[go: up one dir, main page]

CN109536497A - 日本血吸虫感染及其组分在人类肿瘤预防和治疗中的应用 - Google Patents

日本血吸虫感染及其组分在人类肿瘤预防和治疗中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109536497A
CN109536497A CN201811436581.8A CN201811436581A CN109536497A CN 109536497 A CN109536497 A CN 109536497A CN 201811436581 A CN201811436581 A CN 201811436581A CN 109536497 A CN109536497 A CN 109536497A
Authority
CN
China
Prior art keywords
schistosoma japonicum
mirna
tumor
cell
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201811436581.8A
Other languages
English (en)
Inventor
潘卫庆
张远斌
林玉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tongji University
Original Assignee
Tongji University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tongji University filed Critical Tongji University
Priority to CN201811436581.8A priority Critical patent/CN109536497A/zh
Publication of CN109536497A publication Critical patent/CN109536497A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/15—Cells of the myeloid line, e.g. granulocytes, basophils, eosinophils, neutrophils, leucocytes, monocytes, macrophages or mast cells; Myeloid precursor cells; Antigen-presenting cells, e.g. dendritic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0003—Invertebrate antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明涉及日本血吸虫感染及其组分在人类肿瘤预防和治疗中的应用。血吸虫组分包括但不局限于虫卵、miRNAs、外泌体及蛋白质等。本发明首次表明日本血吸虫组分具有抗多种宿主肿瘤的作用，这些肿瘤包括但不限于肝癌等。血吸虫及其组分或通过诱导宿主特异和非特异免疫应答反应、或调节肿瘤相关基因及其信号通路、或直接杀伤肿瘤细胞的方式发挥作用。血吸虫及其组分具有人类肿瘤预防和治疗的应用价值。

Description

日本血吸虫感染及其组分在人类肿瘤预防和治疗中的应用
技术领域
本发明属于寄生虫学和肿瘤学领域，尤其是涉及日本血吸虫感染及其组分在人类肿瘤预防和治疗中的应用。
背景技术
血吸虫病是一种流行广泛、危害严重的寄生虫病。日本血吸虫感染，其成虫寄生在宿主肠系膜静脉，在那里产生虫卵，并随血流到肝脏，引起肝脏的病变。众所周知，一些病原体感染可导致肿瘤的发生和促进肿瘤的发展，如幽门螺杆菌、人乳头状病毒、肝炎病毒等，在寄生虫中，已证明华支睾吸虫和埃及血吸虫感染可分别致胆管癌和膀胱癌。但就日本血吸虫(Schistosoma japonicum,S.japonicum)感染而言，沉积在肝脏的虫卵，其里面是一个活的毛蚴，可分泌大量的蛋白质、核酸以及外泌体等，这些因子本身或通过刺激宿主细胞产生各类因子对宿主产生致病作用，如引起肝脏严重的炎症反应和肝纤维化。
日本血吸虫感染导致宿主肝脏严重的炎症和肝纤维化，继而发生肝硬化，这些已被证明是肝脏肿瘤的诱发因素。然而，国内一些流行病学调查结果提示，日本血吸虫慢性感染与肠癌的发生存在一定的相关性，但这种关联性迄今仍然是一种推测，缺乏更有说服力实验证据。长期以来有关日本血吸虫感染与原发性肝癌之间的关联性存在争议。尽管一些病例对照研究和死亡率分析结果提示血吸虫感染与肝癌之间存在关联性，但绝大多数流行病和临床数据不支持这种关联性。在我国就此问题曾开展大规模的流行病调查，此调查涉及日本血吸虫病7个高流行县，结果显示日本血吸虫感染与原发性肝癌无关联性。血吸虫感染引起宿主肝脏的炎性反应，继而发生肝纤维化和肝硬化，这是向肝癌发展的典型路径。
MicroRNA(miRNA)是一类真核生物高度保守的内源性小调节RNA，长度约18～26个核苷酸，通过与靶mRNA特异性碱基配对引起靶mRNA降解或翻译抑制，调控基因转录后表达。miRNA具有广泛的基因调节功能，能对基因活动(生长、分化、凋亡及应激反应等)的各个层面进行调节，参与了生命过程中的一系列重要进程，包括早期胚胎发育、细胞增殖、细胞凋亡、细胞死亡、脂肪代谢以及干细胞维持和分化等。MiRNAs也影响人类疾病的发生发展，包括肿瘤。已经证实人体一些miRNA失调可促进各种癌症的发生和发展，同时另外一些miRNA通过调节肿瘤相关基因而发挥抗肿瘤作用，具有潜在的肿瘤治疗作用。特别是近年来，一些研究显示来自植物或病原体的miRNA能够跨物种调控宿主的基因，因而影响宿主的生理和病理过程，包括对肿瘤的影响。本发明发明人所在实验室是最早发现日本血吸虫存在miRNA，包括保守的和血吸虫特异的miRNA。由于血吸虫虫卵沉积在肝脏组织，虫卵分泌的miRNA可以直接进入邻近的宿主肝细胞发挥调控宿主细胞基因的功能，从而影响宿主细胞的表型，包括对肿瘤的影响。而对于很多植物 miRNA，其发挥作用需经过胃肠道及穿过肠壁，关于这方面的机制仍有很多不清楚的。
发明内容
根据背景技术的记载，本发明推测，血吸虫感染所致的肝脏严重炎症和纤维化，本应向原发性肝癌方向发展，但由于血吸虫是真核生物病原体，能编码近两万种蛋白，并存在大量非编码RNA，其中一些或通过诱导宿主产生的抗癌因子可能对肿瘤的发生和发展起到抑制作用。因此，本发明探讨了日本血吸虫虫卵及非编码小RNA等的抗肿瘤活性因子及其分子机制。
