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CN109562162A - 多特异性免疫调节性抗原结合构建体 - Google Patents

多特异性免疫调节性抗原结合构建体 Download PDF

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CN109562162A CN201780006606.8A CN201780006606A CN109562162A CN 109562162 A CN109562162 A CN 109562162A CN 201780006606 A CN201780006606 A CN 201780006606A CN 109562162 A CN109562162 A CN 109562162A
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T·J·舒茨
P·博布罗维茨
H·萨布泽瓦里
M·M·施密特
R·V·泰伊三世
S·米特诺
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Compass Pharmaceuticals LLC
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Abstract

本文中提供了多特异性免疫调节性抗原结合构建体(MIAC)和包含所述构建体的组合物。还提供了使用所述构建体的方法和制备所述构建体的方法。

Description

多特异性免疫调节性抗原结合构建体
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年1月13日提交的美国临时申请号62/278,359和2016年7月13日提交的美国临时申请号62/361,842的权益，其各自的全部内容通过引用并入本文用于所有目的。
序列表
本申请含有序列表，其已经以ASCII格式电子提交，并且其全部内容据此通过引用并入本文。在2017年1月11日创建的所述ASCII副本命名为35868PCT_CRF_sequencelisting.txt，并且大小为94,734字节。
技术领域
本文中提供了多特异性免疫调节性抗原结合构建体(MIAC)和包含MIAC的组合物。还提供了使用构建体的方法和制备构建体的方法。
背景技术
同时调节相同效应细胞上的活化性和抑制性受体
基于效应细胞的免疫调节性抗体疗法利用抗体将诸如T细胞和天然杀伤(NK)细胞的效应细胞募集到期望的作用位点，如肿瘤。
基于效应细胞的免疫调节性抗体疗法的一个实例是来自Amgen Inc.的双特异性T细胞衔接器(Bispecific T Cell Engager)免疫疗法平台。平台设计为发挥T细胞和癌细胞之间的桥梁的功能。分子具有两个抗原结合位点：(1)结合肿瘤细胞表面上的抗原的结合位点；和(2)CD3结合位点，其结合T细胞表面上的CD3。通过结合这两种抗原，分子利用T细胞的细胞毒性活性来破坏表达特定抗原的癌细胞。参见Nagorsen和Baeuerle,Exp.Cell.Res.,2011,317:1255-1260；以及Baeuerle等人,Curr.Opin.Mol.Ther.,2009,11:22-30，每篇的全部内容通过引用并入。
其它基于效应细胞的免疫调节性抗体疗法包括衔接癌细胞上表达的抗原，以及在T细胞表面上表达的共刺激(即活化性)受体CD3和CD28的分子。参见Wang等人，J.Biochem.,2004,135:555-565，其全部内容通过引用并入。
然而，证据正在积累中，即仅提供规范的信号1和2(即，分别经由CD3和CD28)不能足以在癌症疗法的背景中诱导效应细胞的治疗相关的活化。关于这点的一个原因是一些癌细胞表达由效应细胞表达的抑制性受体的配体。例如，由癌细胞的PD-L1表达活化抑制性受体PD-1。抑制性受体转导抑制信号，其消除了来自相同效应细胞上共衔接的活化性受体的刺激信号。
另外，一些癌细胞不能展示由效应细胞表达的活化性受体的配体。例如，MICA或MICB的癌细胞脱落意味着这些配体将不能刺激活化性受体NKG2D。
不受理论的约束，似乎在单个细胞水平上整合由这些相反类型受体(即，活化性和抑制性)传输的信号，并且每个细胞然后根据在其免疫突触处转导的活化和抑制性信号的整合(例如总数)被活化(或者不活化)。例如，NK细胞的活化特别取决于经由活化性受体诸如NKG2D和抑制性受体如KIR的抑制形式和PD-1两者的信号传导的整合。参见Pegram等人，Immunology and Cell Biology,2011,89:216-224，其全部内容通过引用并入。
目前基于效应细胞的免疫调节性抗体疗法不考虑这些整合的信号传导机制。因此，目前的疗法缺乏在某些治疗情况(如表达由效应细胞表达的抑制性受体的配体的恶性肿瘤)中活化效应细胞的能力。
因此，需要通过同时调节经由由相同效应细胞表达的活化性和抑制性受体两者的信号传导来优化效应细胞功能的新型癌细胞靶向疗法。因此，在一些实施方案中，本文中提供了进行此功能的分子。还提供了使用此类分子的方法，例如在利用效应细胞的治疗应用中。还提供了制备这些分子的方法。
免疫调节性构建体对癌细胞的特异性靶向
某些癌细胞(i)不能表达由效应细胞表达的活化性受体的配体；或(ii)表达由效应细胞表达的抑制性受体的配体。癌细胞刺激效应细胞中活化信号的所得失败，或癌细胞在刺激效应细胞中的抑制信号中的成功也分别可以促进癌症的进展。
例如，Hodi等人(New Engl.J.Med,2010,363:711-723)(其全部内容通过引用并入)描述了接受拮抗抑制性受体的抗CTLA-4抗体易普利姆玛(ipilimumab)的转移性黑素瘤患者中的改善的存活。虽然易普利姆玛的施用确实增加了存活，但该抗体不是特异性靶向癌细胞的，因此广泛地且非特异性地活化免疫系统。此类广泛活化的后果包括严重的自身免疫毒性，如结肠炎和内分泌病。见上文。
因此，目前基于效应细胞的免疫调节疗法通常是有力的但非特异性的。相反，靶向癌细胞上的细胞表面抗原的传统的基于单克隆抗体的疗法通常是非常特异性的，但是可能缺乏效力。
因此，还需要解决许多基于效应细胞的免疫调节性抗体疗法中固有的特异性缺乏，以及许多癌细胞靶向性单克隆抗体疗法的效力的缺乏的新型治疗剂。有用的分子会将癌细胞靶向性单克隆抗体的特异性与基于效应细胞的免疫调节性疗法的免疫调节能力组合。因此，在一些实施方案中，本文中提供了进行该功能的分子。还提供了使用此类分子的方法，例如在利用效应细胞的治疗应用中。还提供了制备这些分子的方法。
本申请与2016年1月13日提交的同一申请人的专利申请PCT/US2016/013294相关，其全部内容通过引用并入本文用于所有目的。
发明内容
本文中描述了多特异性免疫调节性抗原结合构建体(MIAC)多肽，其包含：特异性结合由癌细胞表达的抗原的抗原结合模块1(ABM1)；特异性结合由效应免疫细胞表达的活化性受体的抗原结合模块2(ABM2)，其中ABM2与所述活化性受体的结合激动所述活化性受体；和特异性结合由所述效应免疫细胞表达的抑制性受体的抗原结合模块3(ABM3)，其中ABM3与所述抑制性受体的结合拮抗所述抑制性受体，其中ABM1、ABM2和ABM3彼此可操作连接，并且任选地其中每种抗原结合模块能够在每种其它抗原结合模块与其相应的抗原或受体结合的同时结合其相应的抗原或受体。
在一些方面中，MIAC还包含Fc，其中ABM1是scFv片段，ABM2是Fab片段，并且ABM3是scFv片段，其中ABM2与Fc连接，ABM3与ABM2连接，并且ABM1与Fc连接，其中相对于抗体对照组，所述MIAC在结合至少一种效应免疫细胞和至少一种癌细胞时通过效应免疫细胞诱导更多量的下列至少一种：IFN-γ、TNF-α、IL-2和粒酶B分泌，其中所述抗体对照组由与所述MIAC共同特异性结合相同靶标的以等摩尔浓度存在的不同单特异性抗体组成，其中相对于所述抗体对照组，所述MIAC在结合至少一种效应免疫细胞和至少一种癌细胞时诱导更高水平的效应免疫细胞增殖，并且其中相对于所述抗体对照组，所述MIAC在结合至少一种效应免疫细胞和至少一种癌细胞时诱导更高水平的效应免疫细胞CD25细胞表面表达。
在一些方面中，MIAC由连接在一起的ABM1、ABM2、ABM3和Fc组成，其中ABM1是scFv片段，ABM2是Fab片段，并且ABM3是scFv片段，其中ABM2的重链的C末端与Fc的N末端连接，ABM1与Fc的C末端连接，并且ABM3与ABM2的轻链的C末端连接，其中相对于抗体对照组，所述MIAC在结合至少一种效应免疫细胞和至少一种癌细胞时通过效应免疫细胞诱导更多量的下列至少一种：IFN-γ、TNF-α、IL-2和粒酶B分泌，其中所述抗体对照组由与所述MIAC共同特异性结合相同靶标的以等摩尔浓度存在的不同单特异性抗体组成，其中相对于所述抗体对照组，所述MIAC在结合至少一种效应免疫细胞和至少一种癌细胞时诱导更高水平的效应免疫细胞增殖，并且其中相对于所述抗体对照组，所述MIAC在结合至少一种效应免疫细胞和至少一种癌细胞时诱导更高水平的效应免疫细胞CD25细胞表面表达。
在一些方面中，MIAC由连接在一起的ABM1、ABM2、ABM3和Fc组成，其中ABM1是scFv片段，ABM2是Fab片段，并且ABM3是scFv片段，其中ABM2的重链的C末端与Fc的N末端连接，ABM1与Fc的C末端连接，并且ABM3与ABM2的轻链的C末端连接。
MIAC可以包含ABM1、ABM2和ABM3及作为Fc的支架。
ABM1和ABM2可以连接于与Fc的C末端不同的位置，且ABM3可以与Fc的C末端连接。ABM1和ABM3可以连接于与Fc的C末端不同的位置，且ABM2可以与Fc的C末端连接。在某些方面，ABM3与Fc的C末端连接。在某些方面，ABM2与Fc的C末端连接。在某些方面，ABM1与Fc的N末端连接。在某些方面，ABM1是与Fc的N末端连接的Fab片段。ABM和Fc可以以基本上不干扰针对癌细胞的ADCC的形式连接。
ABM3和ABM2可以连接于与Fc的C末端不同的位置，且ABM1可以与Fc的C末端连接。在某些方面，ABM3与Fc的N末端连接。在某些方面，ABM2与Fc的N末端连接。在某些方面，ABM1与Fc的C末端连接。ABM和Fc可以以基本上干扰针对所述癌细胞的ADCC的形式连接。
MIAC可以包含ABM1、ABM2和ABM3，其中ABM1是抗EGFR，ABM2是抗CD137，和ABM3是抗PD-1。
本文中还描述了多特异性免疫调节性抗原结合构建体(MIAC)，其包含：特异性结合由癌细胞表达的抗原的抗原结合模块1(ABM1)；和特异性结合由效应免疫细胞表达的活化性受体的抗原结合模块2(ABM2)，其中ABM2与所述活化性受体的结合激动所述活化性受体，其中ABM1和ABM2彼此可操作连接，并且任选地其中每种抗原结合模块能够在每种其它抗原结合模块与其相应的抗原或受体结合的同时结合其相应的抗原或受体。在一些方面中，MIAC还包含Fc，任选地其中ABM2是Fab片段并且ABM1是scFv片段，任选地其中ABM2的重链的C末端与Fc的N末端连接，并且ABM1与Fc的C末端连接，任选地其中所述MIAC是二聚体，任选地其中所述二聚体是同二聚体。
MIAC可以包含ABM1和ABM2，其中ABM1是抗CD19和ABM2是抗CD137。
MIAC可以包含ABM1和ABM2，其中ABM1是抗EGFR和ABM2是抗CD137。
ABM1可以与Fc的N末端连接和ABM2可以与Fc的C末端连接。在一些方面，ABM1是与Fc的N末端连接的Fab片段，且ABM2与Fc的C末端连接。在一些方面，ABM2与Fc的C末端连接。在一些方面，ABM1与Fc的N末端连接。ABM和Fc可以以基本上不干扰针对癌细胞的ADCC的形式连接。
ABM2可以与Fc的N末端连接和ABM1可以与Fc的C末端连接。在一些方面，ABM2与Fc的N末端连接；且ABM1是scFv片段和与Fc的C末端连接。在一些方面，ABM2与Fc的N末端连接。在一些方面，ABM1与Fc的C末端连接。ABM和Fc可以以基本上干扰针对癌细胞的ADCC的形式连接。
本文中还描述了多特异性免疫调节性抗原结合构建体(MIAC)，其包含：特异性结合由癌细胞表达的抗原的抗原结合模块1(ABM1)；和特异性结合由所述效应免疫细胞表达的抑制性受体的抗原结合模块3(ABM3)，其中ABM3与所述抑制性受体的结合拮抗所述抑制性受体，其中ABM1和ABM3彼此可操作连接，并且任选地其中每种抗原结合模块能够在每种其它抗原结合模块与其相应的抗原或受体结合的同时结合其相应的抗原或受体。在一些方面中，MIAC还包含Fc，任选地其中ABM3是Fab片段并且ABM1是scFv片段，任选地其中ABM3的重链的C末端与Fc的N末端连接，并且ABM1与Fc的C末端连接，任选地其中所述MIAC是二聚体，任选地其中所述二聚体是同二聚体。
MIAC可以包含ABM1和ABM3，其中ABM1是抗CD20和ABM3是抗PD-1。
MIAC可以包含ABM1和ABM3，其中ABM1是抗CD19和ABM3是抗PD-1。
MIAC可以包含ABM1和ABM3，其中ABM1是抗EGFR和ABM3是抗PD-1。
ABM1可以与Fc的N末端连接和ABM3可以与Fc的C末端连接。在一些方面，ABM1是与Fc的N末端连接的Fab片段，且ABM3与Fc的C末端连接。在一些方面，ABM3与Fc的C末端连接。在一些方面，ABM1与Fc的N末端连接。ABM和Fc可以以基本上不干扰针对癌细胞的ADCC的形式连接。
ABM3可以与Fc的N末端连接和ABM1可以与Fc的C末端连接。在一些方面，ABM3与Fc的N末端连接；且ABM1是scFv片段和与Fc的C末端连接。在一些方面，ABM3与Fc的N末端连接。在一些方面，ABM1与Fc的C末端连接。ABM和Fc可以以基本上干扰针对癌细胞的ADCC的形式连接。
在一些方面中，MIAC还包含支架，任选地其中所述支架是Fc，任选地其中所述Fc是人Fc，任选地其中所述Fc是人IgG Fc，任选地其中每种ABM用或不用接头直接或间接地与所述支架连接，任选地其中所述接头是多肽接头。在一些方面中，Fc是IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgA(IgA1、IgA2)、IgD、IgE或IgM，任选地其中Fc是修饰的，任选地其中所述修饰降低糖基化，并且任选地其中所述修饰降低ADCC。
在一些方面中，每种ABM是抗体或其抗原结合片段。在一些方面中，抗体或其抗原结合片段是IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgA(IgA1、IgA2)、IgD、IgE、IgM、DVD-Ig和/或重链抗体。在一些方面中，抗体或其抗原结合片段是Fv片段、Fab片段、F(ab')2片段、Fab’片段、scFv片段、scFv-Fc片段和/或单结构域抗体或其抗原结合片段。在一些方面中，抗体或其抗原结合片段是单克隆的、人的、人源化的和/或嵌合的。
在一些方面中，至少一种ABM还包含备选支架，或MIAC的另一部分还包含备选支架。
在一些方面中，由癌细胞表达的抗原是肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。在一些方面中，由癌细胞表达的抗原选自HER2、CD20、9-O-乙酰基-GD3、βhCG、A33抗原、CA19-9标志物、CA-125标志物、钙网蛋白、碳酸酐酶IX(MN/CA IX)、CCR5、CCR8、CD19、CD22、CD25、CD27、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD63、CD70、CC123、CD138、癌胚抗原(CEA；CD66e)、桥粒芯蛋白4、E-钙粘蛋白新表位(neoepitope)、内皮唾酸蛋白、肝配蛋白(ephrin)A2(EphA2)、表皮生长因子受体(EGFR)、表皮细胞粘附分子(EpCAM)、ErbB2、胎儿乙酰胆碱受体、成纤维细胞活化抗原(FAP)、岩藻糖基GM1、GD2、GD3、GM2、神经节苷脂GD3、Globo H、糖蛋白100、HER2/neu、HER3、HER4、胰岛素样生长因子受体1、Lewis-Y、LG、Ly-6、黑素瘤特异性硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSCP)、间皮素、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC7、MUC16、穆勒(Müllerian)抑制物(MIS)受体II型、浆细胞抗原、多聚SA、PSCA、PSMA、音猬因子(sonic hedgehog)(SHH)、SAS、STEAP、sTn抗原、TNF-α前体及其组合。在一些方面，由癌细胞表达的抗原是EGFR。在一些方面，由癌细胞表达的抗原是CD19。在一些方面，由癌细胞表达的抗原是CD20。
在一些方面中，活化性受体选自2B4(CD244)、α4β1整联蛋白、β2整联蛋白、CD2、CD16、CD27、CD38、CD96、CD100、CD160、CD137、CEACAM1(CD66)、CRTAM、CS1(CD319)、DNAM-1(CD226)、GITR(TNFRSF18)、KIR的活化形式、NKG2C、NKG2D、NKG2E、一种或多种天然细胞毒性受体、NTB-A、PEN-5及其组合，任选地其中所述β2整联蛋白包含CD11a-CD18、CD11b-CD18或CD11c-CD18，任选地其中所述KIR的活化形式包含KIR2DS1、KIR2DS4或KIR-S，并且任选地其中所述天然细胞毒性受体包含NKp30、NKp44、NKp46或NKp80。在一些方面中，活化受体是CD137。
在一些方面中，抑制性受体选自KIR、ILT2/LIR-1/CD85j、KIR的抑制形式、KLRG1、LAIR-1、NKG2A、NKR-P1A、Siglec-3、Siglec-7、Siglec-9及其组合，任选地其中所述KIR的抑制形式包含KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2或KIR-L。
在一些方面中，活化性受体选自CD3、CD2(LFA2、OX34)、CD5、CD27(TNFRSF7)、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD40L、CD84(SLAMF5)、CD137(4-1BB)、CD226、CD229(Ly9、SLAMF3)、CD244(2B4、SLAMF4)、CD319(CRACC、BLAME)、CD352(Ly108、NTBA、SLAMF6)、CRTAM(CD355)、DR3(TNFRSF25)、GITR(CD357)、HVEM(CD270)、ICOS、LIGHT、LTβR(TNFRSF3)、OX40(CD134)、NKG2D、SLAM(CD150、SLAMF1)、TCRα、TCRβ、TCRδγ、TIM1(HAVCR、KIM1)及其组合。
在一些方面中，抑制性受体选自PD-1(CD279)、2B4(CD244、SLAMF4)、B71(CD80)、B7H1(CD274、PD-L1)、BTLA(CD272)、CD160(BY55、NK28)、CD352(Ly108、NTBA、SLAMF6)、CD358(DR6)、CTLA-4(CD152)、LAG3、LAIR1、PD-1H(VISTA)、TIGIT(VSIG9、VSTM3)、TIM2(TIMD2)、TIM3(HAVCR2、KIM3)及其组合。在一些方面中，抑制性受体是PD-1。
在一些方面中，效应免疫细胞是T细胞或天然杀伤(NK)细胞，任选地其中所述T细胞是CD4+辅助T细胞或CD8+细胞毒性T细胞。
在一些方面中，癌细胞是来自以下的细胞：急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、急性髓样白血病(AML)、肾上腺皮质癌、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、脑肿瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt Lymphoma)、未知原发性起源癌、心脏肿瘤、宫颈癌、脊索瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性骨髓增生性赘生物、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、导管癌、胚胎性肿瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、鼻腔神经胶质瘤、纤维组织细胞瘤、尤因肉瘤(Ewingsarcoma)、眼癌、生殖细胞肿瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠类癌肿瘤、胃肠基质肿瘤、妊娠滋养细胞疾病、神经胶质瘤、头颈癌、毛细胞白血病、肝细胞癌、组织细胞增多症、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、下咽癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞瘤、卡波西肉瘤(Kaposi sarcoma)、肾癌、朗格汉斯细胞组织细胞增多症(Langerhans cell histiocytosis)、喉癌、白血病、唇和口腔癌、肝癌、原位小叶癌、肺癌、淋巴瘤、巨球蛋白血症、恶性纤维组织细胞瘤、黑素瘤、默克尔细胞癌(Merkel cell carcinoma)、间皮瘤、隐匿性原发性转移性鳞状颈癌、涉及NUT基因的中线道癌(midline tract carcinoma)、口腔癌、多发性内分泌赘生物综合征、多发性骨髓瘤、蕈样肉芽肿病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性赘生物、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状瘤病、副神经节瘤、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌瘤、唾液腺癌、塞扎里综合征(Sezary syndrome)、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、脊髓肿瘤、胃癌、T细胞淋巴瘤、畸胎样瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、阴道癌、外阴癌和维尔姆斯瘤(Wilms tumor)。
在一些方面中，ABM2在存在时包含四个免疫球蛋白可变结构域。在一些方面中，ABM1在存在时包含两个免疫球蛋白可变结构域。在一些方面中，ABM3在存在时包含两个免疫球蛋白可变结构域。在一些方面中，ABM2在存在时是Fab片段，ABM1在存在时是scFv片段，并且ABM3在存在时是scFv片段。
在一些方面中，MIAC还包含Fc，并且ABM2在存在时与Fc连接，ABM3在存在时与ABM2连接，并且ABM1在存在时与Fc连接。在一些方面中，ABM2的重链的C末端在存在时与Fc的N末端连接，ABM1在存在时与Fc的C末端连接，并且ABM3在存在时与ABM2的轻链的C末端连接。
在一些方面中，每个连接是直接的或者经由接头，任选地其中所述接头是多肽接头，任选地其中所述多肽接头是gly-ser接头或免疫球蛋白铰链区或其部分。
在一些方面中，MIAC是二聚体，任选地其中所述二聚体是同二聚体。
在一些方面中，MIAC还包含特异性结合由所述效应免疫细胞表达的另外的分子的抗原结合模块4(ABM4)。在一些方面中，由所述效应免疫细胞表达的另外的分子选自CD16(CD16a、CD16b)、CD32a、CD64和CD89。在一些方面中，ABM4是Fc。
在一些方面中，至少两个ABM彼此共价缔合。在一些方面中，共价缔合为融合蛋白的形式。在一些方面中，至少两个ABM彼此非共价缔合。
在一些方面中，相对于抗体对照组，MIAC在结合至少一种效应免疫细胞和至少一种癌细胞时通过效应免疫细胞诱导更多量的下列至少一种：IFN-γ、TNF-α、IL-2和粒酶B分泌，其中所述抗体对照组由与所述MIAC共同特异性结合相同靶标的以等摩尔浓度存在的不同单特异性抗体组成。在一些方面中，由MIAC诱导的IFN-γ、TNF-α、IL-2和/或粒酶B分泌的量比由所述抗体对照组诱导的大约2、3、4、5、6、7或8倍。
在一些方面中，相对于抗体对照组，MIAC在结合至少一种效应免疫细胞和至少一种癌细胞时诱导更高水平的效应免疫细胞增殖，其中所述抗体对照组由与所述MIAC共同特异性结合相同靶标的以等摩尔浓度存在的不同单特异性抗体组成。在一些方面中，由MIAC诱导的增殖的水平比由所述抗体对照组诱导的大约2、3、4、5、6、7或8倍。
在一些方面中，相对于抗体对照组，MIAC在结合至少一种效应免疫细胞和至少一种癌细胞时诱导更高水平的效应免疫细胞CD25细胞表面表达，其中所述抗体对照组由与所述MIAC共同特异性结合相同靶标的以等摩尔浓度存在的不同单特异性抗体组成。在一些方面中，由所述MIAC诱导的CD25表达比由所述抗体对照组诱导的大约2、3、4、5、6、7或8倍。
在一些方面中，相对于抗体对照组，所述MIAC在结合至少一种效应免疫细胞和至少一种癌细胞时诱导更高水平的癌细胞死亡，其中所述抗体对照组由与所述MIAC共同特异性结合相同靶标的以等摩尔浓度存在的不同单特异性抗体组成。
在一些方面中，每种ABM在每种其它抗原结合模块与其相应的抗原或受体结合的同时结合其相应的抗原或受体，并且任选地其中当每种ABM与其相应的抗原或受体同时结合时，每种结合模块对其相应的抗原或受体的亲和力是约0.3nM至约1.7nM、0.37至1.66nM、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6或1.7nM。
本文中还公开了包含MIAC和药剂的缀合物。在一些方面中，药剂选自治疗剂、诊断剂、掩蔽部分、可切割部分及其组合。在一些方面中，用接头将所述药剂与所述MIAC连接。
本文中还公开了药物组合物，所述药物组合物包含本文中公开的MIAC或缀合物和赋形剂。
本文中还公开了治疗具有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文中公开的MIAC或缀合物或药物组合物。
本文中还公开了抑制或降低癌症生长的方法，所述方法包括使所述癌症与对于受试者有效量的本文中公开的MIAC或缀合物或药物组合物接触。
在一些方面中，MIAC结合癌细胞和效应细胞。在一些方面中，MIAC结合两种或更多种效应细胞。在一些方面中，MIAC激动效应细胞上的活化性受体并且拮抗所述效应细胞上的抑制性受体。在一些方面中，MIAC活化效应细胞。在一些方面中，活化的效应细胞表现出选自下组的表型：针对癌细胞的细胞毒性、增殖、IL-2的分泌、干扰素γ的分泌、LAMP-1的上调、CD16的下调、CD69的上调和KLRG1的上调。在一些方面中，由所述MIAC诱导的增殖大于在没有ABM3的情况下由MIAC诱导的增殖。
在一些方面中，癌症选自急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、急性髓样白血病(AML)、肾上腺皮质癌、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、脑肿瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、未知原发性起源癌、心脏肿瘤、宫颈癌、脊索瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性骨髓增生性赘生物、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、导管癌、胚胎性肿瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、鼻腔神经胶质瘤、纤维组织细胞瘤、尤因肉瘤、眼癌、生殖细胞肿瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠类癌肿瘤、胃肠基质肿瘤、妊娠滋养细胞疾病、神经胶质瘤、头颈癌、毛细胞白血病、肝细胞癌、组织细胞增多症、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞瘤、卡波西肉瘤、肾癌、朗格汉斯细胞组织细胞增多症、喉癌、白血病、唇和口腔癌、肝癌、原位小叶癌、肺癌、淋巴瘤、巨球蛋白血症、恶性纤维组织细胞瘤、黑素瘤、默克尔细胞癌、间皮瘤、隐匿性原发性转移性鳞状颈癌、涉及NUT基因的中线道癌、口腔癌、多发性内分泌赘生物综合征、多发性骨髓瘤、蕈样肉芽肿病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性赘生物、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状瘤病、副神经节瘤、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌瘤、唾液腺癌、塞扎里综合征、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、脊髓肿瘤、胃癌、T细胞淋巴瘤、畸胎样瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、阴道癌、外阴癌和维尔姆斯瘤。
在一些方面中，本文中公开的方法还包括向所述受试者施用至少一种另外的药剂。
本文中还提供了包含编码本文中公开的MIAC的至少一种多核苷酸或一组多核苷酸的组合物。
本文中还公开了包含编码本文中公开的MIAC的至少一种多核苷酸或一组多核苷酸的细胞。
本文中还公开了制备MIAC的方法，所述方法包括在细胞中表达MIAC，所述细胞包含编码本文中公开的MIAC的至少一种多核苷酸或一组多核苷酸。
本文中还公开了制备MIAC的方法，其包括表达本文中公开的MIAC的ABM，并且装配所述ABM以形成MIAC。
本文中还公开了载体或载体组，所述载体或载体组包含编码本文中公开的MIAC的至少一种多核苷酸或一组多核苷酸。
本文中还公开了包含本文中公开的MIAC和使用说明书的试剂盒，任选地其中使用说明书包括用于实践本文中公开的方法的说明书。
附图说明
