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CN109536455B - 一种car-nk细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

一种car-nk细胞及其制备方法和应用 Download PDF

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CN109536455B CN201811509243.2A CN201811509243A CN109536455B CN 109536455 B CN109536455 B CN 109536455B CN 201811509243 A CN201811509243 A CN 201811509243A CN 109536455 B CN109536455 B CN 109536455B
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Abstract

本发明公开了一种CAR‑NK细胞及其制备方法和应用，属于细胞治疗领域、生物制药领域，本发明将脐血作为NK细胞来源，解决了NK细胞系、外周血和自体血来源的CAR‑NK细胞存在一些问题，比如操作复杂，具有成瘤风险，细胞活性不够，细胞数量少，部分异体来源的细胞会引GVHD等问题。

Description

一种CAR-NK细胞及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于细胞治疗领域、生物制药领域，具体涉及以脐血作为异体细胞来源的CAR-NK细胞，以及利用人源嵌合抗原受体修饰来进行肿瘤及感染性疾病的治疗。
背景技术
嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)修饰的T细胞(CAR-T)在白血病研究中取得了重大突破，为血液肿瘤患者带来了新的希望。但是CAR-T治疗也存在着一些问题，比如脱靶效应、细胞因子风暴、插入突变等，并且对实体瘤尚未取得显著疗效。研发新的具有强大抗肿瘤作用的效应细胞具有重要的理论意义和临床应用价值。NK细胞(自然杀伤细胞，natural killer cell)因其特殊的识别靶细胞的机制、短暂的生理周期、广泛的肿瘤杀伤能力等优势，被视为同样有潜力通过CAR修饰增强其抗肿瘤能力的效应细胞。
NK细胞是一类对肿瘤细胞具有强力杀伤作用且MHC非依赖的淋巴细胞，其对肿瘤细胞的识别主要依赖于其表面活化性受体和抑制性受体的相互交叉调控。当识别肿瘤细胞之后，NK细胞通过释放杀伤介质穿孔素和颗粒酶使靶细胞凋亡、表达膜TNF家族分子诱导靶细胞凋亡和抗体依赖的细胞毒作用等多种途径杀伤肿瘤细胞。通过CAR修饰NK细胞有望增强其靶向杀伤肿瘤细胞的能力并研制出具有强大抗肿瘤作用的效应细胞。目前已有大量研究针对不同的肿瘤靶点设计出相应的CAR-NK，在实验研究中取得的效果显著，并正在临床研究中验证其可行性。例如专利申请号为CN201810069667的文中阐述了一种靶向CSF1R嵌合抗原受体修饰的NK92MI细胞和T细胞及其制法和应用。申请号CN201810036254文中阐述了一种以CD33为靶点的特异性抗体、CAR-NK细胞及其制备和应用。申请号CN201810036245文中阐述了一种以CD19为靶点的特异性抗体、CAR-NK细胞及其制备和应用。
目前相关专利中制作CAR-NK的NK细胞来源主要有3种途径。(1)NK细胞系，包括NK-92、NKG、YT、NK-YS、HANK-1和NKL等，其中NK-92在CAR-NK中研究最为广泛，NK-92具有强大的细胞毒性，高表达一系列与细胞溶解相关的分子，例如穿孔素和颗粒酶B。同时缺乏表面杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer-cell immunoglobulin-like receptors，KIRs)等表面抑制性受体，抑制性受体信号的缺失使得其对多种肿瘤的杀伤能力要优于原代NK细胞。但是NK-92也存在着一些明显的缺点，例如致瘤性和潜在的EB病毒易感性等。因此，作为安全考虑，NK-92必须经过辐照后才能够使用。(2)自体外周血来源NK细胞，自体CAR-NK细胞回输，其抑制性受体与自体正常细胞表达的HLA-Ⅰ类分子结合而产生抑制信号，会抑制NK细胞的杀伤效应。虽然肿瘤细胞丢失了经典的HLA-Ⅰ类分子，但是非经典的HLA-Ⅰ类分子HLA-G、HLA-E等的表达，同样能够抑制NK细胞的活化。同时由于肿瘤患者体内NK细胞数量、质量的下降和肿瘤逃逸机制的存在，其在体内的抗肿瘤功能未能得到充分发挥。(3)异体外周血来源的NK细胞，异体NK细胞的KIRs由于与患者HLA-Ⅰ类分子并不匹配，因此并不会产生抑制信号引起干扰。但是，异体NK细胞供者血液中存在着以T细胞为主的其他淋巴细胞，这些其他免疫细胞的存在会引起移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)。因此在用于治疗之前，必须要清除T细胞，但同时也会损失一些在杀伤过程中起到辅助功能的其他淋巴细胞。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种CAR-NK细胞，该NK细胞来源于脐血单个核细胞。
脐血作为另一种异体免疫细胞来源，有着诸多优势，无伦理问题，医疗废弃物再利用，来源丰富，容易筛选最优的供者，脐血中淋巴细胞发育不成熟，多为幼稚细胞，免疫原性低，移植后发生急性慢性GVHD的几率低程度轻。脐血中的NK细胞通过体外分离扩增活化后可以获得大量有着杀瘤活性的NK细胞，通过CAR基因修饰后，作为成药冻存，需要时复苏使用，使其成为药品一样现成的易得的治疗方式，即“off-the-shelf”的概念。因此，脐血能成为异体CAR-NK细胞比较理想的来源，经过实验，也能符合制药要求。
本发明所述的脐血来自于足月产的健康婴儿的脐带和胎盘，无家族遗传病史，产妇无传染病史，胎儿健康产程顺利。
可选或优选的，NK细胞为脐血中的NK细胞和/或脐血中造血干细胞诱导而来的NK细胞。
可选或优选的，CAR特异性识别的抗原为肿瘤特异性抗原、病毒抗原、细菌抗原、寄生虫的蛋白抗原、或寄生虫的糖蛋白抗原；