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供日本血吸虫感染及其组分在人类肿瘤预防和治疗中的应用。
本发明首先建立了DEN诱导肝癌和日本血吸虫感染的小鼠模型，在此基础上评价血吸虫感染对小鼠肝癌发生和发展的影响。本发明还通过皮下接种血吸虫虫卵和肿瘤细胞，观察虫卵对肿瘤细胞皮下成瘤及其生长的影响。此外，本发明在体外筛选了能抑制肿瘤细胞生长的日本血吸虫非编码小RNA，选择其中一些能阻滞细胞周期、抑制肿瘤细胞生长和迁移的非编码小RNA进行后续研究，包括检测其体内的抗肿瘤作用。构建了能稳定表达Sja-miR-3096的稳转细胞株及肝原位和皮下移植瘤模型，采用小鼠肝癌动物模型评价日本血吸虫miRNAs对小鼠肝癌发生发展的抑制作用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
在本发明的第一方面，采用日本血吸虫感染的方法，所述感染方法包括：
(1)通过人工感染制备日本血吸虫尾蚴，这种尾蚴具有感染人体或适宜动物宿主，如小鼠、家兔和水牛等的能力。
(2)用日本血吸虫尾蚴通过皮肤感染进入宿主体内，并经历童虫、成虫发育，并产虫卵；
(3)产出的虫卵部分能随血流分布在肝脏、肠壁等组织；
进入宿主的日本血吸虫各发育阶段，通过虫体自身成分以及分泌物或直接抑制肿瘤或通过诱导宿主产生特殊的免疫反应，包括天然免疫、获得性免疫、激活抗癌基因等，发挥抗肿瘤作用。
所述抗肿瘤作用包括对肝脏局部，也包括全身其他脏器的抗肿瘤作用。
本发明的第二方面，提供一种分离日本血吸虫虫卵的方法，包括以下步骤：
(1)日本血吸虫尾蚴感染适宜宿主，宿主包括但不限于家兔；
(2)取感染6至8周的宿主动物肝脏，用于虫卵的制备
(3)分离及纯化日本血吸虫的虫卵
(4)通过虫卵的培养，产生含有虫卵分泌物的培养上清。
所述日本血吸虫虫卵，通过皮下或静脉注射，用于恶性肿瘤的治疗和预防。
本发明的第三方面，提供一组分离的日本血吸虫非编码小RNA(日本血吸虫miRNA，简称为Sja-miRNA)，所述的miRNA具有如下特性：
(1)来源于日本血吸虫；
(2)序列如SEQ ID NO:n所示的miRNA，或与SEQ ID NO:n所示序列互补的miRNA，或如SEQ ID NO:n所示的miRNA在核心序列外的序列存在若干碱基替换、缺失等而不影响其抗肿瘤作用的miRNA，或与SEQ ID NO:n所示序列互补的miRNA在核心序列外的序列存在若干碱基替换、缺失等而不影响其抗肿瘤作用的miRNA，n为1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12。
(3)能在体外或体内显示出有抑制肿瘤细胞生长的作用，包括阻滞肿瘤细胞周期阻滞肿瘤细胞周期、或抑制肿瘤细胞增殖、或抑制肿瘤细胞迁移、或促进肿瘤细胞凋亡等。
进一步地，本发明提供了一系列能抑制小鼠肝癌细胞系增殖、迁移或周期阻滞的Sja-miRNAs，序列分别如表1所示，同时，本发明提供了一系列能抑制人肝癌细胞系增殖、迁移或周期阻滞的Sja-miRNAs，序列分别如表2所示，
表1.能抑制小鼠肝癌细胞系增殖、迁移或周期阻滞的Sja-miRNAs
表2.能抑制人肝=细胞系增殖、迁移或周期阻滞的Sja-miRNAs
Sja-miRNAs名称 成熟体序列(5’→3’)
Sja-miR-7-5p UGGAAGACUGGUGAUAUGUUGUU
Sja-miR-124 UAAGGCACGCGGUGAAUGUCA
Sja-miR-3005 AAGGAACAACUGCUUGAAGC
Sja-miR-71a UGAAAGACGAUGGUAGUGAGAUG
Sja-miR-3044 CGCGUGGAUCUGUCACACAUUA
Sja-miR-3006 AAGGUGUUUCCCUCGGACAAA
注：表2中加粗字体的为对小鼠肝癌细胞系、人肝癌细胞系均有细胞周期阻滞作用的 Sja-miRNA。
优选地，Sja-miRNA有：Sja-miR-3096、Sja-miR-7-5p、Sja-miR-124、Sja-miR-61，Sja-miR-3005和Sja-miR-71a。
本发明还提供上述分离的日本血吸虫Sja-miRNA的前体，即Sja-pre-miRNA，及其与 pre-miRNA所示序列互补的pre-miRNA。
本发明还提供一种合成的上述成熟Sja-miRNA，即Sja-miRNA mimics。
本发明还提供一种脂质体，包含本上述成熟Sja-miRNA序列。
本发明还提供一种表达载体，包括上述Sja-pre-miRNA序列。
本发明还提供一种遗传工程化的宿主细胞，包括上述脂质体或表达载体，或染色体整合有本发明的第三方面所述的Sja-miRNA序列。
本发明的第四方面，提供一种日本血吸虫的外泌体(Exosome)，具有以下特性：
(1)是日本血吸虫虫卵、童虫或成虫细胞主动向外分泌的大小均一的囊泡样小体；
(2)其直径为40～100nm，内含非编码小RNA等多种生物活性成分，包括能抑制肿瘤细胞生长或抑制迁移以及促进肿瘤细胞凋亡的日本血吸虫非编码RNA。
本发明的第五方面，提供一种日本血吸虫的分泌蛋白，具有以下特性：
(1)是日本血吸虫虫卵、童虫或成虫细胞主动向外分泌的蛋白质；
(2)一般为可溶性蛋白；
(3)能诱导并活化宿主的免疫系统，包括特异性免疫或天然免疫细胞，活化宿主细胞抗肿瘤信号通路，产生抗肿瘤因子，从而在体内抑制肿瘤细胞生长或迁移或促进肿瘤细胞凋亡等。
本发明的第六方面，提供了本发明以上四方面所述的日本血吸虫感染、日本血吸虫虫卵以及日本血吸虫非编码小RNA的用途：
(1)日本血吸虫感染用于制备癌症治疗和/或预防癌症转移复发的药物的应用；
(2)日本血吸虫虫卵用于制备癌症治疗和/或预防癌症转移复发的药物的应用；
(3)日本血吸虫miRNA用于制备癌症治疗和/或预防癌症转移复发的药物的应用；
(4)日本血吸虫分泌蛋白质用于制备癌症治疗和/或预防癌症转移复发的药物的应用；
(5)权利要求4所述的日本血吸虫miRNA的前体用于制备癌症治疗和/或预防癌症转移复发的药物的应用；
(6)权利要求5所述的脂质体用于制备癌症治疗和/或预防癌症转移复发的药物的应用；
(7)权利要求6所述的表达载体用于制备癌症治疗和/或预防癌症转移复发的药物的应用；
(8)权利要求7所述的宿主细胞用于制备癌症治疗和/或预防癌症转移复发的药物的应用；
(9)权利要求8所述的日本血吸虫的外泌体用于制备癌症治疗和/或预防癌症转移复发的药物的应用；
(10)肿瘤患者体内的免疫细胞，通过日本血吸虫虫卵或日本血吸虫组分的体外刺激后回输入患者体内，用于恶性肿瘤的治疗；
所述免疫细胞包括但不限于巨噬细胞、NK细胞、T细胞、DC细胞。