图1提供了本公开的多特异性免疫调节性抗原结合构建体(即，MIAC；101)的示意图。MIAC包含三个抗原结合模块(ABM；102、103和104)。抗原结合模块1(ABM1；102)包含癌细胞特异性抗原结合位点。抗原结合模块2(ABM2；103)包含对由效应细胞表达的活化性受体具有激动活性的结合位点。抗原结合模块3(ABM3；104)包含对由效应细胞表达的抑制性受体具有拮抗活性的结合位点。该示意图为了说明本文中提供的MIAC的组分，并且就各个ABM的排列或数目而言不是限制性的。如下面更详细地描述，根据形成ABM的分子(例如，免疫球蛋白、抗体片段和备选支架)的性质，ABM可以不同地排列。ABM也可以以不同的量存在，以改变相互作用的价态和/或提供对效应细胞活化的改善的控制。
图2A-2D提供了本文中提供的MIAC的某些说明性实施方案的示意图。这些说明性实施方案由IgG和两个scFv装配。图2A提供了其中两个scFv连接到IgG重链的C末端的实施方案的示意图。图2B提供了其中两个scFv连接到IgG轻链的C末端的实施方案的示意图。图2C和2D提供了其中一个scFv连接到IgG轻链的C末端并且一个scFv连接到IgG重链的C末端的实施方案的示意图。在图2A-2D中，ABM1称为201，ABM2称为202，并且ABM3称为203。
图3A-3D提供了本文中提供的MIAC的进一步说明性实施方案的示意图。图3A-3D中提供的说明性实施方案显示了MIAC，其中可以通过改变活化性和抑制性受体的结合位点的数目以及它们在MIAC内的位置来调节效应细胞的活化。这些说明性实施方案由IgG和三个scFv装配。图3A提供了实施方案的示意图，其中一个ABM2(202)连接到一个IgG重链的C末端，一个ABM3(203)连接到另一个IgG重链的C末端，并且一个ABM3(203)连接到一个IgG轻链的C末端。图3B提供了实施方案的示意图，其中一个ABM2(202)连接到一个IgG轻链的C末端，一个ABM3(203)连接到另一个IgG轻链的C末端，并且一个ABM3(203)连接到一个IgG重链的C末端。图3C提供了实施方案的示意图，其中一个ABM2(202)连接到一个IgG轻链的C末端，一个ABM2(202)连接到一个IgG重链的C末端，并且一个ABM3(203)连接到另一个IgG重链的C末端。图3D提供了实施方案的示意图，其中一个ABM2(202)连接到一个IgG轻链的C末端，一个ABM2(202)连接到一个IgG重链的C末端，并且一个ABM3(203)连接到另一个IgG轻链的C末端。
图4A-4B提供了本文中提供的MIAC的进一步说明性实施方案的示意图。这些说明性实施方案由IgG和四个scFv装配。图4A提供了实施方案的示意图，其中ABM2(202)连接到IgG分子的一半的重链和轻链的C末端，并且ABM3(203)连接到IgG分子的另一半的重链和轻链的C末端。图4B提供了实施方案的示意图，其中ABM2(202)连接到一个IgG轻链的C末端和一个IgG重链的C末端，而ABM3(203)连接到另一个IgG轻链的C末端和另一个IgG重链的C末端。在图4A-4B中，ABM1称为201，ABM2称为202，并且ABM3称为203。
图5A-5B提供了本文中提供的MIAC的进一步说明性实施方案的示意图，其中ABM2(图5A)或ABM3(图5B)是IgG，并且剩余ABM是连接到IgG重链的C末端的scFv。在图5A和5B中，ABM1称为201，ABM2称为202，并且ABM3称为203。
图6提供了本文中提供的MIAC的进一步说明性实施方案的示意图，其中ABM1、ABM2和ABM3中的每一种是scFv。在图6中，ABM1称为201，ABM2称为202，并且ABM3称为203。
图7A-7C提供了本文中提供的MIAC的进一步说明性实施方案的示意图，其中一个ABM与其它两个ABM两者结合，但是其它两个ABM彼此不结合。在图7A-7C中，ABM1称为201，ABM2称为202，并且ABM3称为203。
图8提供了本文中提供的MIAC的进一步说明性实施方案的示意图，其中每个ABM与其它两个ABM结合。在图8中，ABM1称为201，ABM2称为202，并且ABM3称为203。
图9提供了本公开的多特异性免疫调节性抗原结合构建体(即，MIAC；101)的示意图。MIAC包含两个抗原结合模块(ABM；102和103)。抗原结合模块1(ABM1；102)包含癌细胞特异性抗原结合位点。抗原结合模块2(ABM2；103)包含对由效应细胞表达的活化性受体具有激动活性的结合位点。该示意图为了说明本文中提供的MIAC的组分，并且就各个ABM的排列或数目而言不是限制性的。如下面更详细地描述，根据形成ABM的分子(例如，免疫球蛋白、抗体片段和备选支架)的性质，ABM可以不同地排列。ABM也可以以不同的量存在，以改变相互作用的价态和/或提供对效应细胞活化的改善的控制。
图10提供本公开的多特异性免疫调节性抗原结合构建体(即，MIAC；101)的示意图。MIAC包含两个抗原结合模块(ABM；102和104)。抗原结合模块1(ABM1；102)包含癌细胞特异性抗原结合位点。抗原结合模块3(ABM2；104)包含对由效应细胞表达的抑制性受体具有拮抗活性的结合位点。该示意图为了说明本文中提供的MIAC的组分，并且就各个ABM的排列或数目而言不是限制性的。如下面更详细地描述，根据形成ABM的分子(例如，免疫球蛋白、抗体片段和备选支架)的性质，ABM可以不同地排列。ABM也可以以不同的量存在，以改变相互作用的价态和/或提供对效应细胞活化的改善的控制。
图11A-11D提供了本文中提供的MIAC的某些说明性实施方案的示意图。这些说明性实施方案由IgG和两个scFv装配。图11A和11C提供了两个scFv连接到IgG重链的C末端的实施方案的示意图。图11B和11D提供了两个scFv连接到IgG轻链的C末端的实施方案的示意图。在图11A-11D中，ABM1称为201，ABM2称为202，并且ABM3称为203。
图12A-12B提供了本文中提供的MIAC的某些说明性实施方案的示意图。这些说明性实施方案由IgG和两个scFv装配。图12A和12B提供实施方案的示意图，其中一个scFv连接到IgG轻链的C末端并且一个scFv连接到IgG重链的C末端。在图12A-12B中，ABM1称为201，ABM2称为202，并且ABM3称为203。
图13A-13D提供了本文中提供的MIAC的进一步说明性实施方案的示意图。图13A-13D中提供的说明性实施方案显示MIAC，其中可以通过改变活化性或抑制性受体的结合位点的数目来调节效应细胞的活化。这些说明性实施方案由IgG和三个scFv装配。图13A提供了实施方案的示意图，其中一个ABM2(202)连接到一个IgG重链的C末端，一个ABM2(202)连接到另一个IgG重链的C末端，并且一个ABM2(202)连接到一个IgG轻链的C末端。图13B提供了实施方案的示意图，其中一个ABM2(202)连接到一个IgG轻链的C末端，一个ABM2(202)连接到另一个IgG轻链的C末端，并且一个ABM2(202)连接到一个IgG重链的C末端。图13C提供了实施方案的示意图，其中一个ABM3(203)连接到一个IgG轻链的C末端，一个ABM3(203)连接到一个IgG重链的C末端，并且一个ABM3(203)连接到另一个IgG重链的C末端。图13D提供了实施方案的示意图，其中一个ABM3(203)连接到一个IgG轻链的C末端，一个ABM3(203)连接到一个IgG重链的C末端，并且一个ABM3(203)连接到另一个IgG轻链的C末端。
图14A-14B提供了本文中提供的MIAC的进一步说明性实施方案的示意图。这些说明性实施方案由IgG和四个scFv装配。图14A提供了其中ABM2(202)连接到IgG分子的所有重链和轻链的C末端的实施方案的示意图。图14B提供了其中ABM3(203)连接到IgG分子的所有重链和轻链的C末端的实施方案的示意图。在图14A-14B中，ABM1称为201，ABM2称为202，并且ABM3称为203。
图15A-15B提供了本文中提供的MIAC的进一步说明性实施方案的示意图，其中ABM1是scFv并且ABM2或ABM3各自是scFv和IgG。在图15A和15B中，ABM1称为201，ABM2称为202，并且ABM3称为203。
图16A-16B提供了本文中提供的MIAC的进一步说明性实施方案的示意图，其中ABM1、ABM2和ABM3中的每一种是scFv。在图16A-16B中，ABM1称为201，ABM2称为202，并且ABM3称为203。
图17A-17B提供了本文中提供的MIAC的进一步说明性实施方案的示意图。在图17A-17B中，两个ABM1(201)scFv连接到IgG样分子的重链的C末端。IgG样分子的N末端区域包含形成两个ABM2结合位点的VH-VL区(202)和形成两个ABM3结合位点的VH-VL区(203)。在图17A中描绘的实施方案中，ABM3结合位点是由IgG样分子形成的最N末端的ABM。在图17B中描绘的实施方案中，ABM2结合位点是由IgG样分子形成的最N末端的ABM。
图18A-18B提供了本文中提供的MIAC的进一步说明性实施方案的示意图。在图18A-18B中，两个ABM1(201)scFv连接到IgG样分子的重链的C末端。在图18A中，IgG样分子的N末端区域包含形成四个ABM2结合位点的VH-VL区(202)。在图18A中，IgG样分子的N末端区域包含形成四个ABM3结合位点的VH-VL区(203)。
图19提供了ABM1是具有CD30的两个结合位点的IgG的实施方案。ABM2是具有CD137激动结合位点的scFv，并且ABM3是具有PD-1拮抗结合位点的scFv。ABM2和3scFv连接到形成ABM1的IgG的重链的C末端。然而，如贯穿本公开所述，一个或多个scFv也可以连接到重链的N末端和/或轻链的C或N末端。
图20提供了两个ABM1scFv连接到IgG样分子的重链的C末端的实施方案。IgG样分子的N末端区域包含形成两个ABM2结合位点的VH-VL区和形成两个ABM3结合位点的VH-VL区。在此MIAC中，ABM3结合位点是由IgG样分子形成的最N末端ABM。
图21A-C提供了经工程化、表达和纯化以用于功能性体外测定的四种示例性MIAC构建体(PID7、PID92、PID128和PID130)的示意图。PID7(图21A)是双特异性MIAC，其由对Her2肿瘤抗原具有特异性的两个ABM1scFv及与之融合的识别PD-1的IgG1ABM3的重链c末端构成。PID92(图21B)是双特异性MIAC，其由针对Her2的两个ABM1scFv及与之融合的针对CD137的IgG1ABM2的重链c末端构成。PID128(图21C)是双特异性MIAC，其由识别Her2的两个ABM1scFv及与之融合的针对CD3的IgG1ABM2的重链c末端构成。PID130(图21D)是三特异性MIAC，其由针对Her2的两个ABM1scFv及与之融合的针对CD3的IgG1ABM2的重链c末端和识别PD-1的两个ABM3scFv及与之融合的IgG的轻链c末端构成。在第16节中提供这些示例性MIAC的序列信息。
图22含有三个SEC色谱图，其显示了示例性MIAC蛋白质PID3(单特异性α-CD3)、PID128(双特异性α-Her2/α-CD3)和PID130(三特异性α-Her2/α-CD3/α-PD-1)的POI(目标峰)。
图23含有来自两个示例性MIAC蛋白PID7(α-Her2/α-PD-1)和PID92(α-Her2/α-CD137)的ForteBio 结合传感图(sensogram)，证明抗原结合活性以MIAC形式保留。来自这些实例和其它示例性MIAC的测量亲和力显示在表E中。
图24显示了如使用流式细胞术测量，四种不同癌细胞系(A431、MDA-MB-453、JIMT1、NCI-H441)表面上的Her2肿瘤抗原和免疫抑制性配体PD-L1的表达。
图25显示了示例性Her2靶向性MIAC蛋白的浓度依赖性肿瘤细胞结合活性。将MIAC的结合活性与单特异性抗Her2(曲妥珠单抗(trastuzumab)，作为阳性对照)和单特异性抗CD3(阴性对照)进行比较。
图26含有两幅图，其显示了在存在增加浓度的示例性双特异性α-Her2/α-CD137MIAC(PID92)的情况下与Her2+JIMT1肿瘤细胞共培养的CD4+和CD8+T细胞上的CD25表达(通过流式细胞术)。将MIAC的效果与等同浓度的组合的单特异性α-Her2和α-CD137抗体进行比较。
图27含有两幅图，其显示了在存在增加浓度的示例性双特异性α-Her2/α-CD137MIAC(PID92)的情况下与Her2+JIMT1肿瘤细胞共培养的CD4+和CD8+T细胞的增殖(如通过CFSE稀释测定)。将MIAC的效果与等同浓度的组合的单特异性α-Her2和α-CD137抗体进行比较。
图28含有两幅图，其显示了在存在增加浓度的示例性双特异性α-Her2/α-CD137MIAC(PID92)的情况下与Her2+JIMT1肿瘤细胞共培养的人原代T细胞的IFN-γ和TNF-α细胞因子诱导(如通过Luminex测定)。将MIAC的效果与等同浓度的组合的单特异性α-Her2和α-CD137抗体进行比较。
图29A-B显示了在存在增加浓度的示例性双特异性α-Her2/α-CD3MIAC(PID128)的情况下与Her2+JIMT1肿瘤细胞共培养的人原代T细胞中的增殖(图29A)和CD25表达的诱导(图29B)，如通过流式细胞术测定。将MIAC的效果与等同浓度的组合的单特异性α-Her2和α-CD3进行比较。
图30含有两幅图，其显示了在存在增加浓度的示例性双特异性α-Her2/α-CD3MIAC(PID128)的情况下与Her2+JIMT1肿瘤细胞共培养的人原代T细胞的IFN-γ和TNF-α细胞因子诱导(如通过Luminex测定)。将MIAC的效果与等同浓度的组合的单特异性α-Her2和α-CD3进行比较。
图31显示暴露于增加浓度的示例性双特异性α-Her2/α-CD3MIAC(PID128)的人原代T细胞和Her2+JIMT1肿瘤细胞的共培养物中的粒酶B水平(如通过Luminex测定)。将MIAC的效果与等同浓度的组合的单特异性α-Her2和α-CD3进行比较。
图32A-B显示在存在增加浓度的示例性三特异性α-Her2/α-CD3/α-PD-1MIAC(PID130)的情况下与Her2+JIMT1肿瘤细胞共培养的人原代T细胞中的增殖(图32A)和CD25表达的诱导(图32B)，如通过流式细胞术测定。将MIAC的效果与等同浓度的组合的单特异性α-Her2、α-CD3和α-PD-1进行比较。
图33含有两幅图，显示了在存在增加浓度的示例性三特异性α-Her2/α-CD3/α-PD-1MIAC(PID130)的情况下与Her2+JIMT1肿瘤细胞共培养的人原代T细胞的IFN-γ和TNF-α细胞因子诱导(如通过Luminex测定)。将MIAC的效果与等同浓度的组合的单特异性α-Her2、α-CD3和α-PD-1进行比较。
图34显示了暴露于增加浓度的示例性三特异性α-Her2/α-CD3/α-PD-1MIAC(PID130)的人原代T细胞和Her2+JIMT1肿瘤细胞的共培养物中的粒酶B水平(如通过Luminex测定)。将MIAC的效果与等同浓度的组合的单特异性α-Her2、α-CD3和α-PD-1进行比较。
图35显示了在存在增加浓度的示例性双特异性α-Her2/α-CD3MIAC(PID128)的情况下将CD3+T细胞与Her2+BT474人癌细胞共培养的体外细胞性细胞毒性测定的结果。将MIAC的效果与等同浓度的组合的α-Her2和α-CD3单特异性抗体进行比较。使用CytoTox试剂盒(Promega)测定肿瘤细胞的T细胞杀伤，以测量从裂解细胞释放的乳酸脱氢酶。
图36包含两幅图，其显示暴露于增加浓度的示例性双特异性α-Her2/α-CD3MIAC(PID128)的CD3+T细胞/BT474肿瘤细胞共培养物中的IFN-γ和粒酶B诱导(如通过Luminex测定)。将MIAC的效果与等同浓度的组合的α-Her2和α-CD3单特异性抗体进行比较。
具体实施方式
1.定义
除非另有定义，本文使用的所有领域术语、符号和其它科学术语旨在具有本发明所属领域技术人员通常理解的含义。在某些情况下，为了清楚起见和/或为了便于参考，本文定义了具有通常理解的含义的术语，并且在此包含此类定义不应被解释为表示与本领域中通常理解的事情的差异。在本文中描述或参考的技术和程序通常是本领域技术人员使用常规方法良好理解和普遍采用的，诸如例如Sambrook等人，Molecular Cloning:ALaboratory Manual第2版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY中描述的广泛利用的分子克隆方法学。在适当时，涉及使用可商购获得的试剂盒和试剂的程序通常根据制造商定义的方案和/或参数进行，除非另有说明。
如本文中使用，单数形式“一个”、“一种”和“所述/该”包括复数指示物，除非上下文另有明确指出。
术语“约”指示并包含指示值和高于和低于该值的范围。在某些实施方案中，术语“约”指示指定值±10％、±5％或±1％。
术语“包含”在本文中以其最具包容性和开放性的意义使用，并且不排除权利要求中所述的任何附加元件或方法步骤。例如，包含ABM1、ABM2和ABM3的MIAC也可以包含任何其它ABM(例如，ABM4)或ABM1、ABM2和/或ABM3的多个拷贝或版本。MIAC还可以包括不是ABM的任何其它元件。类似地，包含两个免疫球蛋白可变结构域的ABM也可以包含三个、四个、五个、六个、七个、八个或超过八个免疫球蛋白结构域。
术语“由…组成”在本文中用于排除紧接在该过渡短语之后的条款中没有叙述的任何要素、步骤或成分，除了通常与所要求保护的主题相关的杂质。
术语“基本上由…组成”在本文中用于将权利要求的范围限于规定的材料或步骤和不会实质上影响要求保护的发明的基本和新颖特征的材料或步骤。
术语“抗原结合模块1”或“ABM1”是指特异性结合由癌细胞表达的抗原的抗原结合模块。
术语“抗原结合模块2”或“ABM2”是指特异性结合由效应细胞如效应免疫细胞表达的活化性受体的抗原结合模块，其中ABM2与效应细胞的活化性受体的结合激动所述活化性受体。
术语“抗原结合模块3”或“ABM3”是指特异性结合由效应细胞如效应免疫细胞表达的抑制性受体的抗原结合模块，其中ABM3与效应细胞的抑制性受体的结合拮抗所述抑制性受体。
术语“抗原结合模块4”或“ABM4”是指结合效应细胞上的Fc受体的抗原结合模块。在一些实施方案中，ABM4激动Fc受体。
术语“激动剂”和“激动”当用于指ABM2的生物学活性时指ABM2结合效应细胞上的其受体靶标，并活化该受体以通过该受体在效应细胞中诱导生物应答。
术语“拮抗剂”和“拮抗”当用于指ABM3的生物学活性时指ABM3结合效应细胞上的其受体靶标，并且阻断或抑制该受体的活化(例如，通过其内源性配体)来阻止经由该受体诱导效应细胞中的生物应答。
术语“免疫球蛋白”是指通常包含两对多肽链的一类结构相关蛋白质：一对轻(L)链和一对重(H)链。在“完整的免疫球蛋白”中，所有这四条链通过二硫键相互连接。已经很好地表征了免疫球蛋白的结构。参见例如Paul,Fundamental Immunology第7版,第5章(2013)Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,PA。简言之，每个重链通常包含重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)。重链恒定区通常包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每个轻链通常包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区。轻链恒定区通常包含一个结构域，缩写为CL。
术语“抗体”描述了一类免疫球蛋白分子，并且在本文中以其最广泛的意义使用。抗体明确包括完整抗体(例如完整免疫球蛋白)和抗体片段，如抗体的抗原结合片段。抗体包含至少一个抗原结合结构域。抗原结合结构域的一个实例是由VH-VL二聚体形成的抗原结合结构域。抗体可以通过其特异性结合的抗原来描述。例如，NKG2D抗体或抗NKG2D抗体是特异性结合受体NKG2D的抗体。抗体可以通过其活性进一步描述。例如，激动性NKG2D抗体是结合受体NKG2D并激动它的抗体。
VH和VL区域可以进一步细分为散布有更保守的区域的高度可变区(“高变区(HVR)”，也称为“互补决定区”(CDR))。更保守的区域称为框架区域(FR)。每个VH和VL通常包含三个CDR和四个FR，按以下顺序排列(从N末端至C末端)：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。CDR参与抗原结合，并对抗体赋予抗原特异性和结合亲和力。参见Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest第5版(1991)Public HealthService，National Institutes of Health,Bethesda,MD，其全部内容通过引用并入。
来自脊椎动物物种的轻链可以根据恒定结构域的序列分配为两种类型之一，称为κ和λ。
来自脊椎动物物种的重链可以分配到五种不同类别(或同种型)之一：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。这些类别也分别称为α、δ、ε、γ和μ。基于序列和功能的差异，IgG和IgA类进一步分为亚类。人类表达以下亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
CDR的氨基酸序列边界可以由本领域技术人员使用许多已知编号方案中的任何一种来确定，包括由Kabat等人,见上文(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人,1997,J.Mol.Biol.,273:927-948(“Chothia”编号方案)；MacCallum等人,1996,J.Mol.Biol.262:732-745(“Contact”编号方案)；Lefranc等人,Dev.Comp.Immunol.,2003,27:55-77(“IMGT”编号方案)；以及Honegge和Plückthun,J.Mol.Biol.,2001,309:657-70(“AHo”编号方案)(每篇通过引用整体并入)描述的那些方案。
表1提供了如由Kabat和Chothia方案鉴定的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的位置。对于CDR-H1，使用Kabat和Chothia编号方案两者提供残基编号。
除非另有规定，本文中用于鉴定特定CDR的编号方案是Kabat/Chothia编号方案。在这两种编号方案所包含的残基不一致的情况下，编号方案规定为Kabat或Chothia。
表1.根据Kabat和Chothia编号方案的CDR中的残基。
CDR Kabat Chothia
L1 L24-L34 L24-L34
L2 L50-L56 L50-L56
L3 L89-L97 L89-L97
H1(Kabat编号) H31-H35B H26-H32或H34*
H1(Chothia编号) H31-H35 H26-H32
H2 H50-H65 H52-H56
H3 H95-H102 H95-H102
*CDR-H1的C末端当使用Kabat编号规定编号时随CDR的长度在H32和H34之间变化。
当提及抗体重链或轻链恒定区中的残基时通常使用“EU编号方案”(例如，如Kabat等人，见上文所报道)。除非另有说明，否则EU编号方案用于指本文中所述的抗体重链和轻链恒定区中的残基。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，如完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段包括例如Fv片段、Fab片段、F(ab')2片段、Fab'片段、scFv(sFv)片段、scFv-Fc片段和单结构域抗体。
“Fv”片段包含一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的非共价连接的二聚体。
除了Fv片段的重链和轻链可变结构域外，“Fab”片段还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。可以例如重组产生或通过全长抗体的木瓜蛋白酶消化产生Fab片段。
“F(ab’)2”片段含有通过二硫键在铰链区附近连接的两个Fab片段。可以例如重组或通过胃蛋白酶消化完整的抗体(其除去大部分Fc区同时保留完整铰链区的部分)产生F(ab’)2片段。通过用还原剂如β-巯基乙醇处理可以将F(ab’)2片段解离(成两个F(ab’)分子)。
“单链Fv”或“sFv”或“scFv”片段在单个多肽链中包含VH结构域和VL结构域。VH和VL通常通过肽接头连接。参见Plückthun A.(1994).Antibodies from Escherichia coli.InRosenberg M.&Moore G.P.(编),The Pharmacology of Monoclonal Antibodies第113卷(第269-315页),Springer-Verlag,New York，其全部内容通过引用并入。在一些实施方案中，接头可以是单个氨基酸。在一些实施方案中，接头可以是化学键。“scFv-Fc”片段包含连接于Fc结构域的scFv。例如，Fc结构域可以连接到scFv的C末端。取决于scFv中可变结构域的取向(即VH-VL或VL-VH)，Fc结构域可以在VH或VL后。Fc结构域可以是本领域已知的或本文所述的任何合适的Fc结构域。在一些情况下，Fc结构域是IgG1Fc结构域。
“单结构域抗体”是包含单个单体免疫球蛋白可变结构域的抗体片段。参见Holt等人，Trends in Biotechnol.,2003,21:484-490，其全部内容通过引用并入。单结构域抗体可以包含单个重链或单个轻链。Masat等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1994,91:893-896中提供了单个轻链抗体的实例。
术语“双重可变结构域免疫球蛋白”或“DVD-IgTM”是指多价和多特异性结合蛋白，例如描述于例如DiGiammarino等人,Methods Mol.Biol.,2012,899:145-156，以及于美国专利号7,612,181；8,258,268；8,586,714；8,716,450；8,722,855；8,735,546；和8,822,645；每篇的全部内容通过引用并入。
术语“重链抗体”是指包含至少两条重链并且缺少轻链的抗体。参见Harmesen等人，Applied Microbiology and Biotechnology,77:13-22,2007；以及Hamers-Casterman等人,Nature,1993,363:446-448；每篇的全部内容通过引用并入。
术语“单克隆抗体”是指来自基本上同质抗体群体的抗体。基本同质的抗体群体包含基本相似并结合相同表位的抗体，除了在单克隆抗体产生过程中通常可出现的变体外。此类变体通常仅以少量存在。单克隆抗体通常通过包括从多种抗体中选择单一抗体的方法获得。例如，选择过程可以是从多个克隆(如酵母克隆、噬菌体克隆、细菌克隆、哺乳动物细胞克隆、杂交瘤克隆或其它重组DNA克隆的合并物)中选择独特的克隆。可以进一步改变所选择的抗体，例如以提高对靶标的亲和力(“亲和力成熟”)，使抗体人源化，改善其在细胞培养物中的产生，和/或降低其对受试者的免疫原性。
术语“嵌合抗体”是指其中重链和/或轻链的一部分源自特定来源或物种的抗体，而重链和/或轻链的剩余部分源自不同来源或物种的抗体。
非人抗体的“人源化”形式是含有源自非人抗体的最小序列的嵌合抗体。人源化抗体通常是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自一个或多个CDR的残基被来自非人抗体(供体抗体)的一个或多个CDR的残基替换。供体抗体可以是任何合适的非人抗体，如具有期望的特异性、亲和力或生物学效应的小鼠、大鼠、兔、鸡或非人灵长类动物抗体。在一些情况下，受体抗体的选定框架区残基被来自供体抗体的相应框架区残基替换。人源化抗体还可以包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。可以进行此类修饰以进一步改善抗体功能。关于更多细节，参见Jones等人，Nature,1986,321:522-525；Riechmann等人，Nature,1988,332:323-329；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,1992,2:593-596，每篇全部内容通过引用并入。
“人抗体”是具有对应于由人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列，或源自利用人抗体库或人抗体编码序列(例如，从人来源获得或从头设计)的非人来源的氨基酸序列的抗体。人抗体明确排除人源化抗体。
术语“备选支架”是指下述分子，其中可以使一个或多个区域多样化以产生与抗体具有相似的特异性和亲和力的分子。示例性备选支架包括源自纤连蛋白(例如AdnectinsTM)、β-三明治(例如iMab)、脂质运载蛋白(lipocalin)(例如)、EETI-II/AGRP、BPTI/LACI-D1/ITI-D2(例如Kunitz结构域)、硫氧还蛋白肽适体、蛋白A(例如亲和体(Affibody))、锚蛋白重复(例如DARPins)、γ-B-晶体蛋白/泛素(例如Affilins)、CTLD3(例如，四连接素(Tetranectins))和(LDLR-A模块)(例如高亲和性多聚体(Avimers))的支架。在Binz等人,Nat.Biotechnol.,2005 23:1257-1268；以及Skerra,CurrentOpin.in Biotech.,2007 18:295-304(每篇的全部内容通过引用并入)中提供关于备用支架的附加信息。
术语“可操作连接”指示MIAC部分(例如，一个或多个ABM和/或Fc)排列为使得它们一致发挥功能用于其意图目的。
