CN109536399B - 一种维吉尼亚霉素高产菌株的高通量筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种维吉尼亚霉素高产菌株的高通量筛选方法，本发明公开了快速的维吉尼亚霉素检测方法，通过在检测样品中加入含有对二甲氨基苯甲醛、异丙醇和强酸的显色剂进行显色反应，根据显色产物的吸光值计算维吉尼亚霉素的产量，结合维吉尼亚霉素生产菌株的多孔板培养和高效快速的样品提取方法，实现了对维吉尼亚霉素高产菌株的高通量筛选。本发明提供的高通量筛选方法，与传统的筛选方法相比，具有快速高效、简单易行等优势，能够大大缩短筛选周期，提高菌株的筛选效率，极大地降低了维吉尼亚霉素高产菌株选育的工作量，为高产菌株的选育提供了有力的技术保障。

Description

一种维吉尼亚霉素高产菌株的高通量筛选方法

技术领域

本发明涉及微生物遗传育种和生物发酵领域，具体涉及一种维吉尼亚霉素高产菌株的高通量筛选方法。

背景技术

维吉尼亚霉素(virginiamycin)是一类多肽类抗生素，分子结构中含有内酯环，是从维吉尼亚链霉菌发酵产物中分离得到的。维吉尼亚霉素对革兰氏阳性菌具有抑制作用，其作用机理是抑制细菌的核糖体中蛋白质的合成。维吉尼亚霉素在结构上由M(约占70％)和S(约占30％)两个因子构成，两者的结构和抗菌范围均不相同。M因子是一种巨环内酯，分子式为C₂₈H₃₅N₃O₇，S因子是一种环状多肽，分子式为C₄₃H₄₉N₇O₁₀。S和M混合，使其抗菌活性增强，而且不容易产生抗药性。美国Smith Lklinr药厂研发了维吉尼亚霉素产品Stafac(速大肥)，由70％M因子和30％S因子构成。由于维吉尼亚霉素在动物肠道内不易被吸收，残留量小，毒性小，有较好的生物降解性，而且其结构非常稳定(在室温下保存3年其作用效果基本不会发生变化)使得经过饲料加工后活性仍十分稳定，因此，维吉尼亚霉素被誉为最有前景的抗生素之一。然而，目前维吉尼亚霉素发酵生产的产品效价较低，直接制约了维吉尼亚霉素的应用推广。维吉尼亚链霉菌的菌株性能直接影响维吉尼亚霉素产量的高低，因此，筛选维吉尼亚链霉菌高产菌株对于维吉尼亚霉素的推广应用至关重要。

目前报道的筛选维吉尼亚生产菌株的方法主要包括紫外诱变筛选、亚硝酸胍诱变筛选、平板分离等方法，然而无论诱变得到的突变菌株还是多重基因工程改造构建的突变菌株的筛选，均存在菌株数量大、筛选周期长、筛选方法操作繁琐等问题。而维吉尼亚霉素的检测方法也主要集中在HPLC检测，其检测周期长，单次检测只限于一个样品，对于样品数量限制较大，不适于发酵过程的随时取样检测。因此，亟需开发维吉尼亚霉素高产菌株的高通量筛选方法。