本发明的第七方面，提供了一种抑制肿瘤生长或肿瘤治疗的组合物，其特征在于，所述的组合物含有有效量的所述日本血吸虫miRNA、日本血吸虫的外泌体，或日本血吸虫分泌的蛋白质；以及药学上可接受的载体。
与现有技术相比，本发明发现日本血吸虫感染具有抗多种宿主肿瘤的作用，同时发现，日本血吸虫组分，包括虫卵以及非编码RNA、外泌体及蛋白质等同样具有抗多种宿主肿瘤的作用，这些肿瘤包括但不限于肝癌等。
日本血吸虫感染或日本血吸虫组分或通过诱导宿主特异和非特异免疫应答反应、或调节肿瘤相关基因及其信号通路、或直接杀伤肿瘤细胞的方式发挥作用。因此，日本血吸虫感染或日本血吸虫组分具有人类肿瘤预防和治疗的应用价值。可用于基于日本血吸虫组分的抗肿瘤药物的研发。
本发明的创新点在于：
(1)日本血吸虫非编码小RNA能通过调控宿主肿瘤相关基因，从而抑制肿瘤细胞的生长、迁移等。
(2)日本血吸虫感染诱导激活的宿主免疫细胞及间质细胞具有抑制肿瘤细胞生长作用。
(3)日本血吸虫虫卵免疫能抑制皮下瘤生长。
(4)日本血吸虫miRNA能在宿主细胞内加工成熟且有效的抑制肿瘤细胞生长和迁移。
附图说明
图1.各组小鼠肿瘤标志物AFP和GPC3的检测。
图2.分离纯化的日本血吸虫虫卵及镜检图。
图3.虫卵免疫对肝癌细胞皮下成瘤的影响。
图4.日本血吸虫感染对肝癌细胞皮下成瘤的影响。
图5.感染小鼠间质细胞培养上清对Hepa1-6肿瘤细胞体外增殖的影响
图5包括图5A与图5B；
图5A：肝间质细胞CM对Hepa1-6细胞增殖的影响；
图5B：肝星状细胞CM对Hepa1-6细胞增殖的影响；
数据以Mean±SD表示，实验重复三次，*P<0.05，**P<0.01。
图6.感染小鼠肝间质细胞对Hepa1-6细胞体内生长的影响
图6包括图6A、图6B、图6C；
图6A：间质细胞数量是Hepa1-6细胞数量20倍时的肿瘤生长曲线；
图6B：间质细胞数量是Hepa1-6细胞数量10倍时的肿瘤生长曲线；
图6C：瘤体重量；
数据以Mean±SEM表示，*P<0.05，**P<0.01。
图7.Sja-miRNA对肝癌细胞细胞周期的影响
与对照相比，Sja-miR-7-5p、Sja-miR-124、Sja-miR-61和Sja-miR-3096能有效将Hepa1-6 肝癌细胞周期阻滞在G0/G1期
数据以Mean±SEM表示，*P<0.05。
图8Sja-miR-7-5p对HepG2肝癌细胞周期的影响
图8包括图8A、图8B；
图8A：FACS细胞周期图；
图8B：细胞周期各时期细胞所占比例统计；
数据以Mean±SEM表示，*P<0.05，**P<0.01。
图9Sja-miRNA对肿瘤细胞增殖的影响
图9包括图9A、图9B、图9C
图9A：Sja-miR3096抑制Hepa1-6肿瘤细胞的增殖
图9B：Sja-miR-7-5p抑制Hepa1-6肿瘤细胞的增殖
图9C：Sja-miR-7-5p抑制HepG2肿瘤细胞的增殖
图10Sja-miR-3096和Sja-miR-7-5p抑制Hepa1-6和HepG2肿瘤细胞的迁移
图10包括图10A、图10B、图10C、图10D
图11Sja-miRNA抑制肿瘤细胞克隆形成
图11包括图11A、图11B、图11C
图11A:Sja-miR-3096显著抑制Hepa1-6肿瘤细胞系克隆形成；
图11B:Sja-miR-7-5p显著抑制Hepa1-6肿瘤细胞系的克隆形成；
图11C:B:Sja-miR-7-5p显著抑制HepG2肿瘤细胞系的克隆形成。
图12Sja-miRNA抑制肿瘤细胞划痕愈合
图12包括图12A、图12B
图12A:Sja-miR-3096显著抑制Hepa1-6肿瘤细胞系划痕愈合；
图12B:Sja-miR-7-5p显著抑制Hepa1-6肿瘤细胞系划痕愈合。
图13Sja-miR-3096抑制Hepa1-6皮下瘤生长
图13包括图13A、图13B、图13C、图13D
图14Sja-miR-7-5p抑制HepG2皮下瘤生长
图14包括图14A、图14B、图14C
图15miR-3096稳转株筛选及鉴定
图15包括图15A、图15B、图15C
图15A:qPCR检测稳转株pri-和成熟sja-miR-3096
图15B:凝胶电泳显示pri-sja-miR-3096
图15C:凝胶电泳显示成熟sja-miR-3096
图16miR-3096稳转株细胞生物学特性
图16包括图16A、图16B、图16C、图16D
图16A:miR-3096稳转株细胞周期阻滞
图16B:miR-3096稳转株增殖抑制
图16C&D:miR-3096稳转株克隆形成抑制
图17miR-3096抑制稳转株皮下成瘤
图17包括图17A、图17B、图17C
图18Sja-miR-3096抑制稳转株肝原位成瘤
图18包括图18A、图18B、图18C、图18D
图19体内转染miR-3096mimics对Hepa1-6皮下瘤的抑制作用
图19包括图19A、图19B、图19C、图19D、图19E、图19F；
图20日本血吸虫虫卵exosome中miRNA的检测。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1
日本血吸虫感染对DEN诱导小鼠肝脏肿瘤的抑制作用
实验采用C57小鼠，雄性，周龄5-6W；分为PBS组、PBS+感染组(inf)、DEN诱导组和DEN+感染组。
DEN诱导小鼠成瘤：采用0.25mg/100ul/只小鼠，腹腔注射二乙基亚硝胺(DEN)；
PBS组和PBS+双性感染组小鼠腹腔注射100ul PBS作为对照；
血吸虫感染：DEN诱导后第8周经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴，尾蚴经性别鉴定后配对感染，感染负荷3-5对/只。
结果：DEN诱导后第36周处死小鼠，观察小鼠成瘤情况，记录瘤体质量、成瘤数量，瘤体大小，病理与分子检测等。结果如下：PBS组及PBS+感染组未见瘤体，DEN组和 DEN+感染组均出现肿瘤，成瘤率为64-100％，见表1，表1为日本血吸虫感染对小鼠肝癌发生发展的影响，可见两组平均瘤体个数和最大瘤体直径无显著性差异。
表1：日本血吸虫感染对小鼠肝癌发生发展的影响
肝脏瘤体组织切片HE染色病理检查结果显示，DEN组所有瘤体(18个)均可诊断为肝细胞癌(HCC)，而DEN+感染组(13个瘤体)仅有一例诊断为HCC，其余瘤体均不能诊断为HCC，根据病理切片诊断结果为：DEN组100％的瘤体诊断为HCC，而DEN+ 感染组只有7.69％的瘤体诊断为HCC。利用甲胎蛋白(AFP)特异性抗体做组化检测，结果显示，DEN组所有瘤体均可见AFP阳性细胞(100％)，而DEN+inf组未见阳性细胞(0％)；采用qPCR方法分析两组小鼠瘤体组织HCC特异性标志分子AFP及GPC3表达情况，结果显示，DEN组瘤体组织AFP及GPC3表达水平较DEN+inf组显著上调，具体见图1所示。
