CN109503710A - 抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体，其通过从Hp裂解液分离的Ure、VacA、CagA三种蛋白富集混合物作为免疫原，对产蛋母鸡进行注射免疫，然后从免疫鸡蛋蛋黄中运用水稀释法、氯化钠盐析法及嗜硫亲和层析法提取纯化抗体。通过方法制备所得卵黄抗体纯度高，具有较强的中和幽门螺旋杆菌活性，能够应用于制备预防及治疗幽门螺旋杆菌感染引起的胃肠道疾病药物。

Description

抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术，特别是涉及一种特异性抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体及其制备方法与应用。

背景技术

幽门螺旋杆菌(Hp)是一种螺旋形、微厌氧、对生长条件要求十分苛刻的革兰氏阴性杆菌。1983年首次从慢性活动性胃炎患者的胃粘膜活检组织中分离成功，是目前所知能够在人胃中生存的惟一微生物种类。幽门螺旋杆菌病包括由Hp感染引起的胃炎、消化道溃疡、淋巴增生性胃淋巴瘤等。幽门螺旋杆菌病的不良预后是胃癌。Hp寄生在胃粘膜组织中，67％-80％的胃溃疡和95％的十二指肠溃疡是由Hp引起的。

Hp在世界不同种族、不同地区的人群中均有感染，可以说是成年人中最广泛的慢性细菌性感染。总的趋势是:Hp感染率随年龄增加而上升，发展中国家约为80％，发达国家约为40％，男性略高于女性。我国的感染年龄早于发达国家20年左右，20岁-40岁感染率为45.4％-63.6％,70岁以上高达78.9％。另外，我国北方地区的感染率高于南方地区。

Hp如何破坏胃细胞以致最终引发胃癌，现在普遍认为主要与其体内表达的3种蛋白有关，分别是尿素酶(Ure)、空泡细胞毒素(VacA)及细胞毒素相关基因A(CagA)。Ure是螺杆菌属所富含的一种酶，它可以改变Hp在胃内生长的局部强酸性环境，对该菌属在胃内的寄生和致病起重要作用，Hp合成的尿素酶量很大，约占菌体总蛋白的5％，几乎所有的Hp细菌均含有尿素酶。VacA基因全长5961bp，开放阅读框为2888bp，存在于所有的Hp菌株的基因组中，其表达产物为能使上皮细胞产生空泡变性的毒蛋白，也被称为空泡毒素，VacA毒素是Hp产生的重要毒力因子。CagA全长为3444～5925bp不等，分子量在128kD-140kD之间,是Hp毒力标志之一，与Hp致病性及临床相关疾病严重程度有关。

目前，临床上治疗Hp感染的方法主要有含克拉霉素的标准三联疗法或铋剂四联疗法或左氧氟沙星三联疗法，但这些联合疗法一方面费用较高给患者带来较大的经济负担，另一方面长期用药会对人体产生严重的副作用，而且容易产生耐药性，患者难以接受。因此，开发可以减少费用且副作用小又有良好效果的产品，对于预防及治疗Hp感染显得非常重要。随着被动免疫方法逐渐被人们所知，使得特异性抗幽门螺旋杆菌的卵黄抗体防治Hp感染成为了一种行之有效的方法。

鸡卵黄抗体(IgY)，即鸡经特定抗原免疫后，产生相应的特异性抗体，并转运、储存于卵黄中。IgY的性质与哺乳动物的IgG相似，分子量约为180KD，由两条轻链和两条重链组成，等电点约为5.2。但与一般哺乳动物IgG相比，IgY具有较强的耐热、耐酸、抗离子强度和一定的抗酶降解能力。IgY在PH4.0-11.0时比较稳定，PH3.0-3.5时活性迅速下降，PH12时活性也有所下降。IgY对胃蛋白酶有较高的抵抗力，但对胰蛋白酶十分敏感。特定病原菌的卵黄抗体能直接黏附于病原菌的细胞壁上，改变病原细胞的完整性，直接抑制病原菌的生长；卵黄抗体可黏附于细菌的菌毛上，使之不能黏附于肠道黏膜上皮细胞；一部分卵黄抗体在肠道消化酶的作用下，降解为可结合片段，这些片段含有抗体的可变小肽(Fab)部分，这些小肽很容易被肠道吸收，进入血液后能与特定的病原菌黏附因子结合，使病原菌不能黏附易感细胞而失去致病性，而IgY的稳定区(Fc)部分留在肠内。