所述肿瘤特异性抗原为：CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD44v7/8、CEA、EGP-2、EGP-40、erb-B2、erb-B 2,3,4、FBP、Fetal acetylcholine receptor、GD2、GD3、Her2/neu、IL-13R-a2、KDR、LeY、MAGE-A1、Mesothelin、MUC1、NKG2D ligands、Oncofetal antigen、PSCA、PSMA、TAG-72、或VEGF-R2。
可选或优选的，所述CAR的结构包括依次连接的SP、scFv、CD8铰链区、CD28TM+ICD、4-1BB和CD3ζ。
该CAR为第三代，不仅包含CD3ζ信号域，还包括两个共刺激信号分子CD28TM+ICD、4-1BB，共刺激信号分子解决了CAR-NK细胞作用不持久等问题，而CD8铰链区、scFv(胞外抗原识别域，通常为单链抗体，也可以是多肽或其他蛋白)、SP(信号肽)同第一代。其中SP和scFv位于胞外，CD28TM+ICD、4-1BB和CD3ζ位于胞内。
可选或优选的，上述CAR-NK细胞中，CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，scFv为EGFRvIII。
SEQ ID NO.1EGFRvIII CAR序列
MALPVTALLLPLALLLHAARPEIQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGSGFNIEDYYIHWVRQMPGKGLEWMGRIDPENDETKYGPIFQGHVTISADTSINTVYLQWSSLKASDTAMYYCAFRGGVYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLDSDGKTYLNWLQQKPGQPPKRLISLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCWQGTHFPGTFGGGTKVEIKNWSHPQFEKGGGGSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*
其中，SP氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：MALPVTALLLPLALLLHAA。
scfv氨基酸序如SEQ ID NO:3所示：(EGFRvIII)
DVVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLDSDGKTYLNWLQQKPGQPPKRLISLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCWQGTHFPGTFGGGTKVEIK。
CD8hinge氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示：
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD。
CD28跨膜域氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示：
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV。
胞内信号结构域由CD28、4-1BB和CD3zeta组成,氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示：
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*。
可选或优选的，CAR核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示：
atggccctccctgtcaccgccctgctgcttccgctggctcttctgctccacgccgctcggcccgagattcagctcgtgcaatcgggagcggaagtcaagaagccaggagagtccttgcggatctcatgcaagggtagcggctttaacatcgaggattactacatccactgggtgaggcagatgccggggaagggactcgaatggatgggacggatcgacccagaaaacgacgaaactaagtacggtccgatcttccaaggccatgtgactattagcgccgatacttcaatcaataccgtgtatctgcaatggtcctcattgaaagcctcagataccgcgatgtactactgtgctttcagaggaggggtctactggggacagggaactaccgtgactgtctcgtccggcggaggcgggtcaggaggtggcggcagcggaggaggagggtccggcggaggtgggtccgacgtcgtgatgacccagagccctgacagcctggcagtgagcctgggcgaaagagctaccattaactgcaaatcgtcgcagagcctgctggactcggacggaaaaacgtacctcaattggctgcagcaaaagcctggccagccaccgaagcgccttatctcactggtgtcgaagctggattcgggagtgcccgatcgcttctccggctcgggatcgggtactgacttcaccctcactatctcctcgcttcaagcagaggacgtggccgtctactactgctggcagggaacccactttccgggaaccttcggcggagggacgaaagtggagatcaagaactggagccacccccagttcgagaagggcggtggcggaagcaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa。
本发明还提供了以上任一所述CAR-NK细胞的制备方法，是将NK细胞与含有细胞因子的培养基一起培养进行活化，再通过基因修饰使CAR表达于NK细胞中。
