CN109536437B - 一种维持稳定性、高滴度病毒抗原生产的悬浮细胞病毒的培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种维持病毒抗原生产稳定性，提高病毒有效含量的悬浮细胞病毒的培养方法，该方法在细胞培养阶段使用无血清培养方法，一次换液后降低了细胞代谢物对细胞生长的影响及后期病毒生产的干扰，换液后加入硫酸葡聚糖等有效起到提高病毒感染敏感性及细胞分散的作用，后期接毒换液体系中加入PEG6000及高钙溶液提高了接毒效率并大幅增加了口蹄疫病毒的稳定性。制备的病毒液滴度可高达10^7.0‑10^9.01ogTCID₅₀/mL，完全抗原146S含量可达6ug/ml以上且培养的口蹄疫病毒更稳定。

Description

一种维持稳定性、高滴度病毒抗原生产的悬浮细胞病毒的培 养方法

技术领域

本发明属于细胞的培养和维持，以及病毒抗原的制备领域，特别涉及维持稳定性、高滴度病毒抗原生产的悬浮细胞病毒的培养方法、培养的病毒、制备含该病毒抗原的疫苗组合物。

背景技术

利用动物细胞培养技术生产病毒的过程是指使用液体培养基在特定容器中大规模培养动物细胞,然后接入病毒使其在细胞中大量增殖的过程。1928年，Maitland创建利用组织培养的方法体外繁殖病毒的技术。1949年Enders利用Hela细胞体外培养脊髓灰质炎病毒并进行疫苗生产,这标志着动物细胞培养技术正式应用于疫苗生产领域。1962年,Capsti等将BHK贴壁细胞驯化为生长稳定、对口蹄疫病毒敏感的BHK悬浮细胞,这使得悬浮培养技术首次成功应用于兽用疫苗生产。1965年,Telling等首先尝试将基于BHK悬浮细胞的大规模生物反应器体系(30L)应用于口蹄疫疫苗工业化生产。1985年,悬浮培养工艺己成为口蹄疫疫苗生产中普遍采用的方法。生产能力上,口蹄疫疫苗生产企业的制造工艺也在不断升级。早在十年前,英国Wellcome公司就已成功将生产规模扩大到5000L。目前,20000L生物反应器已经投入使用,将显著降低生产成本并提高疫苗产品的生产质量。2011年由我国农业部发布的第1708号公告中己明确指出,自2012年起采用滚瓶等传统方式生产的兽用疫苗生产线将停止受理GMP验收的申请。凭借细胞生长环境均一、培养操作简单可控、大规模体系中容易放大、清洁、对环境损害较小和生产成本较低等优势,悬浮细胞培养必将成为未来产业发展的新方向。

但是，伴随着BHK悬浮细胞大规模培养在病毒培养工业化上的应用，一些问题也随之放大，其中最突出也最具有迷惑性的现象就是BHK悬浮细胞在病毒培养上病毒数量、质量高低与培养细胞的密度、状态关系不稳定。往往细胞生长状态良好但会出现培养出的病毒质量较差的现象发生。就此国内外大量的科研院所与疫苗生产企业都做了大量的研究工作，目前较为普遍的解决手段主要有调整接毒量，调整接毒时间，更换培养基等几类，然而目前尚没有一个系统、稳定、符合大规模生产条件的可行解决方法。

现有技术主要问题在于，细胞培养与病毒培养割离评判，现有技术主要将精力放在前期细胞培养的培养密度及细胞生长状态上了，然而实际情况是细胞密度高时病毒培养后病毒量并不一定多。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供了一种维持稳定性、高滴度病毒抗原生产的悬浮细胞病毒的培养方法，其中，所述方法包括：步骤(1)将悬浮细胞进行稀释传代，培养，使得悬浮细胞处于传代后细胞密度为0.5×10⁶-0.6×10⁶cells/ml，得到悬浮细胞种子；步骤(2)在生物反应器中接入所述步骤(1)中所述悬浮细胞种子，培养至所述悬浮细胞密度达到≥1-2×10⁶cells/毫升；步骤(3)从所述步骤(2)中所述细胞密度达到1-2×10⁶cells/ml时的悬浮细胞分离掉培养基，替换加入无血清DMEM/F12培养基进行重悬，所述无血清DMEM培养基由以下组分组成：DMEM/F12液体培养基，pH为7.0～7.2，含有1-3μg/ml胰岛素、1～10μg/ml转铁蛋白、0.2～0.8μg/ml硫酸葡聚糖；步骤(4)培养所述悬浮细胞，使其适应所述无血清DMEM培养基生长环境，之后，加入终浓度0.01-0.3％v/v的PEG6000，再按MOI＝0.01-0.1接种口蹄疫病毒；以及步骤(5)继续培养，加入CaCL₂溶液，终浓度为6-12mM。培养，收毒。