“分离的MIAC”是从其产生环境的组分中分离和/或回收的。环境的组分可以包括细胞、培养基和其它蛋白质性或非蛋白质性物质，如核酸。在一些实施方案中，将分离的MIAC纯化至足以获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，例如通过使用旋转杯式测序仪。在一些实施方案中，通过在还原或非还原条件下如通过凝胶电泳(例如SDS-PAGE)分析，通过考马斯兰或银染检测，将分离的MIAC纯化至同质性。在一些实施方案中，分离的MIAC包含在产生MIAC的重组细胞内原位的MIAC。在一些实施方案中，通过至少一种纯化步骤制备分离的MIAC。
在一些实施方案中，将分离的MIAC纯化至按重量计至少80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施方案中，提供分离的MIAC作为包含按重量计至少85％、90％、95％、98％、99％至100％的MIAC的溶液，剩余重量包括在溶剂中溶解的其它溶质的重量。
“亲和力”是指分子的单个结合位点(例如，MIAC的抗原结合模块)与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有指示，如本文中使用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映结合对(例如抗原结合模块和抗原)成员之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(KD)表示。亲和力可以通过本领域已知的方法测量，例如通过使用表面等离子体共振(SPR)技术(例如仪器)或生物层干涉测量法(例如，仪器)来测量。
关于ABM与靶分子的结合，术语与/对特定抗原(例如多肽靶标)或特定抗原上的表位的“特异性结合”、“特异性地结合”、“特异性”、“选择性结合”和“选择性”意指可测量地不同于非特异性或非选择性相互作用的结合。可以例如通过与对照分子的结合比较确定与分子的结合来测量特异性结合。特异性结合也可以通过与靶标相似的对照分子，如过量的未标记的靶标的竞争来确定。在该情况下，如果标记的靶标与探针的结合被过量的未标记的靶标竞争性地抑制，则指示特异性结合。
如本文中使用，术语“kd”(sec-1)是指特定的ABM-抗原相互作用的解离速率常数。该值也称为koff值。
如本文中使用，术语“ka”(M-1×sec-1)是指特定的ABM-抗原相互作用的缔合速率常数。该值也称为kon值。
如本文中使用，术语“KD”(M)是指特定的ABM-抗原相互作用的解离平衡常数。KD＝kd/ka。
如本文中使用，术语“KA”(M-1)是指特定的ABM-抗原相互作用的缔合平衡常数。KA＝ka/kd。
“亲和力成熟的”ABM是具有与不拥有改变的亲本ABM相比，导致ABM对其抗原的亲和力改善的一个或多个改变(例如，在一个或多个CDR或FR中)的ABM。在一个实施方案中，亲和力成熟的ABM对靶抗原具有纳摩尔或皮摩尔亲和力。亲和力成熟的ABM可以使用本领域已知的多种方法产生。例如，Marks等人(Bio/Technology,1992,10:779-783，其全部内容通过引用并入)描述了通过VH和VL结构域改组的亲和力成熟。CDR和/或框架残基的随机诱变由例如Barbas等人(Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.,1994,91:3809-3813)；Schier等人,Gene,1995,169:147-155；Yelton等人,J.Immunol.,1995,155:1994-2004；Jackson等人,J.Immunol.,1995,154:3310-33199；以及Hawkins等人,J.Mol.Biol.,1992,226:889-896(每篇的全部内容通过引用并入)描述。
当本文中在两种或更多种ABM的情况下使用时，术语“与...竞争”或“与…交叉竞争”指示两种或更多种ABM竞争对抗原的结合。在一个示例性测定中，将抗原包覆在平板上并允许结合第一ABM，之后添加第二标记的ABM。如果第一ABM的存在降低了第二ABM的结合，则ABM竞争。术语“与…竞争”还包括ABM的组合，其中一种ABM减少另一种ABM的结合，但是当以相反的顺序添加ABM时，没有观察到竞争。然而，在一些实施方案中，第一和第二ABM抑制彼此的结合，而不管它们的添加顺序如何。在一些实施方案中，一种ABM将另一种ABM与其抗原的结合降低至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
术语“表位”意指能够特异性结合ABM的抗原部分。表位通常由表面可接近的氨基酸残基和/或糖侧链组成，并且可以具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象和非构象性表位的区别在于，在变性溶剂存在下，与前者而非后者的结合丧失。表位可以包括直接参与结合的氨基酸残基和不直接参与结合的其它氨基酸残基。可以使用用于表位测定的已知技术，诸如例如，对具有不同点突变的抗原变体的ABM结合的测试来确定ABM结合的表位。
当用于描述ABM时，术语“价态”是指ABM中抗原识别(结合)位点的数目。每个抗原识别位点特异性地识别并因此能够结合一种抗原或抗原上的表位。当ABM包含超过一个抗原识别位点(例如，当ABM是IgG时，所述IgG在其可变区中具有两个抗原识别位点)，每个抗原识别位点可以特异性地识别相同或不同的抗原。然而，在一些实施方案中，ABM中的每个抗原识别位点特异性地识别相同的抗原。
多肽序列和参考序列之间的百分比“同一性”定义为多肽序列中在比对序列并且在必要时引入缺口以达到最大百分比序列同一性之后与参考序列中的氨基酸残基同一的氨基酸残基的百分比。为了确定百分比氨基酸序列同一性的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用公开可获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN、MEGALIGN(DNASTAR)、CLUSTALW或CLUSTAL OMEGA软件。在一些实施方案中，使用CLUSTAL OMEGA软件进行比对。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在待比较的序列的全长上实现最大比对所需要的任何算法。
“保守的取代”或“保守的氨基酸取代”是指用一个或多个化学或功能上相似的氨基酸取代一个或多个氨基酸。提供相似氨基酸的保守取代表是本领域公知的。具有此类取代的多肽序列称为“保守修饰的变体”。此类保守修饰的变体是在多态性变体、种间同系物和等位基因之外并且不排除多态性变体、种间同系物和等位基因。举例来说，表2-4中提供的氨基酸组认为是彼此的保守取代。
表2.在某些实施方案中，认为是彼此的保守取代的所选择的氨基酸组。
酸性残基 D和E
碱性残基 K、R和H
亲水性不带电荷的残基 S、T、N和Q
脂肪族不带电荷的残基 G、A、V、L和I
非极性不带电荷的残基 C、M和P
芳香族残基 F、Y和W
表3.在某些实施方案中，认为是彼此的保守取代的另外的选择的氨基酸组。
组1 A、S和T
组2 D和E
组3 N和Q
组4 R和K
组5 I、L和M
组6 F、Y和W
表4.在某些实施方案中，认为是彼此的保守取代的另外的选择的氨基酸组。
可以例如在Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties第2版(1993)W.H.Freeman&Co.,New York,NY中找到另外的保守取代。通过对亲本ABM中氨基酸残基进行一个或多个保守取代产生的ABM称为“保守修饰的变体”。
术语“氨基酸”是指二十种常见的天然存在的氨基酸。天然存在的氨基酸包括丙氨酸(Ala；A)、精氨酸(Arg；R)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、半胱氨酸(Cys；C)；谷氨酸(Glu；E)、谷氨酰胺(Gln；Q)、甘氨酸(Gly；G)；组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、甲硫氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)、丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)和缬氨酸(Val；V)。在一些实施方案中，术语“氨基酸”还包括非天然氨基酸。可以使用任何合适的非天然氨基酸。在一些实施方案中，非天然氨基酸包含用于将药剂与MIAC缀合的反应性部分。
在某些实施方案中，任何疾病或病症的“治疗”或“处理”是指改善患者中存在的疾病或病症。在另一个实施方案中，“治疗”或“处理”包括改善至少一种物理参数，其可以是受试者难识别的。在另一个实施方案中，“治疗”或“处理”包括身体上(例如，可辨别症状的稳定)或生理上(例如物理参数的稳定)或两者调节疾病或病症。在另一个实施方案中，“治疗”或“处理”包括延迟或预防疾病或病症的发作。
如本文中使用，术语“治疗有效量”或“有效量”是指当施用于受试者时有效治疗疾病或病症的MIAC的量。
如本文中使用，术语“受试者”意指哺乳动物受试者。示例性受试者包括但不限于人、猴、狗、猫、小鼠、大鼠、牛、马、骆驼、山羊和绵羊。在某些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者患有或怀疑患有可用本文中提供的MIAC治疗的疾病或病状。在某些方面，疾病或病状是癌症。在一些实施方案中，受试者是具有可以用本文中提供的MIAC治疗的癌症的人。在一些实施方案中，受试者是怀疑患有可用本文中提供的MIAC治疗的癌症的人。
2.多特异性免疫调节性抗原结合构建体(MIAC)
2.1多特异性免疫调节性抗原结合构建体(MIAC)，其靶向癌细胞，并且同时调节相同效应细胞上的活化性和抑制性受体
图1中显示了MIAC概念的一个方面，其显示了包括三个ABM、基本上由三个ABM组成、由三个ABM组成的MIAC。ABM1包含癌细胞特异性抗原结合位点。ABM2包含对由效应细胞表达的活化性受体具有激动活性的结合位点。ABM3包含对由效应细胞表达的抑制性受体具有拮抗活性的结合位点。
图1中提供的说明性实施方案提供了MIAC概念，其中MIAC靶向癌细胞并同时调节相同效应细胞上的活化性和抑制性受体。如在本公开的其它地方更详细地描述的，MIAC的每个组分的结合位点的数目可以通过选择形成ABM的分子的类型，或通过改变包含在MIAC中的每个ABM的数目来改变。例如，选择单个IgG作为ABM将产生用于靶向抗原的两个结合位点。另一方面，选择单个scFv作为ABM将产生用于靶向抗原的单一结合位点。
在一些实施方案中，本文中提供的MIAC包含下列各项，基本上由下列各项组成或由下列各项组成：(a)特异性结合由癌细胞表达的抗原的抗原结合模块1(ABM1)；(b)特异性结合由效应细胞表达的活化性受体的抗原结合模块2(ABM2)；和(c)特异性结合由效应细胞表达的抑制性受体的抗原结合模块3(ABM3)。
ABM2与效应细胞的活化性受体的结合激动所述活化性受体，从而通过促进经由活化性受体的活化信号的转导来促进效应细胞的活化。在一些实施方案中，经由活化性受体的活化信号的转导诱导来自效应细胞的应答，所述应答选自增殖、针对癌细胞的细胞毒性活性、细胞因子(例如IL-2和干扰素γ)的分泌、LAMP-1的上调、CD16的下调、CD69的上调和KLRG1的上调。
ABM3与效应细胞的抑制性受体的结合拮抗所述抑制性受体，从而通过阻断经由抑制性受体的抑制性信号传导的转导促进效应细胞的活化。在一些实施方案中，阻断经由抑制性受体的抑制性信号传导的转导诱导来自效应细胞的应答，所述应答选自增殖、针对癌细胞的细胞毒性活性、细胞因子(例如IL-2和干扰素γ)的分泌、LAMP-1的上调、CD16的下调、CD69的上调和KLRG1的上调。
2.2.多特异性免疫调节性抗原结合构建体(MIAC)，其靶向癌细胞并且激动由效应细胞表达的活化性受体
图9中显示了MIAC概念的另一方面，其显示了包含两个ABM、基本由两个ABM组成或由两个ABM组成的MIAC。ABM1包含癌细胞特异性抗原结合位点。ABM2包含对由效应细胞表达的活化性受体具有激动活性的结合位点。
图9中提供的说明性实施方案提供了MIAC概念，其中MIAC靶向癌细胞并调节效应细胞上的活化性受体。如在本公开的其它地方更详细地描述的，MIAC的每个组分的结合位点的数目可以通过选择形成ABM的分子的类型，或通过改变包含在MIAC中的每个ABM的数目来改变。例如，选择单个IgG作为ABM将产生用于靶向抗原的两个结合位点。另一方面，选择单个scFv作为ABM将产生用于靶向抗原的单一结合位点。
在一些方面，本文中提供的MIAC包含下列各项，主要由下列各项组成或由下列各项组成：(a)特异性结合由癌细胞表达的抗原的抗原结合模块1(ABM1)；和(b)特异性结合由效应细胞表达的活化性受体的抗原结合模块2(ABM2)。在这方面，MIAC不包括ABM3。
ABM2与效应细胞的活化性受体的结合激动所述活化性受体，从而通过促进经由活化性受体的活化信号的转导来促进效应细胞的活化。在一些实施方案中，经由活化性受体的活化信号的转导诱导来自效应细胞的应答，所述应答选自增殖、针对癌细胞的细胞毒性活性、细胞因子(例如IL-2和干扰素γ)的分泌、LAMP-1的上调、CD16的下调、CD69的上调和KLRG1的上调。
在一些实施方案中，当MIAC包含ABM1和ABM2但不包含ABM3时，ABM2特异性地不结合参与效应细胞活化的某些规范受体。在一些实施方案中，ABM2不结合CD3并且不结合CD28。在一些实施方案中，ABM2不结合CD3。在一些实施方案中，ABM2不结合CD28。
2.3多特异性免疫调节性抗原结合构建体(MIAC)，其靶向癌细胞，并且拮抗由效应细胞表达的抑制性受体
图10中显示了MIAC概念的另一方面，其显示了包含两个ABM、基本上由两个ABM组成或由两个ABM组成的MIAC。ABM1包含癌细胞特异性抗原结合位点。ABM3包含对由效应细胞表达的抑制性受体具有拮抗活性的结合位点。
图10中提供的说明性实施方案提供MIAC概念，其中MIAC靶向癌细胞并调节效应细胞上的抑制性受体。如在本公开的其它地方更详细地描述的，MIAC的每个组分的结合位点的数目可以通过选择形成ABM的分子的类型，或通过改变包含在MIAC中的每个ABM的数目来改变。例如，选择单个IgG作为ABM将产生用于靶向抗原的两个结合位点。另一方面，选择单个scFv作为ABM将产生用于靶向抗原的单一结合位点。
在一些方面，本文中提供的MIAC包含下列各项，基本上由下列各项组成或由下列各项组成：(a)特异性结合由癌细胞表达的抗原的抗原结合模块1(ABM1)；和(b)特异性结合由效应细胞表达的抑制性受体的抗原结合模块3(ABM3)。在这方面，MIAC不包括ABM2。
ABM3与效应细胞的抑制性受体的结合拮抗所述抑制性受体，从而通过阻断经由抑制性受体的抑制性信号传导的转导促进效应细胞的活化。在一些实施方案中，阻断经由抑制性受体的抑制性信号传导的转导诱导来自效应细胞的应答，所述应答选自增殖、针对癌细胞的细胞毒性活性、细胞因子(例如IL-2和干扰素γ)的分泌、LAMP-1的上调、CD16的下调、CD69的上调和KLRG1的上调。
2.4.多特异性免疫调节性抗原结合构建体(MIAC)可以包含一种或多种支架，如Fc
MIAC可以包括支架诸如Fc。此类支架可用于将每个ABM彼此可操作连接。在某些方面，一种或多种ABM可以包括支架诸如Fc。
本文中术语“Fc”或“Fc结构域”或“Fc区”用于定义含有至少恒定区的一部分的免疫球蛋白重链的C末端区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。除非本文另有规定，Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，也称为EU索引，如描述于Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991。如本文中使用，二聚体Fc的“Fc多肽”是指形成二聚体Fc结构域的两个多肽之一，即包含免疫球蛋白重链的C末端恒定区的多肽，其能够稳定的自身缔合。例如，二聚体IgG Fc的Fc多肽包含IgG CH2和IgG CH3恒定域序列。
Fc结构域包含CH3结构域或CH3和CH2结构域。CH3结构域包含两个CH3序列，一个来自二聚体Fc的两个Fc多肽中的每个。CH2结构域包含两个CH2序列，一个来自二聚体Fc的两个Fc多肽中的每个。
在一些方面，Fc包含至少一个或两个CH3序列。在一些方面，用或不用一种或多种接头将Fc与第一抗原结合模块和/或第二抗原结合模块偶联。在一些方面，Fc是人Fc。在一些方面，Fc是人IgG或IgG1Fc。在一些方面，Fc是异二聚体Fc。在一些方面，Fc包含至少一个或两个CH2序列。
在一些方面，Fc包含CH3序列的至少一个中的一个或多个修饰。在一些方面，Fc包括在CH2序列的至少一个中的一个或多个修饰。在一些方面，Fc是单个多肽。在一些方面，Fc是多个肽，例如两个多肽。可以修饰Fc，例如以在CH2结构域和/或CH3结构域中包含一个或多个修饰。此类修饰可以影响Fc功能和结合特征如Fc受体(FcR)结合。可以修饰Fc以阻断与FcR的结合，例如可以修饰Fc以包括阻断FcR结合的突变，例如在氨基酸N297处的突变。可以修饰Fc以防止N-连接的糖基化和/或减少ADCC。下面的实施例部分中显示了实例。
3.抗原结合模块(ABM)
MIAC的ABM可以包含任何合适的抗原结合分子。在一些实施方案中，ABM包含选自免疫球蛋白、抗体、抗体片段和/或备选支架的分子。
在一些实施方案中，ABM1是抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，ABM1包含选自IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgA(IgA1、IgA2)、IgD、IgE和IgM的免疫球蛋白分子或其片段。在一些实施方案中，ABM1包含Fv片段、Fab片段、F(ab’)2片段、Fab'片段、scFv片段、scFv-Fc片段和单结构域抗体。在一些实施方案中，ABM1是DVD-IgTM。在一些实施方案中，ABM1是重链抗体。
在一些实施方案中，ABM1包含备选支架，其包含选自AdnectinsTM、iMab、EETI-II/AGRP、Kunitz结构域、硫氧还蛋白肽适体、亲和体(Affibody)、DARPin、Affilin、四连接素和高亲和性多聚体(Avimer)的分子。
在一些实施方案中，ABM2是抗体。在一些实施方案中，ABM2包含选自IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgA(IgA1、IgA2)、IgD、IgE和IgM的免疫球蛋白分子或其片段。在一些实施方案中，ABM2包含Fv片段、Fab片段、F(ab’)2片段、Fab'片段、scFv片段、scFv-Fc片段和单结构域抗体。在一些实施方案中，ABM2是DVD-IgTM。在一些实施方案中，ABM2是重链抗体。
在一些实施方案中，ABM2包含备选支架，其包含选自AdnectinsTM、iMab、EETI-II/AGRP、Kunitz结构域、硫氧还蛋白肽适体、亲和体、DARPin、Affilin、四连接素和高亲和性多聚体的分子。
在一些实施方案中，ABM3是抗体。在一些实施方案中，ABM3包含选自IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgA(IgA1、IgA2)、IgD、IgE和IgM的免疫球蛋白分子或其片段。在一些实施方案中，ABM3包含Fv片段、Fab片段、F(ab’)2片段、Fab'片段、scFv片段、scFv-Fc片段和单结构域抗体。在一些实施方案中，ABM3是DVD-IgTM。在一些实施方案中，ABM3是重链抗体。
在一些实施方案中，ABM3包含备选支架，其包含选自AdnectinsTM、iMab、EETI-II/AGRP、Kunitz结构域、硫氧还蛋白肽适体、亲和体、DARPin、Affilin、四连接素和高亲和性多聚体的分子。
在一些实施方案中，ABM4包含选自IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgA(IgA1、IgA2)、IgD、IgE和IgM的免疫球蛋白分子或其片段。在一些实施方案中，ABM4包含Fv片段、Fab片段、F(ab’)2片段、Fab'片段、scFv片段、scFv-Fc片段和单结构域抗体。在一些实施方案中，ABM4是DVD-IgTM。在一些实施方案中，ABM4是重链抗体。
在一些实施方案中，ABM4包含备选支架，其包含选自AdnectinsTM、iMab、EETI-II/AGRP、Kunitz结构域、硫氧还蛋白肽适体、亲和体、DARPin、Affilin、四连接素和高亲和性多聚体的分子。
本文中提供的ABM的组合物是说明性的，并且能够发挥ABM功能的任何合适的分子可用于本文中提供的MIAC。能够发挥ABM功能的分子包括具有本文所述的ABM的结合和功能特性的蛋白质、肽、核酸、脂质、适体(肽和寡核苷酸)等。
3.1.价态和免疫球蛋白可变结构域
本文中提供的ABM可以根据其对抗原的价态来表征。ABM可以具有任何合适的价态。在一些实施方案中，ABM可以是一价、二价、三价、四价或超过四价。熟练技术人员将认识到，可以通过选择形成ABM的分子控制价态。例如，scFv ABM通常是一价的，而IgG ABM通常是二价的。
在一些实施方案中，ABM1是一价的。在一些实施方案中，ABM1是二价的。在一些实施方案中，ABM1是三价的。在一些实施方案中，ABM1是四价的。在一些实施方案中，ABM1具有大于四价的价态。
在一些实施方案中，ABM2是一价的。在一些实施方案中，ABM2是二价的。在一些实施方案中，ABM2是三价的。在一些实施方案中，ABM2是四价的。在一些实施方案中，ABM2具有大于四价的价态。
在一些实施方案中，ABM3是一价的。在一些实施方案中，ABM3是二价的。在一些实施方案中，ABM3是三价的。在一些实施方案中，ABM3是四价的。在一些实施方案中，ABM3具有大于四价的价态。
在一些实施方案中，ABM4是一价的。在一些实施方案中，ABM4是二价的。在一些实施方案中，ABM4是三价的。在一些实施方案中，ABM4是四价的。在一些实施方案中，ABM4具有大于四价的价态。
在一些实施方案中，所有ABM是一价的。例如，在某些方面，ABM1是一价的，ABM2是一价的，并且ABM3是一价的。
在一些实施方案中，至少一种ABM是二价的。例如，在一些方面，ABM1是二价的，ABM2是二价的，并且ABM3是二价的。在一些方面，ABM1是二价的，ABM2是一价的，并且ABM3是一价的。在一些方面，ABM1是一价的，ABM2是二价的，并且ABM3是一价的。在一些方面，ABM1是一价的，ABM2是一价的，并且ABM3是二价的。
在一些实施方案中，可以通过特定数目的免疫球蛋白可变结构域的存在来表征价态。在一些实施方案中，可变结构域选自VH结构域和VL结构域。
在一些实施方案中，ABM1包含一个免疫球蛋白可变结构域。在一些实施方案中，ABM1包含两个免疫球蛋白可变结构域。在一些实施方案中，ABM1包含三个免疫球蛋白可变结构域。在一些实施方案中，ABM1包含四个免疫球蛋白可变结构域。在一些实施方案中，ABM1包含超过四个免疫球蛋白可变结构域。
在一些实施方案中，ABM2包含一个免疫球蛋白可变结构域。在一些实施方案中，ABM2包含两个免疫球蛋白可变结构域。在一些实施方案中，ABM2包含三个免疫球蛋白可变结构域。在一些实施方案中，ABM2包含四个免疫球蛋白可变结构域。在一些实施方案中，ABM2包含超过四个免疫球蛋白可变结构域。
在一些实施方案中，ABM3包含一个免疫球蛋白可变结构域。在一些实施方案中，ABM3包含两个免疫球蛋白可变结构域。在一些实施方案中，ABM3包含三个免疫球蛋白可变结构域。在一些实施方案中，ABM3包含四个免疫球蛋白可变结构域。在一些实施方案中，ABM3包含超过四个免疫球蛋白可变结构域。
在一些实施方案中，每个ABM包含两个免疫球蛋白可变结构域(例如，两个VH结构域和VL结构域；两个VH结构域；或两个VL结构域)。例如，在一些方面，ABM1包含两个免疫球蛋白可变结构域，ABM2包含两个免疫球蛋白可变结构域，并且ABM3包含两个免疫球蛋白可变结构域。
在一些实施方案中，至少一种ABM包含四个免疫球蛋白可变结构域(例如两个VH结构域和两个VL结构域)。例如，在一些方面中，ABM1、ABM2和ABM3各自包含四个免疫球蛋白可变结构域。在一些方面中，ABM1包含四个免疫球蛋白可变结构域，ABM2包含两个免疫球蛋白可变结构域，并且ABM3包含两个免疫球蛋白可变结构域。在一些方面中，ABM1包含两个免疫球蛋白可变结构域，ABM2包含四个免疫球蛋白可变结构域，并且ABM3包含两个免疫球蛋白可变结构域。在一些方面中，ABM1包含两个免疫球蛋白可变结构域，ABM2包含两个免疫球蛋白可变结构域，并且ABM3包含四个免疫球蛋白可变结构域。
在一些实施方案中，价态可以表示为一种ABM的结合位点与另一种ABM的结合位点的数目的比率。改变此比率可以是有益的，例如在调谐效应细胞活化程度中。
在一些实施方案中，ABM1、ABM2和ABM3结合位点以2:1:1比率存在。图2A-2D显示了具有以此比率存在的结合位点的MIAC的实例。
在一些实施方案中，ABM1、ABM2和ABM3结合位点以2:1:2比率存在。图3A-3B显示了具有此比率存在的结合位点的MIAC的实例。
在一些实施方案中，ABM1、ABM2和ABM3结合位点以2:2:1比率存在。图3C-3D显示了具有此比率存在的结合位点的MIAC的实例。
在一些实施方案中，ABM1、ABM2和ABM3结合位点以2:2:2比率存在。图4A-4B显示了具有此比率存在的结合位点的MIAC的实例。
在一些实施方案中，ABM1、ABM2和ABM3结合位点以2:2:0比率存在。图11A-B和12A显示了具有此比率存在的结合位点的MIAC的实例。
在一些实施方案中，ABM1、ABM2和ABM3结合位点以2:0:2比率存在。图11C-D和12B显示了具有此比率存在的结合位点的MIAC的实例。
在一些实施方案中，ABM1、ABM2和ABM3结合位点以2:3:0比率存在。图13A-B显示了具有此比率存在的结合位点的MIAC的实例。
在一些实施方案中，ABM1、ABM2和ABM3结合位点以2:0:3比率存在。图13C-D显示了具有此比率存在的结合位点的MIAC的实例。
在一些实施方案中，ABM1、ABM2和ABM3结合位点以2:4:0比率存在。图14A显示了具有此比率存在的结合位点的MIAC的实例。
在一些实施方案中，ABM1、ABM2和ABM3结合位点以2:0:4比率存在。图14B显示了具有此比率存在的结合位点的MIAC的实例。
在一些实施方案中，ABM1、ABM2和ABM3结合位点以1:3:0比率存在。图15A显示了具有此比率存在的结合位点的MIAC的实例。
在一些实施方案中，ABM1、ABM2和ABM3结合位点以1:0:3比率存在。图15B显示了具有此比率存在的结合位点的MIAC的实例。
ABM1、ABM2和ABM3结合位点的其它合适的比率包括1:1:1(例如图6)、1:2:1(例如图5A)、1:1:2(例如图5B)、2:1:2、2:2:1等。技术人员将容易地认识到由不同模块贡献的结合位点的比率不是限制性的，并且可以基于MIAC的预期生物活性来选择适当的比率。
在一些实施方案中，本文中提供了具有各以1-10:0-10:0-10的比率存在的ABM1、ABM2和ABM3结合位点的MIAC。特别地，本文中提供了具有各以1-5:0-5:0-5的比率存在的ABM1、ABM2和ABM3结合位点的MIAC。例如，在一些实施方案中，ABM1、ABM2和ABM3以1:0:1、1:0:2、1:0:3、1:0:4、1:0:5、1:1:0、1:1:1、1:1:2、1:1:3、1:1:4、1:1:5、1:2:0、1:2:1、1:2:2、1:2:3、1:2:4、1:2:5、1:3:0、1:3:1、1:3:2、1:3:3、1:3:4、1:3:5、1:4:0、1:4:1、1:4:2、1:4:3、1:4:4、1:4:5、1:5:0、1:5:1、1:5:2、1:5:3、1:5:4、1:5:5、2:0:1、2:0:2、2:0:3、2:0:4、2:0:5、2:1:0、2:1:1、2:1:2、2:1:3、2:1:4、2:1:5、2:2:0、2:2:1、2:2:2、2:2:3、2:2:4、2:2:5、2:3:0、2:3:1、2:3:2、2:3:3、2:3:4、2:3:5、2:4:0、2:4:1、2:4:2、2:4:3、2:4:4、2:4:5、2:5:0、2:5:1、2:5:2、2:5:3、2:5:4、2:5:5、3:0:1、3:0:2、3:0:3、3:0:4、3:0:5、3:1:0、3:1:1、3:1:2、3:1:3、3:1:4、3:1:5、3:2:0、3:2:1、3:2:2、3:2:3、3:2:4、3:2:5、3:3:0、3:3:1、3:3:2、3:3:3、3:3:4、3:3:5、3:4:0、3:4:1、3:4:2、3:4:3、3:4:4、3:4:5、3:5:0、3:5:1、3:5:2、3:5:3、3:5:4、3:5:5、4:0:1、4:0:2、4:0:3、4:0:4、4:0:5、4:1:0、4:1:1、4:1:2、4:1:3、4:1:4、4:1:5、4:2:0、4:2:1、4:2:2、4:2:3、4:2:4、4:2:5、4:3:0、4:3:1、4:3:2、4:3:3、4:3:4、4:3:5、4:4:0、4:4:1、4:4:2、4:4:3、4:4:4、4:4:5、4:5:0、4:5:1、4:5:2、4:5:3、4:5:4、4:5:5、4:0:1、5:0:2、5:0:3、5:0:4、5:0:5、5:1:0、5:1:1、5:1:2、5:1:3、5:1:4、5:1:5、5:2:0、5:2:1、5:2:2、5:2:3、5:2:4、5:2:5、5:3:0、5:3:1、5:3:2、5:3:3、5:3:4、5:3:5、5:4:0、5:4:1、5:4:2、5:4:3、5:4:4、5:4:5、5:5:0、5:5:1、5:5:2、5:5:3、5:5:4或5:5:5的比率存在。
类似地，也可以调节每个模块的亲和力以调整MIAC的靶向(ABM1)、激动(ABM2)和拮抗(ABM3)效果。