基因修饰包括基因的重组，过表达以及基因敲除，比如嵌合抗原受体的表达，PD-1、TIM3的敲除。基因修饰采用的技术手段包括慢病毒，逆转录病毒，电转，睡美人转座等。所述的基因敲除方法，包括但不限于CRISPR技术、ZFN技术、TALEN技术等。
可选或优选的，上述制备方法中，所述细胞因子包括IL-2、IL-15、IL-7、IL-21中的一种或几种。
本发明还提供了一种上述含有SEQ ID NO.1-6或SEQ ID NO.7的CAR制备方法，包括以下步骤：
(1)脐血单个核细胞分离提取：取脐血，通过密度梯度离心获取单个核细胞。
(2)NK细胞活化：步骤(1)的单个核细胞接种在含有1～10％脐血自体血浆、200～1500IU/mL的IL-2、10～50ng/mL的IL-15、10～30ng/mL的IL-7和50～100ng/mL的IL-21淋巴细胞培养基培养，并在第3d按细胞密度0.8～1.0×106个/mL补液；培养至第5d，收获活化的NK细胞；
(3)用构建有CAR的慢病毒转导活化的NK细胞，培养；获得CAR-NK细胞；
(4)CAR-NK细胞扩增培养：第5d转袋并按细胞密度0.8～1.0×106个/mL补液，之后每隔嵌2d按细胞密度0.8～1.0×106个/mL补液，扩增到第15d后，收获细胞。
本发明还提供了以上任一所述CAR-NK细胞在制备药物中的应用，所述药物治疗的疾病对应于CAR-NK中嵌合抗原的种类。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明将脐血作为NK细胞来源，解决了NK细胞系、外周血和自体血来源的CAR-NK细胞存在一些问题，比如操作复杂，具有成瘤风险，细胞活性不够，细胞数量少，部分异体来源的细胞会引GVHD等问题。
本发明CAR-NK细胞在杀瘤方面显著优于NK细胞。
附图说明
图1为本发明实施例中EGFRvIII-CAR-NK细胞的转导效率检测结果。
图2为本发明实施例中EGFRvIII-CAR-NK细胞及NK细胞对阳性靶细胞U87(EGFRvIII)的体外杀伤效率。
图3为本发明实施例中EGFRvIII-CAR-NK细胞及NK细胞对阴性靶细胞Raji的体外杀伤效率。
图4为本发明实施例中EGFRvIII CAR结构。
图5为本发明实施例中PLVX-EGFRvIII-strepII质粒图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1脐血单个核细胞提取
(1)取脐血50mL，平均分装于2支50mL离心管中，于室温下650g离心15min，取上层淡黄色血浆至新的50mL离心管中(下层红色液体用于提取单个核细胞)，将血浆于56℃水浴锅中灭活30min，然后900g离心10min，取上清，置于-20℃环境中15min；再次离心，900g，10min，取上清，置于4℃保存待用。(离心机调节升速1，降速1)。
(2)取上一步血浆提取中得到的下层红色液体用生理盐水等体积稀释，总体积约20mL，颠倒混匀，备用。另取2支新的50mL的离心管，每管加入淋巴细胞分离液20mL。将20mL稀释后的血液加入到含20mL淋巴细胞分离液的离心管中，使血液和淋巴细胞分离液形成一个明显的分层，室温650g离心30min。(离心机调节升速1，降外周血速1)。
(3)轻轻吸取单核细胞(白膜层)以及它下面一半的淋巴细胞分离液并转移至新的50mL离心管内；加入等体积生理盐水，室温260g离心10min。弃上清，再次用生理盐水清洗细胞，离心，弃上清。重复清洗步骤，用生理盐水重悬细胞，同时取少量细胞悬液台盼蓝染色计数，计数后260g离心10min，弃上清，备用。
实施例2脐血NK细胞诱导活化
实施例1中获得的单个核细胞按细胞密度2×106个/mL接种在含有1～10％脐血自体血浆，200～1500IU/mL的IL-2，10～50ng/mL的IL-15，10～30ng/mL的IL-7和50～100ng/mL的IL-21淋巴细胞培养基中，放入37℃，5％CO2培养箱中培养，并在第3d按细胞密度0.8～1.0×106个/mL补液。
实施例3外周血和脐血来源的NK细胞表面标志物检测
取50mL外周血，按实施例1中的方法提取单个核细胞，按实施例2中方法进行活化培养。
取实施例2中细胞和活化培养的外周血来源的NK细胞，用PBS洗2次，后加入鼠IgG，4℃避光30min；分别加入特异性抗体CD16、CD161、NKG2A、NKG2D、NKp46，4℃避光孵育30min。将染色后的细胞洗2次，用流式细胞仪检测上述标志物。统计学方法采用SPSS10统计软件。所有数据以珋x±s表示，采用t检验和Mann-Whitney检验。结果见表1，两种来源的NK细胞在表型上没有明显差异。
表1脐血及外周血NK细胞表面标志表达
观察项目 脐血NK细胞 外周血NK细胞
CD16 90.71±8.05 93.22±5.44
CD161 83.08±9.18 70.87±12.54
NKG2A 75.34±8.39 25.88±2.31
NKG2D 93.67±5.05 96.54±2.56
NKp46 94.23±5.06 88.98±6.74
注：与外周血NK细胞比较，P＜0.05。
实施例4外周血和脐血来源的NK细胞功能相关指标检测
取实施例2中细胞和活化培养的外周血来源的NK细胞于37℃用PMA(20ng/ml)和ionomycin(1μg/ml)刺激4h，加入monensin(10μg/ml)阻断细胞因子分泌；细胞洗2次，加入特异性抗体CD3、CD56，4℃避光孵育30min，标记表面标志。将Fix/Perm液加入标记过后的细胞中室温放置20min，加入IFN-γ、TNF-α、granzyme B、perforin等内标抗体室温放置1h。细胞洗2次，上机检测。外周血和脐血来源的NK细胞颗粒酶B、穿孔素、FasL、IFN-γ、TNF-α表达。统计学方法采用SPSS 10统计软件。所有数据以珋x±s表示，采用t检验和Mann-Whitney检验。结果见表2，脐血来源的NK细胞除了颗粒酶B的释放较少，其他功能性蛋白跟外周血来源的NK没有明显差异。
表2脐血及外周血NK细胞功能蛋白表达
观察项目 脐血NK细胞 外周血NK细胞
IFN-γ 45.43±8.36 34.98±12.88
