CN109467605A - 嵌合抗原受体DAP12-T2A-CD8α-MSLN scFv-NKp44及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种优化的嵌合抗原受体DAP12‑T2A‑CD8α‑MSLN scFv‑NKp44及其用途，所述的嵌合抗原受体由胞内第二传导结构域DAP12、T2A、CD8α信号肽、抗人MSLN单克隆抗体ss1轻链和重链可变区MSLN scFv、胞内第一传导结构域串联构成。该嵌合抗原受体用于修饰T淋巴细胞，修饰后的T细胞(CAR‑T细胞)能用于MSLN阳性的恶性实体肿瘤的治疗。在恶性实体肿瘤杀伤试验中，明显加强了CAR‑T细胞对胰腺癌肿瘤细胞的杀伤能力，在临床应用中展现出良好的安全性和抗肿瘤活性。

Description

嵌合抗原受体DAP12-T2A-CD8α-MSLN scFv-NKp44及其用途

技术领域

本发明涉及肿瘤免疫治疗技术领域。本发明利用基因工程技术获得编码嵌合抗原受体DAP12-T2A-CD8α-MSLN scFv-NKp44的融合基因，将该基因片段插入慢病毒表达载体，包装成慢病毒，转导入人T淋巴细胞中，使T细胞表达该嵌合抗原受体。本发明还涉及编码此类跨膜多肽的核酸、载体，以及用于免疫治疗的在其表面表达所述CAR的免疫细胞。本发明所涉及的嵌合抗原受体修饰的T细胞能靶向并特异性杀伤MSLN阳性的肿瘤细胞，用于恶性实体肿瘤的治疗，开辟了对用于治疗癌症的有效的过继性免疫治疗策略的道路。

背景技术

随着肿瘤免疫学理论和临床技术的发展，嵌合抗原受体T细胞疗法(Chimericantigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T)成为目前最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一[Schmitz M，et al.Chimeric antigen receptor-engineered T cellsforimmunotherapy of Cancer.J Biomed Biotechnol，2010，doi：10.1155/2010/956304.]。嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，CAR能针对所选择的免疫细胞重定向其特异性和反应性，因此赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较与正常T细胞受体(TCR)应答不同，不受MHC限制，具有活化和增殖的能力，因此具有高效的杀伤肿瘤细胞的能力。

嵌合抗原受体(CAR)在T细胞上表达合成蛋白，其将抗体的抗原识别片段(如抗体单链可变区片段)与胞内信号结构域融合。研究发现，以肿瘤特异性单克隆抗体的单链可变区(scFv)取代TCR的α，β链可变区，并将scFv直接和T细胞信号传导结构域连接，形成嵌合抗原受体(CAR)表达于T细胞表面，可通过scFv识别肿瘤特异性抗原，直接产生T细胞的活化信号，促进T细胞活化、增殖，特异性杀伤肿瘤细胞。该过程主要依赖CAR-T细胞表面的scFv对肿瘤抗原的特异性识别，免疫反应的特异性和杀伤性较强。

间皮素(MSLN)是一种通过磷脂酰肌醇区(GPI)锚定在细胞膜上得糖蛋白。它最初合成的是一个69kDa的细胞表面蛋白。成熟过程中在弗林蛋白酶的作用下断裂成两段，C末端40kDa的片段锚定在膜上，N末端32kDa的片段以溶解的形式释放出来，称为巨核细胞增效因子(MPF)。MSLN在腹膜、胸膜腔和心包上的间皮细胞上表达，而在上气管、卵巢、睾丸网、扁桃体和输卵管的上皮细胞表面低表达。此外，MSLN被发现在间皮瘤、卵巢癌和肺癌等恶性肿瘤中高表达。宾夕法尼亚大学的一项研究表明，六名复发性浆液性卵巢癌患者注射表达二代CAR的MSLN CAR-T细胞治疗后，没有观察到与输注相关的急性不良事件(AE)和细胞因子释放综合症。一名患者观察到相关的3-4级AE，包括胸腔积液，呼吸急促和呼吸困难；2例患者伴有腹痛，腹水和便秘。在治疗一个月后，所有六名患者在按照RECIST标准成像时显示病情稳定(SD)[Gregory L.，et al.Activity of Mesothelin-specific Chimeric AntigenReceptor T cells Against Pancreatic Carcinoma Metastases in a Phase 1Trial.Gastroenterology,2018.]

本发明提供一种嵌合抗原受体DAP12-T2A-CD8α-MSLN scFv-NKp44，包含胞内第二传导结构域DAP12、T2A、CD8α信号肽、抗人MSLN单克隆抗体ss1轻链和重链可变区MSLNscFv、胞内第一传导结构域NKp44。该嵌合抗原受体用于修饰T淋巴细胞，修饰后的T细胞(CAR-T细胞)能用于MSLN阳性的恶性实体肿瘤的治疗。在实体肿瘤杀伤试验中，明显加强了CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，在临床应用中展现出良好的安全性和抗肿瘤活性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种优化的靶向MSLN的嵌合抗原受体(DAP12-T2A-CD8α-MSLN scFv-NKp44)，表达该嵌合抗原受体的T细胞具有其独特性，首先研究其在细胞水平的肿瘤特异性杀伤功能，进一步展示了其在临床治疗中的应用。