因此，利用上述Hp的三种蛋白免疫产蛋母鸡制备抗幽门螺旋杆菌的卵黄抗体，可以阻止Hp黏附于胃粘膜和其毒性蛋白破坏胃壁细胞以及使其无法在胃酸性环境中生长，从而可以防治由Hp感染引起的胃肠道疾病。

现有技术实现方案中，主要通过裂解Hp提取的菌株总蛋白或者原核重组表达的某个Hp特有蛋白如FlaA蛋白按照一定的免疫程序免疫产蛋母鸡，然后收集鸡蛋，用水稀释法和硫酸铵沉淀法或PEG沉淀法从鸡蛋中提取纯化抗幽门螺旋杆菌的卵黄抗体，或直接通过冻干制成卵黄粉用于食品添加剂或功能性保健品。

现有技术存在的问题和缺点主要是其制备的抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体对Hp中和活性较弱从而降低了其防治Hp感染引起的胃肠道疾病的效果。造成这一主要问题的原因主要体现在两方面，一方面用于蛋鸡免疫的免疫原中幽门螺旋杆菌特异性致病成分活性较弱或丰度较低从而导致免疫产生的抗Hp卵黄抗体亲合力较小，另一方面从鸡蛋中提取纯化卵黄抗体时纯度不够，而用于防治Hp感染的抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体要求其具有较高纯度。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的上述问题，本申请通过提高Hp特异性致病因子活性和丰度增强免疫效果以及改进纯化方法提高卵黄抗体纯度的方法，获得了一种抗Hp的卵黄抗体，该IgY具有较强中和Hp活性，能高效防治Hp感染引起的胃肠道疾病，并提供其制备方法与应用。

技术方案：本发明所述的一种抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：

(1)收集免疫鸡蛋：使用幽门螺旋杆菌特异性抗原免疫正在产蛋蛋鸡，免疫结束后收集鸡蛋，保鲜保存；

(2)水稀释法提取卵黄抗体：取步骤(1)收集的免疫鸡蛋，无菌条件下去除卵白收集卵黄，加入超纯水磁力搅拌，调节PH至5.0～5.2，继续磁力搅拌，置于-20℃～-80℃过夜凝固，完成后先4℃解冻1～4h，再室温至完全解冻，离心收集上清液，再经灭菌滤纸过滤，收集滤出液；

(3)氯化钠盐析法纯化：搅拌状态下向步骤(2)收集的滤出液中加入固体氯化钠，搅拌均匀后调节PH至4.0，磁力搅拌，离心，收集沉淀晾干；

(4)嗜硫亲和层析纯化：取步骤(3)收集的沉淀用缓冲液溶解，过滤膜后上样洗脱，收集洗脱液离心，脱盐浓缩后用滤膜过滤，分装冻干，得到抗幽门螺旋杆菌的卵黄抗体。

步骤(1)中，所述幽门螺旋杆菌特异性抗原为富集Hp特异性抗原，主要包括Ure、VacA、CagA等三种蛋白的幽门螺旋杆菌裂解分离物。优选的购自品牌为BioReagents、货号为A144的幽门螺旋杆菌特异性抗原。

步骤(1)中，一般情况下，免疫正在产蛋蛋鸡3～5次，每次免疫间隔时间为14～30天，每次免疫剂量为50～200μg，免疫结束7天后开始收集鸡蛋。

本申请步骤(1)中，优选使用幽门螺旋杆菌特异性抗原免疫正在产蛋蛋鸡3次，第一次免疫时，将幽门螺旋杆菌特异性抗原与等体积弗氏完全佐剂混合后超声乳化；第二次免疫时，将幽门螺旋杆菌特异性抗原与等体积弗氏不完全佐剂混合后超声乳化；第三次免疫时，不使用佐剂。