颗粒酶B 2.45±1.98 70.34±4.94
穿孔素 40.36±18.53 35.27±13.84
TNF-α 1.97±1.24 1.84±1.38
注：除了颗粒酶，其他指标与外周血NK细胞比较，P＜0.01。
实施例5利用慢病毒将EGFRvIII-CAR转染至脐血来源NK细胞中
(1)实施例2中的NK细胞活化培养至第5d后收获细胞，按MOI为3加入LVEGFRvIII-CAR病毒(该病毒含有表达质粒PLVX-EGFRvIII-strepII，结构参见实施例7，能够表达EGFRvIII-CAR)进行转导，混匀后置于CO2培养箱孵育，4小时后补加适量的NK细胞完全培养基进行培养(慢病毒转导成功后获得EGFRvIII-CAR-NK细胞)。慢病毒转导24小时后将转导后EGFRvIII-CAR-NK细胞换入新鲜培养液，并调整活细胞密度为1.0×106/mL，继续培养扩增10～20天，每天进行观察和计数，并根据计得的细胞数量进行补液扩大培养，始终保持细胞培养密度为1.0×106/mL。
(2)EGFRvIII-CAR-NK转导效率检测
取1.0×106个转导后NK细胞，与Goat anti-Human IgG Antibody，FITCconjugate室温孵育30分钟，生理盐水清洗两次后，通过流式细胞仪检测FITC荧光信号，测量FITC阳性细胞比率，反映了CAR-NK细胞在总细胞中的比率。检测结果如图1和下表所示。说明成功制备了EGFRvIII-CAR-NK细胞。
表3 EGFRvIII-CAR-NK细胞的转导效率检测结果
转导类型 EGFRvIII-CAR-NK
转导效率 30.6％
实施例6 EGFRvIII-CAR-NK体外杀伤功能检测
采用钙黄绿素检测法对EGFRvIII-CAR-NK细胞进行体外杀瘤功能检测。取适量U87细胞作为靶细胞，在1×106/mL的细胞悬液(PBS，5％胎牛血清)加入钙黄绿素-乙酰羟甲基酯(Calcein-AM)至终浓度25μM，培养箱中孵育30min。常温下，洗两遍后将细胞重悬至1.5×105/mL。按不同效靶比加入EGFRvIII-CAR-NK细胞，200g离心30秒，37℃孵育2～3小时。孵育完成后取上清，测量其中钙黄绿素的荧光强度，并根据自发释放对照和最大释放对照，计算靶细胞裂解百分数。
杀瘤实验数据：对慢病毒转导的NK细胞在应用前需进行其对肿瘤细胞系杀伤等功能性检测，使用钙黄绿素检测法。结果参见图2和图3及表4和表5。结果显示，EGFRvIII-CAR-NK细胞对高表达EGFRvIII的肿瘤细胞具有特异杀伤活性，而对EGFRvIII阴性细胞没有杀瘤活性，体现了很好的靶向性。
表4 EGFRvIII-CAR-NK细胞及NK细胞对阳性靶细胞U87的体外杀伤效率
Figure BDA0001900274390000071
表5 EGFRvIII-CAR-NK细胞及NK细胞对阴性靶细胞Raji的体外杀伤效率
Figure BDA0001900274390000081
实施例7EGFRvIII-CAR表达载体构建
通过人工合成SEQ ID NO:7所示的长度为1647bp的DNA片段，其中，第1-57位的核苷酸编码SP，第58-801位的核苷酸编码靶向EGFRvIII的SCFV，第844-978位的核苷酸编码CD8铰链区，第979-1182位的核苷酸编码CD28TM+ICD，第1183-1308位的核苷酸编码4-1BB，第1309-1647位的核苷酸编码CD3 zeta，具体结构示意图见附图4。后面三个区域构成胞内信号区。
将上述DNA片段插入慢病毒表达载体PLVX的EF1alpha启动子下游，得到靶向EGFRvIII的嵌合抗原受体表达质粒PLVX-EGFRvIII-strepII，质粒图谱见附图5。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 武汉波睿达生物科技有限公司
<120> 一种CAR-NK细胞及其制备方法和应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 548
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
20 25 30
Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe
35 40 45
Asn Ile Glu Asp Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asn Asp Glu Thr Lys
65 70 75 80
Tyr Gly Pro Ile Phe Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
85 90 95
Ile Asn Thr Val Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr
100 105 110
Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Phe Arg Gly Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly
115 120 125
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr
145 150 155 160
Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile
165 170 175
Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr
180 185 190
Leu Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu Ile
195 200 205
Ser Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
210 215 220
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