发明内容

为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种维吉尼亚霉素高产菌株的高通量筛选方法。

本发明提供一种维吉尼亚霉素高产菌株的高通量筛选方法，包括如下步骤：

(1)将维吉尼亚霉素生产菌株进行发酵培养；

(2)提取发酵液中的维吉尼亚霉素，得到检测样品；

(3)在所述检测样品中加入显色剂进行显色反应，所述显色剂包含对二甲氨基苯甲醛、异丙醇和强酸；

(4)测定595nm处的吸光值，根据吸光值计算生产菌株的维吉尼亚产量。

优选地，所述强酸为盐酸、硫酸、高氯酸中的一种或多种。

具体地，本发明所述的显色剂包含如下组分：

对二甲氨基苯甲醛，2g/L～10g/L；异丙醇，体积百分含量分别为30％～60％；盐酸，体积百分含量为1％～10％。

优选地，所述显色剂包含如下组分：

对二甲氨基苯甲醛，5g/L～10g/L；异丙醇，体积百分含量分别为30％～50％；盐酸，体积百分含量为1％～5％。

更优选地，所述显色剂包括如下组分：

对二甲氨基苯甲醛，6g/L～9g/L；异丙醇，体积百分含量分别为30％～40％；盐酸，体积百分含量为1％～3％。

本发明中，所述的显色反应中检测样品和显色剂的体积比为1：1～1：5。

具体地，所述显色反应为在60～80℃反应5min～30min；优选地，所述显色反应为在70～80℃反应10min～20min。

作为本发明的优选实施方式，步骤(3)的方法如下：在步骤(2)得到的检测样品中加入所述显色试剂，摇匀，70～80℃水浴10～20min。

本发明中，所述的提取发酵液中的维吉尼亚霉素为在发酵液中加入提取液进行提取。

所述提取液包含乙腈、丙酮、甲醇中的一种或多种。

作为本发明的优选实施方式，所述提取液为乙腈。

优选地，所述发酵液和提取液的体积比为1：1～1：5。

作为本发明的优选实施方式，所述发酵液和提取液的体积比为1：1～1：2。

本发明所述的检测样品的制备为在发酵液中加入乙腈进行振荡提取20min～100min，分离上清液和沉淀，得到的上清液即为检测样品。

优选地，所述振荡提取的时间为30min～60min。

本领域技术人员应当理解，为缩短检测样品的制备时间，在条件允许的情况下，也可以在提取的过程中进行超声处理或搅拌处理，这些处理只是为了加速维吉尼亚霉素的提取，因此均在本发明的保护范围内。

本发明所述的高通量筛选方法中，步骤(1)所述的发酵培养的培养基包括如下组分：

可溶性淀粉5～30g/L，豆粕2～5g/L，酵母浸膏1～5g/L，葡萄糖5～50g/L，亚麻油1～5g/L，磷酸氢二钾0.2～1g/L，硫酸亚铁0.01-0.05g/L，硫酸铵0.2～2g/L，碳酸钙1～5g/L。

所述发酵培养基的pH为7.0～7.2。

优选地，所述发酵培养为在多孔板中培养。

更优选地，所述多孔板为深孔培养板。

所述发酵的温度为30～32℃，转速为200～1000rpm。

作为本发明的优选实施方式，所述发酵温度为32℃，所述转速为500～800rpm。

本发明所述的发酵培养的种子为采用多孔板培养，种子培养的温度为28～32℃，转速为500～1000rpm。

本发明所述的种子培养基包括如下组分：豆粕10～15g/L，花生粕20～25g/L，葡萄糖30～40g/L，酵母浸膏2～5g/L，可溶性淀粉15～20g/L，碳酸钙2～3g/L。

所述种子培养基的pH为7.0～7.2。

所述种子培养得到的种子液的菌丝生长量(packed mycelial volume，PMV)为20％～40％，所述发酵培养的接种量为5％～20％。

优选地，所述种子培养得到的种子液的PMV为25％～30％，所述发酵培养的接种量为5％～8％。

所述维吉尼亚霉素生产菌株为链霉菌属微生物，优选为维吉尼亚链霉菌。

所述维吉尼亚霉素生产菌株可以为诱变育种、基因工程育种或其结合的方法选育得到的能够积累维吉尼亚霉素的菌株。

本发明提供了维吉尼亚霉素高产菌株的高通量筛选方法，快速准确的产物检测方法是对菌株进行高通量筛选的前提和基础，针对维吉尼亚霉素的结构和理化性质，发明人经过对大量的有机物和无机物及其组合进行筛选，得到了能够与维吉尼亚霉素发生稳定的显色反应的显色剂。维吉尼亚霉素的显色产物在595nm处具有特征吸收峰，且吸光值与发酵液中的维吉尼亚霉素含量具有很好的线性相关性，与HPLC检测的维吉尼亚霉素产量也具有很好的正相关性。进一步通过优化多孔板的培养方法以及发酵液中维吉尼亚霉素的提取方法，最终得到了高效的维吉尼亚霉素高产菌株的高通量筛选方法。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明首次建立了维吉尼亚霉素高产菌株的高通量筛选方法，结合多孔板培养和快速简单的检测方法，能够通过一次操作对大量的菌株进行维吉尼亚霉素生产性能的筛选，快速淘汰负突变菌株，筛选高产菌株。

(2)本发明的高通量筛选方法，与传统的筛选方法相比，具有快速高效、简单易行等优势，能够大大缩短筛选周期，提高菌株的筛选效率，极大地降低了维吉尼亚霉素高产菌株选育的工作量，为高产菌株的选育提供了有力的技术保障。

附图说明

图1为实施例2中维吉尼亚霉素比色法检测的标准曲线。

图2为实施例3中高通量筛选方法与摇瓶发酵-HPLC检测的传统筛选方法的结果相关性分析。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1维吉尼亚链霉菌的诱变处理

本实施例以维吉尼亚链霉菌(Streptomyces virginiae)ATCC13161(购自上海林渊生物科技有限公司)作为示例，进行诱变处理，具体方法如下。

1、维吉尼亚链霉菌成熟孢子的制备

(1)维吉尼亚链霉菌单菌落的制备：在无菌条件下，用无菌生理盐水溶解维吉尼亚链霉菌ATCC13161的冻干粉，涡旋震荡混匀，稀释后均匀涂布于平板培养基上，26℃恒温静置培养8-10天，备用。