进一步的，步骤(1)中，第一次和第二次免疫采取颈背部皮下两点和胸大肌两点注射，第三次免疫采取鸡翅尾静脉注射幽门螺旋杆菌特异性抗原。

更进一步的，步骤(1)中，第一次和第二次免疫剂量为每只蛋鸡50～200μg免疫原，注射体积0.2～0.5ml；第三次免疫剂量为每只蛋鸡50～200μg免疫原，注射体积0.2～0.5ml。

将步骤(1)收集的鸡蛋4℃保存。

步骤(2)中，卵黄：超纯水体积比为1:7～10，加入超纯水后磁力搅拌10min。

步骤(2)中，用HCl调节卵黄溶液PH至5.0～5.2，置磁力搅拌器上均匀搅拌2h～8h，搅拌速率是100～200rpm/min。

步骤(2)中，凝固再解冻，是为了充分除脂，减小脂类对后续盐析沉淀的干扰，提高卵黄抗体纯度。解冻后离心条件：13500g/min，10℃，15min。

步骤(3)中，氯化钠的加入量为总体积(w/v)的8.2％～9.4％，然后充分搅拌10min。

步骤(4)中，取步骤(3)收集的沉淀用缓冲液溶解，过0.45μm滤膜后上样洗脱，收集洗脱液离心，脱盐浓缩后用0.22μm滤膜过滤。

步骤(4)中，所述缓冲液具体是50mM NaH₂PO₄，0.5M Na₂SO₄，PH8.0。

步骤(4)中，洗脱条件为50mM NaH₂PO₄，PH8.0，流速为2～5ml/min。

上述方法制备所得抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体也在本发明的保护范围内。

上述抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体在制备预防和治疗幽门螺旋杆菌感染引起的胃肠道疾病药物中的应用也在本发明的保护范围内。

进一步的，本发明提供的抗Hp卵黄抗体可以在体外中和Hp毒性蛋白诱导的细胞毒性作用，在体内也可以中和Hp从而抑制其生长，所述抗体可被进一步加工处理成食品添加剂或功能性保健品，应用于预防和治疗Hp感染引起的胃肠道疾病。

有益效果：相比较于现有技术，本发明采用从Hp裂解液分离的Ure、VacA、CagA三种蛋白富集混合物作为免疫原，对产蛋母鸡进行注射免疫，然后从免疫鸡蛋蛋黄中运用水稀释法、氯化钠盐析法及嗜硫亲和层析法提取纯化抗体。通过方法制备所得卵黄抗体纯度高，具有较强的中和幽门螺旋杆菌活性，为后续在制备预防及治疗幽门螺旋杆菌感染引起的胃肠道疾病药物研究打下基础。

附图说明

图1是本申请抗Hp卵黄抗体制备方案流程图；

图2是实施例1中蛋鸡第二次免疫后第10天抗血清效价；

图3是实施例3抗Hp卵黄抗体10％SDS-PAGE电泳图；

图4是实施例4纯化的抗Hp卵黄抗体效价；

图5是实施例5纯化的抗Hp卵黄抗体中和Hp毒性蛋白诱导的细胞毒性结果；

图6是实施例6抗Hp卵黄抗体治疗Hp感染小鼠后小鼠血清中抗Hp IgG效价结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本申请作出详细说明。

材料来源：

免疫原获取：通过查阅相关商品化产品及比较分析，最终选定了品牌为BioReagents、货号为A144的幽门螺旋杆菌裂解分离物。该产品采用具有自主知识产权的纯化方法从幽门螺旋杆菌裂解液中分离富集Hp特异性抗原，主要包括Ure、VacA、CagA等三种蛋白。从国内代理公司南京瀚睿生物科技有限公司购买1mg此免疫原，其浓度为2.5mg/ml，并进行分装，保存在-20℃。