实施例2
日本血吸虫虫卵分离与纯化
日本血吸虫尾蚴获取与感染：日本血吸虫中国大陆株阳性钉螺由中国疾控中心上海寄生虫病研究所提供。常规逸蚴法逸出日本血吸虫尾蚴，光照使尾蚴浮出聚集。在去氯水中调整尾蚴数量，在新西兰大白兔(购自上海斯莱克实验动物有限责任公司)腹部剃除毛发，于裸露皮肤铺片，感染日本血吸虫尾蚴约800条。常规饲养条件饲养白兔。
新西兰白兔肝脏分离与匀浆：尾蚴感染56天后通过兔耳缘静脉注射5mL空气处死白兔，无菌手术取出兔肝脏于消毒器皿中，除去胆管、血管及结缔组织。以高压灭菌并4℃预冷的0.9％生理盐水洗净血污，将肝脏剪成碎块。在肝碎块中加入适量4℃预冷的生理盐水，倒入高速组织匀浆机中，12,000rpm匀浆3次，每次匀浆时间1分钟，每次匀浆间隔1分钟。得到肝脏组织匀浆液。
虫卵分级分离与纯化：将肝脏组织匀浆液依次用80目/120目/180目标准分样筛过筛，每次过筛后收集滤液，并用少量4℃预冷生理盐水洗涤滤渣3次，收集的滤液与洗液再过下一次分样筛。获得所有的滤液约1000mL，倒入50mL无菌离心管中，在4℃条件下以 3,500rpm离心1分钟。弃去上清，以生理盐水重悬沉淀，并加入终浓度为0.25％的胰蛋白酶溶液，混匀沉淀，于37℃培养箱中消化，每隔15分钟颠倒混匀一次。消化约2个小时后，镜检肝组织残片被充分消化。再将消化混悬液以4℃预冷的生理盐水稀释并过300目分样筛，收集分样筛上的虫卵，并以生理盐水重悬虫卵，3,500rpm离心1分钟，对虫卵沉淀再以生理盐水重悬洗涤并离心。反复洗涤4次后，获得的虫卵以DMEM培养基重悬。在显微镜光镜下镜检虫卵纯度及虫卵计数。
分离纯化的日本血吸虫虫卵及镜检图如图2所示，镜检结果表明，通过以上方法获得的虫卵非常纯净，镜检无肝脏组织残片，仅有少量破碎的虫卵碎片。本实施例为后续实验获取了重要的实验材料，本发明在以下实施例中进一步对虫卵与H22细胞成瘤能力的关系进行研究。
实施例3
日本血吸虫虫卵免疫对小鼠皮下成瘤的抑制作用
虫卵免疫C57BL/6小鼠：上述实施例2制备的新鲜无菌日本血吸虫虫卵，调整浓度至1*105个/mL，取50μL虫卵重悬液(即免疫总数量为5000个虫卵)，以注射器1.2号针头皮下注射至6周龄雄性C57BL/6小鼠背侧肩胛部。每只小鼠注射前需轻弹注射器混匀虫卵，并在注射后滞留针头约30秒，再缓慢轻轻退出针头。同时以皮下注射50μL空白 DMEM培养基的小鼠，作为对照组。
虫卵免疫后接种H22肿瘤细胞：事先以H22细胞腹腔接种至昆明鼠，体内扩增H22细胞。待腹水形成后抽离腹水，分离H22细胞。将H22细胞重悬于DMEM培养基，调整细胞浓度为2*107个/mL，取50μL细胞重悬液(即接种总数量为1*106个细胞)，在按虫卵免疫后一天后，第七天后，十六天后，分别皮下注射至相应虫卵免疫处，即天数的 C57BL/6小鼠背侧肩胛部。每个虫卵免疫时间点，各设置4-6只实验组小鼠，以及5只对照组小鼠。H22细胞接种后3-4天，待小鼠注射部位已长出实体瘤组织后，每隔3-4天测量一次各瘤体横径(a)与宽径(b)，并计算各个瘤体体积(v＝0.5*a*b*b)。H22细胞接种后约22天左右，处死所有小鼠，对小鼠皮下成瘤进行照相留存记录，并记录所有小鼠体重，瘤体大小和重量，收集相应瘤体样本，抽提RNA。
虫卵免疫对肝癌细胞皮下成瘤的影响如图3所示，结果表明，在虫卵免疫实验小鼠后，H22成瘤能力显著降低，两组肿瘤体积间成瘤差异曲线差异显著(P＝0.0318)，且虫卵免疫组的肿瘤重量低于DMEM免疫组。
实施例4
日本血吸虫感染对小鼠皮下成瘤及其生长的抑制作用
小鼠分组：5-6周龄C57雄性小鼠，随机分成感染组和正常组；
血吸虫尾蚴感染：小鼠固定后用剃刀剃去腹部鼠毛暴露皮肤，湿润，尾蚴在盖玻片上计数后贴在皮肤上10min，感染结束后取下盖玻片；
种植瘤：在小鼠感染血吸虫后第42天，在小鼠肩胛部皮下接种1*106个H22肿瘤细胞，接种后每天测量一次肿瘤体积，记录肿瘤生长情况，接种肿瘤细胞后第16天处死小鼠，分离瘤体称重并拍照。
日本血吸虫感染对肝癌细胞皮下成瘤的影响如图4所示，结果显示：动态测量皮下瘤体生长曲线显示，感染组小鼠皮下瘤体生长速度较正常组小鼠慢，感染组小鼠瘤体重量显著低于未感染组小鼠。
实施例5
感染肝脏间质细胞对肿瘤的抑制作用
小鼠肝间质细胞制备：24只6周龄的雄性C57BL/6J小鼠(18-20克)购自第二军医大学实验动物中心，其中12只经腹部贴片法感染16条日本血吸虫尾蚴，剩下的12只不做感染,56天后分离肝间质细胞，并继续分离星状细胞。采用He等的文献[He X, Hepatology 2015,61(6):2008-2017]，通过胶原酶灌注两步法分离细胞，并加以改进。大致过程如下：(1)颈椎脱臼处死小鼠后，采用肝脏原位灌注Ⅳ型胶原酶获得肝脏总细胞悬液； (2)然后经50×g离心4min(4℃)，取出上清再经离心洗涤后获得较纯净的肝间质细胞； (3)肝星状细胞的分离需将肝间质细胞用10ml的11.5％Optiprep重悬，然后转移至15ml 离心管，然后在其上层铺2ml DMEM培养基，然后1400×g无加减速离心20min(4℃)，离心结束取出11.5％Optiprep和DMEM培养基界面的细胞层，离心洗涤获得初步纯化的星状细胞。
分离的细胞计数后，并按照以下细胞数量和培养基来制备条件性培养基(CM)：(1)感染或正常小鼠肝间质细胞CM：1.2×107cells+10ml DMEM；(2)感染或正常星状细胞CM：1×106cells+1.5ml DMEM；(3)仅DMEM-CM：10ml。
上述细胞按各自条件加入DMEM培养基(含双抗)后，放入细胞培养箱中培养24h，然后收集上清，采用0.2μm滤器过滤，放置于-80℃保存(称为“条件性培养基”)。
条件性培养基对小鼠肝癌细胞系体外生长的影响：
上述制备的细胞条件性培养基(CM)，使用时从-80℃取出，放置于4℃冰箱融化，按10％体积加入胎牛血清，然后与小鼠肝癌细胞Hepa1-6共培养。采用CCK-8检测条件性培养基(CM)对Hepa1-6细胞增殖的影响。按照(2×103cells+0.1ml DMEM培养基) /孔，加入96孔细胞培养板(Corning，USA)，每组3个重复，检测72h时的细胞增殖情况。在指定时间点，向每孔中加入10μl Cell Counting Kit-8试剂(CCK-8，Dojindo，Japan)，并将细胞在37℃下孵育1h，然后使用Microplate读数器(Bio-Tek，USA)测量450nm 波长处的吸光度，并以630nm波长作为参比波长，然后计算细胞相对增殖倍数。
细胞相对增殖倍数＝(实验组OD值﹣背景值)/(对照组OD值﹣背景值)。