特别地，ABM2和ABM3之间的亲和力的比率将影响效应细胞的活化程度。合适的ABM2:ABM3亲和力比率的范围为例如1:100至100:1。在一些实施方案中，ABM2:ABM3亲和力比率是约1:100、1:90、1:80、1:70、1:60、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:1、10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1或100:1。在一些实施方案中，ABM2:ABM3亲和力比率是至少1:100、1:90、1:80、1:70、1:60、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:1、10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1或100:1。在一些实施方案中，ABM2:ABM3亲和力比率是至多1:100、1:90、1:80、1:70、1:60、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:1、10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1或100:1。
本文中提供的MIAC可以包含任何合适数目的本文中提供的任何ABM。在一些实施方案中，本文中提供的MIAC包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个ABM1。在一些实施方案中，本文中提供的MIAC包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个ABM2。在一些实施方案中，本文中提供的MIAC包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个ABM3。在一些实施方案中，本文中提供的MIAC包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个ABM4。
本文中提供的MIAC还可以包含每个ABM具有任何合适数目的结合位点的ABM。在一些实施方案中，本文中提供的MIAC中使用的ABM1包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个对癌细胞抗原的结合位点。在一些实施方案中，本文中提供的MIAC中使用的ABM2包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个对效应细胞上的活化性受体的结合位点。在一些实施方案中，本文中提供的MIAC中使用的ABM3包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个对效应细胞上的抑制性受体的结合位点。在一些实施方案中，本文中提供的MIAC中使用的ABM4包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个对效应细胞上的Fc受体的结合位点。
此外，本文中提供的MIAC还可以包含靶向不同癌细胞抗原、不同活化性受体和/或不同抑制性受体的ABM。
例如，在一些实施方案中，本文中提供的MIAC包含靶向超过一种癌细胞抗原的ABM1，在一些实施方案中，ABM1靶向2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种不同的癌细胞抗原。
在一些实施方案中，本文中提供的MIAC包含超过一种ABM1，其中每种ABM1靶向不同癌细胞抗原。在一些实施方案中，不同ABM1共同靶向2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种不同癌细胞抗原。在一些实施方案中，一些ABM1靶向相同的癌细胞抗原，并且一些ABM1靶向不同癌细胞抗原，但是ABM1共同靶向2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种不同癌细胞抗原。
在一些实施方案中，本文中提供的MIAC包含靶向超过一种活化性受体的ABM2。在一些实施方案中，ABM2靶向2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种不同活化性受体。
在一些实施方案中，本文中提供的MIAC包含超过一种ABM2，其中每种ABM2靶向不同活化性受体。在一些实施方案中，不同ABM2共同靶向2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种不同活化性受体。在一些实施方案中，一些ABM2靶向相同的活化性受体，并且一些ABM2靶向不同活化性受体，但是ABM2共同靶向2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种不同活化性受体。
在一些实施方案中，本文中提供的MIAC包含靶向超过一种抑制性受体的ABM3。在一些实施方案中，ABM3靶向2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种不同抑制性受体。
在一些实施方案中，本文中提供的MIAC包含超过一种ABM3，其中每种ABM3靶向不同抑制性受体。在一些实施方案中，不同ABM3共同靶向2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种不同抑制性受体。在一些实施方案中，一些ABM3靶向相同的抑制性受体，并且一些ABM3靶向不同抑制性受体，但是ABM3共同靶向2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种不同抑制性受体。
3.2.抗原结合模块1(ABM1)：癌细胞抗原结合剂
在本文中提供的MIAC中，ABM1特异性结合由癌细胞表达的抗原(“癌细胞抗原”)。由ABM1结合的优选抗原包括那些由癌细胞而不是正常细胞表达的抗原，或与正常细胞相比在癌细胞中上调的抗原。优选的是，抗原在细胞的表面上表达，其中它可被ABM1接近。任何合适的癌细胞抗原都可以被ABM1靶向，并且技术人员将能够选择适合于ABM1结合的抗原。
在一些实施方案中，与对照细胞相比，由ABM1结合的抗原在癌细胞中上调至少一定量。对照细胞可以是来自相同组织的细胞。来自相同组织的细胞可以是可以形成有待靶向的癌细胞的细胞类型的正常形式。例如，如果癌细胞是人结肠癌上皮细胞，则对照细胞可以是正常的人结肠上皮细胞。为了说明的目的而提供该实例，并且本领域普通技术人员可以容易地选择合适的对照细胞与癌细胞进行比较。
在一些实施方案中，与对照细胞相比，由ABM1结合的抗原上调至少2倍。在一些实施方案中，与对照细胞相比，由ABM1结合的抗原上调至少5倍。在一些实施方案中，与对照细胞相比，由ABM1结合的抗原上调至少10倍。在一些实施方案中，与对照细胞相比，由ABM1结合的抗原上调至少100倍。在一些实施方案中，与对照细胞相比，由ABM1结合的抗原上调至少1,000倍。在一些实施方案中，与对照细胞相比，由ABM1结合的抗原上调至少10,000倍。在一些实施方案中，与对照细胞相比，由ABM1结合的抗原上调至少100,000倍。在一些实施方案中，与对照细胞相比，由ABM1结合的抗原上调至少1,000,000倍。
ABM1的作用是将MIAC靶向到恶性肿瘤的部位，例如到癌细胞。因此，不要求ABM1在结合其抗原后施加任何特定的生物活性(即激动或拮抗活性)。然而，ABM1通过结合其抗原施加生物活性的MIAC也在本发明的范围内。在一些实施方案中，ABM1激动受体抗原。在一些实施方案中，ABM1拮抗受体抗原。在一些实施方案中，ABM1结合抗原(包括受体抗原)而没有激动或拮抗效果。
用于ABM1结合的示例性癌细胞抗原包括例如9-O-乙酰基-GD3、βhCG、A33抗原、CA19-9标志物、CA-125标志物、钙网蛋白、碳酸酐酶IX(MN/CA IX)、CCR5、CCR8、CD19、CD20、CD22(SIGLEC-2)、CD25、CD27(TNFRSF7)、CD30(TNFRSF8)、CD33(SIGLEC-3)、CD38(环状ADP核糖水解酶)、CD44v6、CD63(LAMP-3)、CD66e(CEACAM5)、CD70、CD123(IL3RA)、CD138(多配体聚糖(syndecan)1)、CD248(内皮唾酸蛋白)癌胚抗原(CEA)、桥粒芯蛋白4、E-钙粘蛋白新表位、肝配蛋白A2(EphA2)、表皮生长因子受体(EGFR)、表皮细胞粘附分子(EpCAM)、ErbB2、胎儿乙酰胆碱受体、成纤维细胞活化抗原(FAP)、岩藻糖基GM1、GD2、GD3、GM2、神经节苷脂GD3、Globo H、糖蛋白100(gp100)、HER2/neu、HER3、HER4、胰岛素样生长因子受体1、Lewis-Y、LG、Ly-6、黑素瘤特异性硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSCP)、间皮素、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC7、MUC16、穆勒抑制物(MIS)受体II型、浆细胞抗原、多聚SA、PSCA、PSMA、音猬因子(SHH)、SAS、STEAP、sTn抗原和TNF-α前体。美国专利号7,235,641(其全部内容通过引用并入)中提供了可以通过ABM1靶向的癌抗原的实例。
在一些实施方案中，ABM1是多特异性抗原结合模块。多特异性抗原结合模块可以通过本领域中已知或本文中所述的任何方法，如钮和孔(knobs and holes)方法或组合已知结合不同抗原的单结构域抗体制备。在一些实施方案中，多特异性ABM1结合2、3、4、5、6、7、8或更多个不同抗原。在一些实施方案中，每种不同抗原是由ABM1结合位点识别的不同抗原。
在一些实施方案中，可以形成杂合多特异性ABM，其包含超过一类ABM结合位点。例如，在一些实施方案中，杂合多特异性ABM包含ABM1和ABM2的结合位点。此类杂合ABM的一个实例是双特异性IgG，其中一个结合位点形成ABM1的结合位点，并且一个结合位点形成ABM2的结合位点。本文中还提供了多特异性杂合ABM结合ABM1和3；ABM1和4；ABM1、2和3；ABM1、2和4；ABM1、3和4；和ABM1、2、3和4。
3.3.抗原结合模块2(ABM2)：活化性受体的激动剂
在本文中提供的MIAC中，ABM2特异性结合由效应细胞表达的活化性受体。ABM2与活化性受体的结合激动所述活化性受体，导致活化信号转导到效应细胞。可以通过例如改变ABM2对活化性受体的亲和力、ABM2的价态或ABM2的数目，从而改变活化信号的强度来调谐效应细胞的活性。
选择ABM2靶向的活化性受体，例如，基于希望募集到癌细胞的效应细胞的类型。例如，在一个说明性的实施方案中，可以通过利用具有激动活性的CD137结合分子作为ABM2来募集并活化自然杀伤(NK)细胞。
在一些实施方案中，效应细胞是NK细胞。适合于ABM2激动的说明性NK细胞受体包括例如2B4(CD244)、α4β1整联蛋白、β2整联蛋白(例如CD11a-CD18、CD11b-CD18、CD11c-CD18)、CD2(LFA2、OX34)、CD16、CD27(TNFRSF7)、CD38、CD96、CD100、CD160、CD137、CEACAM1(CD66)、CRTAM、CS1(CD319)、DNAM-1(CD226)、GITR(TNFRSF18)、KIR的活化形式(例如KIR2DS1、KIR2DS4、KIR-S)、NKG2C、NKG2D、NKG2E、天然细胞毒性受体(例如NKp30、NKp44、NKp46、NKp80)、NTB-A和PEN-5。在Miller，Hematology,2013,2013(1):247-253；Mentlik等人,Frontiers in Immunology,2013,4:481(1-12)；Stein等人,Antibodies,2012,1:88-123；Pegram等人,Immunology and Cell Biology,2011,89:216-224；和Vivier等人,Nature Immunology,2008,9:503-510(每篇的全部内容通过引用并入)提供了关于适合于ABM2激动的NK细胞受体的更多信息。
在一些实施方案中，效应细胞是T淋巴细胞。在一些实施方案中，T淋巴细胞是细胞毒性T淋巴细胞。在一些实施方案中，T淋巴细胞是γδT细胞。在一些实施方案中，T淋巴细胞是NKT细胞。在一些实施方案中，NKT细胞是iNKT细胞。适合于ABM2激动的说明性T淋巴细胞受体包括例如CD2(LFA2、OX34)、CD3、CD5、CD27(TNFRSF7)、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD40L、CD84(SLAMF5)、CD137(4-1BB)、CD226、CD229(Ly9、SLAMF3)、CD244(2B4、SLAMF4)、CD319(CRACC、BLAME)、CD352(Ly108、NTBA、SLAMF6)、CRTAM(CD355)、DR3(TNFRSF25)、GITR(CD357)、HVEM(CD270)、ICOS、LIGHT、LTβR(TNFRSF3)、OX40(CD134)、NKG2D、SLAM(CD150、SLAMF1)、TCRα、TCRβ、TCRδγ和TIM1(HAVCR、KIM1)。在Stein等人，Antibodies,2012,1:88-123；Chen和Flies,Nature Reviews Immunology,2013,13:227-242；和Pardoll,NatureReviews Cancer,2012,12:252-264(每篇的全部内容通过引用并入)中提供了关于适合于ABM2激动的T细胞受体的更多信息。
在一些实施方案中，ABM2特别不是由效应细胞表达的活化性受体的天然配体或其部分。在一些实施方案中，ABM2是由效应细胞表达的活化性受体的天然配体或其部分。
在一些实施方案中，ABM2是多特异性抗原结合模块。多特异性抗原结合模块可以通过本领域中已知或本文中所述的任何方法，如钮和孔方法或组合已知结合不同抗原的单结构域抗体制备。在一些实施方案中，多特异性ABM2结合2、3、4、5、6、7、8或更多个不同抗原。在一些实施方案中，每种不同抗原是由ABM2结合位点识别的不同抗原。
在一些实施方案中，可以形成杂合多特异性ABM，其包含超过一类ABM结合位点。例如，在一些实施方案中，杂合多特异性ABM包含ABM2和ABM1的结合位点。此类杂合ABM的一个实例是双特异性IgG，其中一个结合位点形成ABM2的结合位点，并且一个结合位点形成ABM1的结合位点。本文中还提供了多特异性杂合ABM结合ABM2和3；ABM2和4；ABM2、1和3；ABM2、1和4；ABM2、3和4；和ABM2、1、3和4。
3.4.抗原结合模块3(ABM3)：抑制性受体的拮抗剂
在本文中提供的MIAC中，ABM3特异性结合由效应细胞表达的抑制性受体。ABM3与抑制性受体的结合拮抗所述抑制性受体，导致转导到效应细胞的抑制信号的阻断。可以通过例如改变ABM3对抑制性受体的亲和力、ABM3的价态或ABM3的数目，从而改变抑制信号的拮抗程度来进一步调谐效应细胞的活性。
选择ABM3靶向的抑制性受体，例如，基于希望募集到癌细胞的效应细胞的类型。例如，在效应细胞是NK细胞的说明性实施方案中，ABM3可以是具有拮抗活性的KIR2DL1结合分子。
在一些实施方案中，效应细胞是NK细胞。适合于ABM3拮抗的说明性NK细胞受体包括例如ILT2/LIR-1/CD85j、KIR的抑制形式(例如KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR-L)、KLRG1、LAIR-1、NKG2A、NKR-P1A、Siglec-3、Siglec-7和Siglec-9。在Miller,Hematology,2013,2013(1):247-253；Mentlik等人,Frontiers in Immunology,2013,4:481(1-12)；Stein等人,Antibodies,2012,1:88-123；Pegram等人,Immunology andCell Biology,2011,89:216-224；及Vivier等人,Nature Immunology,2008,9:503-510(每篇的全部内容通过引用并入)提供了关于用于ABM3拮抗的NK细胞受体的更多信息。
在一些实施方案中，效应细胞是T淋巴细胞。在一些实施方案中，T淋巴细胞是细胞毒性T淋巴细胞。在一些实施方案中，T淋巴细胞是γδT细胞。在一些实施方案中，T淋巴细胞是NKT细胞。在一些实施方案中，NKT细胞是iNKT细胞。适合于ABM3拮抗的说明性T淋巴细胞受体包括例如2B4(CD244、SLAMF4)、B71(CD80)、B7H1(CD274、PD-Ll)、BTLA(CD272)、CD160(BY55、NK28)、CD352(Ly108、NTBA、SLAMF6)、CD358(DR6)、CTLA-4(CD152)、LAG3、LAIR1、PD-1(CD279)、PD-1H(VISTA)、TIGIT(VSIG9、VSTM3)、TIM2(TIMD2)和TIM3(HAVCR2、KIM3)。在Stein等人,Antibodies,2012,1:88-123；Chen和Flies,Nature Reviews Immunology,2013,13:227-242；以及Pardoll,Nature Reviews Cancer,2012,12:252-264(每篇的全部内容通过引用并入)中提供了关于用于ABM3拮抗的T细胞受体的更多信息。
在一些实施方案中，ABM3特别不是由效应细胞表达的抑制性受体的天然配体或其部分。在一些实施方案中，ABM3是由效应细胞表达的抑制性受体的天然配体或其部分。
在一些实施方案中，ABM3是多特异性抗原结合模块。多特异性抗原结合模块可以通过本领域中已知或本文中所述的任何方法，如钮和孔方法或组合已知结合不同抗原的单结构域抗体制备。在一些实施方案中，多特异性ABM3结合2、3、4、5、6、7、8或更多个不同抗原。在一些实施方案中，每种不同抗原是由ABM3结合位点识别的不同抗原。
在一些实施方案中，可以形成杂合多特异性ABM，其包含超过一类ABM结合位点。例如，在一些实施方案中，杂合多特异性ABM包含ABM3和ABM1的结合位点。此类杂合ABM的一个实例是双特异性IgG，其中一个结合位点形成ABM3的结合位点，并且一个结合位点形成ABM1的结合位点。本文中还提供了多特异性杂合ABM结合ABM3和2；ABM3和4；ABM3、1和2；ABM3、1和4；ABM3、2和4；和ABM3、1、2和4。
3.5.ABM1、ABM2和ABM3组合的说明性实例
可以组合任何合适的ABM1、ABM2和/或ABM3以产生本文的MIAC。仅为了说明目的提供以下组合，并不意图将本发明限于ABM1、ABM2和ABM3的任何具体的组合。
在一些实施方案中，MIAC包含ABM1、ABM2和ABM3，其中ABM1结合CD30，ABM2激动CD137，并且ABM3拮抗PD-1。在一些实施方案中，MIAC包含ABM1和ABM2，其中ABM1结合CD30并且ABM2激动CD137。在一些实施方案中，MIAC包含ABM1和ABM3，其中ABM1结合CD30并且ABM3拮抗PD-1。在一些实施方案中，本段中描述的任何构建体包含结合CD64的ABM4。
在一些实施方案中，MIAC包含ABM1、ABM2和ABM3，其中ABM1结合CD30，ABM2激动NKG2D，并且ABM3拮抗KIR的抑制形式。在一些实施方案中，MIAC包含ABM1和ABM2，其中ABM1结合CD30并且ABM2激动NKG2D。在一些实施方案中，MIAC包含ABM1和ABM3，其中ABM1结合CD30并且ABM3拮抗KIR的抑制形式。在一些实施方案中，本段中描述的任何构建体包含结合CD64的ABM4。
在一些实施方案中，MIAC包含ABM1、ABM2和ABM3，其中ABM1结合CD30，ABM2激动CD137，并且ABM3拮抗KIR的抑制形式。在一些实施方案中，MIAC包含ABM1和ABM2，其中ABM1结合CD30并且ABM2激动CD137。在一些实施方案中，MIAC包含ABM1和ABM3，其中ABM1结合CD30并且ABM3拮抗KIR的抑制形式。在一些实施方案中，本段中描述的任何构建体包含结合CD64的ABM4。
在一些实施方案中，MIAC包含ABM1、ABM2和ABM3，其中ABM1结合CD20，ABM2激动NKG2D，并且ABM3拮抗KIR的抑制形式。在一些实施方案中，MIAC包含ABM1和ABM2，其中ABM1结合CD20并且ABM2激动NKG2D。在一些实施方案中，MIAC包含ABM1和ABM3，其中ABM1结合CD20并且ABM3拮抗KIR的抑制形式。在一些实施方案中，本段中描述的任何构建体包含结合CD64的ABM4。
在一些实施方案中，MIAC包含ABM1、ABM2和ABM3，其中ABM1结合CD30，ABM2激动NKG2D，并且ABM3拮抗NKG2A。在一些实施方案中，MIAC包含ABM1和ABM2，其中ABM1结合CD30并且ABM2激动NKG2D。在一些实施方案中，MIAC包含ABM1和ABM3，其中ABM1结合CD30并且ABM3拮抗NKG2A。在一些实施方案中，本段中描述的任何构建体包含结合CD64的ABM4。
3.6.抗原结合模块4(ABM4)：Fc受体结合模块
在一些实施方案中，本文中提供的MIAC包含结合效应细胞上的Fc受体的结合模块。Fc受体包括例如CD16(CD16a，CD16b)、CD32a、CD64和CD89。
在一些实施方案中，ABM4是特异性结合Fc受体的免疫球蛋白、抗体、抗体片段或备选支架。在一些实施方案中，ABM4是免疫球蛋白的Fc结构域。
虽然免疫球蛋白的Fc结构域在本领域中通常不称为“抗原结合”，但为了本公开的MIAC的ABM4的目的，Fc结构域的受体被认为是由Fc结构域结合的“抗原”。换言之，在前述段落中以及在本公开内容中描述的其它类型的ABM4中，免疫球蛋白的Fc结构域是一类ABM4。
例如，在ABM1、ABM2和/或ABM3包含具有Fc结构域的免疫球蛋白的情况下，则可以存在Fc结构域。更具体地并且作为说明，在ABM1、ABM2或ABM3中的任一个包含IgG的情况下，则ABM4可以是IgG的Fc结构域。在这些实施方案中，单个IgG可以形成ABM4以及ABM1、ABM2和ABM3中的至少一种，如本领域技术人员容易认识的。Ravetch和Kinet,Ann.Rev.Immunol.,1991,9:457-492(其全部内容通过引用并入)总结了效应细胞上的FcR表达。
在某些实施方案中，可以将修饰引入Fc区以产生Fc区变体。在某些实施方案中，Fc区变体拥有增强或以其它方式改变的效应器功能。具有改变的效应器功能的许多取代或取代或缺失是本领域已知的。Fc区变体的实例包括在美国专利号8,815,237；Lazar等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2006,103:4005-4010；及Strohl,Current Opinion inBiotechnology,2009,20:685-691中描述的那些变体；每篇的全部内容通过引用并入。
可以使用体外和/或体内测定来确认补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性的改变。例如，可以进行Fc受体结合测定以测量FcγR结合。用于评估目标分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例在美国专利号5,500,362和5,821,337；Hellstrom等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1986,83:7059-7063；Hellstrom等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1985,82:1499-1502；及Bruggemann等人,J.Exp.Med.,1987,166:1351-1361中提供，每篇全部内容通过引用并入。或者或另外，可以使用诸如Clynes等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1998,95:652-656(其全部内容通过引用并入)所公开的动物模型在体内评估目标分子的ADCC活性。
在一些实施方案中，MIAC不包含ABM4。
在ABM4的背景中，可以修饰Fc，例如以在CH2结构域和/或CH3结构域中包括一个或多个修饰。此类修饰可以影响Fc功能和结合特征如Fc受体(FcR)结合。可以修饰Fc以阻断与FcR的结合，例如可以修饰Fc以包括阻断FcR结合的突变，例如在氨基酸N297处的突变。可以修饰Fc以防止N-连接的糖基化和/或减少ADCC。
3.7.抗原结合模块的装配
本文中提供的MIAC的特征在于，构成MIAC的ABM彼此共价或非共价缔合(或“结合”)以形成MIAC。技术人员能够根据ABM的性质和应用选择缔合类型。
在一些实施方案中，一个ABM与其它两个ABM两者结合，但是其它两个ABM彼此不直接结合。例如，如图7A中所示，在一些方面，ABM1与ABM2和ABM3两者结合，而ABM2和ABM3彼此不结合。在一些方面，如图7B中所示，ABM2与ABM1和ABM3两者结合，而ABM1和ABM3彼此不直接结合。在一些方面，如图7C中所示，ABM3与ABM1和ABM2两者结合，而ABM1和ABM2彼此不直接结合。
在一些实施方案中，每个ABM与其它两个ABM结合。例如，在某些方面，如图8中所示，ABM1与ABM2和ABM3结合；ABM2与ABM1和ABM3结合；并且ABM3与ABM1和ABM2结合。
在MIAC仅包括两个ABM的实施方案中，ABM通常将彼此共价或非共价缔合。然而，在一些实施方案中，每个ABM可以与不是ABM的第三分子缔合。
3.7.1共价缔合的ABM
在一些实施方案中，ABM彼此共价缔合。共价缔合可以是任何合适的共价连接。
在一些实施方案中，共价缔合为包含两个或更多个ABM或其部分的融合蛋白的形式。此类融合蛋白的说明性实施方案包括包含scFv和IgG的重链或轻链的融合蛋白，如图2A-5B和11A-15B中显示。融合蛋白的进一步说明性实施方案是图6和16A-18B中描绘的MIAC。
本文中提供的MIAC可以包含任何合适的融合蛋白结构，并且本领域技术人员可以根据例如MIAC的每个ABM的期望价态和分子量进行合适的融合蛋白的选择。在本公开内容中提供了合适的融合蛋白结构的实例。在本公开的其它地方描述了产生融合蛋白的方法。
在一些实施方案中，融合蛋白包含多肽接头。多肽接头可以是将融合蛋白质的至少两种蛋白质(例如，ABM)彼此连接的任何合适的多肽接头。熟练技术人员能够基于融合蛋白的组分(例如，ABM)及其应用来选择合适的多肽接头。合适的接头的实例包括(GGGGS)n(SEQ ID NO:20)、来自人IgG1CH2残基297-322的Fc中间接头：NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK(SEQ ID NO:21)和来自人血清白蛋白的D3结构域的HAS中间接头：FQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVS(SEQ ID NO:22)。参见Fang等人,Chines.Sci.Bull.,2003,48:1912-1918，其全部内容通过引用并入。在一些实施方案中，接头是(GGGGS)3(SEQ IDNO:23)。提供了其它接头，例如在美国专利号5,525,491；Alfthan等人,Protein Eng.,1995,8:725-731；Shan等人,J.Immunol.,1999,162:6589-6595；Newton等人,Biochemistry,1996,35:545-553；Megeed等人；Biomacromolecules,2006,7:999-1004；和Perisic等人,Structure,1994,12:1217-1226；每篇的全部内容通过引用并入。
在一些实施方案中，通过化学偶联共价缔合ABM。可以使用任何合适的化学接头共价缔合本文中提供的ABM。抗体彼此的化学偶联描述于例如Wong等人,Scand.J.Rheumatol.,2000,29:282-287；Jung等人,Eur.J.Immunol.,1991,21:2431-2435；Tutt等人,J.Immunol.,1991,147:60-69；French,Methods Mol.Biol.,1998,80:121-134；以及Gavrilyuk等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.,2009,19:3716-3720；每篇的全部内容通过引用并入。
在一些实施方案中，化学偶联是经由间隔物。在一些实施方案中，间隔物是选自聚合物、多肽、碳水化合物(例如葡聚糖)等的分子。在具体实施方案中，间隔物是聚(乙)二醇(PEG)聚合物。在一些实施方案中，PEG具有约2.5kDa至约50kDa范围内的分子量。用于化学偶联的PEG试剂及其使用方法描述于例如Hermanson,Bioconjugate Techniques,2013,第3版,第18章,Academic Press,London,UK,Waltham MA,and San Diego,CA，其全部内容通过引用并入。
3.7.2.非共价缔合的ABM
在一些实施方案中，ABM彼此非共价缔合。非共价缔合可以是任何合适的共价连接。
在一些实施方案中，非共价缔合是两个分子之间的特异性相互作用的形式。例如，在一些实施方案中，非共价缔合是抗生物素蛋白和生物素之间的相互作用。在一些实施方案中，抗生物素蛋白选自链霉亲和素和中性抗生物素蛋白(neutravidin)。在这些实施方案中，将抗生物素蛋白分子连接到一个ABM，并且将生物素分子连接到另一个ABM。然后，ABM由于抗生物素蛋白和生物素之间特异性高亲和力相互作用而缔合。抗生物素蛋白-生物素系统及其使用方法描述于例如Hermanson,Bioconjugate Techniques,2013,第3版,第11章,Academic Press,London,UK,Waltham MA,and San Diego,CA，其全部内容通过引用并入。
3.8.多特异性免疫调节性构建体(MIAC)的说明性实施方案
图2A-6和11A-18B提供了本文中提供的MIAC的说明性、非限制性实例。