用于胃幽门螺旋杆菌感染小鼠模型建立的H.Pylori取自十二指肠溃疡患者体内。

实施例1免疫蛋鸡及抗血清效价测定

选取3只正在产蛋的健康蛋鸡分笼饲养，分别编号#1、#2、#3。首次免疫时将免疫原与等体积弗氏完全佐剂充分混合，超声乳化完全，采取颈背部皮下两点和胸大肌两点注射，免疫剂量为每只蛋鸡100μg免疫原，注射体积为0.5ml。间隔30天进行第二次免疫，此次免疫与首次免疫区别在于将弗氏完全佐剂改成弗氏不完全佐剂，免疫剂量和注射体积同第一次免疫。第二次免疫后间隔30天进行第三次免疫，此次免疫不使用佐剂，采取鸡翅尾静脉注射，免疫剂量为每只蛋鸡50μg免疫原，注射体积为0.5ml。此次免疫结束7天后开始收集鸡蛋，每次收集鸡蛋时在鸡蛋外壳写明所属蛋鸡编号及生蛋日期，鸡蛋保存在4℃。

在第二次免疫后第10天，每只鸡通过鸡翅尾静脉采血约0.5ml，4℃放置半小时，然后10000rpm，4℃离心10min，分离血清检测抗血清效价。

检测抗血清效价时采用间接ELISA方法，其中间接ELISA方法如下：用免疫原包被酶标板，2μg/ml，50μl/孔，4℃过夜。次日倾去包被液，用0.05％PBST人工洗板3次后，加入0.5％BSA封闭，200μl/孔，37℃，1h。弃去封闭液，0.05％PBST人工洗板3次后，加入自1:1000开始倍比稀释的上述抗血清共7个稀释度，空白对照为PBS，50μl/孔，37℃，1h。0.05％PBST人工洗板3次后，加入1:2000稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgY二抗，50μl/孔，37℃，1h。0.05％PBST人工洗板5次后，加入显色底物TMB，50μl/孔，室温，10min。

在酶标仪上读取OD450nm，结果如图2所示，其中横坐标是抗血清稀释倍数，纵坐标是OD450nm，基线为空白对照孔OD值的2.1倍，基线以上为阳性值，基线以下为阴性值。结果显示#1和#2蛋鸡的抗血清效价达到1:4000以上，而#3蛋鸡的抗血清效价达到1:16000以上，说明本申请免疫原免疫蛋鸡能产生较高亲和力的抗Hp特异性卵黄抗体。

实施例2提取纯化抗Hp卵黄抗体

结合附图1的卵黄抗体制备流程图和实施例1中的免疫鸡蛋收集，进一步采用水稀释法、氯化钠盐析法及嗜硫亲和层析法提取纯化抗体。

准备工作：实验用所有器具(250ml烧杯2个、250ml玻璃试剂瓶2个、250ml量筒1个、蛋黄分离器1个、玻璃棒1只、滤纸2张、磁力搅拌子1个)及试剂(超纯水、PBS)提前一天高温高压灭菌，待用。

水稀释法提取卵黄抗体：用水清洗鸡蛋表面后将其浸泡于新洁尔灭中，浸泡1～3min，取出用纱布擦干后，再用75％酒精擦一遍，自然晾干，尽量保证是在无菌条件下去除卵白。采用蛋黄分离器分离卵黄和卵白，将卵黄置于灭菌滤纸上滚动吸掉残留卵白，刺破卵黄膜，使卵黄液流入灭菌烧杯内，计量(一般一个鸡蛋所收集卵黄体积约15ml)。按照卵黄：超纯水体积比分别为1:7、1:8、1：9加入超纯水(一般约105ml、120ml、135ml)稀释，置磁力搅拌器上充分搅拌10min。用1M HCl调节卵黄溶液PH至5.0或5.2，置磁力搅拌器上均匀搅拌2h、4h、8h。将卵黄溶液转移至无菌50ml离心管中，放置-20℃或-80℃过夜凝固。第二天转移至4℃解冻1h或4h，再转移至室温待完全解冻。离心(13500g/min，10℃，15min)，将上清液转移至灭菌滤纸上过滤至灭菌玻璃试剂瓶中，弃去沉淀，滤出液备用。