本发明的细胞培养与接毒之间的换液体系，降低了细胞代谢物对细胞生长的影响及后期病毒生产的干扰，能保持悬浮细胞的稳定生长，换液后加入硫酸葡聚糖等组分，起到有效提高病毒感染敏感性及细胞分散的作用，后期接毒换液体系中加入PEG6000及高钙溶液提高了接毒效率并大幅增加了口蹄疫病毒的稳定性，保证了后续病毒的稳定生长需要，产生的病毒效价高，不同传代批次制备的抗原保持稳定。

本发明采取两步法制备口蹄疫病毒，第一步细胞培养阶段使用无血清培养方法加入硫酸葡聚糖等有效起到提高病毒感染敏感性及细胞分散的作用，后期接毒换液体系中加入PEG6000及高钙溶液提高了接毒效率并大幅增加了口蹄疫病毒的稳定性。

作为本发明的一种实施方式，所述步骤(1)的所述悬浮细胞为BHK细胞，所述培养悬浮细胞的培养基为无添加DMEM/F12培养基。

所述无添加DMEM/F12培养基即为没有添加物的DMEM/F12培养基。

作为本发明的一种实施方式，所述步骤(1)中将能稳定传代的BHK-21悬浮细胞株稀释计数，将处于冻存前处于对数生长期的细胞悬液按密度0.5×10⁶-0.6×10⁶cells/ml接种到125ml摇瓶，摇瓶放置在37℃、5％CO₂培养箱中进行培养,105r/min搅拌；每隔48h取样计数,并进行稀释传代，传代后细胞密度控制在0.5×10⁶-0.6×10⁶cells/ml。

作为本发明的一种实施方式，所述步骤(2)的培养基为无添加DMEM/F12培养基。

所述无添加DMEM/F12培养基即为没有添加物的DMEM/F12培养基。

作为本发明的一种实施方式，所述步骤(2)中在生物反应器中接入驯化后的种子细胞，初始密度0.5×10⁶cells/ml，种子细胞的活力高于95％，反应器参数设定为：转速为80转/分，培养温度为37℃，溶氧为30-45％，pH值为7.2-7.4；悬浮培养BHK-21细胞，细胞密度达到≥4.5×10⁶cells/ml，稀释细胞密度达到≥1-2×10⁶/毫升时进行换液。

作为本发明的一种实施方式，所述步骤(3)中的所述替换加入的无血清DMEM培养基为整个体系的90％。

作为本发明的一种实施方式，所述步骤(3)中的所述悬浮培养BHK-21细胞在细胞密度稀释至1-2×10⁶cells/ml时停止搅拌，生物反应器中自然沉降6-8小时，弃去90％上清培养基，使用所述无血清DMEM培养基进行重悬。

作为本发明的一种实施方式，所述步骤(4)中所述接种的口蹄疫病毒为A型、O型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型、或ASIA1型口蹄疫病毒。

作为本发明的一种实施方式，所述步骤(4)中所述接种的口蹄疫病毒为ONXC/92株。

ONXC/92株可在商业上获得，如可购自兰兽研。

作为本发明的一种实施方式，所述步骤(4)中当生物反应器中BHK-21细胞的浓度高于450万/mL时，加入PEG6000终浓度达到0.01-0.3％(v/v)；按MOI＝0.01-0.1接种口蹄疫毒；生物反应器设定参数为：转速80转/分钟，DO值50％，温度为37℃。