在图2A中，ABM1(201)是IgG，ABM2(202)是scFv，并且ABM3(203)是scFv。使用多肽接头将ABM2(202)和ABM3(203)连接到IgG的重链的C末端。然而，也可以将ABM2(202)和ABM3(203)中的一个或两个连接到IgG的重链的N末端。
在图2B中，ABM1(201)是IgG，ABM2(202)是scFv，并且ABM3(203)是scFv。使用多肽接头将ABM2(202)和ABM3(203)连接到IgG的轻链的C末端。然而，也可以将ABM2(202)和ABM3(203)中的一个或两个连接到IgG的轻链的N末端。
在图2C中，ABM1(201)是IgG，ABM2(202)是scFv，并且ABM3(203)是scFv。使用多肽接头将ABM2(202)连接到IgG的一个轻链的C末端。使用多肽接头将ABM3(203)连接到IgG的一个重链的C末端。然而，还可以分别将ABM2(202)和ABM3(203)中的一个或两个连接到轻链的N末端或重链的N末端。
在图2D中，ABM1(201)是IgG，ABM2(202)是scFv，并且ABM3(203)是scFv。使用多肽接头将ABM2(202)连接到IgG的一个重链的C末端。使用多肽接头将ABM3(203)连接到IgG的一个轻链的C末端。然而，也可以分别将ABM2(202)和ABM3(203)中的一个或两个连接到重链的N末端或轻链的N末端。
在图3A中，ABM1(201)是IgG，ABM2(202)是scFv，并且ABM3(203)是scFv。使用多肽接头将ABM2(202)连接到IgG的一个重链的C末端。使用多肽接头将ABM3(203)连接到IgG的另一个重链的C末端，和IgG的一个轻链。然而，也可以将ABM2(202)和ABM3(203)中的一个或两个连接到重链的N末端或轻链的N末端。
在图3B中，ABM1(201)是IgG，ABM2(202)是scFv，并且ABM3(203)是scFv。使用多肽接头将ABM2(202)连接到IgG的一个轻链的C末端。使用多肽接头将ABM3(203)连接到IgG的另一轻链的C末端，和IgG的一个重链。然而，也可以将ABM2(202)和ABM3(203)中的一个或两个连接到轻链的N末端或重链的N末端。
在图3C中，ABM1(201)是IgG，ABM2(202)是scFv，并且ABM3(203)是scFv。使用多肽接头将ABM2(202)连接到IgG的一个重链的C末端，和IgG的一个轻链。使用多肽接头将ABM3(203)连接到IgG的另一个重链的C末端。然而，也可以将ABM2(202)和ABM3(203)中的一个或两个连接到重链的N末端或轻链的N末端。
在图3D中，ABM1(201)是IgG，ABM2(202)是scFv，并且ABM3(203)是scFv。使用多肽接头将ABM2(202)连接到IgG的一个重链的C末端，和IgG的一个轻链。使用多肽接头将ABM3(203)连接到IgG的另一个轻链的C末端。然而，也可以将ABM2(202)和ABM3(203)中的一个或两个连接到轻链的N末端或重链的N末端。
在图4A中，ABM1(201)是IgG，ABM2(202)是scFv，并且ABM3(203)是scFv。将ABM2(202)连接到IgG的一半上的轻链的C末端和IgG的相同一半上的重链的C末端。将ABM3(203)连接到IgG的另一半上的轻链的C末端和IgG的另一半上的重链的C末端。然而，也可以将ABM2(202)和ABM3(203)中的一个或多个连接到轻链的N末端或重链的N末端。
在图4B中，ABM1(201)是IgG，ABM2(202)是scFv，并且ABM3(203)是scFv。将ABM2(202)连接到IgG的一半上的轻链的C末端和IgG的另一半上的重链的C末端。将ABM3(203)连接到IgG的一半上的轻链的C末端和IgG的另一半上的重链的C末端。然而，也可以将ABM2(202)和ABM3(203)中的一个或多个连接到轻链的N末端或重链的N末端。
在图5A中，ABM1(201)是scFv，ABM2(202)是IgG，并且ABM3(203)是scFv。使用多肽接头将ABM1(201)和ABM3(203)连接到IgG的重链的C末端。然而，可以将ABM1(201)和ABM3(203)中的一个或两个连接到IgG的重链的N末端。也可以将ABM1(201)和ABM3(203)连接到IgG的任何其它合适的位点，包括轻链的C或N末端。
在图5B中，ABM1(201)是scFv，ABM2(202)是scFv，并且ABM3(203)是IgG。使用多肽接头将ABM1(201)和ABM2(202)连接到IgG的重链的C末端。然而，可以将ABM1(201)和ABM2(203)中的一个或两个连接到IgG的重链的N末端。也可以将ABM1(201)和ABM2(203)连接到IgG的任何其它合适的位点，包括轻链的C或N末端。
在图6中，ABM1(201)是scFv，ABM2(202)是scFv，并且ABM3(203)是scFv。在该说明性实施方案中，使用多肽接头以从N末端至C末端的ABM1-ABM2-ABM3的顺序装配scFv。然而，可以以任何合适的顺序装配scFv，包括例如从N末端至C末端，ABM1-ABM3-ABM2、ABM2-ABM1-ABM3、ABM2-ABM3-ABM1、ABM3-ABM1-ABM2和ABM3-ABM2-ABM1。
在图11A中，ABM1(201)是IgG，并且ABM2(202)是scFv。使用多肽接头将一个ABM2(202)连接到IgG的重链的每个C末端。然而，也可以将一个或两个ABM2(202)连接到IgG的重链的N末端。
在图11B中，ABM1(201)是IgG，并且ABM2(202)是scFv。使用多肽接头将一个ABM2(202)连接到IgG的轻链的每个C末端。然而，也可以将一个或两个ABM2(202)连接到IgG的轻链的N末端。
在图11C中，ABM1(201)是IgG，并且ABM3(203)是scFv。使用多肽接头将一个ABM3(203)连接到IgG的重链的每个C末端。然而，也可以将一个或两个ABM3(203)连接到IgG的重链的N末端。
在图11D中，ABM1(201)是IgG，并且ABM3(203)是scFv。使用多肽接头将一个ABM3(203)连接到IgG的轻链的每个C末端。然而，也可以将一个或两个ABM3(203)连接到IgG的轻链的N末端。
在图12A中，ABM1(201)是IgG，并且ABM2(202)是scFv。使用多肽接头将一个ABM2(202)连接到IgG的一个轻链的C末端。使用多肽接头将另一个ABM2(202)连接到IgG的一个重链的C末端。然而，也可以分别将一个或两个ABM2(202)连接到轻链的N末端或重链的N末端。
在图12B中，ABM1(201)是IgG，并且ABM3(203)是scFv。使用多肽接头将一个ABM3(203)连接到IgG的一个轻链的C末端。使用多肽接头将另一个ABM3(203)连接到IgG的一个重链的C末端。然而，也可以分别将一个或两个ABM3(203)连接到轻链的N末端或重链的N末端。
在图13A中，ABM1(201)是IgG，并且ABM2(202)是scFv。使用多肽接头将ABM2(202)连接到IgG的两个重链和一个轻链的C末端。然而，还可以将任何ABM2(202)连接到重链的N末端或轻链的N末端。
在图13B中，ABM1(201)是IgG，并且ABM2(202)是scFv。使用多肽接头将ABM2(202)连接到IgG的两个轻链和一个重链的C末端。然而，还可以将任何ABM2(202)连接到轻链的N末端或重链的N末端。
在图13C中，ABM1(201)是IgG，并且ABM3(203)是scFv。使用多肽接头将ABM3(203)连接到IgG的两个重链和一个轻链的C末端。然而，还可以将任何ABM3(203)连接到重链的N末端或轻链的N末端。
在图13D中，ABM1(201)是IgG，并且ABM3(203)是scFv。使用多肽接头将ABM3(203)连接到IgG的两个轻链和一个重链的C末端。然而，也可以将任何ABM3(203)连接到轻链的N末端或重链的N末端。
在图14A中，ABM1(201)是IgG，并且ABM2(202)是scFv。将ABM2(202)连接到两个重链和两个轻链的C末端。然而，还可以将一个或多个ABM2(202)连接到轻链的N末端或重链的N末端。
在图14B中，ABM1(201)是IgG，并且ABM3(203)是scFv。将ABM3(203)连接到两个重链和两个轻链的C末端。然而，也可以将一个或多个ABM3(203)连接到轻链的N末端或重链的N末端。
在图15A中，ABM1(201)是scFv，并且ABM2(202)是IgG和scFv。使用多肽接头将ABM1(201)和scFv ABM2(202)连接到IgG的重链的C末端。然而，可以将ABM1(201)和scFv ABM2(202)中的一个或两个连接到IgG的重链的N末端。也可以将ABM1(201)和scFvABM2(202)连接到IgG的任何其它合适的位点，包括轻链的C或N末端。
在图15B中，ABM1(201)是scFv，并且ABM3(203)是IgG和scFv。使用多肽接头将ABM1(201)和scFv ABM3(203)连接到IgG的重链的C末端。然而，可以将ABM1(201)和scFv ABM3(203)中的一个或两个连接到IgG的重链的N末端。也可以将ABM1(201)和scFv ABM3(203)连接到IgG的任何其它合适的位点，包括轻链的C或N末端。
在图16A中，ABM1(201)是scFv，并且两个ABM2(202)都是scFv。在该说明性实施方案中，使用多肽接头以从N末端至C末端的顺序ABM1-ABM2-ABM2装配scFv。然而，可以以任何合适的顺序装配scFv，包括例如从N末端至C末端，ABM2-ABM1-ABM2和ABM2-ABM2-ABM1。
在图16B中，ABM1(201)是scFv，并且两个ABM3(203)都是scFv。在该说明性实施方案中，使用多肽接头以从N末端至C末端的顺序ABM1-ABM3-ABM3装配scFv。然而，可以以任何合适的顺序装配scFv，包括例如从N末端至C末端，ABM3-ABM1-ABM3和ABM3-ABM3-ABM1。
在图17A-17B中，将两个ABM1(201)scFv连接到IgG样分子的重链的C末端。IgG样分子的N末端区域包含形成两个ABM2结合位点的VH-VL区(202)和形成两个ABM3结合位点的VH-VL区(203)。在图17A中描绘的实施方案中，ABM3结合位点是由IgG样分子形成的最N末端的ABM结合位点。在图17B中描绘的实施方案中，ABM2结合位点是由IgG样分子形成的最N末端的ABM结合位点。还可以将一种或多种scFv ABM1(201)连接到IgG样分子的轻链的C或N末端，或连接到重链的N末端。
在图18A-18B中，将两个ABM1(201)scFv连接到IgG样分子的重链的C末端。IgG样分子的N末端区域包含形成四个ABM2结合位点(202；图18A)或四个ABM3结合位点(203；图18B)的VH-VL区。还可以将一个或多个scFv ABM1(201)连接到IgG样分子的轻链的C或N末端，或连接到重链的N末端。
4.多特异性免疫调节性抗原结合构建体(MIAC)的制备
可以使用本领域已知并在下文中更详细地描述的核酸克隆、蛋白质表达和蛋白质装配技术制备MIAC。如本公开的其它部分所述，形成MIAC的ABM可以由具有多个亚基的蛋白质(和融合蛋白质)装配。在MIAC由多个亚基形成的情况中，可以在重组细胞内或重组细胞外进行MIAC的最终装配。
4.1.抗原制备
用于产生ABM的抗原可以是由细胞表达的完整分子(例如癌细胞特异性抗原、活化性受体和/或抑制性受体)或这些分子的片段。抗原可以为分离的蛋白质的形式，或为表达蛋白质的细胞的形式。可用于产生ABM的其它形式的抗原对于本领域技术人员是显而易见的。
4.2抗体
可以例如使用首先由Kohler等人，Nature,1975,256:495-497(其全部内容通过引用并入)描述的杂交瘤方法和/或通过重组DNA方法(参见例如美国专利号4,816,567，其全部内容通过引用并入)获得抗体。也可以例如使用基于噬菌体或酵母的文库来获得单克隆抗体。参见例如美国专利号8,258,082和8,691,730，每篇的全部内容通过引用并入。
在杂交瘤方法中，将小鼠或其它合适的宿主动物免疫以引发产生或能够产生将特异性结合用于免疫的蛋白质的抗体的淋巴细胞。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。然后使用合适的融合剂如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞。参见GodingJ.W.,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,第3版(1986)Academic Press,San Diego,CA，其全部内容通过引用并入。
将杂交瘤细胞在合适的培养基中接种并且生长，所述培养基含有一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞的生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基通常包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，所述物质阻止HGPRT缺陷型细胞生长。
有用的骨髓瘤细胞是能够有效融合，支持通过选择的产生抗体的细胞的稳定高水平的抗体产生，并且是对培养基条件，例如存在或缺乏HAT培养基敏感的细胞。在这些中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，如源自MOP-21和MC-11小鼠肿瘤的骨髓瘤细胞系(可购自Salk研究所细胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center),SanDiego,CA)和SP-2或X63-Ag8-653细胞(可购自美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)，Rockville，MD)。还描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系。参见例如Kozbor,J.Immunol.,1984,133:3001，其全部内容通过引用并入。
在鉴定产生具有期望特异性、亲和力和/或生物活性的抗体的杂交瘤细胞后，可以通过有限稀释程序对所选择的克隆进行亚克隆并通过标准方法使之生长。参见Goding，同上。用于此目的的合适的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可以在动物体内作为腹水肿瘤进行生长。
使用常规方法(例如，通过使用能够特异性结合编码单克隆抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)，可以容易地分离和测序编码单克隆抗体的DNA。因此，杂交瘤细胞可以充当编码具有期望性质的抗体的DNA的有用来源。一旦分离，可以将DNA置于表达载体中，然后将所述表达载体转染入宿主细胞如细菌(如大肠杆菌(E.coli))、酵母(例如酵母属(Saccharomyces)或巴斯德驹形氏酵母属(Komagataella(毕赤酵母属(Pichia))种)、COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或在其它情况下不产生抗体的骨髓瘤细胞，以产生单克隆抗体。
4.2.1人源化抗体
可以通过用相应的人抗体序列替换单克隆抗体的大部分或全部结构部分来产生人源化抗体。因此，产生其中只有抗原特异性变体或CDR由非人序列组成的杂合分子。获得人源化抗体的方法包括例如Winter和Milstein,Nature,1991,349:293-299；Rader等人,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.,1998,95:8910-8915；Steinberger等人,J.Biol.Chem.,2000,275:36073-36078；Queen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1989,86:10029-10033；及美国专利号5,585,089；5,693,761；5,693,762；和6,180,370中描述的那些方法；每篇的全部内容通过引用并入。
4.2.2.人抗体
可以通过本领域已知的多种技术产生人抗体，例如通过使用转基因动物(例如人源化小鼠)来产生。参见例如Jakobovits等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1993,90:2551；Jakobovits等人,Nature,1993,362:255-258；Bruggermann等人,Year in Immuno.,1993,7:33；及美国专利号5,591,669、5,589,369和5,545,807；其全部内容通过引用并入本文。人抗体也可以源自噬菌体展示文库(参见例如Hoogenboom等人,J.Mol.Biol.,1991,227:381-388；Marks等人,J.Mol.Biol.,1991,222:581-597；和美国专利号5,565,332和5,573,905)；每篇的全部内容通过引用并入。人抗体也可以通过体外活化的B细胞产生(参见例如美国专利号5,567,610和5,229,275，每篇的全部内容通过引用并入)。人抗体也可以源自基于酵母的文库(参见例如美国专利号8,691,730，其全部内容通过引用并入)。
4.3.备选支架
可以通过本领域已知的任何方法来制备备选支架。
例如，在Emanuel等人，mAbs,2011,3:38-48(其全部内容通过引用并入)中描述了制备AdnectinsTM的方法。制备iMab的方法描述于美国专利号2003/0215914，其全部内容通过引用并入。制备的方法描述于Vogt和Skerra,Chem.Biochem.,2004,5:191-199，其全部内容通过引用并入。制备Kunitz结构域的方法描述于Wagner等人，Biochem.&Biophys.Res.Comm.,1992,186:118-1145，其全部内容通过引用并入。Geyer和Brent,Meth.Enzymol.,2000,328:171-208(其全部内容通过引用并入)中提供了制备硫氧还蛋白肽适体的方法。Fernandez,Curr.Opinion in Biotech.,2004,15:364-373(其全部内容通过引用并入)中提供了亲和体的制备方法。Zahnd等人，J.Mol.Biol.,2007,369:1015-1028(其全部内容通过引用并入)中提供了制备DARPins的方法。在Ebersbach等人，J.Mol.Biol.,2007,372:172-185(其全部内容通过引用并入)中提供了制备Affilins的方法。在Graversen等人,J.Biol.Chem.,2000,275:37390-37396(其全部内容通过引用并入)中提供了制备四连接素的方法。在Silverman等人,Nature Biotech.,2005,23:1556-1561(其全部内容通过引用并入)中提供了制备高亲和性多聚体的方法。
在Binz等人,Nat.Biotechnol.,2005 23:1257-1268；及Skerra,Current Opin.inBiotech.,2007 18:295-304(每篇的全部内容通过引用并入)中提供了关于备用支架的更多信息。
4.4.融合蛋白
可以使用本领域已知的标准分子生物学方法制备融合蛋白。通常，合成编码两种或更多种待融合的蛋白质，例如两种或更多种ABM的多核苷酸序列。设计多核苷酸序列使得多核苷酸序列的转录和翻译导致包含两种或更多种蛋白质(例如ABM)的多肽链的表达。该多肽链被称为“融合蛋白”。融合蛋白的一个说明性实例是与scFv融合的IgG重链。
可以设计编码融合蛋白的多核苷酸序列，使得待融合的蛋白质彼此直接连接，或经由氨基酸或多肽接头彼此连接。在一些实施方案中，融合蛋白中的一个蛋白质的N末端直接跟随融合蛋白中另一个蛋白质的C末端。在一些实施方案中，在构成融合蛋白的至少两种蛋白质之间存在单个氨基酸。在一些实施方案中，在构成融合蛋白的至少两种蛋白质之间存在多肽接头。
提供了产生具有与其重链融合的scFv的免疫球蛋白的方法，例如在Coloma和Morrison，Nature Biotechnol.,1997,15:159-163(其全部内容通过引用并入)中。提供了产生具有与其轻链融合的scFv的免疫球蛋白的方法，例如在Orcutt等人,Protein Eng.,2010,23:221-228(其全部内容通过引用并入)中。
例如在Joosten等人,Microbial Cell.Factories,2003,2:1；以及Powers等人,J.Immunol.Meth.,2001,251:123-136(每篇的全部内容通过引用并入)中提供了在酵母和丝状真菌中产生抗体融合蛋白的方法。产生scFv-Fc融合蛋白的方法描述于例如Ono等人,J.Biosci.&Bioeng.,2003,95:231-238；以及Kamihara等人,J.Virology,2005,79:10864-10874；每篇的全部内容通过引用并入。用于产生scFv融合蛋白的无细胞方法描述于例如Kanter等人，Blood,2007,109:3393-3399中，其全部内容通过引用并入。
4.5.多肽接头
任何合适的多肽接头可用于将MIAC的ABM彼此连接，并且熟练技术人员能够基于ABM的性质和MIAC的应用来选择合适的多肽接头。合适的接头组成是本领域已知的并且在本公开的其它部分中描述。可以通过评估不同接头长度对ABM的亲和力和MIAC的生物活性的影响来进行合适的接头长度的选择。合适的接头长度的确定完全在本领域技术人员的能力之内。
作为一个说明性实例，在一些实施方案中，可以通过测试具有以下组成和长度的五个接头来确定合适的接头长度：(2)(GGGGS)(SEQ ID NO:25)；(2)(GGGGS)2(SEQ ID NO:26)；(3)(GGGGS)3(SEQ ID NO:23)；(4)(GGGGS)4(SEQ ID NO:24)；和(5)(GGGGS)5(SEQ IDNO:27)。可以将五个接头中的每一个评估为MIAC的每个ABM之间的连接，并且可以选择提供最佳ABM亲和力、MIAC生物活性、产量等的连接以包含在MIAC中。仅为了说明的目的而提供上述接头，并且如本领域技术人员将认识到的，所评估的接头的组成和长度可以以任何合适的方式变化。
在一些实施方案中，多肽接头由多核苷酸编码，所述多核苷酸也编码由多肽接头连接的两个或更多个ABM(例如，融合蛋白)。此类多核苷酸可以通过装配或合成编码第一ABM、第一多肽接头和第二ABM的多核苷酸来产生。在一些实施方案中，多核苷酸可进一步编码第二多肽接头和第三ABM。然后，可以根据本文中提供的和本领域已知的方法来表达多核苷酸以产生包含由接头连接的两个或更多个ABM的融合蛋白。
在一些实施方案中，分别表达ABM，并且使用多肽接头在表达后将两个或更多个ABM彼此连接。在此类实施方案中，在适合于在第一ABM和第一多肽接头之间形成化学键的条件下，将第一ABM与第一多肽接头接触。然后在适合于在第一多肽接头和第二ABM之间形成化学键的条件下，将第二ABM与由第一ABM和第一多肽接头形成的缀合物接触。可以通过利用类似的技术将另外的ABM与第一和/或第二ABM或与第一接头缀合。例如，在Hermanson,Bioconjugate Techniques,2013,第3版,Academic Press,London,UK,Waltham MA,andSan Diego,CA(其全部内容通过引用并入)中提供了适用于在多肽接头和ABM之间形成化学键的条件。
4.6.化学偶联
在一些实施方案中，分别表达ABM，并且使用多肽接头以外的化学偶联试剂在表达后将两个或更多个ABM彼此连接。在此类实施方案中，在适合于在第一ABM和第一化学偶联试剂之间形成化学键的条件下，将第一ABM与第一化学偶联试剂接触。然后，在适合于在第一化学偶联试剂和第二ABM之间形成化学键的条件下，将第二ABM与由第一ABM和第一化学偶联试剂形成的缀合物接触。可以通过使用类似的技术将额外的ABM与第一和/或第二ABM或与第一化学偶联试剂缀合。例如，在Hermanson,Bioconjugate Techniques,2013,第3版,Academic Press,London,UK,Waltham MA,and San Diego,CA(其全部内容通过引用并入)中提供了适用于在化学偶联试剂和ABM之间形成化学键的条件。
当化学偶联MIAC时，可以使用任何合适的偶联试剂。偶联试剂包括零长度交联剂、同双功能交联剂、异双功能交联剂、三功能交联剂、树枝状聚合物和树模石(dendron)、化学选择性和生物正交试剂等。示例性合适的偶联试剂包括例如间马来酰亚胺苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺酯、戊二醛和碳二亚胺。用于化学偶联的其它合适的试剂及其使用方法描述于例如Hermanson,Bioconjugate Techniques,2013,第3版,Academic Press,London,UK,Waltham MA,and San Diego,CA，其全部内容通过引用并入。抗体彼此的化学偶联描述于例如Wong等人,Scand.J.Rheumatol.,2000,29:282-287；Jung等人,Eur.J.Immunol.,1991,21:2431-2435；Tutt等人,J.Immunol.,1991,147:60-69；French,Methods Mol.Biol.,1998,80:121-134；及Gavrilyuk等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.,2009,19:3716-3720；每篇的全部内容通过引用并入。
5.载体、宿主细胞和产生MIAC的方法
5.1.载体
本发明还提供编码MIAC的分离核酸、包含核酸的载体和宿主细胞、以及用于产生MIAC的重组技术。
对于本文中提供的MIAC的重组产生，可以分离编码MIAC的核酸并将其插入可复制载体中用于进一步克隆(即扩增DNA)或表达。在一些方面，可以通过同源重组产生核酸，例如如描述于美国专利号5,204,244，其全部内容通过引用并入。
许多不同的载体是本领域已知的。载体组分通常包括但不限于以下一个或多个：信号序列、复制起点、一个或多个标志物基因、增强子元件、启动子和转录终止序列，例如如在美国专利号5,534,615中描述，其全部内容通过引用并入。
5.2.宿主细胞
可以使用任何合适的宿主细胞来产生本文中提供的MIAC。以下提供合适的宿主细胞的说明性实例。这些宿主细胞不旨在为限制性的。
合适的宿主细胞包括任何原核(例如细菌)、低等真核生物(例如酵母)或高等真核(例如哺乳动物)细胞。合适的原核生物包括真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)如埃希氏杆菌属(Escherichia)(大肠杆菌)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)(鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium))、沙雷氏菌属(粘质沙雷氏菌(S.marcescans))、志贺氏菌属(Shigella)，芽孢杆菌属(Bacilli)(枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、假单胞菌属(Pseudomonas)(铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))和链霉菌属(Streptomyces)。一种有用的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294，尽管其它菌株如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776和大肠杆菌W3110是适合的。
除了原核生物之外，真核微生物如丝状真菌或酵母也是适合于MIAC编码载体的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母是通常使用的低等真核宿主微生物。然而，许多其它属、种和菌株是可获得的且有用的，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)(乳酸克鲁维氏酵母(K.lactis)、脆弱克鲁维氏酵母(K.fragilis)、保加利亚克鲁维氏酵母(K.bulgaricus)、威克曼氏克鲁维氏酵母(K.wickeramii)、瓦尔特克鲁维氏酵母(K.waltii)、果蝇克鲁维氏酵母(K.drosophilarum)、耐热克鲁维氏酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维氏酵母(K.marxianus))、耶氏酵母属(Yarrowia)、巴斯德驹形氏酵母属(毕赤酵母属)甲醇酵母(pastoris)；念珠菌属(Candida)(白念珠菌(C.albicans))；里氏木霉(Trichodermareesia)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)；许旺氏酵母属(Schwanniomyces)(西方许旺氏酵母(S.occidentalis))；和丝状真菌，诸如例如青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉属(Aspergillus)(构巢曲霉(A.nidulans)和黑色曲霉(A.niger))。
有用的哺乳动物宿主细胞包括COS-7细胞，HEK293细胞；幼仓鼠肾(BHK)细胞；中国仓鼠卵巢(CHO)；小鼠塞托利细胞(sertoli cell)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)等。