氯化钠盐析法纯化：用量筒计量上述滤出液体积并倒入灭菌烧杯内，边搅拌边往滤出液中缓慢加入固体氯化钠，加入量为总体积(w/v)的8.8％或9.4％，充分搅拌10min。用1M HCl调节卵黄溶液PH至4.0，置磁力搅拌器上均匀搅拌2h。将混合液转移至50ml离心管中，离心(3700g，10℃，20min)，弃去上清，离心管倒扣晾干。

嗜硫亲和层析纯化：取上述所有沉淀用50ml 50mM NaH₂PO₄，0.5M Na₂SO₄，PH8.0稀释溶解，然后用0.45μm滤膜过滤至灭菌玻璃试剂瓶中。按照嗜硫亲和层析预装柱说明书进行卵黄抗体的嗜硫亲和层析纯化。收集洗脱液至15ml 100KD超滤离心管中，离心(4000rpm，10℃，15min)，期间用5ml PBS换洗2次，使其脱盐浓缩至约2ml体积。用0.22μm滤膜过滤，分装冻干，得到抗幽门螺旋杆菌的卵黄抗体。

实施例3

实施例2所得抗Hp卵黄抗体浓度测定及纯度检测

抗Hp卵黄抗体在纯化后，用超微量分光光度计检测其A280和A260，以PBS空白检测。当A280/A260<1.5时，用Lowry-Kalokar公式：样本蛋白质含量(mg/ml)＝1.45A280-0.74A260，计算卵黄抗体浓度，一般一个鸡蛋按照实施例2中方法可以提取纯化80mg以上卵黄抗体。

采用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色法对上述纯化抗体的纯度进行检测，结果如图3所示，其中M为蛋白分子量标准，泳道1、2为分别从#3蛋鸡于2018/8/18和2018/8/11两个时间点产下的鸡蛋中提取纯化的卵黄抗体的变性还原电泳条带，重链约70KD，轻链约25KD，泳道3、4为变性非还原电泳条带。表明按照实施例2中方法提取纯化的卵黄抗体纯度可以达到95％以上，完全满足用于防治Hp感染的抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体的纯度要求。

实施例4抗Hp卵黄抗体效价测定

抗Hp卵黄抗体在纯化定量后，采用间接ELISA方法测定其效价。间接ELISA方法如下：用免疫原包被酶标板，2μg/ml，50μl/孔，4℃过夜。次日倾去包被液，用0.05％PBST人工洗板3次后，加入0.5％BSA封闭，200μl/孔，37℃，1h。弃去封闭液，0.05％PBST人工洗板3次后，加入自100μg/ml开始倍比稀释的上述纯化抗体共7个浓度，空白对照为PBS，50μl/孔，37℃，1h。0.05％PBST人工洗板3次后，加入1:2000稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgY二抗，50μl/孔，37℃，1h。0.05％PBST人工洗板5次后，加入显色底物TMB，50μl/孔，室温，10min。

在酶标仪上读取OD450nm，结果如图4所示，从#3蛋鸡于2018/8/18和2018/8/11两个时间点产下的鸡蛋中提取纯化的抗Hp卵黄抗体的效价，其中横坐标是纯化的抗Hp卵黄抗体浓度，纵坐标是OD450nm，基线为空白对照孔OD值的2.1倍，基线以上为阳性值，基线以下为阴性值。显示抗Hp卵黄抗体的效价可以达到5μg/ml以上。

实施例5抗Hp卵黄抗体中和Hp毒性蛋白诱导的细胞毒性实验

实验证明Hp毒性蛋白如VacA、CagA可以诱导细胞毒性抑制细胞生长，为了验证抗Hp卵黄抗体在体外是否有中和这些毒性蛋白作用从而使细胞恢复正常增殖生长，按照下述实验方法进行。

