权利要求21至26中任一项所述的方法，其中所述第一染料和所述第二染料中的至少一者是聚合物染料。

28.一种制备两个或更多个干反应物点的方法，所述方法包括：

将第一反应物以液相干燥到基底上以形成第一干反应物点，所述第一反应物包括与第一染料共轭的第一结合配偶体；以及

将第二反应物以液相干燥到所述基底上以形成第二干反应物点，所述第二反应物包括与第二染料共轭的第二结合配偶体；

其中所述第一干反应物点和所述第二干反应物点在所述基底上至少基本上物理分离，并且其中所述第一染料和所述第二染料中的至少一者是聚合物染料。

29.根据权利要求28所述的方法，还包括在干燥期间保持所述第一反应物和所述第二反应物的物理分离，使得所述第一干反应物点和所述第二干反应物点不重叠。

30.根据权利要求28至29中任一项所述的方法，还包括将所述基底放置在反应容器内。

31.根据权利要求28至30中任一项所述的方法，其中所述基底是膜。

32.根据权利要求28至31中任一项所述的方法，还包括将所述基底结合到反应容器的内表面。

33.根据权利要求28至30中任一项所述的方法，其中所述基底是珠。

34.根据权利要求28至29中任一项所述的方法，其中所述基底是反应容器的内表面。

35.根据权利要求21至34中任一项所述的方法，其中同时干燥所述第一反应物和所述第二反应物。