平板培养基的组分如下：酵母膏30-35g/L，麦芽浸膏8-10g/L，葡萄糖3-4g/L，琼脂粉15-20g/L。

(2)维吉尼亚链霉菌的斜面培养：用接种针挑取生长饱满的、健壮的、紫色的维吉尼亚链霉菌孢子，接种到斜面培养基上，26℃恒温静置培养8-10天，备用。

斜面培养基的组分如下：酵母膏30-35g/L，麦芽浸膏8-10g/L，葡萄糖3-4g/L，琼脂粉15-20g/L。

2、常压室温等离子体(ARTP)诱变处理

取实施例步骤1中长势良好的成熟斜面，用0.9％的无菌生理盐水冲洗孢子，涡旋震荡打散孢子，吸取20μL加入到样品载片中，用镊子将待诱变处理的样品载片放置到诱变载物台上，并旋转至等离子体发生器正下方调节定位台高度5mm，氮气流量5-12SLM，气压0.1-0.2MPa，功率10-100w，分别照射0、10、20、25、30、35、40、45、50、55、60s，将照射后的载片用镊子夹取到装有生理盐水的EP管中，在震荡器上充分震荡1分钟，梯度稀释。吸取100μL稀释液均匀涂布于平板培养基上，26℃恒温培养箱中培养72h后，计数菌落形成单位，制作致死率曲线，挑选生长饱满、健壮、紫色的单菌落均匀转接到斜面，保存。

实施例2维吉尼亚霉素高产菌株的高通量筛选

取实施例1制备得到的ARTP诱变菌株斜面进行进行高通量筛选，具体方法如下。

1、种子培养：依据种子培养基的配方，按比例配制种子培养基，80-90℃恒温水浴20-30分钟，冷却后调pH至7.0-7.2。将种子培养基加入至96孔板中。挑取适量的ARTP诱变菌株的成熟孢子接种至种子培养基中，500rpm、28℃恒温培养24小时，种子液的PMV值为25％～30％。

种子培养基的组分如下：豆粕15g/L，花生粕20g/L，葡萄糖30g/L，酵母浸膏4g/L，可溶性淀粉15g/L，碳酸钙3g/L。

2、发酵培养：依据发酵培养基的配方，按比例配制发酵培养基，80-90℃恒温水浴20-30分钟，冷却后调pH至7.0-7.2。将发酵培养基加入到48孔板中。将步骤1获得的种子液以6％的接种量转接入发酵培养基中，转速650rpm，32℃恒温培养72小时。

发酵培养基的组分如下：可溶性淀粉20g/L，豆粕4.5g/L，酵母浸膏2.5g/L，葡萄糖10g/L，亚麻油5g/L，磷酸氢二钾0.4g/L，硫酸亚铁0.03g/L，硫酸铵0.5g/L，碳酸钙3g/L。

3、显色剂的配制(100mL)：显色剂现用现配，称取0.75g的对二甲氨基苯甲醛，加入30mL异丙醇和2mL盐酸，充分溶解后加水定容至100mL。

4、维吉尼亚霉素的比色法检测：

(1)维吉尼亚霉素检测标准曲线的制作：称取维吉尼亚霉素分别配制浓度为100mg/L、200mg/L、400mg/L、800mg/L、1g/L、2g/L、的标准品溶液，在各标准品溶液中分别加入与标准品溶液等体积的显色剂，摇匀，75℃水浴15min，酶标仪测定595nm处的吸光值，根据吸光值制作的标准曲线如图1所示，结果表明，吸光值与维吉尼亚霉素的线性关系良好，R²＝0.9988，维吉尼亚霉素的浓度计算公式为Y＝0.0025X+0.0033(X为吸光度，Y为维吉尼亚霉素浓度(mg/L))。

(2)发酵液样品的检测：发酵结束后，在发酵液中加入等体积的乙腈，振荡提取30min，离心取上清，即得检测样品。在检测样品中加入等体积的显色剂，摇匀，75℃水浴15min，酶标仪测定595nm处的吸光值，根据公式Y＝0.0025X+0.0033(X为吸光度，Y为维吉尼亚霉素浓度(mg/L))计算得到发酵液提取物中维吉尼亚霉素的浓度。

得到的高产维吉尼亚霉素的菌株可用于进一步复筛。

实施例3高通量筛选方法的有效性验证

为验证本发明的高通量筛选方法是否能够有效地对维吉尼亚生产菌株的产物生产性能进行筛选，选取部分实施例2筛选得到的具有不同水平的维吉尼亚霉素产量的突变菌株采用传统的菌株筛选方法进行验证(摇瓶实验和HPLC检测)。