(1)接种100μl HEK293T细胞悬液于96孔板中(10000个细胞/孔，注意不要产生气泡)预培养24h，同时设置空白组和对照组，每组设置2个复孔；

(2)不同浓度抗Hp卵黄抗体(分别为0,5,10,20mg/ml)与100μg/ml的免疫原等体积混合，37℃反应2h，向每孔分别加入10μl反应液，在培养箱中孵育72h；

(3)向每孔加入10μl CCK-8(建议沿细胞板壁加入，后轻轻混匀，不要产生气泡)，培养箱中孵育2h；

(4)酶标仪测定450nm处的吸光值。

(5)计算抑制百分比＝[(B-A)/(B-C)]×100％

A:实验组吸光值(为含有培养基、细胞、待测药物和CCK-8的吸光值)

B:对照组吸光值(为含有培养基、细胞、CCK-8的吸光值)

C:空白组吸光值(为含有培养基、CCK-8的吸光值)

结果如图5所示，从#3蛋鸡于2018/8/18和2018/8/11两个时间点产下的鸡蛋中提取纯化的抗Hp卵黄抗体中和Hp毒性蛋白诱导的细胞毒性实验结果，其中横坐标是抗Hp卵黄抗体浓度，纵坐标是细胞生长抑制率，抑制率为负数可以认为完全无抑制作用。结果表明，50μg/ml的Hp毒性蛋白就能对HEK293T细胞生长产生60％抑制率，而加入上述三种浓度的抗Hp卵黄抗体后便能逆转这种抑制作用，而且5mg/ml浓度的抗Hp卵黄抗体就能使Hp毒性蛋白诱导的细胞毒性作用完全消失。因此，抗Hp卵黄抗体在体外具有很强的中和Hp活性。

实施例6抗Hp卵黄抗体体内抑菌实验

(1)幽门螺旋杆菌菌株制备

选用十二指肠溃疡患者体内分离的H.Pylori菌株(CagA+、VacA+)，应用液体培养法增菌：将-70℃冻存菌株在空肠弯曲菌琼脂平板上复苏，转种于脑心浸液培养基中，微氧条件37℃培养60～72h，取少量培养液涂片，革兰染色后观察细菌形态并检测尿素酶、过氧化氢酶和氧化酶。均为阳性后，将细菌浓度调整到1x10⁹cfu/mL，立即接种6～8周龄雌性Balb/c小鼠。

(2)建立Hp感染小鼠模型

小鼠禁食禁水12h后灌饲0.1M的NaHCO3溶液0.5mL，2h后再灌胃接种新鲜培养的Hp菌液0.5mL，继续禁食禁水4h。灌胃后重复5次，中间间隔48h，其中后3次不灌NaHCO3。末次感染l0天后随机取5只小鼠，解剖取胃，用胃幽门螺杆菌pH指示剂法诊断试剂盒检测胃内均有Hp定植，并取胃黏膜内侧物质进行培养并传代，均检测到有可稳定传代的Hp生长，说明造模成功。将模型小鼠随机分组并于次日开始给药。

(3)抗Hp卵黄抗体给药治疗Hp感染小鼠

将实验动物按照如下描述分组：①空白对照组1(正常小鼠，给予生理盐水)；②空白对照组2(正常小鼠，给予100mg/ml抗Hp IgY)；③模型对照组(感染小鼠，给予生理盐水)；④阳性对照组(感染小鼠，给予克拉霉素)；⑤阴性对照组(感染小鼠，给予阴性卵黄抗体)；⑥抗Hp IgY治疗组(感染小鼠，给予100mg/ml抗Hp IgY)；⑦抗Hp IgY治疗组(感染小鼠，给予50mg/ml抗Hp IgY)；⑧抗Hp IgY治疗组(感染小鼠，给予10mg/ml抗Hp IgY)；每组5只小鼠，给药途径均为灌胃。每天灌胃一次，间隔1天，共3次，每次灌胃前先灌碳酸氢钠以中和胃酸防止卵黄抗体失活，服用卵黄抗体后4周后采用间接ELISA方法检测每只小鼠血清中抗HpIgG效价。