可以在多种培养基中培养用于制备本文中提供的MIAC的宿主细胞。可商购获得的培养基，诸如例如汉克F10(Ham's F10)、最小必需培养基(Minimal Essential Medium)(MEM)、RPMI-1640和达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle'sMedium)(DMEM)适用于培养宿主细胞。此外，可以使用Ham等人,Meth.Enz.,1979,58:44；Barnes等人,Anal.Biochem.,1980,102:255；和美国专利号4,767,704、4,657,866、4,927,762、4,560,655和5,122,469或WO90/03430和WO 87/00195中描述的任何培养基。本段中引用的每篇参考文献的全部内容通过引用并入。
任何这些培养基可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素、微量元素(定义为通常以微摩尔范围内的终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等同能源。也可以以本领域技术人员已知的适当浓度包含任何其它必需的补充剂。
培养条件如温度、pH等是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些条件，并且对于本领域普通技术人员是显而易见的。
5.3产生MIAC
重组蛋白质产生的一般方法，特别是抗体产生方法可应用于本文中提供的MIAC的产生。在Al-Rubeai编,Antibody Expression and Production,2011,Springer,Heidelberg,London,New York中提供了关于抗体产生方法的进一步细节。
例如，在一些实施方案中，在细胞内，在周质空间中产生MIAC，或将MIAC直接分泌到培养基中。如果在细胞内产生MIAC，则作为第一步，例如通过离心或超滤除去颗粒碎片，即宿主细胞或裂解片段。例如，Carter等人(Bio/Technology,1992,10:163-167；其全部内容通过引用并入)描述了分离分泌到大肠杆菌周质空间中的ABM的方法。简言之，在约30分钟内，在存在乙酸钠(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)的情况下将细胞糊解冻。可以通过离心除去细胞碎片。
在一些实施方案中，在无细胞系统中产生MIAC。在一些方面，无细胞系统是Yin等人，mAbs,2012,4:217-225(其全部内容通过引用并入)中所述的体外转录和翻译系统。在一些方面，无细胞系统利用来自真核细胞或来自原核细胞的无细胞提取物。在某些方面，原核细胞是大肠杆菌。MIAC的无细胞表达可以是有用的，例如，在MIAC作为不溶性聚集体在细胞中累积的情况下，或者在来自周质表达的产率较低的情况下。
在一些实施方案中，本文中提供的MIAC由细胞表达装配。在一些实施方案中，细胞是能够分泌完全形成的、适当装配的MIAC的酵母细胞。在一些实施方案中，本文中提供的MIAC需要进一步处理(例如，在重链和/或轻链之间形成二硫键)以完成装配。来自重组表达且纯化的免疫球蛋白重链和轻链的功能性ABM的装配描述于例如Boss等人，Nucleic AcidsRes.,1984,12:3791-3806，其全部内容通过引用并入。熟练技术人员将认识到，在本公开内容中描述的其它技术中，可以将此类技术容易地适用于装配包含免疫球蛋白重链的融合蛋白和/或包含免疫球蛋白轻链的融合蛋白。
当MIAC被分泌到培养基中时，通常首先使用可商购获得的蛋白质浓缩滤器，例如或超滤单元浓缩来自此类表达系统的上清液。蛋白酶抑制剂如PMSF可以包括在任何前述步骤中以抑制蛋白水解，并且可以包括抗生素以防止外来污染物的生长。
可以使用例如羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析和亲和色谱来纯化从细胞制备的MIAC组合物，亲和色谱是特别有用的纯化技术。蛋白A作为亲和配体的适用性取决于存在于MIAC中的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1，γ2或γ4重链的MIAC(Lindmark等人，J.Immunol.Meth.,1983,62:1-13，其全部内容通过引用并入)。蛋白G可用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等人，EMBO J.,1986,5:1567-1575，其全部内容通过引用并入)。
亲和配体所连接的基质最通常是琼脂糖，但其它的基质是可用的。机械稳定的基质如可控孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯允许比用琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。当MIAC包含CH3结构域时，树脂可用于纯化。
用于蛋白质纯化的其它技术，如离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅上的色谱法、在肝素上的色谱法、色谱聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀也是可用的，并且可以由本领域技术人员应用。
在任何初步纯化步骤之后，包含目标MIAC和污染物的混合物可以使用pH为约2.5至约4.5的洗脱缓冲液进行低pH疏水相互作用色谱法，通常在低盐浓度(例如，约0至约0.25M盐)下进行。
在一些情况下，本文中所述的MIAC的各个组分可以装配形成多个分子种类。如果发生这种情况，则可以使用标准技术例如色谱法从多个中纯化期望的分子种类。
此外，可以使用诸如“钮和孔”方法的技术以有利于产生正确装配的MIAC，这将减少或消除对除去不期望的分子种类的需要。参见美国专利号5,731,168；7,695936；8642745；和8,679,785；其全部内容通过引用并入。
在一些实施方案中，产生识别超过一种抗原的ABM可以是有用的。可以使用任何合适的技术来产生此类ABM，包括上述的钮和孔方法。在一些实施方案中，识别超过一种抗原的ABM通过分离识别不同抗原的单结构域抗体，然后将它们组合成识别由单结构域抗体识别的每种不同抗原的分子来开发。例如，在一些实施方案中，将结合一种抗原的单一轻链抗体和结合另一种抗原的单一重链抗体组合以形成结合这两种抗原的完整免疫球蛋白或其片段。
也可以使用来自Zymeworks Inc.的AzymetricTM平台来产生多特异性ABMS。此类多特异性ABM及其制备方法描述于例如美国专利公开号2012/0149876；2012/0244577；2013/0195849；2013/0336973；2014/0051835；2014/0066378；2014/0072581；和2014/0200331；每篇的全部内容通过引用并入。
6.缀合物
在一些实施方案中，可以将MIAC与药剂缀合。有用的药剂包括例如治疗剂和诊断剂。在一些实施方案中，用接头将试剂与MIAC缀合。在一些方面，接头是可生物降解的接头。
本领域技术人员可以选择合适的药剂和接头。关于接头和药剂的更多信息可以参见例如Gerber等人，Nat.Prod.Rep.,2013,30:625-639；Alley等人,Current Opinion inChemical Biology,2010,14:529-537；及美国专利号5,010,176；每篇的全部内容通过引用并入。在下面讨论了另外的治疗剂，并且也可以与本文中提供的MIAC缀合。
在一些实施方案中，本文中提供的MIAC的ABM包括掩蔽部分和可切割部分。掩蔽部分抑制ABM与其靶标的结合。在切割可切割部分后减少或消除掩蔽部分的抑制活性。此类ABM表现出“可活化的”构象，使得当可切割部分未被切割时，ABM不太可接近靶标，并且在存在切割剂的情况下切割可切割部分之后变得更可接近靶标。使用掩蔽部分和可切割部分的可活化结合多肽以及获得它们的方法的实例在美国专利公开号2010/0189651；2010/0221212；2013/0101555；2013/0309230；2013/0315906；2014/0023664；2014/0045195；2014/0024810；2014；0235467；2014/0255313；和美国专利号8,399,219；8,513,390；8,518,404；8,541,203；8,529,898；8,563,269中提供；每篇的全部内容通过引用并入。
7.药物组合物和施用方法
本文中提供的MIAC可以以任何合适的药物组合物提供，并且通过任何合适的施用途径施用。合适的施用途径包括但不限于肠胃外、吸入、动脉内、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、鼻、肺和皮下途径。
药物组合物可以包含一种或多种药物赋形剂。可以使用任何合适的药物赋形剂，并且本领域普通技术人员能够选择合适的药物赋形剂。因此，下面提供的药物赋形剂旨在是说明性的而不是限制性的。另外的药物赋形剂包括例如Handbook of PharmaceuticalExcipients,Rowe等人(编),第6版(2009)(其全部内容通过引用并入)中描述的药物赋形剂。
在一些实施方案中，药物组合物包含溶剂。在一些方面，溶剂是盐溶液，如无菌等张盐水溶液或右旋糖溶液。在某些方面，溶剂是注射用水。
在一些实施方案中，药物组合物包含消泡剂。可以使用任何合适的消泡剂。在某些方面，消泡剂选自醇、醚、油、蜡、硅酮、表面活性剂及其组合。在某些方面，消泡剂选自矿物油、蔬菜油、亚乙基双硬脂酰胺、石蜡、酯蜡、脂肪醇蜡、长链脂肪醇、脂肪酸皂、脂肪酸酯、硅二醇、氟硅酮、聚乙二醇-聚丙二醇共聚物、聚二甲基硅氧烷-二氧化硅、醚、辛基醇、辛醇、脱水山梨糖醇三油酸酯、乙醇、2-乙基己醇、二甲硅油、油醇、西甲硅油及其组合。
在一些实施方案中，药物组合物包含共溶剂。共溶剂的说明性实例包括乙醇、聚(乙)二醇、丁二醇、二甲基乙酰胺、甘油和丙二醇。
在一些实施方案中，药物组合物包含缓冲液。缓冲液的说明性实例包括乙酸盐、硼酸盐、碳酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、氢氧化物、二乙醇胺、单乙醇胺、甘氨酸、甲硫氨酸、瓜尔胶和谷氨酸单钠。
在一些实施方案中，药物组合物包含载体或填充剂。载体或填充剂的说明性实例包括乳糖、麦芽糖糊精、甘露醇、山梨糖醇、壳聚糖、硬脂酸、黄原胶和瓜尔胶。
在一些实施方案中，药物组合物包含表面活性剂。表面活性剂的说明性实例包括d-α生育酚、苯扎氯铵、苄索氯铵、十六烷基三甲基溴化铵(cetrimide)、西吡氯铵(cetylpyridinium chloride)、多库酯钠、山嵛酸甘油酯、单油酸甘油酯、月桂酸、聚乙二醇15羟基硬脂酸酯(macrogol 15hydroxystearate)、肉豆蔻醇、磷脂、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯(polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters)、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚氧乙烯甘油酯(polyoxylglycerides)、月桂基硫酸钠、脱水山梨糖醇酯和维生素E聚乙(二醇)琥珀酸酯。
在一些实施方案中，药物组合物包含抗结块剂。抗结块剂的说明性实例包括磷酸钙(三碱式)、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素和氧化镁。
可以与药物组合物一起使用的其它赋形剂包括例如白蛋白、抗氧化剂、抗细菌剂、抗真菌剂、生物可吸收聚合物、螯合剂、控制释放剂、稀释剂、分散剂、溶解增强剂、乳化剂、胶凝剂、软膏基质、渗透促进剂、防腐剂、增溶剂、溶剂、稳定剂和糖。每种这些药剂的具体实例描述于例如Handbook of Pharmaceutical Excipients,Rowe等人(编)第6版(2009),Pharmaceutical Press，其全部内容通过引用并入。
在一些实施方案中，药物组合物为颗粒形式，如微粒或纳米颗粒。微粒和纳米颗粒可以由任何合适的材料，如聚合物或脂质形成。在一些方面，微粒或纳米颗粒是胶束、脂质体或聚合物体(polymersomes)。在某些实施方案中，本文中提供的组合物是药物组合物或单一单位剂型。本文中提供的药物组合物和单一单位剂型包含预防或治疗有效量的一种或多种预防或治疗性MIAC。
本文还包括包含MIAC的无水药物组合物和剂型，因为水可促进一些MIAC的降解。
可以使用含有无水或低水分的成分和低水分或低湿度条件来制备本文中提供的无水药物组合物和剂型。如果预期在制备、包装和/或储存期间与水分和/或湿气实质性接触，则包含乳糖和至少一种包含伯胺或仲胺的活性成分的药物组合物和剂型可以是无水的。
应制备和储存无水药物组合物，使得维持其无水性质。因此，可以使用已知防止暴露于水的材料来包装无水组合物，使得它们可以包含在合适的配方试剂盒中。合适的包装的实例包括但不限于气密密封的箔、塑料、单位剂量容器(例如小瓶)、泡罩包装和带状包装。
7.1.肠胃外剂型
在某些实施方案中，提供包含MIAC的肠胃外剂型。肠胃外剂型可以通过各种途径施用于受试者，包括但不限于皮下、静脉内(包括推注)、肌肉内和动脉内。因为它们的施用通常绕过受试者对污染物的天然防御，所以肠胃外剂型通常在施用于受试者之前是无菌的或能够被灭菌。肠胃外剂型的实例包括但不限于准备注射的溶液、准备溶解或悬浮在药学上可接受的注射用载体中的无水产品、准备注射的混悬液和乳液。
可用于提供肠胃外剂型的合适载体是本领域技术人员熟知的。实例包括但不限于：注射用水USP；水性媒介物，如但不限于氯化钠注射液、林格氏注射液(Ringer'sInjection)、右旋糖注射液、右旋糖和氯化钠注射液、以及乳酸林格氏注射液；水混溶性载体，如但不限于乙醇、聚乙二醇和聚丙二醇；和非水性载体，如但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯。
增加本文公开的一种或多种MIAC的溶解度的赋形剂也可以掺入到肠胃外剂型中。
8.测定法
可以使用任何合适的体外或体内活性测定法评估本文中提供的MIAC的活性。在一些实施方案中，这些测定法可以适用于高通量方法，以使得能够高效探询大量的MIAC构建体。
在一些实施方案中，测定法测量效应细胞的增殖。任何合适的测定法可用于测量效应细胞的增殖。用于测量效应细胞增殖的合适测定法包括例如3H-胸苷掺入、CFSE(羧基荧光素琥珀酰亚胺酯)稀释测定和Ki67抗原表达的抗体检测。参见Gong和Klingemann,,Leukemia,1994,8:652-658；Parish,Immunol.Cell Biol.,1999,77:499-508；及Lyons,J.Immunol.Methods,2000,243:147-154,及Soares,J.Immunol.Methods,2010,362(1-2):43-50；每篇的全部内容通过引用并入。
在一些实施方案中，测定法测量效应细胞的刺激和/或抑制。在一些实施方案中，可以通过测量细胞因子和/或趋化因子产生来评估效应细胞的活化和/或抑制。可以测量任何合适的细胞因子和/或趋化因子的产生。在一些实施方案中，测量选自IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-12p70、IL-15、MIP-α/β、RANTES的一种或多种细胞因子和/或趋化因子的产生。任何合适的测定法可用于测量细胞因子和/或趋化因子的产生。合适的测定法包括例如BDTM流式细胞术微球阵列(Cytometric Bead Array)(CBA)测定法(BD Biosciences)、技术(Luminex Corporation)和ELISpot测定(例如，Mabtech，ProImmune)。
在一些实施方案中，测定法测定效应细胞的细胞毒性活性。任何合适的测定法可用于测量效应细胞的细胞毒性活性。用于测量效应细胞的细胞毒性活性的合适的测定法包括例如铬-51释放测定法、粒酶B ELISpot或基于Luminex的测定法、CD107a细胞表面动员(mobilization)的测量、胱天蛋白酶-3测定法、用荧光团PKH-26和TO-PRO-3碘化物的流式细胞测定法，以及ADCC测定法，如ADCC报告物生物测定法(Promega)。参见Shafer-Weaver等人,J.Transl.Med.,2003,1:14；Rininsland等人,J.Immunol.Methods,2000,240:143-155；Betts等人,J.Immunol.Methods,2003,28:65-78；Jerome等人,Apoptosis,2003,8:563-571；He等人,J.Immunol.Methods,2005,304:43-59；Lee-MacAry等人,J.Immunol.Methods,2001,252:83-92；以及Aktas等人,Cell.Immunol.,2009,254:149-154。
在一些实施方案中，测定法测量效应细胞的适应度(fitness)。任何合适的测定法可用于测量效应细胞的适应度。用于测量效应细胞适应度的合适的测定法包括例如凋亡测定法。可以使用任何合适的测定法测量凋亡，包括膜联蛋白V测定法和膜联蛋白V FITC测定法(例如，BD Biosciences)。参见Vermes等人,J.Immunol.Methods,1995,84:39-51；以及Poggi等人,J.Immunol.,2005,17:2653-2660。
9.剂量和单位剂型
在人治疗剂中，医生将根据预防或治愈性治疗以及根据对有待治疗的受试者特定的年龄、重量、状况和其它因素确定他认为最合适的剂量学。
将有效预防或治疗病症或其一种或多种症状的MIAC的量将随着疾病或病状的性质和严重程度以及施用MIAC的途径而变化。频率和剂量也将根据对于每名受试者特定的因素而变化，这取决于施用的具体疗法(例如治疗剂或预防剂)、病症、疾病或病状的严重程度、施用途径以及受试者的年龄、体重、响应以及过去的医学史。有效剂量可以从源自体外或动物模型测试系统的剂量-响应曲线推导。
在某些实施方案中，组合物的示例性剂量包括每千克受试者或样品重量的毫克或微克量MIAC(例如，每千克约10微克至每千克约50毫克、每千克约100微克至每千克约25毫克，或每千克约100微克至每千克约10毫克)。在某些实施方案中，基于为了预防、治疗、管理或改善病症或其一种或多种症状而施用的MIAC的重量，本文中提供的MIAC的剂量为0.1mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、10mg/kg或15mg/kg或更多的受试者的体重。在另一个实施方案中，本文中提供的为了预防、治疗、管理或改善受试者的病症或其一种或多种症状而施用的MIAC的剂量是0.1mg至200mg、0.1mg至100mg、0.1mg至50mg、0.1mg至25mg、0.1mg至20mg、0.1mg至15mg、0.1mg至10mg、0.1mg至7.5mg、0.1mg至5mg、0.1至2.5mg、0.25mg至20mg、0.25至15mg、0.25至12mg、0.25至10mg、0.25mg至7.5mg、0.25mg至5mg、0.25mg至2.5mg、0.5mg至20mg、0.5至15mg、0.5至12mg、0.5至10mg、0.5mg至7.5mg、0.5mg至5mg、0.5mg至2.5mg、1mg至20mg、1mg至15mg、1mg至12mg、1mg至10mg、1mg至7.5mg、1mg至5mg或1mg至2.5mg。
剂量可以根据合适的日程表施用，例如每周一次、两次、三次或四次；每月一次、两次、三次或四次；或每年一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次或十二次。如本领域普通技术人员将显而易见的，在某些情况下可以必需使用在本文公开的范围外的MIAC剂量。此外，注意到临床医生或治疗医师将知道如何以及何时结合受试者反应而中断、调整或终止治疗。
不同的治疗有效量可以适用于不同的疾病和病状，如本领域普通技术人员容易知道的。类似地，足以预防、管理、治疗或改善此类病症但不足以引起，或足以减少与本文中提供的MIAC相关的副作用的量也是由本文所述的剂量量和剂量频率日程表涵盖的。此外，当对受试者施用多剂的本文中提供的组合物时，并不是所有的剂量都需要相同。例如，可以增加施用于受试者的剂量以改善组合物的预防或治疗效果，或者可以减少它以降低特定受试者正在经历的一种或多种副作用。
在某些实施方案中，治疗或预防可以用一个或多个负载剂量的本文中提供的MIAC或组合物开始，随后是一个或多个维持剂量。
在某些实施方案中，可以施用本文中提供的MIAC或组合物的剂量以实现受试者血液或血清中MIAC的稳态浓度。稳态浓度可以根据技术人员可用的技术通过测量来确定，或者可以基于受试者的身体特征，如身高、体重和年龄。
在某些实施方案中，可以重复施用相同的组合物，并且施用可以间隔至少1天，2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月或6个月。在其它实施方案中，可以重复施用相同的预防剂或治疗剂，并且施用可以间隔至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月或6个月。
在某些实施方案中，可以与另外的治疗剂同时施用本文中提供的MIAC。说明性的进一步的治疗剂包括例如烷化剂(例如苯达莫司汀(bendamustine)、白消安(busulfan)、卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、达卡巴嗪(dacarbazine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、美法仑(melphalan)、丙卡巴肼(procarbazine)、链佐星(streptozocin)、替莫唑胺(temozolomide))；抗代谢物(例如天冬酰胺酶(asparaginase)，卡培他滨(capecitabine)，阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶、氟达拉滨(fludarabine)、吉西他滨、甲氨蝶呤、培美曲塞(pemetrexed)、雷替曲塞(raltitrexed))；抗肿瘤抗生素(例如放线菌素D、博来霉素、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、丝裂霉素、米托蒽醌)；微管抑制剂(如依托泊苷、多西他赛、伊立替康、紫杉醇、托泊替康、长春碱、长春新碱、长春瑞滨)；DNA连接剂(例如卡铂、顺铂、奥沙利铂)；生物制剂(例如阿仑单抗(alemtuzumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、本妥昔单抗(brentuximab)、西妥昔单抗(cetuximab)、尼索美珠单抗(denosumab)、伊布他珠单抗(ibritumomab)、干扰素、易普利姆玛(ipilimumab)、奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、帕尼单抗(panitumumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、利妥昔单抗(rituximab)、鲁索利替尼(ruxolitinib)、司妥昔单抗(siltuximab)、托西莫单抗(tositumomab)、曲妥珠单抗(trastuzumab))；激酶抑制剂(例如，阿法替尼(afatinib)、阿西替尼(axitinib)、博舒替尼(bosutinib)、克唑替尼(crizotinib)、达拉非尼(dabrafenib)、埃罗替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、依鲁替尼(ibrutinib)、伊马替尼(imatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、尼洛替尼(nilotinib)、帕唑帕尼(pazopanib)、帕纳替尼(ponatinib)、瑞戈非尼(regorafenib)、鲁索利替尼、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)、曲美替尼(trametinib)、凡德他尼(vandetanib)、威罗菲尼(vemurafenib))；雷帕霉素衍生物(例如雷帕霉素、西罗莫司、替西罗莫司(temsirolimus)、依维莫司、德罗莫司(deforolimus))；二膦酸盐(例如氯膦酸、伊班膦酸、帕玛二磷酸(pamidronate)、唑来膦酸)；及激素和其它药物(例如阿那曲唑、阿比特龙、氨磷汀、贝沙罗汀、比卡鲁胺、布舍瑞林、环丙孕酮、地加瑞克(degarelix)、依西美坦、氟他胺、亚叶酸、氟维司群、戈舍瑞林、兰瑞肽、来那度胺(lenalidomide)、来曲唑、亮丙瑞林、甲羟孕酮、甲孕酮、美司钠、奥曲肽、己烯雌酚、他莫昔芬、沙立度胺、曲普瑞林)。
与本文中提供的MIAC一起可用的其它治疗剂的其它实例包括阿比特龙、阿地白介素、氨基酮戊酸、阿瑞匹坦、阿那曲唑、苯达莫司汀、贝沙罗汀、比卡鲁胺、博来霉素、硼替佐米、白消安、卡巴他赛(cabazitaxel)、卡博替尼-S-苹果酸(cabozantinib-S-malate)、卡培他滨、卡铂、卡非佐米(carfilzomib)、苯丁酸氮芥、氯法拉滨、顺铂、阿糖胞苷、更生霉素、达拉非尼(dabrafenib)、达卡巴嗪、达沙替尼(dasatinib)、地西他滨(decitabine)、地加瑞克(degarelix)、地尼白介素-毒素连接物(denelukin diftitox)、右雷佐生、多西他赛，艾曲波帕(eltrombopag)、恩杂鲁胺(enzalutamide)、表柔比星、艾日布林(eribulin)、厄洛替尼、依西美坦、非格司亭、氟达拉滨、氟尿嘧啶、氟维司群、吉西他滨、谷卡匹酶(glucarpidase)、戈舍瑞林、异环磷酰胺、咪喹莫特、干扰素α-2b、伊立替康、伊沙匹隆(ixabepilone)、来那度胺、来曲唑、甲酰四氢叶酸、亮丙瑞林、洛莫司汀、氮芥、甲地孕酮、巯嘌呤、去铁胺、丝裂霉素C、诺维本、奈拉滨(nelarabine)、高三尖杉酯碱(omacetaxine)、奥沙利铂、紫杉醇、帕利夫明(palifermin)、帕洛诺司琼(palonosetron)、帕玛二磷酸、培美曲塞、普乐沙福(plerixafor)、泊马度胺(pomalidomide)、帕纳替尼(ponatinib)、普拉曲沙(pralatrexate)、丙卡巴肼、雷洛昔芬、拉布立酶、罗米地辛(romidepsin)、罗米司亭(romiplostim)、替莫唑胺、托泊替康、托瑞米芬、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、伏立康胺(vorinostat)、维莫德吉(vismodegib)和唑来膦酸。
这些药剂可以与本文中提供的MIAC共施用，或根据任何合适的日程表施用。在一些实施方案中，将药剂与本文中提供的MIAC一起配制成单位剂型。在一些实施方案中，将药剂与本文中提供的MIAC缀合。
10.治疗应用
对于治疗应用，将本发明的MIAC以药学上可接受的剂型(如本领域已知的那些剂型和上述讨论的那些剂型)施用于哺乳动物，通常为人。例如，可以静脉内以推注或者通过一段时间内连续输注、通过肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内或瘤内途径对人施用本发明的MIAC。还通过肿瘤周围、病灶内或损伤周围路径适当地施用MIAC，以施加局部和全身性治疗效果。腹膜内途径可以特别有用，例如在卵巢肿瘤的治疗中。
本文中提供的MIAC可用于治疗靶向效应细胞活化具有治疗益处的任何疾病或病状，如癌症。
可以用本文中提供的MIAC治疗任何合适的癌症。示例性合适的癌症包括例如急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、急性髓样白血病(AML)、肾上腺皮质癌、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、脑肿瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、未知原发性起源癌、心脏肿瘤、宫颈癌、脊索瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性骨髓增生性赘生物、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、导管癌、胚胎性肿瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、鼻腔神经胶质瘤、纤维组织细胞瘤、尤因肉瘤、眼癌、生殖细胞肿瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠类癌肿瘤、胃肠基质肿瘤、妊娠滋养细胞疾病、神经胶质瘤、头颈癌、毛细胞白血病、肝细胞癌、组织细胞增多症、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞瘤、卡波西肉瘤、肾癌、朗格汉斯细胞组织细胞增多症、喉癌、白血病、唇和口腔癌、肝癌、原位小叶癌、肺癌、淋巴瘤、巨球蛋白血症、恶性纤维组织细胞瘤、黑素瘤、默克尔细胞癌、间皮瘤、隐匿性原发性转移性鳞状颈癌、涉及NUT基因的中线道癌、口腔癌、多发性内分泌赘生物综合征、多发性骨髓瘤、蕈样肉芽肿病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性赘生物、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状瘤病、副神经节瘤、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌瘤、唾液腺癌、塞扎里综合征、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、脊髓肿瘤、胃癌、T细胞淋巴瘤、畸胎样瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、阴道癌、外阴癌和维尔姆斯瘤。