如图5A所示，感染小鼠的肝间质细胞CM能显著抑制Hepa1-6细胞的增殖，约为正常小鼠的肝间质细胞CM组的0.383±0.007倍(P<0.01)。
如图5B所示，感染小鼠的肝星状细胞CM能显著抑制Hepa1-6细胞的增殖，约为正常小鼠的肝星状细胞CM组的0.301±0.025倍(P<0.01)。
感染肝间质细胞对小鼠肝癌细胞体内生长的影响：
首先，观察了感染肝间质细胞对Hepa1-6肝癌细胞在小鼠体内生长的影响。25只4周龄的雄性BALB/c裸鼠，随机分为5组，每组5只。用不同比例的感染肝间质细胞与肿瘤细胞混合，注入小鼠，观察成瘤情况。感染或正常肝间质细胞与肿瘤细胞(Hepa1-6) 的比例如下：(1)感染20:1组；(2)感染10:1组；(3)正常20:1组；(4)正常10:1组；
(5)仅肿瘤细胞组。
将各组细胞混合后再打入裸鼠左右肩胛皮下，接种后每2天测量瘤体的长径和短径，瘤体的计算公式为：1/2×L×S2(L表示瘤体的长径，单位为mm；S表示瘤体的短径，单位为mm)，总共观察12天，第12天时剖杀裸鼠，取出瘤体称重，然后拍照。
如图6所示，相对于正常肝间质细胞组，感染肝间质细胞能显著抑制Hepa1-6细胞在体内的生长(P<0.05)，包括20：1(图6A)和10：1(图6B)组。在瘤体重量方面，相对于正常小鼠来源的肝间质细胞，来源于感染小鼠肝间质细胞的两个组，其瘤体肿瘤更轻，具有显著性差异(P<0.05)，包括20：1和10：1(图6C)组。
实施例6
抑制肿瘤细胞生长的日本血吸虫非编码小RNA的筛选与验证
选取了132条日本血吸虫miRNAs(Sja-miRNA)，委托上海吉玛制药有限公司合成这些miRNA mimics及对照(NC)mimics。利用脂质体转染试剂(lipo3000)将miRNA mimics按终浓度40nM的量分别体外转染小鼠肝癌细胞系Hepa1-6，48h后CCK8试剂盒检测细胞增殖，并采用流式细胞仪(FACS)检测细胞周期。
以上实验均以NC组和仅加入lipo3000组(Blk)为对照。
如图7所示，结果显示：筛选出6条显著抑制肿瘤细胞增殖且能使细胞周期阻滞在G0/G1阻滞的日本血吸虫miRNA，即Sja-miR-3096、Sja-miR-7-5p、Sja-miR-124、 Sja-miR-61，Sja-miR-3005和Sja-miR-71。
在此基础上，对部分筛选出来的Sja-miRNA的抗肿瘤活性进行体外验证，主要包括：
(1)Sja-miR-3096和Sja-miR-7-5p对肝癌细胞系细胞周期的影响：利用lipo3000将 miRNA mimics按终浓度40nM的量分别转染Hepa1-6和HepG2，48h后收集细胞并进行固定、加PI染料和过滤，采用FACS法检测细胞周期。
结果显示：Sja-miR-7-5p能显著阻滞HepG2人肝癌细胞在G0/G1期，见图8，同时，Sja-miR-3096和Sja-miR-7-5p能显著将Hepa1-6细胞阻滞在G0/G1期，见图7。
(2)Sja-miR-3096和Sja-miR-7-5p对肝癌细胞系细胞增殖的影响:利用lipo3000将 miRNA mimics按终浓度40nM的量分别转染Hepa1-6和HepG2，在一定时间点加入CCK8 试剂，酶标仪测定OD(A450)值，绘制细胞增殖曲线。
结果显示：Sja-miR-3096能显著抑制Hepa1-6细胞增殖，Sja-miR-7能显著抑制Hepa1-6 和HepG2细胞增殖，见图9。
(3)Sja-miR-3096和Sja-miR-7-5p对肝癌细胞系细胞迁移的影响:利用lipo3000将 miRNA mimics按终浓度40nM的量分别转染Hepa1-6和HepG2肿瘤细胞，24h后贴壁生长的细胞用胰酶消化，中和后1,000rpm离心3min。用不含血清培养基重悬细胞沉淀，充分均匀后计数，取2*104/100μl细胞悬液至Transwell上层小室，在下层小室加入500μl 完全培养基，将上层小室轻放浮于下层培养基上。24h后将上层小室内的细胞悬液吸掉，用PBS洗涤小室，甲醇室温固定小室细胞10min后，取出小室，用结晶紫染色15min。 PBS洗涤小室，用湿棉签小心擦拭上层小室底部表面附着的细胞。
显微镜下观察并随机选取5个视野进行拍照并计数。
结果显示：Sja-miR-3096和Sja-miR-7-5p均能显著抑制Hepa1-6和HepG2的细胞迁移，参考图10。
(4)Sja-miR-3096和Sja-miR-7-5p对肝癌细胞系克隆形成的影响:利用lipo3000将 miRNA mimics按终浓度40nM的量分别转染Hepa1-6和HepG2，24h后贴壁生长的细胞用胰酶消化，中和后1,000rpm离心3min。用PBS重悬细胞后1,000rpm离心3min。 200个细胞/孔加至24孔细胞培养板，每孔含1ml完全培养基，重复6孔。8～10天后，倒置显微镜下观察克隆形成情况。弃培养基，PBS洗涤，甲醇室温固定细胞10min后，弃固定液后PBS洗涤，然后用结晶紫染色15min。弃染液，用PBS洗涤，拍照，解剖显微镜下计数克隆数。
结果显示：Sja-miR-3096能显著抑制Hepa1-6细胞克隆形成，Sja-miR-7-5p能显著抑制Hepa1-6和HepG2细胞克隆形成，结果如图11所示。
(5)Sja-miR-3096和Sja-miR-7-5p对肝癌细胞划痕愈合的影响：利用lipo3000将miRNA mimics按终浓度40nM的量转染Hepa1-6。转染后24h，用灭菌的200μl微量移液器Tip头垂直于培养板底部划线，用PBS轻轻洗涤细胞表面以去除刮落的细胞。加入含低血清(2％FBS)DMEM培养基，显微镜下观察细胞状态并拍照，记录为0h，继续培养。24h、48h分别取出观察并拍照，标记为24h、48h。
结果显示：Sja-miR-3096和Sja-miR-7-5p均能显著抑制Hepa1-6肝癌细胞划痕愈合，结果如图12，表明其能抑制肿瘤细胞的迁移。
实施例7
日本血吸虫miRNA体内抑制肿瘤生长的作用
以Sja-miR-3096和Sja-miR-7-5p为例阐述其体内抗肿瘤的作用。
(1)对皮下成瘤的影响：
利用lipo3000将miRNA mimics按终浓度40nM的量分别转染Hepa1-6和HepG2。转染后24h，胰酶消化细胞，中和后1,000rpm离心3min。吸去上清，PBS重悬细胞并计数。调整细胞浓度，1×106/100μl PBS皮下接种于4周龄雄性裸鼠两侧肩胛处。每次重复实验5只小鼠，其中左侧接种miRNA组，右侧接种NC组。接种后第2、4、6、7 或8天测量瘤体长径和宽径，并计算肿瘤体积，在第7或8天时剖杀小鼠，瘤体拍照，收集瘤体相应样本待测。
结果显示：Sja-miR-3096能显著抑制Hepa1-6皮下成瘤，见图13，Sja-miR-7-5p能显著抑制HepG2皮下成瘤，见图14。