225 230 235 240
Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gly
245 250 255
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asn Trp Ser His Pro
260 265 270
Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg
275 280 285
Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg
290 295 300
Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly
305 310 315 320
Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val
325 330 335
Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp
340 345 350
Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met
355 360 365
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala
370 375 380
Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys
385 390 395 400
Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr
405 410 415
Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly
420 425 430
Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
435 440 445
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
450 455 460
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
465 470 475 480
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
485 490 495
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
500 505 510
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
515 520 525
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
530 535 540
Leu Pro Pro Arg
545
<210> 2
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala
<210> 3
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Ser Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Gly Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 4
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 5
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 6
<211> 195
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu
35 40 45
Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln
50 55 60
Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly
65 70 75 80
Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
85 90 95
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
100 105 110
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
115 120 125
Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
130 135 140
Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
145 150 155 160
Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
165 170 175
Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
180 185 190
Pro Pro Arg
195
<210> 7
<211> 1647
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60
cccgagattc agctcgtgca atcgggagcg gaagtcaaga agccaggaga gtccttgcgg 120
atctcatgca agggtagcgg ctttaacatc gaggattact acatccactg ggtgaggcag 180
atgccgggga agggactcga atggatggga cggatcgacc cagaaaacga cgaaactaag 240
tacggtccga tcttccaagg ccatgtgact attagcgccg atacttcaat caataccgtg 300
tatctgcaat ggtcctcatt gaaagcctca gataccgcga tgtactactg tgctttcaga 360
ggaggggtct actggggaca gggaactacc gtgactgtct cgtccggcgg aggcgggtca 420
ggaggtggcg gcagcggagg aggagggtcc ggcggaggtg ggtccgacgt cgtgatgacc 480
cagagccctg acagcctggc agtgagcctg ggcgaaagag ctaccattaa ctgcaaatcg 540
tcgcagagcc tgctggactc ggacggaaaa acgtacctca attggctgca gcaaaagcct 600
ggccagccac cgaagcgcct tatctcactg gtgtcgaagc tggattcggg agtgcccgat 660
cgcttctccg gctcgggatc gggtactgac ttcaccctca ctatctcctc gcttcaagca 720
gaggacgtgg ccgtctacta ctgctggcag ggaacccact ttccgggaac cttcggcgga 780
gggacgaaag tggagatcaa gaactggagc cacccccagt tcgagaaggg cggtggcgga 840
agcaccacga cgccagcgcc gcgaccacca acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc 900
ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg 960
ctggacttcg cctgtgattt ttgggtgctg gtggtggttg gtggagtcct ggcttgctat 1020
agcttgctag taacagtggc ctttattatt ttctgggtga ggagtaagag gagcaggctc 1080
ctgcacagtg actacatgaa catgactccc cgccgccccg ggcccacccg caagcattac 1140
cagccctatg ccccaccacg cgacttcgca gcctatcgct ccaaacgggg cagaaagaaa 1200
ctcctgtata tattcaaaca accatttatg agaccagtac aaactactca agaggaagat 1260
ggctgtagct gccgatttcc agaagaagaa gaaggaggat gtgaactgag agtgaagttc 1320
agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag cagggccaga accagctcta taacgagctc 1380
aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag 1440
atggggggaa agccgagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa 1500
gataagatgg cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag 1560
gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt 1620
cacatgcagg ccctgccccc tcgctaa 1647

Claims (5)

1.一种CAR-NK细胞，其特征在于，所述NK细胞来源于脐血单个核细胞，是脐血中的NK细胞和/或脐血中造血干细胞诱导而来的NK细胞，经过以下方法活化获得：
单个核细胞按细胞密度2×106个/mL接种在含有1～10％脐血自体血浆，200～1500IU/mL的IL-2，10～50ng/mL的IL-15，10～30ng/mL的IL-7和50～100ng/mL的IL-21淋巴细胞培养基中，放入37℃，5％CO2培养箱中培养，并在第3d按细胞密度0.8～1.0×106个/mL补液；
所述CAR的结构包括依次连接的SP、scFv、CD8铰链区、CD28TM+ICD、4-1BB和CD3ζ，CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的CAR-NK细胞，其特征在于，CAR核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
3.权利要求1或2所述CAR-NK细胞的制备方法，其特征在于，将NK细胞与含有细胞因子的培养基一起培养进行活化，再通过基因修饰使CAR表达于NK细胞中。
4.权利要求3所述CAR-NK细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)脐血单个核细胞分离提取：取脐血，通过密度梯度离心获取单个核细胞；
(2)NK细胞活化：步骤(1)的单个核细胞接种在含有1～10％脐血自体血浆、200～1500IU/mL的IL-2、10～50ng/mL的IL-15、10～30ng/mL的IL-7和50～100ng/mL的IL-21淋巴细胞培养基培养，并在第3d按细胞密度0.8～1.0×106个/mL补液；培养至第5d，收获活化的NK细胞；
(3)用构建有CAR的慢病毒转导活化的NK细胞，培养；获得CAR-NK细胞；
(4)CAR-NK细胞扩增培养：第5d转袋并按细胞密度0.8～1.0×106个/mL补液，之后每隔嵌2d按细胞密度0.8～1.0×106个/mL补液，扩增到第15d后，收获细胞。
5.权利要求1或2所述CAR-NK细胞在制备药物中的应用，所述药物治疗的疾病对应于CAR-NK中嵌合抗原的种类。
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