作为本发明的一种实施方式，所述步骤(4)中的所述BHK-21细胞体系≤6000L。

使用本发明的制备方法，本发明悬浮BHK-21细胞培养密度可以达到4.5×10⁶cells/ml以上，体积可放大至6000L，口蹄疫病毒收毒毒价可在10^8.5或者10^9.01ogTCID₅₀/mL，甚至可达10^11.0，且培养的口蹄疫病毒更稳定。

作为本发明的一种实施方式，所述步骤(5)中在所述口蹄疫病毒接种2-3小时后开始缓慢加入CaCL₂溶液，CaCL₂终浓度为6-12mM；在细胞CPE为90％时收毒。

本发明还涉及所述的培养方法培养的病毒抗原。

本发明所述方法制备的病毒抗原不仅在各代次、批次生产的抗原之间表现出稳定性，还在反复冻融、高温挑战实验中均展现出高稳定性。

作为本发明的一种实施方式，所述病毒抗原为口蹄疫病毒146s抗原。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。

除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1连续三批进行口蹄疫种ONXC/92株培养

1.1复苏BHK-21细胞系

复苏冻存于液氮的BHK-21细胞，将能稳定传代的BHK-21悬浮细胞稀释计数，将冻存前处于对数生长期的细胞悬液按密度0.5×10⁶-0.6×10⁶cells/ml接种到125ml摇瓶，培养基为DMEM/F12无任何添加物的培养基。摇瓶放置在37℃、5％CO₂培养箱中进行培养；用微型磁力搅拌器提供磁力驱动，速度设置为105r/min。每隔48h取样计数,并进行稀释传代。传代后细胞密度控制在0.5×10⁶-0.6×10⁶cells/ml。

1.2种子细胞在生物反应器中的培养

在生物反应器中接入驯化后的种子细胞(初始密度0.5×10⁶cells/ml，种子细胞的活力(活细胞数/总细胞数)高于95％)，培养基为DMEM/F12无任何添加物的培养基，反应器参数设定为：转速为80转/分，培养温度为37℃，溶氧为30-45％，pH值为7.2-7.4；悬浮培养BHK-21细胞，细胞密度达到高于4.5×10⁶cells/毫升时进行换液。

1.3换液

将悬浮培养BHK-21细胞稀释至1-2×10⁶cells/ml，停止搅拌，生物反应器中自然沉降6-8小时，弃去90％上清培养基，使用新鲜无血清DMEM/F12培养基进行重悬，继续培养。

所述无血清培养基由以下组分配制而成：

DMEM/F12液体溶液，且过滤除菌，调节pH至7.0～7.2；其中含：胰岛素1-3μg/ml；转铁蛋白1～10μg/ml；硫酸葡聚糖：0.2～0.8μg/ml。

1.4接种病毒

当生物反应器中BHK-21细胞的浓度高于450万/mL时，加入PEG6000终浓度达到0.01-0.3％(v/v)，按MOI＝0.01-0.1接种ONXC/92株口蹄疫毒液。

1.5病毒大规模扩增

生物反应器设定参数为：转速80转/分钟，DO值50％，温度为37℃。

1.6病毒收获

病毒接种2-3小时后开始缓慢加入CaCL₂溶液,终浓度达到6-12mM。CPE达到90％时进行收毒。

1.7结果检测：

1.7.1连续三批样品TCID₅₀的测定

根据样品多少在加样槽中加入适量pH＝7.6-7.8的无血清DMEM培养基。根据样品计算所需10ml离心管数，每管加入4.5ml pH＝7.6-7.8的无血清的DMEM培养基。将样品进行10倍梯度稀释，即取0.5ml样品至盛有4.5ml的pH＝7.6-7.8的无血清的DMEM的管中。每次稀释要用旋涡混合器进行混匀，液体需完全旋起，混匀时间应为3～5秒，混匀3次。样品从一个稀释度移至下一稀释度要更换吸头。