(2)稳定表达Sja-miR-3096的小鼠肝癌细胞株的筛选与鉴定：
将日本血吸虫pri-miR-3096构建至过表达miRNAs的pLVX质粒中：从日本血吸虫成虫基因组中通过PCR扩增日本血吸虫pri-miR-3096序列(约450bp)。上下游引物分别含BamHⅠ和AscⅠ酶切位点，酶切位点两端为与载体同源性的碱基。将PCR产物用无缝克隆体系连接至酶切后的pLVX质粒，转化感受态细菌后涂布氨苄抗性平板。选择阳性克隆保种并抽提质粒。将构建的pLVX-pri-3096质粒(0.8μg/孔)与空质粒 pLVX分别转染Hepa1-6细胞，转染后48h加入嘌呤霉素(3μg/ml)的完全培养基以杀死未转染成功的细胞。持续筛选两到三周后，收集细胞，用流式细胞仪分选带有绿色荧光且有嘌呤霉素抗药性的稳转细胞，并进行单克隆筛选。已筛选的稳转细胞株使用含 1.5μg/ml嘌呤霉素的完全培养基维持选择压力培养，并将实验组稳转株和空质粒对照稳转株分别命名为Hepa1-6/3096稳转株和Hepa1-6/pLVX稳转株。
结果显示：与稳定转染空质粒的对照细胞Hepa1-6/pLVX及空白Hepa1-6细胞相比，Hepa1-6/3096稳转株细胞其pri-miR-3096的表达量远远高于对照组细胞，细胞内 Sja-miR-3096成熟体的相对表达量同样高于对照组细胞，见图15A。2％琼脂糖凝胶电泳结果证实在450bp处能看到一条较亮的pri-miR-3096条带，见图15B，12％聚丙烯酰胺凝胶电泳显示在65bp处能到一条较亮的Sja-miR-3096成熟体条带，见图15C。
(3)Sja-miR-3096稳转细胞株生物学特性：
如上述方法提取稳转株总RNA并反转录，检测pri-miR-3096和Sja-miR-3096成熟体的表达水平，并进一步通过小RNA测序方法验证pLVX/3096稳转株中是否表达 Sja-miR-3096成熟体。采用同前述方法检测稳转细胞株的细胞周期、细胞增殖、克隆形成特点。
结果显示：与对照相比，pLVX/3096稳转细胞株细胞周期显著阻滞于G0/G1期、细胞增殖减慢、克隆形成能力减弱，见图16。
(4)Sja-miR-3096稳转细胞株皮下成瘤：
12只4周龄的雄性BALB/c裸鼠建立皮下瘤模型。将稳转株细胞(5×106/100μl) 接种至小鼠的左肩胛，每侧肩胛接种的终体积为100μl。接种后第3天起用测量皮下瘤的长径和宽径，并计算肿瘤的体积，每2天记录一次至接种后10天,并绘制肿瘤生长曲线。接种后第10天，处死小鼠并剥离肿瘤，拍照记录并称取瘤体重量。
结果显示：观察周期内，Hepa1-6/3096组一直未见明显瘤体，而Hepa1-6/pLVX对照组瘤体显著增大，见图17。
(5)Sja-miR-3096稳转株肝原位成瘤：
每组5只5周龄的雄性C57BL/6J建立肝原位成瘤模型。胰酶分别消化稳转细胞株Hepa1-6/pLVX和Hepa1-6/3096，1,000rpm离心3min，弃去上清。用DMEM重悬细胞沉淀，充分混匀计数后调整浓度，1×106/25μl分别肝原位接种Hepa1-6/pLVX和 Hepa1-6/3096细胞。3周后处理小鼠，称小鼠体重、肝重，剖取瘤体并测量长径和宽径、瘤体重量，拍照记录。
结果显示：接种3周后处理小鼠，Hepa1-6/3096组肝脏和腹腔内均未见明显瘤体，而 Hepa1-6/pLVX空载体对照组肝脏和腹腔中已形成较大瘤体，见图18。
(6)日本血吸虫miRNA在肿瘤移植动物模型中的抗瘤作用：
每组3只4周龄的雄性BALB/c裸鼠建立Hepa1-6皮下瘤模型。以2×106/100μl皮下接种于裸鼠两侧肩胛处。接种后2h，用25μl北京英格恩体内转染试剂与40μg溶于PBS 的Sja-miR-3096mimics或NC mimics室温混匀，尾静脉注射，随后每天一次，共注射4 次。每天观察小鼠状态并测量瘤体长径和宽径，于第5天处理小鼠，收集样本检测分析。结果显示：Hepa1-6接种皮下移植瘤后，利用体内转染试剂，经尾静脉注射的Sja-miR-3096 mimics能抑制肿瘤的体内生长，见图19。
实施例8
日本血吸虫exosome的制备及其内的非编码RNA检测
(1)日本血吸虫exosome的制备
虫卵培养上清中exosome的提取(按照SBI ExoQuick-TC说明书操作)：将6ml虫卵培养上清液首先经3,000×g离心15min以去除虫卵细胞及细胞碎片，并将上清小心吸取至另一洁净离心管；按照体积比5:1(样本：试剂)加入SBI ExoQuick-TC试剂，颠倒混匀，4℃过夜；次日将混合液(样本和试剂)1,500×g离心30min，小心吸去上清，剩余沉淀部分1,500×g再次离心5min，小心吸去上清，勿扰沉淀，留取部分上清作为对照，与沉淀一同放置-80℃备用。
(2)日本血吸虫虫卵exosome中miRNAs的检测：利用Trizol抽提exosome及对照上清的总RNA；设计茎环反转引物，采用qRT-PCR方法分别检测虫卵exosome和对照上清中的Sja-miR-3096。结果显示：Sja-miR-3096存在于虫卵exosome中，而提取exosome 后残余的上清中则很难检测到。说明日本血吸虫虫卵分泌的exosome中含有日本血吸虫特异的miRNA，见图20。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 同济大学
<120> 日本血吸虫感染及其组分在人类肿瘤预防和治疗中的应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> RNA
<213> Schistosoma japonicum
<400> 1
uuggaccacu gagccggcuc 20
<210> 2
<211> 23
<212> RNA
<213> Schistosoma japonicum
<400> 2
uggaagacug gugauauguu guu 23
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> Schistosoma japonicum
<400> 3
uaaggcacgc ggugaauguc a 21
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> Schistosoma japonicum
<400> 4
ugacuagaaa gugcacucac uu 22
<210> 5
<211> 20
<212> RNA
<213> Schistosoma japonicum
<400> 5
aaggaacaac ugcuugaagc 20