在一些实施方案中，本文中提供了治疗具有疾病的受试者的方法，其包括向所述受试者施用有效量的MIAC。在一些实施方案中，本文中提供了治疗具有疾病的受试者的方法，其包括向所述受试者施用有效量的包含MIAC的药物组合物。在某些方面，疾病是癌症。
在一些实施方案中，本文中提供了杀死癌细胞的方法，其包括使所述癌细胞与MIAC接触，其中所述MIAC活化杀死所述癌细胞的效应细胞。在一些实施方案中，该方法是体外方法。在一些实施方案中，该方法是体内方法。
还提供了活化效应细胞的方法，其包括使效应细胞与MIAC接触，其中MIAC活化效应细胞。在一些实施方案中，该方法是体外方法。在一些实施方案中，该方法是体内方法。在一些方面，该方法在癌细胞附近进行。在一些方面，接近性近得足以使效应细胞施加针对癌细胞的细胞毒性活性。
11.诊断应用
在一些实施方案中，本文中提供的MIAC用于诊断应用。例如，可以用可检测部分标记MIAC。合适的可检测部分包括但不限于放射性同位素、荧光标记物和酶-底物标记物。
12.试剂盒
在一些实施方案中，本文中提供的MIAC以试剂盒的形式提供。在一些实施方案中，试剂盒包含预定量的试剂的包装组合以及用于进行程序的说明书。在一些实施方案中，该程序是治疗程序。在其它实施方案中，该程序是诊断测定法。在其它实施方案中，该程序是研究测定法。
在一些实施方案中，试剂盒还包含用于重构MIAC的溶剂。在一些实施方案中，MIAC以药物组合物的形式提供。在一些实施方案中，药物组合物是冻干药物组合物。
实施例
实施例1：MIAC1：靶向CD30、CD137和抑制性KIR的IgG-scFv-scFv MIAC
用以下抗原结合模块制备如本文中所述的MIAC。ABM1结合CD30(即一种经典的霍奇金淋巴瘤和全身性间变性大细胞淋巴瘤中表达的蛋白质)。ABM2结合并激动CD137，即由效应细胞表达的活化性受体。ABM3结合并拮抗由效应细胞表达的抑制性KIR受体。
在本实施例中，ABM1是来自本妥昔单抗的IgG。ABM2是由乌瑞鲁单抗(urelumab)(Bristol-Myers Squibb)产生的scFv。ABM3是由利鲁单抗(lirilumab)(InnatePharma)产生的scFv。使用重链和轻链之间的(GGGGS)4(SEQ ID NO:24)接头，通过标准技术装配scFv。以两个顺序(即VH-接头-VL和VL-接头-VH)装配scFv。参见Plückthun A.(1994)。来自大肠杆菌的抗体。于Rosenberg M.&Moore G.P.(编),The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies第113卷(第269-315页)。
使用标准分子生物学技术装配编码三种ABM的核酸和适当的融合蛋白。本实施例中使用的融合蛋白包括(1)VH-ABM2融合物、(2)VH-ABM3融合物、(3)VL-ABM2融合物和(4)VL-ABM3融合物。
在本实施例中，存在两个ABM1位点，其由IgG的四个可变结构域(两个VH和两个VL)形成。ABM2和ABM3位点的数目如下所述变化。本实施例的MIAC还含有由IgG的Fc区形成的ABM4。如在本公开的其它地方所述，该结构域能够集合表达Fc受体的效应细胞，如NK细胞。
合成编码十种不同类型的MIAC(称为1.1至1.10)的核酸，并且转染到CHO细胞中。使用蛋白A柱表达和纯化MIAC。图2A中显示了MIAC 1.1。图2B中显示了MIAC 1.2。图2C中显示了MIAC 1.3。图2D中显示了MIAC 1.4。图3A中显示了MIAC 1.5。图3B中显示了MIAC 1.6。图3C中显示了MIAC 1.7。图3D中显示了MIAC 1.8。图4A中显示了MIAC 1.9。图4B中显示了MIAC 1.10。
在体外和体内对MIAC测试其活化NK细胞和破坏癌细胞和肿瘤的能力。体外测定法包括通过测量CD16的下调、CD69的上调、LAMP1+细胞的百分比、干扰素γ释放、7-AAD阳性细胞的百分比和暴露于MIAC后的增殖，以及在存在MIAC的情况下杀死暴露于效应细胞的Raji细胞来监测NK细胞的活化。通过用本文中提供的MIAC处理具有诱导的肿瘤或肿瘤异种移植物的动物进行体内测定法。
通过3H-胸苷评估效应细胞的增殖。使用BDTM流式细胞术微球阵列(CBA)测定法来测量IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-12p70、IL-15、MIP-α/β和RANTES的浓度，通过测量细胞因子和趋化因子分泌来测量效应细胞的刺激。通过铬-51释放测定法、粒酶B ELISpot测定法、测量CD107a细胞表面动员、胱天蛋白酶-3测定法和用荧光团PKH-26和TO-PRO-3碘化物的流式细胞测定法测量细胞毒性活性。使用膜联蛋白V FITC测定法测量效应细胞的适合度。
实施例2：MIAC2：靶向CD20、NKG2D和抑制性KIR的IgG-scFv-scFv MIAC
用以下抗原结合模块制备如本文中所述的MIAC。ABM1结合CD20，一种在B细胞表面上表达的与B细胞淋巴瘤和白血病的治疗有关的蛋白质。CD20的ABM的一个实例是利妥昔单抗。ABM2结合并激动NKG2D，即由效应细胞表达的活化性受体。ABM3结合并拮抗由效应细胞表达的抑制性KIR受体。
如实施例1所述合成和表征MIAC 2.1至2.10(对应于图2A至4B中提供的MIAC)。
实施例3：MIAC3：靶向CD20、NKG2D和抑制性KIR的scFv-IgG-scFv和scFv-scFv-IgGMIAC
用以下抗原结合模块制备如本文中所述的MIAC。ABM1结合CD20，一种在B细胞表面上表达的与B细胞淋巴瘤和白血病的治疗有关的蛋白质。ABM2结合并激动NKG2D，即由效应细胞表达的活化性受体。ABM3结合并拮抗由效应细胞表达的抑制性KIR受体。
产生这种MIAC的两种构造。在第一种构造中，ABM1是scFv，ABM2是IgG，并且ABM3是scFv(MIAC3.1)。图5A中描绘了该MIAC的实例。在第二种构造中，ABM1是scFv，ABM2是scFv，并且ABM3是IgG(MIAC3.2)。图5B中描绘了该MIAC的实例。
实施例4：MIAC4：靶向CD20、NKG2D和抑制性KIR的scFv-scFv-scFv MIAC
用以下抗原结合模块制备如本文中所述的MIAC。ABM1结合CD20，一种在B细胞表面上表达的与B细胞淋巴瘤和白血病的治疗有关的蛋白质。ABM2结合并激动NKG2D，即由效应细胞表达的活化性受体。ABM3结合并拮抗由效应细胞表达的抑制性KIR受体。
在此MIAC中，ABM1、ABM2和ABM3中的每一种是scFv。MIAC表达为具有在N末端的ABM1、在中间的ABM2和在C末端的ABM3的融合蛋白。图6中描绘了此MIAC的一个实例。
实施例5：MIAC5：靶向CD20和NKG2D的IgG-scFv MIAC
用以下抗原结合模块制备如本文中所述的MIAC。ABM1结合CD20，一种在B细胞表面上表达的与B细胞淋巴瘤和白血病的治疗有关的蛋白质。ABM2结合并激动NKG2D，即由效应细胞表达的活化性受体。
如实施例1所述合成和表征MIAC 5.1至5.6(对应于图11A-B、12A、13A-B和14A中提供的MIAC)。
实施例6：MIAC6：靶向CD20和抑制性KIR的IgG-scFv MIAC
用以下抗原结合模块制备如本文中所述的MIAC。ABM1结合CD20，一种在B细胞表面上表达的与B细胞淋巴瘤和白血病的治疗有关的蛋白质。ABM3结合并拮抗由效应细胞表达的抑制性受体的抑制性KIR。
如实施例1所述合成和表征MIAC 6.1至6.6(对应于图11C-D、12B、13C-D和14B中提供的MIAC)。
实施例7：MIAC7：靶向CD20和NKG2D的scFv-IgG MIAC
用以下抗原结合模块制备如本文中所述的MIAC。ABM1结合CD20，一种在B细胞表面上表达的与B细胞淋巴瘤和白血病的治疗有关的蛋白质。ABM2结合并激动NKG2D，即由效应细胞表达的活化性受体。
ABM1是scFv，一个ABM2是IgG，并且第二个ABM2是scFv(MIAC 7.1)。图15A中描绘了此MIAC的实例。如实施例1所述合成和表征MIAC。
实施例8：MIAC8：靶向CD20和抑制性KIR的scFv-IgG MIAC
用以下抗原结合模块制备如本文中所述的MIAC。ABM1结合CD20，一种在B细胞表面上表达的与B细胞淋巴瘤和白血病的治疗有关的蛋白质。ABM3结合并拮抗由效应细胞表达的抑制性受体的抑制性KIR。
ABM1是scFv，一个ABM3是IgG，并且第二个ABM3是scFv(MIAC 7.1)。图15B中描绘了此MIAC的实例。如实施例1所述合成和表征MIAC。
实施例9：MIAC9：靶向CD20和NKG2D的scFv-scFv-scFv MIAC
用以下抗原结合模块制备如本文中所述的MIAC。ABM1结合CD20，一种在B细胞表面上表达的与B细胞淋巴瘤和白血病的治疗有关的蛋白质。ABM2结合并激动NKG2D，即由效应细胞表达的活化性受体。
在此MIAC中，ABM1和ABM2中每个是scFv。MIAC表达为具有在N末端的ABM1、在中间的ABM2和在C末端的ABM2的融合蛋白。图16A中描绘了此MIAC(MIAC 9.1)的一个实例。如实施例1所述合成和表征MIAC。
实施例10：MIAC10：靶向CD20和抑制性KIR的scFv-scFv-scFv MIAC
用以下抗原结合模块制备如本文中所述的MIAC。ABM1结合CD20，一种在B细胞表面上表达的与B细胞淋巴瘤和白血病的治疗有关的蛋白质。ABM3结合并拮抗由效应细胞表达的抑制性受体的抑制性KIR。
在此MIAC中，ABM1和ABM3中每个是scFv。MIAC表达为具有在N末端的ABM1、在中间的ABM3和在C末端的ABM3的融合蛋白。图16B中描绘了此MIAC(MIAC 10.1)的实例。如实施例1所述合成和表征MIAC。
实施例11：MIAC11：靶向CD20、NKG2D和抑制性KIR的基于scFv-IgG的MIAC
用以下抗原结合模块制备如本文中所述的MIAC。ABM1结合CD20，一种在B细胞表面上表达的与B细胞淋巴瘤和白血病的治疗有关的蛋白质。ABM2结合并激动NKG2D，即由效应细胞表达的活化性受体。ABM3结合并拮抗由效应细胞表达的抑制性受体的抑制性KIR。
在此MIAC中，ABM1是scFv。ABM2和3是基于IgG的分子的可变结构域。在一个实施方案(图17A；MIAC 11.1)中，ABM3结合位点是基于IgG的分子上最N末端的结合位点。在另一个实施方案(图17B；MIAC 11.2)中，ABM2结合位点是基于IgG的分子上最N末端的结合位点。如实施例1所述合成和表征MIAC。
实施例12：MIAC12：靶向CD20和NKG2D或抑制性KIR的基于scFv-IgG的MIAC
用以下抗原结合模块制备如本文中所述的MIAC。ABM1结合CD20，一种在B细胞表面上表达的与B细胞淋巴瘤和白血病的治疗有关的蛋白质。ABM2结合并激动NKG2D，即由效应细胞表达的活化性受体。ABM3结合并拮抗由效应细胞表达的抑制性受体的抑制性KIR。MIAC含有ABM2或ABM3，但非两者。
在此MIAC中，ABM1是scFv。ABM2和3是基于IgG的分子的可变结构域。在一个实施方案(图18A；MIAC 12.1)中，ABM2结合位点由基于IgG的分子形成。在另一个实施方案(图18B；MIAC 12.2)中，ABM3结合位点由基于IgG的分子形成。如实施例1所述合成和表征MIAC。
实施例13：MIAC13：靶向CD30、CD137和PD-1的scFv-IgG MIAC
用以下抗原结合模块制备如本文中所述的MIAC。ABM1结合CD30，即一种经典的霍奇金淋巴瘤和全身性间变性大细胞淋巴瘤中表达的蛋白质。ABM2结合并激动CD137，即由效应细胞表达的活化性受体。ABM3结合并拮抗PD-1抑制性KIR，即由效应细胞表达的抑制性受体。
在此MIAC中，ABM1是IgG。ABM2和3是scFv。如图19所示，将ABM 2和3scFv连接到形成ABM1的IgG的重链的C末端。在SEQ ID NO：1-3中提供了两条重链和轻链的序列。
如实施例1所述合成和表征MIAC。
实施例14：MIAC14：靶向CD30、CD137和PD-1的基于scFv-IgG的MIAC
用以下抗原结合模块制备如本文中所述的MIAC。ABM1结合CD30，即一种经典的霍奇金淋巴瘤和全身性间变性大细胞淋巴瘤中表达的蛋白质。ABM2结合并激动由效应细胞表达的活化性受体CD137。ABM3结合并拮抗PD-1抑制性KIR，即由效应细胞表达的抑制性受体。
如图20中描绘，在此MIAC中，将两个ABM1scFv连接到IgG样分子的重链的C末端。IgG样分子的N末端区域包含形成两个ABM2结合位点的VH-VL区域和形成两个ABM3结合位点的VH-VL区域。在此MIAC中，ABM3结合位点是由IgG样分子形成的最N末端ABM。在SEQ ID NO:5-6中提供了重链和轻链的序列。
如实施例1所述合成和表征MIAC。
实施例15：示例性单特异性、双特异性和三特异性MIAC构建体的制备
制备许多靶向肿瘤相关抗原、检查点受体和活化性受体的单个或组合的示例性单特异性、双特异性和三特异性MIAC构建体，如下所述。图21中显示了示例性抗体形式的表示。对于双特异性构建体，通过(G4S)3接头(SEQ ID NO:23)将针对靶标1的scFv遗传融合到针对靶标2的全长IgG1抗体重链的C末端。对于三特异性构建体，通过(G4S)3接头(SEQ IDNO:23)将针对靶标1和2的scFv分别遗传融合到针对靶标3的全长IgG1抗体的重链和轻链的C末端。对于含有抗CD3结合结构域的构建体，将Fc结构域中的氨基酸N297突变为丙氨酸以防止N-连接的糖基化并降低ADCC。
示例性的单特异性、双特异性和三特异性构建体
如表A-C中所示制备示例性单特异性、双特异性和三特异性抗体构建体。
表A：示例性单特异性蛋白质
表B：示例性双特异性蛋白质
表C：示例性三特异性蛋白质
通过DNA2.0(Menlo Park,CA)合成编码每个单特异性、双特异性和三特异性构建体的轻链和重链的基因，并克隆到其pD2610.v10表达载体中。使用Qiagen Maxiprep Plus试剂盒按照制造商的说明书，将质粒放大并纯化。
实施例16：示例性单特异性、双特异性和三特异性MIAC构建体的小试规模表达和纯化
通过DNA2.0(Menlo Park，CA)将最终的基因产物亚克隆到商业哺乳动物表达载体pD2610-v1或pD2610-v10(DNA2.0，Menlo Park，CA)中，并通过在人胚胎肾293(HEK-293)细胞系中瞬时转染表达。
用于蛋白质表达的HEK-293细胞是来自Thermo-Fisher Scientific的可商购获得的“Expi293表达系统”中提供的那些HEK-293细胞。根据制造商的推荐进行转染和表达。简言之，在脂质-DNA复合物混合物的指数生长期间，以200至300万个细胞/ml转染Expi293细胞。在“Expi293表达系统试剂盒”中提供所使用的脂质转染试剂，并以商标名称“ExpiFectamine 293试剂”为人所知。使用无内毒素的DNA制备试剂盒，如Qiagen Endo-free Maxi试剂盒制备用于转染的DNA。用于转染的DNA的最终量为每毫升转染培养体积1ugDNA，即30μg总DNA用于30ml表达体积。由于最终蛋白质由至少两种从不同质粒单独表达的蛋白质序列(即最少为重链和轻链)组成，确定质粒组合的最佳比率。例如，为了确定形成异二聚体的最佳浓度范围，将DNA以重链A(HC-A)、轻链(LC)和重链B(HC-B)的最佳DNA比率转染，所述最佳DNA比率允许异二聚体形成(例如HC-A/HC-B/LC比率＝40:40:20(PID94就是如此)。4-5天后收获经转染的细胞，以4000rpm离心后收集培养基，并使用0.45μm滤器澄清。
将澄清的培养基加载到Pierce蛋白-A琼脂糖填充柱(Thermo-Fisher)上，并用10个柱体积的pH7.2的PBS缓冲液清洗。用10个柱体积的柠檬酸盐缓冲液(pH 3.6)洗脱抗体，用pH8.0的TRIS中和含有抗体的合并级份。
为了表征蛋白质-A洗脱的抗体试剂的质量，通过分析级凝胶过滤(SEC)分析样品。为此，通过使用20mM磷酸钠、400mM氯化钠，pH 7.0作为流动相的Agilent Technologies1200系列HPLC在YMC-Pack Diol-200柱(YMC Ltd，Kyoto，Japan)上运行5至20μg蛋白质。使用所获得的色谱图计算装配的单、双和三特异性抗体试剂的目标峰(POI)的百分比。
根据凝胶过滤(SEC)需要，进一步纯化蛋白A抗体洗脱液。对于凝胶过滤，将约1mg的抗体混合物浓缩至1mL，并通过AKTA Pure FPLC以1mL/min的流速加载到Superose6Increase 10/300GL柱(GE Healthcare)上。以流速1mL/min使用pH 7.4的PBS缓冲液。收集与纯化的抗体对应的级分，浓缩至～1mg/mL，并且通过0.2μm滤器过滤灭菌。通过分析凝胶过滤表征所得材料，如前段中所述。下面的表D例示了生成的许多最终抗体试剂的POI百分比。图22描绘了用于单(PID3)、双(PID128)和三特异性(PID130)抗体试剂的分析凝胶过滤色谱图。
表D.分析凝胶过滤表征
试剂 ％POI
PID2(PD-1) 99.1
PID3(Her2) 94.6
PID90<sup>1</sup>(CD137) 97.0
PID127<sup>16</sup>(CD3<sup>无糖</sup>) 100.0
PID92<sup>6</sup>(Her2/CD137) 95.0
PID128<sup>23</sup>(Her2/CD3<sup>无糖</sup>) 94.2
PID130<sup>75</sup>(Her2/CD3<sup>无糖</sup>/PD-1) 92.2
实施例17：通过ForteBio 对示例性单特异性、双特异性和三特异性MIAC构建体的抗原结合分析
单独的抗原结合
使用ForteBio Octet分析MIAC构建体的抗原结合。重组人PD-1Fc、Her2Fc、CD137Fc融合蛋白购自Sino Biological，并且加His标签的重组人CD3ε来自AcroBiosystems。所有抗原在PBS中以0.25ug/ul的终浓度重构。为了分析PD-1、Her2和CD137结合，将抗原(在Fortebio Kinetics缓冲液中100nM)固定在蛋白A传感器上3分钟，随后通过将传感器浸入300nM利妥昔单抗中10分钟来阻断传感器上的潜在的游离结合位点。通过将传感器浸入100nM MIAC构建体中5分钟进行缔合，并且在空白动力学缓冲液中发生解离5分钟。对于CD3ε结合，将抗原固定在Ni-NTA传感器上；在50nM MIAC构建体中进行缔合。使用ForteBio数据分析9.0软件分析结合数据。在图23中显示了代表性的结合传感图。测量的亲和力总结在表E中。该数据显示结合超过一个靶标的四个测试的MIAC中的每个可以同时结合每个靶标。该数据还显示在同时结合条件下，MIAC结合亲和力范围为0.12至1.66nM。
表E.结合亲和力
实施例18：通过流式细胞术分析人乳腺癌细胞系中Her2和PD-L1表达
为了鉴定在其中评估示例性Her2靶向性MIAC的生物学活性的相关细胞系，我们通过流式细胞术对一组癌细胞系筛选了Her2和PD-L1(程序性死亡配体-1)表面表达。图24中的结果显示JIMT1细胞系具有较高的Her2表达，并在其表面上表达免疫抑制分子，程序性死亡配体-1(PD-L1；CD274)。基于这些发现，选择JIMT1细胞用于示例性Her2靶向性MIAC的体外功能评估。
实施例19：通过流式细胞术对示例性Her2靶向性MIAC与肿瘤细胞的结合分析
通过流式细胞术分析示例性MIAC构建体与Her2+JIMT1细胞表面的结合。如下进行实验。
在存在增加浓度(0、0.01、0.1、1.0nM)的双特异性和三特异性Her2靶向性MIAC(PID92[Her2/CD137]、PID128[Her2/CD3]、PID130[Her2/CD3/PD-1])或针对Her2(阳性对照)或CD3(阴性对照)的对照抗体的情况下孵育悬浮液中的JIMT1细胞30分钟。清洗细胞，然后与第二荧光团标记的检测抗体(抗人IgG1-AF488)孵育20分钟。在最终清洗后，使用BDFortessa流式细胞仪分析按平均荧光强度(MFI)计的蛋白质的结合。
如图25中所示，所有三个示例性MIAC显示与JIMT1细胞的可检测的浓度依赖性结合。MIAC结合的水平低于用抗Her2阳性对照抗体观察到的水平，表明Her2结合性scFv与抗体重链C末端的连接可以已经导致Her2抗原结合亲和力(affinity)/亲和力(avidity)的降低。认为由MIAC表现的细胞结合活性的水平足以评估体外生物活性。
实施例20：示例性双特异性抗Her2/抗-CD137MIAC(PID92)对人T细胞/JIMT1肿瘤细胞共培养物中增殖和CD25活化标志物表达的影响
进行此实验以确定靶向Her2和CD137的示例性双特异性MIAC1增强与JIMT1肿瘤细胞共培养的人原代T细胞的增殖和活化的能力。将α-Her2/α-CD137MIAC(PID92)的应答与等摩尔浓度的拥有与MIAC相同的Fab序列的组合单特异性α-Her2和α-CD137抗体进行比较。如下进行实验。
通过Ficoll梯度离心，接着通过磁珠分离(Miltenyi Biotec)来分离CD3+T细胞。在置于与JIMT1乳腺癌细胞以10:1的比率共培养之前，用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)染料标记T细胞。将共培养物接种在用1μg/ml抗CD3抗体(克隆OKT3)预包覆的96孔微量板中，随后在存在增加浓度(0.02至20.0nM)的双特异性α-Her2/α-CD137MIAC(PID92)或等摩尔浓度的组合α-Her2和α-CD137单克隆抗体的情况下孵育72小时。在孵育期结束时，用针对CD4、CD8和CD25的荧光团标记的抗体染色后，通过流式细胞术分析CD4+和CD8+T细胞的增殖和CD25表达。增殖百分比定义为如通过CFSE信号稀释测定的经历至少一轮细胞分裂的细胞的比例。
图26中显示了CD25表达分析的结果。与单特异性α-Her2和α-CD137抗体的组合相比，双特异性MIAC在CD4+和CD8+T细胞亚群两者中刺激CD25的较高表面表达。在所测试的浓度范围内，α-Her2/α-CD137MIAC(PID92)对CD25表达的增强影响是明显的，除了所测试的最低和最高浓度(其显示了MIAC和组合处理两者的相似的表达水平)外。
图27中显示了增殖分析的结果。增殖的浓度依赖性增加在CD8+相对于CD4+T细胞中是更明显的。虽然由α-Her2/α-CD137MIAC(PID92)诱导的增殖的总体幅度与抗体组合相似，但是在2nM处存在明显的响应曲线分离，表明MIAC的效力增强。
实施例21：示例性双特异性抗Her2/抗CD137MIAC(PID92)对人T细胞/JIMT1肿瘤细胞共培养物中细胞因子产生的影响
进行此实验以确定靶向Her2和CD137的示例性双特异性MIAC增强与JIMT1肿瘤细胞共培养的人原代T细胞的细胞因子产生的能力。作为对照，将α-Her2/α-CD137MIAC(PID92)MIAC的效果与等摩尔浓度的拥有与MIAC相同的Fab序列的组合单特异性α-Her2和α-CD137抗体进行比较。
在从实施例6中所述的相同共培养实验收集的细胞培养物上清液中测定细胞因子产生。在72小时孵育期结束时，收集上清液，并且使用Luminex试剂盒(EMD Millipore)测量IFN-γ和TNF-α的水平。
图28中显示了结果。观察到IFN-γ和TNF-α两者中强烈的浓度依赖性增加，与单特异性抗体组合相比，双特异性α-Her2/α-CD137MIAC(PID92)表明显著增强的活性。
另外，进行了类似的实验以测量与Her2+SKBR3细胞共培养的T细胞的IL-2产生。发现100nM的PID92相对于等摩尔浓度的PID90增加IL-2产生大约4倍。
实施例22：示例性双特异性抗Her2/抗CD3MIAC(PID128)对人T细胞/JIMT1肿瘤细胞共培养物中增殖和CD25活化标志物表达的影响
进行该实验以确定靶向Her2和CD3的示例性双特异性MIAC增强与JIMT1肿瘤细胞共培养的人原代T细胞的增殖和活化的能力。作为对照，将α-Her2/α-CD3MIAC(PID128)MIAC的效果与等摩尔浓度的具有MIAC中含有的相同Fab序列的CD3靶向性抗体进行比较。如下进行实验。
通过Ficoll梯度离心，然后通过磁珠分离(Miltenyi Biotec)分离CD3+T细胞，并置于以10:1的比率与JIMT1乳腺癌细胞的共培养物中。将共培养物接种在96孔微量板中，然后在存在增加浓度(0.02至20.0nM)的双特异性α-Her2/α-CD3MIAC(PID128)MIAC或等摩尔浓度的抗CD3单克隆抗体的情况下孵育72小时。在孵育期结束时，用针对Ki67(细胞内增殖标志物)、CD8和CD25的荧光团标记的抗体染色后，通过流式细胞术分析T细胞的增殖和CD25表面表达。
在图29中显示了增殖和CD25表达分析的结果。双特异性α-Her2/α-CD3MIAC(PID128)MIAC显著上调CD25的T细胞增殖和表面表达两者，在所有测试浓度下观察到最大诱导。相比之下，抗CD3抗体的效果是远不太有力的且浓度依赖性的。
实施例23：示例性双特异性抗Her2/抗CD3MIAC(PID128)对人T细胞/JIMT1肿瘤细胞共培养物中细胞因子和粒酶B产生的影响
进行该实验以确定靶向Her2和CD3的示例性双特异性MIAC增强与JIMT1肿瘤细胞共培养的人原代T细胞的细胞因子产生的能力。作为对照，将α-Her2/α-CD3MIAC(PID128)MIAC与等摩尔浓度的拥有与MIAC相同的Fab序列的单特异性抗CD3抗体进行比较。
在从实施例8所述的相同共培养实验收集的细胞培养物上清液中测定细胞因子产生。在72小时孵育期结束时，收集上清液，并且使用Luminex试剂盒(EMD Millipore)测量IFN-γ、TNF-α和粒酶B的水平。
观察到IFN-γ和TNF-α两者中强烈的浓度依赖性增加(图30)，与单特异性CD3抗体相比，双特异性α-Her2/α-CD3MIAC(PID128)MIAC表明显著增强的效力。
粒酶B(一种在介导靶细胞杀伤的CD8+T细胞的细胞毒性颗粒中发现的蛋白酶)也通过用α-Her2/α-CD3MIAC(PID128)MIAC处理强烈诱导(图31)，并且与单特异性抗CD3相比显示显著增加的效力。MIAC在测试的整个浓度范围(包括最低浓度0.02nM)内实现了最大的酶B产生。
实施例24：示例性三特异性抗Her2/抗CD3/抗PD-1MIAC(PID130)对人T细胞/JIMT1肿瘤细胞共培养物中增殖和CD25活化标志物表达的影响
进行该实验以确定靶向Her2、CD3和PD-1(程序性死亡受体-1)的示例性三特异性MIAC增强与JIMT1肿瘤细胞共培养的人原代T细胞的增殖和活化的能力。作为对照，将MIAC的效果与等摩尔浓度的拥有与三特异性α-Her2/α-CD3/α-PD-1MIAC(PID130)相同的Fab序列的组合单特异性抗Her2、抗CD3和抗PD-1抗体进行比较。如下进行实验。
通过Ficoll梯度离心，然后通过磁珠分离(Miltenyi Biotec)来分离CD3+T细胞，并且置于以10:1的比率与JIMT1乳腺癌细胞的共培养物中。将共培养物接种在96孔微量板中，然后在存在增加浓度(0.02至20.0nM)的α-Her2/α-CD3/α-PD-1MIAC(PID130)或等摩尔浓度的组合的单特异性抗Her2、抗CD3和抗PD-1单克隆抗体的情况下孵育72小时。在孵育期结束时，用针对Ki67(细胞内增殖标志物)、CD8和CD25的荧光团标记的抗体染色后，通过流式细胞术分析T细胞的增殖和CD25表面表达。
在图32中显示了增殖和CD25表达分析的结果。三特异性α-Her2/α-CD3/α-PD-1MIAC(PID130)显著上调T细胞增殖和CD25表面表达两者，在所有测试浓度间观察到接近最大的诱导。相比之下，单特异性抗体的三重组合显示了浓度依赖性应答，其远小于MIAC的效力。
实施例25：示例性三特异性抗Her2/抗CD3/抗-PD-1MIAC(PID130)对人T细胞/JIMT1肿瘤细胞共培养物中细胞因子和粒酶B产生的影响
进行该实验以确定靶向Her2、CD3和PD-1的示例性三特异性MIAC增强与JIMT1肿瘤细胞共培养的人原代T细胞的细胞因子产生的能力。作为对照，将α-Her2/α-CD3/α-PD-1MIAC(PID130)与等摩尔浓度的组合的拥有与MIAC相同的Fab序列的针对Her2、CD3和PD-1的单特异性抗体进行比较。
在从实施例10所述的相同共培养实验收集的细胞培养物上清液中测定细胞因子产生。在72小时孵育期结束时，收集上清液，并且使用Luminex试剂盒(EMD Millipore)测量IFN-γ、TNF-α和粒酶B的水平。
如图33中所示，三特异性α-Her2/α-CD3/α-PD-1MIAC(PID130)显著增加IFN-γ和TNF-α两者产生，在测试的整个浓度范围内观察到接近最大的效果。相比之下，单特异性抗体的组合效应是远不太有力且浓度依赖性的，仅在浓度响应曲线的高端观察到细胞因子产生的增加。
粒酶B(一种在介导靶细胞杀伤的CD8+T细胞的细胞毒性颗粒中发现的蛋白酶)通过用α-Her2/α-CD3/α-PD-1MIAC(PID130)处理也以高水平诱导(图34)，并且与细胞因子产生一样，甚至在最低测试浓度下看到最大的效应。相比之下，单特异性抗体的组合确实以浓度依赖性方式增加粒酶B，但是表明比三特异性MIAC低得多的效力。
实施例26：示例性双特异性抗Her2/抗CD3MIAC(PID128)对人T细胞/BT474肿瘤细胞共培养物中的T细胞介导的肿瘤杀伤、粒酶B诱导和IFN-γ产生的影响
进行该实验以确定靶向Her2和CD3的示例性双特异性MIAC增强γ-干扰素的产生并促进人BT474乳腺细胞系的杀伤的能力。将α-Her2/α-CD3MIAC(PID128)的应答与等摩尔浓度的拥有与MIAC相同的Fab序列的组合单特异性α-Her2和α-CD3抗体进行比较。如下进行实验。
通过Ficoll梯度离心，然后通过磁珠分离(Miltenyi Biotec)来分离CD3+T细胞，并在96孔培养板中以15:1的比率共培养BT474乳腺癌细胞。在细胞铺板前，将增加浓度(0.01nM至1.0nM)的双特异性α-Her2/α-CD3MIAC(PID128)或组合的α-Her2和α-CD3单克隆抗体添加到板中的适当孔。将板孵育24小时，并且收集上清液，并根据制造商的方案用于CytoTox 非放射性细胞毒性和Luminex细胞因子测定法。