根据实际情况取五个稀释度中的样本(一般取10^-4—10^-8稀释度，若不知道大概毒价范围则取10^-1—10^-9稀释度)，接入96孔板，每个孔0.1ml，每个稀释度8个孔重复。每个样本至少设8个孔作为阴性对照，每孔加入pH＝7.6-7.8的无血清DMEM/F12培养基0.1ml。盖上盖子在37℃、5％CO₂培养箱中培养3-5天。在板子上做好各个稀释度的标记。按同样的方法对标准参考毒株(ONXC/92株标准参考毒株)进行稀释接种。观察记录每孔病变情况，计算各稀释度孔CPE(病变)的百分率。按Reed-Muench法计算病毒半数感染量(TCID₅₀)。按实施例1.1-1.6制备方法制备的连续三批次毒价测定具体情况见表1：

表1连续三批次(为连续三代)病毒毒价检测结果

毒株编号(ONXC/92)	代次	TCID50/ml
			0503	F6	10<sup>8.0</sup>
0503	F7	10<sup>9.0</sup>
			0503	F8	10<sup>7.8</sup>

1.7.2连续三批样品LD₅₀的测定

选取母性良好的怀孕母鼠，取其所产2-3日龄乳鼠为实验动物。

将校正pH为7.6-7.8的PBS用移液器抽取到管中，每只管取9ml，按实施例1.1-1.6方法细胞培养的病毒每组抽9只管病毒液：用带1ml枪头的移液器抽取毒样1ml，轻轻沿管壁注入盛稀释液9ml的试管中，且管尖不得接触液面，并重复吹振两次，使枪头内壁残留液体尽量少。然后将试管置于旋涡混合器上振荡3-5秒(液面第一个旋涡到达管底即可)共3次，换支枪头重复前述操作。如此共做9次1：10的系列稀释。即最终病毒液含量达10^-9稀释度，其间每一滴度换一支枪头。

做10倍递增滴度注射乳鼠，每个稀释度的病毒液注射4只，每只颈背部注射0.2ml。为了便于区分，测毒乳鼠放于IVC鼠笼上进行观察。注射完毕，16小时内死亡的乳鼠不计数，发病乳鼠表现为四肢麻痹，叫声嘶哑，头颈僵直，膀胱积尿，身体发白，最后小便失禁死亡，死亡后全身发白，尸体僵硬，一般观察72小时可做最终判定。连续三批样品的LD₅₀检测结果见表2：

表2连续三批次(为连续三代)病毒LD₅₀检测结果

毒株编号(ONXC/92)	代次	LD<sub>50</sub>/0.2ml
			0503	F6	10<sup>-9.0</sup>
0503	F7	10<sup>-8.7</sup>
			0503	F8	10<sup>-8.8</sup>

1.7.3连续三批样品146s的测定

根据专利申请CN102998378A公开方法检测三批样品的口蹄疫抗原146S含量。具体检测结果见表3：

表3连续三批次(为连续三代)病毒样品的口蹄疫抗原146S含量检测结果

毒株编号(ONXC/92)	代次	146S(μg/ml)
			0503	F6	6.3
0503	F7	5.6
			0503	F8	5.8

1.7.4连续三批样品细胞状态的测定

对不接毒之前的细胞状态的进行检测，以实施例1.2种子细胞在生物反应器中的开始培养时取样计数时计时，该时间为0h，BHK-21细胞液用0.2％台盼蓝染色液染色，分别于0h、12h、24h、36h取细胞进行台盼蓝染色液染色计数。在普通显微镜下用红细胞计数板进行观察计数,胞体完整,透明,不着色的为健康的活细胞,因死细胞无法进行代谢,能被台盼蓝染成蓝色的为死细胞。分别计出活细胞和死细胞的个数,计算活细胞占总细胞的百分比即为细胞活率。具体检测结果见表4：

表4连续三批样品制备在接毒前BHK-21细胞连续传代结果

1.7.5连续三批样品换液细胞状态的测定

按1.7.4中检测BHK-21细胞状态的方法，从换无血清DMEM/F12培养基开始标记为0h，检测三批次样品制备中在换培养基后不同时间的细胞状态。具体结果见表5：