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> Schistosoma japonicum
<400> 6
aagucguacu gcugacugca u 21
<210> 7
<211> 23
<212> RNA
<213> Schistosoma japonicum
<400> 7
ugaaagacga ugguagugag aug 23
<210> 8
<211> 22
<212> RNA
<213> Schistosoma japonicum
<400> 8
uggcagauug ucuucggaau uu 22
<210> 9
<211> 20
<212> RNA
<213> Schistosoma japonicum
<400> 9
cuggcaggua gguuucccga 20
<210> 10
<211> 21
<212> RNA
<213> Schistosoma japonicum
<400> 10
agaagacugc cgcucguuuu a 21
<210> 11
<211> 22
<212> RNA
<213> Schistosoma japonicum
<400> 11
cgcguggauc ugucacacau ua 22
<210> 12
<211> 21
<212> RNA
<213> Schistosoma japonicum
<400> 12
aagguguuuc ccucggacaa a 21

Claims (10)

1.一组分离的日本血吸虫miRNA，其特征在于，所述miRNA具有如下特性：
(1)来源于日本血吸虫；
(2)序列如SEQ ID NO:n所示的miRNA，或与SEQ ID NO:n所示序列互补的miRNA，或如SEQ ID NO:n所示的miRNA在核心序列外的序列存在若干碱基替换、缺失而不影响其抗肿瘤作用的miRNA，或与SEQ ID NO:n所示序列互补的miRNA在核心序列外的序列存在若干碱基替换、缺失而不影响其抗肿瘤作用的miRNA，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12；
(3)能在体外或体内显示出有抑制肿瘤细胞生长的作用。
2.根据权利要求1所述一组分离的日本血吸虫miRNA，其特征在于，有抑制肿瘤细胞生长的作用包括抑制肿瘤细胞周期、或抑制肿瘤细胞增殖、或抑制肿瘤细胞迁移、或促进肿瘤细胞凋亡。
3.根据权利要求1所述一组分离的日本血吸虫miRNA，其特征在于，所述肿瘤细胞包括但不限于肝癌细胞，
序列如SEQ ID NO:n所示的miRNA能抑制小鼠肝癌细胞系增殖、迁移或周期阻滞，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10；
序列如SEQ ID NO:n所示的miRNA能抑制人肝癌细胞系增殖、迁移或周期阻滞，n为2、3、5、7、11、12。
4.一种pre-miRNA，其特征在于，为如权利要求1-3中任一项所述分离的日本血吸虫miRNA的前体。
5.一种脂质体，其特征在于，包含如权利要求1-3中任一项所述分离的日本血吸虫miRNA序列。
6.一种表达载体，其特征在于，包含如权利要求1-3中任一项所述分离的日本血吸虫miRNA序列。
7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，包含如权利要求5所述的脂质体，或权利要求6所述的表达载体，或染色体整合有权利要求1-3中任一项所述分离的日本血吸虫miRNA序列。
8.一种日本血吸虫的外泌体，其特征在于，具有以下特性：
(1)是日本血吸虫虫卵、童虫或成虫细胞主动向外分泌的大小均一的囊泡样小体；
(2)其直径为40～100nm，内含非编码小RNA蛋白质、脂质、核酸多种生物活性成分，包括能抑制肿瘤细胞生长，或抑制肿瘤细胞迁移，或促进肿瘤细胞凋亡的日本血吸虫非编码RNA。
9.一种日本血吸虫感染或日本血吸虫组分的应用，其特征在于，包括：
(1)日本血吸虫感染用于制备癌症治疗和/或预防癌症转移复发的药物的应用；
(2)日本血吸虫虫卵用于制备癌症治疗和/或预防癌症转移复发的药物的应用；
(3)日本血吸虫miRNA用于制备癌症治疗和/或预防癌症转移复发的药物的应用；
(4)日本血吸虫分泌蛋白质用于制备癌症治疗和/或预防癌症转移复发的药物的应用；
(5)权利要求4所述的日本血吸虫miRNA的前体用于制备癌症治疗和/或预防癌症转移复发的药物的应用；
(6)权利要求5所述的脂质体用于制备癌症治疗和/或预防癌症转移复发的药物的应用；
(7)权利要求6所述的表达载体用于制备癌症治疗和/或预防癌症转移复发的药物的应用；
(8)权利要求7所述的宿主细胞用于制备癌症治疗和/或预防癌症转移复发的药物的应用；
(9)权利要求8所述的日本血吸虫的外泌体用于制备癌症治疗和/或预防癌症转移复发的药物的应用；
(10)肿瘤患者体内的免疫细胞，通过日本血吸虫虫卵或日本血吸虫组分的体外刺激后回输入患者体内，用于恶性肿瘤的治疗；
所述免疫细胞包括但不限于巨噬细胞、NK细胞、T细胞、DC细胞。
10.一种抑制肿瘤生长或肿瘤治疗的组合物，其特征在于，所述的组合物含有有效量的权利要求1-3中任一项所述日本血吸虫miRNA，或权利要求8所述日本血吸虫的外泌体；或日本血吸虫分泌蛋白质；以及药学上可接受的载体。
CN201811436581.8A 2018-11-28 2018-11-28 日本血吸虫感染及其组分在人类肿瘤预防和治疗中的应用 Pending CN109536497A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811436581.8A CN109536497A (zh) 2018-11-28 2018-11-28 日本血吸虫感染及其组分在人类肿瘤预防和治疗中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811436581.8A CN109536497A (zh) 2018-11-28 2018-11-28 日本血吸虫感染及其组分在人类肿瘤预防和治疗中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109536497A true CN109536497A (zh) 2019-03-29

Family

ID=65850700