1、种子培养：依据种子培养基配方(同实施例2的种子培养基)，配制种子培养基，80-90℃恒温水浴20-30分钟，冷却后调pH至7.0-7.2，115℃灭菌20-30分钟，冷却后待用。于250mL三角瓶中加入25mL种子培养基。用1-2mL的无菌生理盐水冲洗维吉尼亚霉素突变菌株的培养斜面上成熟的孢子，将0.5-1mL孢子悬浮液接入种子培养基中，转速200-220rpm，28℃恒温培养24小时。

2、依据发酵培养基配方(同实施例2的发酵培养基)，配制发酵培养基，80-90℃恒温水浴20-30分钟，冷却后调pH至7.0-7.2，115℃灭菌20-30分钟，冷却后待用。250mL三角瓶中加入30mL发酵培养基，将步骤1获得的种子液以6％的接种量转接入发酵培养基中，转速200-220rpm，32℃恒温培养。

3、HPLC检测：发酵结束后，离心去上清，乙酸乙酯洗涤菌体，离心弃上清，加入等体积的乙腈，涡旋震荡10分钟提取维吉尼亚霉素，采用HPLC检测维吉尼亚霉素的发酵效价单位。

HPLC检测方法如下：

(1)仪器设备：岛津液相色谱系统，色谱柱为ODS-3C18色谱柱(250.0mm*4.6mm)；

(2)检测波长：230nm；

(3)洗脱系统：二元高压梯度洗脱，流动相A(0.01M磷酸)；流动相B(乙腈)；0-0.2min，流动相A 94％，流动相B 6％；0.2-35min，流动相A 15％，流动相B 85％；35-45min，流动相A 94％，流动相B 6％；45min结束；

(4)流速：1.0mL/min。

诱变得到的部分菌株的传统筛选方法与高通量筛选方法的筛选结果的对应关系如图2所示，结果显示，采用传统筛选方法得到的菌株的产量与高通量筛选得到的菌株的产量呈现很好的正相关性，表明本发明提供的高通量筛选方法可以用来快速高效地筛选维吉尼亚链霉菌的高产菌株。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (13)

1.一种维吉尼亚霉素高产菌株的高通量筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将维吉尼亚霉素生产菌株进行发酵培养；

(2)提取发酵液中的维吉尼亚霉素，得到检测样品；

(3)在所述检测样品中加入显色剂进行显色反应；

(4)测定595nm处的吸光值，根据吸光值计算生产菌株的维吉尼亚产量；

所述显色剂由如下组分组成：对二甲氨基苯甲醛，7.5g/L；异丙醇，体积百分含量为30％；盐酸，体积百分含量为2％。

2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述显色反应中检测样品和显色剂的体积比为1：1～1：5。

3.根据权利要求1或2所述的筛选方法，其特征在于，所述显色反应为在60～80℃反应5min～30min。

4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，所述显色反应为在70～80℃反应10min～20min。

5.根据权利要求1、2或4所述的筛选方法，其特征在于，所述提取发酵液中的维吉尼亚霉素为在发酵液中加入提取液进行提取；

所述提取液为乙腈、丙酮、甲醇中的一种或多种。

6.根据权利要求5所述的筛选方法，其特征在于，所述发酵液和提取液的体积比为1：1～1：5。

7.根据权利要求1、2或4所述的筛选方法，其特征在于，所述检测样品的制备为在发酵液中加入乙腈进行振荡提取20min～100min，分离上清液和沉淀，得到的上清液即为检测样品。

8.根据权利要求7所述的筛选方法，其特征在于，所述振荡提取的时间为30min～60min。

9.根据权利要求1、2、4、6或8所述的筛选方法，其特征在于，所述发酵培养的培养基由如下组分组成：可溶性淀粉5～30g/L，豆粕2～5g/L，酵母浸膏1～5g/L，葡萄糖5～50g/L，亚麻油1～5g/L，磷酸氢二钾0.2～1g/L，硫酸亚铁0.01-0.05g/L，硫酸铵0.2～2g/L，碳酸钙1～5g/L。

10.根据权利要求9所述的筛选方法，其特征在于，所述发酵培养为在多孔板中培养。

11.根据权利要求9所述的筛选方法，其特征在于，所述发酵的温度为30～32℃，转速为200～1000rpm。

12.根据权利要求1、2、4、6、8、10或11所述的筛选方法，其特征在于，所述维吉尼亚霉素生产菌株为链霉菌属微生物。

13.根据权利要求12所述的筛选方法，其特征在于，所述链霉菌属微生物为维吉尼亚链霉菌( Streptomyces virginiae) 。

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