表5连续三批样品制备在换培养基后细胞状态检测结果

从上述1.7.1～1.7.5检测结果可见，使用本发明的方法，通过在细胞培养阶段使用无血清培养方法加入硫酸葡聚糖等物质能有效地提高病毒感染敏感性及细胞分散的作用，细胞状态在不同批次和培养时间其状态均保持稳定，后期接毒换液体系中加入PEG6000及高钙溶液提高了接毒效率并大幅增加了口蹄疫病毒抗原的稳定性，不仅在连续传代的各批次的病毒液的TCID₅₀、LD₅₀之间均保持了稳定性，还在连续传代的各批次的146s抗原之间均保持了稳定性。

实施例2使用本发明换无血清培养液制备口蹄疫病毒抗原的方法与不换培养液的制备方法区别对比

2.1复苏BHK-21细胞系

将能稳定传代的BHK-21悬浮细胞株稀释计数，将处于对数生长期的细胞悬液按密度0.5×10⁶-0.6×10⁶cells/ml接种到125ml摇瓶。摇瓶放置在37C、5％CO₂培养箱中进行培养；用微型磁力搅拌器提供磁力驱动，速度设置为105r/min。每隔48h取样计数,并进行稀释传代。传代后细胞密度控制在0.5×10⁶-0.6×10⁶cells/ml。

2.2种子细胞在生物反应器中的培养

在生物反应器中接入驯化后的种子细胞(初始密度0.5×10⁶cells/ml，种子细胞的活力高于95％)，反应器参数设定为：转速为80转/分，培养温度为37℃，溶氧为30-45％，pH值为7.2-7.4；悬浮培养BHK-21细胞，细胞密度达到高于1-2×10⁶/毫升，将细胞分为两份，一份进行2.3的换液操作，另一份进行2.4传代培养操作。

2.3换液

悬浮培养BHK-21细胞，细胞密度达到高于4-9×10⁶/毫升时进行换液时停止搅拌，生物反应器中自然沉降6-8小时，弃去90％上清培养基，使用新鲜无血清DMEM培养基进行重悬。

所述无血清培养基由以下组分配制而成：

DMEM/F12液体溶液1ml，且过滤除菌，调节pH至7.0～7.2；

胰岛素1-3μg/ml；

转铁蛋白1～10μg/ml；

硫酸葡萄糖：0.2～0.8μg/ml；

连续培养至细胞密度达到高于3.6×10⁶/毫升。

2.4将步骤2.2细胞液稀释，至传代后细胞密度控制在0.5×10⁶-0.6×10⁶cells/ml。在生物反应器中接入细胞反应器参数设定为：转速为80转/分，培养温度为37℃，溶氧为30-45％，pH值为7.2-7.4；悬浮培养BHK-21细胞，细胞密度达到高于3.6×10⁶/毫升。

2.5两种制备方法不同培养阶段和不同培养时间细胞密度和细胞状态的检测

按照1.7.4的检测方法，在细胞种子培养阶段的0h、24h、36h，和换无血清培养基或不换培养基细胞扩增阶段的0h、8h、12h检测其细胞密度，具体结果见表6：

表6细胞种子培养阶段和换无血清培养基或不换培养基细胞扩增阶段细胞密度检测结果

从表6可见，通过换液培养，在细胞扩增阶段，其较连续培养方式，细胞密度有较大的增加，为后续高滴度的病毒增殖创造了条件。

实施例3病毒储存毒价变化

对实施例1.6收获病毒进行反复冻融、高温挑战实验，验证病毒稳定性。

结果

3.1检测不同冻融次数对病毒稳定性影响

将病毒抗原置-70℃冰箱中存放，然后放置室温至完全融化为一次冻融，连续冻融十次检测抗原稳定性，每次冻融完成后用专利申请CN102998378A公开方法检测146S含量，同时检测TCID₅₀和LD₅₀，检测结果见表8:

表8连续冻融十次病毒稳定性检测结果

3.2温度对病毒稳定性影响

在42℃水浴条件下培养的病毒不同时间，检测抗原稳定性，检测结果见表9：

表9 42℃水浴条件下培养的病毒不同时间病毒稳定性检测结果

上述结果表明，本发明的制备方法制备的病毒液经多次冻融仍保持相当的稳定性，对42℃的加热条件可保持一定的稳定性。

Claims (11)