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811436581.8A Pending CN109536497A (zh) 2018-11-28 2018-11-28 日本血吸虫感染及其组分在人类肿瘤预防和治疗中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109536497A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113832103A (zh) * 2021-08-13 2021-12-24 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) 弓形虫感染dc的外泌体制备及其应用
CN115850426A (zh) * 2022-07-13 2023-03-28 中国人民解放军海军军医大学 日本血吸虫虫卵及其分泌排泄蛋白抗肿瘤的作用及制备和用途

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104994861A (zh) * 2012-10-18 2015-10-21 西澳大学 使用miRNA的癌症疗法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104994861A (zh) * 2012-10-18 2015-10-21 西澳大学 使用miRNA的癌症疗法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GUOFENG CHENG等: "Deep sequencing-based identification of pathogen-specific microRNAs in the plasma of rabbits infected with Schistosoma japonicum", 《PARASITOLOGY》 *
LIHUI ZHU等: "Role of microRNAs in schistosomes and schistosomiasis", 《FRONTIERS IN CELLULAR AND INFECTION MICROBIOLOGY》 *
YU LIN等: "Cross-Species Suppression of Hepatoma Cell Growth and Migration by a Schistosoma japonicum MicroRNA", 《MOLECULAR THERAPY: NUCLEIC ACIDS》 *
刘成兴等: "MicroRNA在血吸虫与血吸虫病中的作用研究", 《齐齐哈尔医学院学报》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113832103A (zh) * 2021-08-13 2021-12-24 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) 弓形虫感染dc的外泌体制备及其应用
CN113832103B (zh) * 2021-08-13 2023-08-22 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) 弓形虫感染dc的外泌体制备及其应用
CN115850426A (zh) * 2022-07-13 2023-03-28 中国人民解放军海军军医大学 日本血吸虫虫卵及其分泌排泄蛋白抗肿瘤的作用及制备和用途
WO2024012540A1 (zh) * 2022-07-13 2024-01-18 中国人民解放军海军军医大学 日本血吸虫虫卵及其分泌排泄蛋白抗肿瘤的作用及制备和用途

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106591306B (zh) 靶向干扰肿瘤ptn-ptprz1通路的小干扰rna在肿瘤免疫治疗中的应用
CN104740648A (zh) miRNA-214抑制剂在抑制调节性T细胞中的应用
CN109536497A (zh) 日本血吸虫感染及其组分在人类肿瘤预防和治疗中的应用
CN111686124B (zh) miR-486-3p在制备治疗SAH导致的神经炎症产品中的应用
CN110496222A (zh) 人ncaph基因的用途
CN102552935A (zh) 肝细胞核因子1α治疗慢性肝病的用途
CN114099546A (zh) 一种基因修饰的人脐带间充质干细胞制剂在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用
WO2024235330A1 (zh) 小核酸在制备治疗猫传染性腹膜炎药物中的应用
CN110960546A (zh) MicroRNAs在制备索拉非尼治疗肝癌的增强剂中的应用
Xia et al. Human tissue-specific microenvironment: an essential requirement for mouse models of breast cancer
CN104368012B (zh) 人rpl34基因的用途及其相关药物
CN113995753A (zh) 一种中药分子槐果碱在制备治疗胶质母细胞瘤药物上的应用
CN119391853B (zh) Kif13b基因在治疗腹主动脉瘤中的应用
KR20140143880A (ko) miRNA의 발현 증가를 이용한 성체줄기세포의 노화 억제 조성물
CN119709745B (zh) 抑制BCL-9的shRNA、重组病毒载体在治疗视网膜血管新生相关疾病中的应用
CN117138048B (zh) Dock6在制备防治眼部新生血管性疾病药物中的应用
CN120249281B (zh) 干扰FIBCD1表达的shRNA、重组质粒、载体及应用
CN118356498B (zh) Reps2的表达抑制剂在制备防治1,2-二氯乙烷引起的大脑中毒性神经炎症的药物中的应用
CN113373144B (zh) 用于皮肤再生和修复的组合物及其制备方法和用途
CN112626068B (zh) 一种靶向Notch1基因的LncRNA及其应用
CN111053762B (zh) 狼毒乙素在制备治疗黑色素瘤药物中的应用
CN108324946B (zh) miRNA708、和/或301簇的微小RNA在改善心脏功能方面的应用
CN119679945A (zh) circRNA 3254在制备预防移植胰岛细胞早期凋亡的制剂或药物中的应用
CN120983512A (zh) 丹参外囊泡在制备抗肺炎药物中的应用
CN109971762B (zh) 日本血吸虫eIF4A基因的siRNA及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190329