在图35中显示了肿瘤细胞杀伤分析的结果。与单特异性α-Her2和α-CD3抗体的组合相比，双特异性MIAC比两种单克隆抗体的组合介导更多的细胞杀伤。
在图36中显示了IFN-γ和粒酶B产生分析的结果。与单克隆抗体的组合相比，在存在α-Her2/α-CD3MIAC(PID128)的情况下，IFN-γ和粒酶B产生的浓度依赖性增加显著更明显。这些结果一起显示，α-Her2/α-CD3MIAC(PID218)在诱导细胞因子产生和促进肿瘤细胞杀伤方面比单克隆抗体的组合更有力。
其它实施方案，通过引用并入
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本公开引用的所有参考文献、出版物和专利的全部内容据此通过引用并入本文。
序列
SEQ ID NO：1-来自实施例13的重链#1
本妥昔单抗VH_人IgG1HC恒定_(GGGGS)3_乌瑞鲁单抗VH_(GGGGS)7_乌瑞鲁单抗_VK(分别公开为SEQ ID NO:23和97的"(GGGGS)3"和"(GGGGS)7")
SEQ ID NO:2–来自实施例13的重链#2
本妥昔单抗VH_人IgG1恒定_(GGGGS)3_派姆单抗VH_(GGGGS)7_派姆单抗_VK(分别公开为SEQ ID NO:23和97的"(GGGGS)3"和"(GGGGS)7")
SEQ ID NO:3–来自实施例13的轻链
本妥昔单抗VL_人IgG1LC恒定
SEQ ID NO:5–来自实施例14的重链
派姆单抗VH_(GGGGS)2_乌瑞鲁单抗VH_人IgG1HC恒定_(GGGGS)3_本妥昔单抗VH_(GGGGS)7_本妥昔单抗_VK(分别公开为SEQ ID NO:26、23和97的"(GGGGS)2"、"(GGGGS)3"和"(GGGGS)7")
SEQ ID NO:6–来自实施例14的轻链
派姆单抗VL_(GGGGS)2_乌瑞鲁单抗VL_人IgG1LC恒定(公开为SEQ ID NO:26的"(GGGGS)2")
SEQ ID NO:7–重链(DID-1)
曲妥珠单抗VH_人IgG1HC恒定
SEQ ID NO:8–轻链(DID-2)
曲妥珠单抗VL_人κLC恒定
曲妥珠单抗重链CDR
CDR-H1：GFNIKDT(SEQ ID NO：28)
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曲妥珠单抗轻链CDR
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SEQ ID NO:9–重链(DID-365)
博纳吐单抗_CD3VH_人无糖基化IgG1恒定
SEQ ID NO:10–轻链(DID-8)
博纳吐单抗_CD3VL_人κLC恒定
博纳吐单抗重链CDR
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博纳吐单抗轻链CDR
CDR-L1RASSSVSYMN(SEQ ID NO：37)
CDR-L2：DTSKVAS(SEQ ID NO：38)
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乌瑞鲁单抗VH_人IgG1恒定
SEQ ID NO:12–轻链(DID-309)
乌瑞鲁单抗VL_人κLC恒定
乌瑞鲁单抗重链CDR
CDR-H1GGSFSGYY(SEQ ID NO：40)
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乌瑞鲁单抗轻链CDR
CDR-L1：RASQSVSSYLA(SEQ ID NO：43)
CDR-L2：DASNRAT(SEQ ID NO：44)
CDR-L3：QQRSNWPPALT(SEQ ID NO：45)
SEQ ID NO:13–重链(DID-15)
派姆单抗VH_人IgG1恒定
SEQ ID NO:14–轻链(DID-16)
派姆单抗VL_人κLC恒定
派姆单抗重链CDR
CDR-H1：GYTFTNYYMY(SEQ ID NO：46)
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派姆单抗轻链CDR
CDR-L1：RASKGVSTSGYSYLH(SEQ ID NO：49)
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SEQ ID NO:15–重链(DID-366)
博纳吐单抗_CD3VH_人无糖基化IgG1HC恒定_(GGGGS)3_曲妥珠单抗VH_(GGGGS)4_曲妥珠单抗VL(分别公开为SEQ ID NO:23和24的"(GGGGS)3"和"(GGGGS)4")
博纳吐单抗重链CDR
CDR-H1：GYTFTRYTMH(SEQ ID NO：52)
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CDR-H3：YYDDHYCLDY(SEQ ID NO：54)
曲妥珠单抗重链CDR
CDR-H1GFNIKDT(SEQ ID NO：55)
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曲妥珠单抗轻链CDR
CDR-L1：RASQDVNTAVA(SEQ ID NO：58)
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SEQ ID NO:16–重链(DID-26)
乌瑞鲁单抗VH_人IgG1HC恒定_(GGGGS)3_曲妥珠单抗VH_(GGGGS)4_曲妥珠单抗VL(分别公开为SEQ ID NO:23和24的"(GGGGS)3"和"(GGGGS)4")
乌瑞鲁单抗重链CDR
CDR-H1：GGSFSGYY(SEQ ID NO：61)
CDR-H2：NHGGY(SEQ ID NO：62)
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曲妥珠单抗重链CDR
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曲妥珠单抗轻链CDR
CDR-L1：RASQDVNTAVA(SEQ ID NO：67)
CDR-L2：SASFLYS(SEQ ID NO：68）
CDR-L3：QQHYTTPPT(SEQ ID NO：69)
SEQ ID NO:17–重链(DID-27)
派姆单抗VH_人IgG1HC恒定_(GGGGS)3_曲妥珠单抗VH_(GGGGS)4_曲妥珠单抗VL(分别公开为SEQ ID NO:23和24的"(GGGGS)3"和"(GGGGS)4")
派姆单抗重链CDR
CDR-H1GYTFTNYYMY(SEQ ID NO：70)
CDR-H2：NPSNGG(SEQ ID NO：71)
CDR-H3：RDYRFDMGFDY(SEQ ID NNO：72)
曲妥珠单抗重链CDR
CDR-H1：GFNIKDT(SEQ ID NO：73)
CDR-H2：YPTNGY(SEQ ID NO：74)
CDR-H3：WGGDGFYAMDY(SEQ ID NO：75)
曲妥珠单抗轻链CDR
CDR-L1：RASQDVNTAVA(SEQ ID NO：76)
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CDR-L3：QQHYTTPPT(SEQ ID NO：78)
SEQ ID NO:18–轻链(DID-50)
博纳吐单抗_CD3VL_人κLC恒定_(GGGGS)3_派姆单抗VH_(GGGGS)4_派姆单抗VL(分别公开为SEQ ID NO:23和24的"(GGGGS)3"和"(GGGGS)4")
博纳吐单抗轻链CDR
CDR-L1：RASSSVSYMN(SEQ ID NO：79)
CDR-L2：DTSKVAS(SEQ ID NO：80)
CDR-L3：QQWSSNPLT(SEQ ID NO：81)
派姆单抗重链CDR
CDR-H1：GYTFTNYYMY(SEQ ID NO：82)
CDR-H2：NPSNGG(SEQ ID NO：83)
CDR-H3：RDYRFDMGFDY(SEQ ID NO：84)
派姆单抗轻链CDR
CDR-L1：RASKGVSTSGYSYLH(SEQ ID NO：85)
CDR-L2：LASYLES(SEQ ID NO：86)
CDR-L3：QHSRDLPLT(SEQ ID NO：87)
SEQ ID NO:19–轻链(DID-310)
乌瑞鲁单抗VL_人κLC恒定_(GGGGS)3_派姆单抗VH_(GGGGS)4_派姆单抗VL(分别公开为SEQ ID NO:23和24的"(GGGGS)3"和"(GGGGS)4")
乌瑞鲁单抗轻链CDR
CDR-L1：RASQSVSSYLA(SEQ ID NO：88)
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派姆单抗重链CDR
CDR-H1：GYTFTNYYMY(SEQ ID NO：91)
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派姆单抗轻链CDR
CDR-L1：RASKGVSTSGYSYLH(SEQ ID NO：94)
CDR-L2：LASYLES(SEQ ID NO：95)
CDR-L3：QHSRDLPLT(SEQ ID NO：96)

Claims (82)

1.一种多特异性免疫调节性抗原结合构建体(MIAC)多肽，其包含：
a.特异性结合由癌细胞表达的HER2抗原的抗原结合模块1(ABM1)；
b.特异性结合由效应免疫细胞表达的活化性受体的抗原结合模块2(ABM2)，其中ABM2与所述活化性受体的结合激动所述活化性受体，且其中所述活化性受体是CD3或CD137；和
c.任选地，特异性结合由所述效应免疫细胞表达的抑制性受体的抗原结合模块3(ABM3)，其中ABM3与所述抑制性受体的结合拮抗所述抑制性受体，
其中ABM1、ABM2和ABM3彼此可操作地连接，并且
其中每种抗原结合模块能够在每种其它抗原结合模块与其相应的抗原或受体结合的同时结合其相应的抗原或受体。
2.根据权利要求1所述的MIAC，其中所述MIAC还包含Fc，其中ABM1是scFv片段，ABM2是Fab片段，ABM2与Fc的N末端连接，和ABM1与Fc的C末端连接。
3.根据权利要求1所述的MIAC，其中所述MIAC还包含Fc，其中ABM1是scFv片段，ABM2是Fab片段，ABM3是scFv片段，ABM2与Fc的N末端连接，ABM1与Fc的C末端连接，和ABM3与ABM2的C末端连接。
4.一种多特异性免疫调节性抗原结合构建体(MIAC)多肽，其包含：
a.特异性结合由癌细胞表达的HER2抗原的抗原结合模块1(ABM1)；
b.任选地，特异性结合由效应免疫细胞表达的活化性受体的抗原结合模块2(ABM2)，其中ABM2与所述活化性受体的结合激动所述活化性受体；和
c.特异性结合由所述效应免疫细胞表达的抑制性受体的抗原结合模块3(ABM3)，其中ABM3与所述抑制性受体的结合拮抗所述抑制性受体，且其中所述抑制性受体是PD1，
其中ABM1、ABM2和ABM3彼此可操作地连接，并且
其中每种抗原结合模块能够在每种其它抗原结合模块与其相应的抗原或受体结合的同时结合其相应的抗原或受体。
5.根据权利要求4所述的MIAC，其中所述MIAC还包含Fc，其中ABM1是scFv片段，ABM3是Fab片段，ABM3与Fc的N末端连接，和ABM1与Fc的C末端连接。
6.根据权利要求4所述的MIAC，其中所述MIAC还包含Fc，其中ABM1是scFv片段，ABM2是Fab片段，ABM3是scFv片段，ABM2与Fc的N末端连接，ABM1与Fc的C末端连接，和ABM3与ABM2的C末端连接。
7.根据权利要求1或4所述的MIAC，其中所述MIAC还包含Fc，其中ABM1是scFv片段，ABM2是Fab片段，并且ABM3是scFv片段，其中ABM2与Fc连接，ABM3与ABM2连接，并且ABM1与Fc连接，其中相对于抗体对照组，所述MIAC在结合至少一种效应免疫细胞和至少一种癌细胞时通过效应免疫细胞诱导更多量的下列至少一种：IFN-γ、TNF-α、IL-2和粒酶B分泌，其中所述抗体对照组由与所述MIAC共同特异性结合相同靶标的以等摩尔浓度存在的不同单特异性抗体组成，其中相对于所述抗体对照组，所述MIAC在结合至少一种效应免疫细胞和至少一种癌细胞时诱导更高水平的效应免疫细胞增殖，并且其中相对于所述抗体对照组，所述MIAC在结合至少一种效应免疫细胞和至少一种癌细胞时诱导更高水平的效应免疫细胞CD25细胞表面表达。
8.根据权利要求1或4所述的MIAC，其中所述MIAC由连接在一起的ABM1、ABM2、ABM3和Fc组成，其中ABM1是scFv片段，ABM2是Fab片段，并且ABM3是scFv片段，其中ABM2的重链的C末端与Fc的N末端连接，ABM1与Fc的C末端连接，并且ABM3与ABM2的轻链的C末端连接，其中相对于抗体对照组，所述MIAC在结合至少一种效应免疫细胞和至少一种癌细胞时通过效应免疫细胞诱导更多量的下列至少一种：IFN-γ、TNF-α、IL-2和粒酶B分泌，其中所述抗体对照组由与所述MIAC共同特异性结合相同靶标的以等摩尔浓度存在的不同单特异性抗体组成，其中相对于所述抗体对照组，所述MIAC在结合至少一种效应免疫细胞和至少一种癌细胞时诱导更高水平的效应免疫细胞增殖，并且其中相对于所述抗体对照组，所述MIAC在结合至少一种效应免疫细胞和至少一种癌细胞时诱导更高水平的效应免疫细胞CD25细胞表面表达。
9.根据权利要求1或4所述的MIAC，其中所述MIAC由连接在一起的ABM1、ABM2、ABM3和Fc组成，其中ABM1是scFv片段，ABM2是Fab片段，并且ABM3是scFv片段，其中ABM2的重链的C末端与Fc的N末端连接，ABM1与Fc的C末端连接，并且ABM3与ABM2的轻链的C末端连接。
10.根据权利要求1或4所述的MIAC，其中所述MIAC还包含支架，任选地其中所述支架是Fc，任选地其中所述Fc是人Fc，任选地其中所述Fc是人IgG Fc，任选地其中ABM1、ABM2和ABM3中的每一种用或不用接头直接或间接地与所述支架连接，任选地其中所述接头是多肽接头。
11.根据权利要求10所述的MIAC，其中所述支架包含Fc。
12.根据权利要求11所述的MIAC，其中Fc是IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgA(IgA1、IgA2)、IgD、IgE或IgM，任选地其中Fc是修饰的，任选地其中所述修饰降低糖基化，任选地其中所述修饰降低ADCC，任选地其中所述修饰是人IgG1Fc中的N297突变，任选地其中所述N297突变是N297A突变。
13.根据权利要求11所述的MIAC，其中Fc是人IgG1 Fc。
14.根据权利要求11所述的MIAC，其中ABM1和ABM2连接于与Fc的C末端不同的位置，且ABM3与Fc的C末端连接。
15.根据权利要求11所述的MIAC，其中ABM1和ABM3连接于与Fc的C末端不同的位置，且ABM2与Fc的C末端连接。
16.根据权利要求11所述的MIAC，其中ABM3与Fc的C末端连接。
17.根据权利要求11所述的MIAC，其中ABM2与Fc的C末端连接。
18.根据权利要求11所述的MIAC，其中ABM1与Fc的N末端连接。
19.根据权利要求11所述的MIAC，其中ABM1是与Fc的N末端连接的Fab片段。
20.根据权利要求11所述的MIAC，其中所述ABM和Fc以基本上不干扰针对所述癌细胞的ADCC的形式连接。
21.根据权利要求11所述的MIAC，其中ABM3和ABM2连接于与Fc的C末端不同的位置，且ABM1与Fc的C末端连接。
22.根据权利要求11所述的MIAC，其中ABM3与Fc的N末端连接。
23.根据权利要求11所述的MIAC，其中ABM2与Fc的N末端连接。
24.根据权利要求11所述的MIAC，其中ABM1与Fc的C末端连接。
25.根据权利要求11所述的MIAC，其中所述ABM和Fc以基本上干扰针对所述癌细胞的ADCC的形式连接。
26.根据上述权利要求中任一项所述的MIAC，其中ABM1、ABM2和ABM3中的每一种是抗体或其抗原结合片段。
27.根据权利要求26所述的MIAC，其中所述抗体或其抗原结合片段是IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgA(IgA1、IgA2)、IgD、IgE、IgM、DVD-Ig和/或重链抗体。
28.根据权利要求26所述的MIAC，其中所述抗体或其抗原结合片段是Fv片段、Fab片段、F(ab')2片段、Fab’片段、scFv片段、scFv-Fc片段和/或单结构域抗体或其抗原结合片段。
29.根据权利要求26所述的MIAC，其中所述抗体或其抗原结合片段是单克隆的、人的、人源化的和/或嵌合的。
30.根据前述权利要求中任一项所述的MIAC，其中ABM1、ABM2和ABM3中的至少一种还包含备选支架，或其中所述MIAC还包含备选支架。
31.根据前述权利要求中任一项所述的MIAC，其中所述效应免疫细胞是T细胞或天然杀伤(NK)细胞，任选地其中所述T细胞是CD4+辅助T细胞或CD8+细胞毒性T细胞。
32.根据前述权利要求中任一项所述的MIAC，其中所述癌细胞是来自以下的细胞：HER2+癌症、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、急性髓样白血病(AML)、肾上腺皮质癌、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、脑肿瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、未知原发性起源癌、心脏肿瘤、宫颈癌、脊索瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性骨髓增生性赘生物、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、导管癌、胚胎性肿瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、鼻腔神经胶质瘤、纤维组织细胞瘤、尤因肉瘤、眼癌、生殖细胞肿瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠类癌肿瘤、胃肠基质肿瘤、妊娠滋养细胞疾病、神经胶质瘤、头颈癌、毛细胞白血病、肝细胞癌、组织细胞增多症、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞瘤、卡波西肉瘤、肾癌、朗格汉斯细胞组织细胞增多症、喉癌、白血病、唇和口腔癌、肝癌、原位小叶癌、肺癌、淋巴瘤、巨球蛋白血症、恶性纤维组织细胞瘤、黑素瘤、默克尔细胞癌、间皮瘤、隐匿性原发性转移性鳞状颈癌、涉及NUT基因的中线道癌、口腔癌、多发性内分泌赘生物综合征、多发性骨髓瘤、蕈样肉芽肿病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性赘生物、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状瘤病、副神经节瘤、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌瘤、唾液腺癌、塞扎里综合征、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、脊髓肿瘤、胃癌、T细胞淋巴瘤、畸胎样瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、阴道癌、外阴癌和维尔姆斯瘤。
33.根据前述权利要求中任一项所述的MIAC，其中ABM2包含四个免疫球蛋白可变结构域。
34.根据权利要求33所述的MIAC，其中ABM1包含两个免疫球蛋白可变结构域。
35.根据权利要求34所述的MIAC，其中ABM3包含两个免疫球蛋白可变结构域。
36.根据权利要求35所述的MIAC，其中ABM2是Fab片段，ABM1是scFv片段，并且ABM3是scFv片段。
37.根据前述权利要求中任一项所述的MIAC，其中所述MIAC还包含Fc，并且其中ABM2与Fc连接，ABM3与ABM2连接，并且ABM1与Fc连接。
38.根据权利要求37所述的MIAC，其中ABM2的重链的C末端与Fc的N末端连接，ABM1与Fc的C末端连接，并且ABM3与ABM2的轻链的C末端连接。
39.根据前述权利要求中任一项所述的MIAC，其中每个连接是直接的或者经由接头，任选地其中所述接头是多肽接头，任选地其中所述多肽接头是gly-ser接头或免疫球蛋白铰链区或其部分，任选地其中所述接头是(G4S)3接头。
40.根据前述权利要求中任一项所述的MIAC，其中所述MIAC是二聚体，任选地其中所述二聚体是同二聚体。
41.根据前述权利要求中任一项所述的MIAC，其还包含特异性结合由所述效应免疫细胞表达的另外的分子的抗原结合模块4(ABM4)。
42.根据权利要求41所述的MIAC，其中由所述效应免疫细胞表达的所述另外的分子选自CD16(CD16a、CD16b)、CD32a、CD64和CD89。
43.根据权利要求41所述的MIAC，其中ABM4是Fc。
44.根据权利要求1至43中任一项所述的MIAC，其中ABM2是抗CD137。
45.根据权利要求1至43中任一项所述的MIAC，其中ABM2是抗CD3。
46.根据权利要求1至43中任一项所述的MIAC，其中ABM3是抗PD-1。
47.根据权利要求1至43中任一项所述的MIAC，其中ABM1是抗HER2和ABM2是抗CD3。
48.根据权利要求1至43中任一项所述的MIAC，其中ABM1是抗HER2和ABM2是抗CD137。
49.根据权利要求1至43中任一项所述的MIAC，其中ABM1是抗HER2和ABM3是抗PD-1。
50.根据权利要求1至43中任一项所述的MIAC，其中ABM1是抗HER2，ABM2是抗CD3，并且ABM3是抗PD-1。
51.根据权利要求1至43中任一项所述的MIAC，其中ABM1是抗HER2，ABM2是抗CD137，并且ABM3是抗PD-1。
52.根据前述权利要求中任一项所述的MIAC，其中ABM1、ABM2和ABM3中的至少两种彼此共价缔合。
53.根据权利要求52所述的MIAC，其中所述共价缔合为融合蛋白的形式。
54.根据前述权利要求中任一项所述的MIAC，其中ABM1、ABM2和ABM3中的至少两种彼此非共价缔合。
55.根据前述权利要求中任一项所述的MIAC，其中相对于抗体对照组，所述MIAC在结合至少一种效应免疫细胞和至少一种癌细胞时通过效应免疫细胞诱导更多量的下列至少一种：IFN-γ、TNF-α、IL-2和粒酶B分泌，其中所述抗体对照组由与所述MIAC共同特异性结合相同靶标的以等摩尔浓度存在的不同单特异性抗体组成。
56.根据权利要求55所述的MIAC，其中由所述MIAC诱导的IFN-γ、TNF-α、IL-2和/或粒酶B分泌的量比由所述抗体对照组诱导的高大约2、3、4、5、6、7或8倍。
57.根据前述权利要求中任一项所述的MIAC，其中相对于抗体对照组，所述MIAC在结合至少一种效应免疫细胞和至少一种癌细胞时诱导更高水平的效应免疫细胞增殖，其中所述抗体对照组由与所述MIAC共同特异性结合相同靶标的以等摩尔浓度存在的不同单特异性抗体组成。
58.根据权利要求57所述的MIAC，其中由所述MIAC诱导的增殖的水平比由所述抗体对照组诱导的高大约2、3、4、5、6、7或8倍。
59.根据前述权利要求中任一项所述的MIAC，其中相对于抗体对照组，所述MIAC在结合至少一种效应免疫细胞和至少一种癌细胞时诱导更高水平的效应免疫细胞CD25细胞表面表达，其中所述抗体对照组由与所述MIAC共同特异性结合相同靶标的以等摩尔浓度存在的不同单特异性抗体组成。
60.根据权利要求59所述的MIAC，其中由所述MIAC诱导的CD25表达比由所述抗体对照组诱导的高大约2、3、4、5、6、7或8倍。
61.根据前述权利要求中任一项所述的MIAC，其中相对于抗体对照组，所述MIAC在结合至少一种效应免疫细胞和至少一种癌细胞时诱导更高水平的癌细胞死亡，其中所述抗体对照组由与所述MIAC共同特异性结合相同靶标的以等摩尔浓度存在的不同单特异性抗体组成。
62.根据前述权利要求中任一项所述的MIAC，其中每种ABM在每种其它抗原结合模块与其相应的抗原或受体结合的同时结合其相应的抗原或受体，并且任选地其中当每种ABM与其相应的抗原或受体同时结合时，每种结合模块对其相应的抗原或受体的亲和力是约0.3nM至约1.7nM、0.37至1.66nM、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6或1.7nM。
63.一种缀合物，其包含根据前述权利要求中任一项所述的MIAC和药剂。
64.根据权利要求63所述的缀合物，其中所述药剂选自治疗剂、诊断剂、掩蔽部分、可切割部分及其组合。
65.根据权利要求63所述的缀合物，其中用接头将所述药剂与所述MIAC连接。
66.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据前述权利要求中任一项所述的MIAC或缀合物和赋形剂。
67.一种治疗具有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据前述权利要求中任一项所述的MIAC或缀合物或根据权利要求66所述的药物组合物。
68.一种抑制或降低癌症生长的方法，所述方法包括使所述癌症与对于所述受试者有效量的根据前述权利要求中任一项所述的MIAC或缀合物或根据权利要求66所述的药物组合物接触。
69.根据权利要求67或权利要求68所述的方法，其中所述MIAC结合癌细胞和效应细胞。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述MIAC结合两种或更多种效应细胞。
71.根据权利要求67-69中任一项所述的方法，其中所述MIAC激动所述效应细胞上的活化性受体并且拮抗所述效应细胞上的抑制性受体。
72.根据权利要求67-71中任一项所述的方法，其中所述MIAC活化所述效应细胞。
73.根据权利要求67-72中任一项所述的方法，其中所述活化的效应细胞表现出选自下组的表型：针对癌细胞的细胞毒性、增殖、IL-2的分泌、干扰素γ的分泌、LAMP-1的上调、CD16的下调、CD69的上调和KLRG1的上调。
74.根据权利要求73所述的方法，其中由所述MIAC诱导的所述增殖大于在没有ABM3的情况下由MIAC诱导的增殖。
75.根据权利要求67-74中任一项所述的方法，其中所述癌症选自HER2+癌症、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、急性髓样白血病(AML)、肾上腺皮质癌、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、脑肿瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、未知原发性起源癌、心脏肿瘤、宫颈癌、脊索瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性骨髓增生性赘生物、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、导管癌、胚胎性肿瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、鼻腔神经胶质瘤、纤维组织细胞瘤、尤因肉瘤、眼癌、生殖细胞肿瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠类癌肿瘤、胃肠基质肿瘤、妊娠滋养细胞疾病、神经胶质瘤、头颈癌、毛细胞白血病、肝细胞癌、组织细胞增多症、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞瘤、卡波西肉瘤、肾癌、朗格汉斯细胞组织细胞增多症、喉癌、白血病、唇和口腔癌、肝癌、原位小叶癌、肺癌、淋巴瘤、巨球蛋白血症、恶性纤维组织细胞瘤、黑素瘤、默克尔细胞癌、间皮瘤、隐匿性原发性转移性鳞状颈癌、涉及NUT基因的中线道癌、口腔癌、多发性内分泌赘生物综合征、多发性骨髓瘤、蕈样肉芽肿病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性赘生物、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状瘤病、副神经节瘤、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌瘤、唾液腺癌、塞扎里综合征、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、脊髓肿瘤、胃癌、T细胞淋巴瘤、畸胎样瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、阴道癌、外阴癌和维尔姆斯瘤。
76.根据权利要求67-75中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用至少一种另外的药剂。
77.一种组合物，所述组合物包含编码根据权利要求1-62中任一项所述的MIAC的至少一种多核苷酸或一组多核苷酸。
78.一种细胞，所述细胞包含根据权利要求77所述的组合物。
79.一种制备MIAC的方法，所述方法包括在根据权利要求78所述的细胞中表达所述MIAC。
80.一种制备MIAC的方法，所述方法包括表达根据权利要求1-62中任一项所述的MIAC的ABM，并且装配所述ABM以形成MIAC。
81.一种载体或载体组，所述载体或载体组包含编码根据权利要求1-62中任一项所述的MIAC的至少一种多核苷酸或一组多核苷酸。
82.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求1-62中任一项所述的MIAC和使用说明书。
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