1.一种维持稳定性、高滴度病毒抗原生产的悬浮细胞病毒的培养方法，其中，所述方法包括：

步骤（1）将悬浮细胞进行稀释传代，培养，使得悬浮细胞处于传代后细胞密度为0.5×10⁶-0.6×10⁶cells/ml，得到悬浮细胞种子，所述悬浮细胞为BHK-21细胞；

步骤（2）在生物反应器中接入所述步骤（1）中所述悬浮细胞种子，培养至所述悬浮细胞密度达到≥1×10⁶cells /ml；

步骤（3）从所述步骤（2）中所述细胞密度达到1×10⁶-2×10⁶ cells /ml时的悬浮细胞分离掉培养基，替换加入无血清DMEM培养基进行重悬，所述无血清DMEM培养基由以下组分组成：

DMEM/F12液体培养基，pH为7.0～7.2，1-3μg/ml胰岛素、1～10μg/ml转铁蛋白、0.2～0.8μg/ml硫酸葡聚糖；

步骤（4）培养所述悬浮细胞，使其适应所述无血清DMEM培养基生长环境，之后，加入终浓度0.01-0.3%v/v的PEG6000，再按MOI＝0.01-0.1接种口蹄疫病毒；以及

步骤（5）继续培养，加入CaCL₂溶液，终浓度为6-12mM，培养，收毒。

2.根据权利要求1所述的培养方法，其中，所述步骤（1）的培养悬浮细胞的培养基为无添加DMEM/F12培养基；所述步骤（2）的培养基为无添加DMEM/F12培养基。

3.根据权利要求1所述的培养方法，其中，所述步骤（1）中将能稳定传代的BHK-21悬浮细胞稀释计数，将处于冻存前处于对数生长期的细胞悬液按密度0.5×10⁶-0.6×10⁶cells/ml接种到125ml摇瓶，摇瓶放置在37℃、5%CO₂培养箱中进行培养,105r/min搅拌；每隔48h取样计数,并进行稀释传代，传代后细胞密度控制在0.5×10⁶-0.6×10⁶cells/ml。

4.根据权利要求1所述的培养方法，其中，所述步骤（2）中在生物反应器中接入驯化后的种子细胞，初始密度0.5×10⁶cells/ml，种子细胞的活力高于95％，反应器参数设定为：转速为80转/分，培养温度为37℃，溶氧为30％-45％，pH值为7.2-7.4；悬浮培养BHK-21细胞，细胞密度达到≥4.5×10⁶ cells /ml，稀释细胞密度达到≥1×10⁶cells/ml时进行换液。

5.根据权利要求1所述的培养方法，其中，所述步骤（3）中的所述替换加入的无血清DMEM培养基为整个体系的90%。

6.根据权利要求1所述的培养方法，其中，所述步骤（3）中的所述悬浮细胞在稀释至1×10⁶-2×10⁶cells/ml时停止搅拌，生物反应器中自然沉降6-8小时，弃去90%上清培养基，使用所述无血清DMEM培养基进行重悬。

7.根据权利要求1所述的培养方法，其中，所述步骤（4）中所述接种的口蹄疫病毒为A型、O型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型、或ASIA1型口蹄疫病毒。

8.根据权利要求7所述的培养方法，其中，所述步骤（4）中所述接种的口蹄疫病毒为ONXC/92株。

9.根据权利要求1所述的培养方法，其中，所述步骤（4）中当生物反应器中BHK-21细胞的浓度高于450万/mL时，加入PEG6000终浓度达到0.01-0.3%v/v；按MOI＝0.01-0.1接种口蹄疫毒；生物反应器设定参数为：转速80转/分钟，DO值50％，温度为37℃。

10.根据权利要求1所述的培养方法，其中，所述步骤（4）中的所述BHK-21细胞体系≤6000L。

11.根据权利要求1所述的培养方法，其中，所述步骤（5）中在所述口蹄疫病毒接种2-3小时后开始缓慢加入CaCL₂溶液，CaCL₂终浓度为6-12mM；在细胞CPE为90%时收毒。