间接ELISA方法如下：用免疫原包被酶标板，2μg/ml，50μl/孔，4℃过夜。次日倾去包被液，用0.05％PBST人工洗板3次后，加入0.5％BSA封闭，200μl/孔，37℃，1h。弃去封闭液，0.05％PBST人工洗板3次后，加入1000倍稀释的小鼠抗血清，50μl/孔，37℃，1h。0.05％PBST人工洗板3次后，加入1:20000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG二抗，50μl/孔，37℃，1h。0.05％PBST人工洗板5次后，加入显色底物TMB，50μl/孔，室温，10min。

在酶标仪上读取OD450nm，结果如图6所示，其中横坐标为各实验组名称，纵坐标为OD450nm，各组OD450nm为5只小鼠平均值。结果显示，抗Hp IgY治疗组包括高中低三个剂量组的小鼠血清中抗Hp IgG水平明显降低，基本上与克拉霉素治疗阳性对照组水平相当，说明抗Hp卵黄抗体在体内具有很强的中和Hp活性从而抑制Hp在胃肠道生长。

因此，利用该抗Hp卵黄抗体可以进一步加工成食品添加剂或功能性保健品，用于预防和治疗Hp感染引起的胃肠道疾病。

Claims (10)

1.一种抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)收集免疫鸡蛋：使用幽门螺旋杆菌特异性抗原免疫正在产蛋蛋鸡，免疫结束后收集鸡蛋，保鲜保存；

(2)水稀释法提取卵黄抗体：取步骤(1)收集的免疫鸡蛋，无菌条件下去除卵白收集卵黄，加入超纯水磁力搅拌，调节PH至5.0～5.2，继续磁力搅拌，置于-20℃～-80℃过夜凝固，完成后先4℃解冻1～4h，再室温完全解冻，离心收集上清液，经灭菌滤纸过滤，收集滤出液；

(3)氯化钠盐析法纯化：搅拌状态下向步骤(2)收集的滤出液中加入固体氯化钠，搅拌均匀后调节PH至4.0，磁力搅拌，离心，收集沉淀晾干；

(4)嗜硫亲和层析纯化：取步骤(3)收集的沉淀用缓冲液溶解，过滤膜后上样洗脱，收集洗脱液离心，脱盐浓缩后用滤膜过滤，分装冻干，得到抗幽门螺旋杆菌的卵黄抗体。

2.根据权利要求1所述的抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述幽门螺旋杆菌特异性抗原为富集Hp特异性抗原，包括Ure、VacA、CagA三种蛋白的幽门螺旋杆菌裂解分离物。

3.根据权利要求1所述的抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，使用幽门螺旋杆菌特异性抗原免疫正在产蛋蛋鸡3次，第一次免疫时，将幽门螺旋杆菌特异性抗原与等体积弗氏完全佐剂混合后超声乳化；第二次免疫时，将幽门螺旋杆菌特异性抗原与等体积弗氏不完全佐剂混合后超声乳化；第三次免疫时，不使用佐剂。

4.根据权利要求3所述的抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，第一次和第二次免疫采取颈背部皮下两点和胸大肌两点注射，第三次免疫采取鸡翅尾静脉注射幽门螺旋杆菌特异性抗原。

5.根据权利要求3所述的抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，第一次和第二次免疫剂量为每只蛋鸡50～200μg免疫原，注射体积0.2～0.5ml；第三次免疫剂量为每只蛋鸡50～200μg免疫原，注射体积0.2～0.5ml。

6.根据权利要求1所述的抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，氯化钠的加入量为总体积的8.2％～9.4％。

7.根据权利要求1所述的抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述缓冲液为50mM NaH₂PO₄，0.5M Na₂SO₄，PH8.0。

8.根据权利要求1所述的抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，洗脱条件为：50mM NaH₂PO₄，PH8.0，流速为2～5ml/min。

9.权利要求1-8中任一制备方法制备所得抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体。

10.权利要求9所述抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体在制备预防和治疗幽门螺旋杆菌感染引起的胃肠道疾病药物中的应用。