本发明的目的之一在于一种优化MSLN靶向性的嵌合抗原受体及其制备方法和用途。

本发明的目的之二在于提供编码该嵌合抗原受体的核酸。

本发明的目的之三在于提供含有该嵌合抗原受体的细胞及其应用。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种优化的嵌合抗原受体DAP12-T2A-CD8α-MSLN scFv-NKp44，所述嵌合抗原受体由胞内第二传导结构域DAP12、T2A、CD8α信号肽、抗人MSLN单克隆抗体ss1轻链和重链可变区MSLN scFv、胞内第一传导结构域NKp44串联构成；所述嵌合抗原受体的核酸序列如SEQ ID NO.16所示，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.20所示。

所述靶向MSLN嵌合抗原受体的抗原结合结构域(即MSLN scFv)为VL-VH或VH-VL，VL为抗体轻链可变区；其中VH为抗体重链可变区；“—”为连接肽或肽键。

在一个实施方案中，所述抗体轻链可变区VL具有SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列，或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽；抗体重链可变区VH具有SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列，或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽。

在一个实施方案中，所述抗原结合结构域的单链抗体的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)之间由连接肽(Linker)连接，包含GS Linker如(G₃S)₄或(G₄S)₃，优选(G₄S)₃连接肽，连接肽氨基酸由SEQ ID NO.13所示。

所述嵌合抗原受体含有针对人MSLN抗原的单链抗体MSLN scFv，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述胞内信号结构域优选第一信号传导结构域包括NKp44、NKp46、NKp30、NKG2D、TREM1或TREM2的序列。进一步优选的，第一信号传导结构域包括NKp44的序列。

所述第一传导结构域NKp44的氨基酸序列优选SEQ ID NO.9所示，或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽。

所述胞内第二传导结构域DAP12通过T2A与胞外信号肽和抗原结合结构域串联。优选的，所述DAP12氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述T2A氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明嵌合抗原受体结构如下：

DAP12-T2A-CD8α信号肽-VH-Linker-VL-NKp44 mesoCAR-1

DAP12-T2A-CD8α信号肽-VL-Linker-VH-NKp44 mesoCAR-2

DAP12-T2A-GM-CSF信号肽-VH-Linker-VL-NKp44 mesoCAR-3

DAP12-T2A-GM-CSF信号肽-VL-Linker-VH-NKp44 mesoCAR-4

其中抗原结合结构域可由VH-Linker-VL或VL-Linker-VH或VHH1-Linker-VHH2组成，VHH1和VHH2可识别相同抗原，或不同抗原。

在本发明的一个优选地实施方案中，所述载体中还包括信号肽编码序列。优选地，所述信号肽序列连接在所述抗原结合结构域核酸序列的上游。优选地所述信号肽为人源CD8α信号肽或人GM-CSF信号肽。

优选地，所述人源CD8α信号肽核酸序列如SEQ ID NO.7所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.8所示，或与其具有85％-99％同一性氨基酸序列；

优选地，所述人GM-CSF信号肽核酸序列如所示SEQ ID NO.14，氨基酸序列如SEQID NO.15，或与其具有85％-99％同一性氨基酸序列；

在一个实施方案中，本发明嵌合抗原受体包含SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQID NO.18、或SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列；氨基酸序列如SEQ ID NO.20、SEQ IDNO.21、SEQ ID NO.22、或SEQ ID NO.23所示，或与其具有85％-99％同一性氨基酸序列。

一种重组表达载体，该表达载体优选慢病毒表达载体，包含编码SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、或SEQ ID NO.19的核苷酸序列。

一种表达嵌合抗原受体的细胞，该细胞优选免疫细胞；进一步优选T淋巴细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、间充质干细胞、造血干细胞、多能干细胞或胚胎干细胞培养分化的免疫细胞。

一种制备嵌合抗原受体DAP12-T2A-CD8α-MSLN scFv-NKp44修饰的T细胞的方法，该方法包括分离和激活待修饰的T细胞，然后以前述表达载体转导该T细胞。

含有所述嵌合抗原受体DAP12-T2A-CD8α-MSLN scFv-NKp44、表达载体、所述细胞在制备治疗肿瘤的药物中的用途。

所述的肿瘤优选包括间皮瘤，恶性胸膜间皮瘤，非小细胞肺癌，小细胞肺癌，鳞状细胞肺癌，大细胞肺癌，胰腺癌，胰腺导管腺癌，胰腺转移，卵巢癌，结肠直肠癌和膀胱癌和其任何组合。

在具体实施方案中，涉及制备治疗实体肿瘤的药物用途。

本发明所述的嵌合抗原受体DAP12-T2A-CD8α-MSLN scFv-NKp44涉及在制备抗肿瘤药物及细胞免疫疗法中的应用。

本发明所述的免疫效应细胞涉及在制备抗肿瘤药物及细胞免疫疗法中的应用。

本发明的有益效果：

本发明提供一种嵌合抗原受体，包含胞内第二传导结构域、T2A、胞外信号肽、靶向MSLN抗原结合结构域、胞内第一传导结构域，例如胞内第二传导结构域DAP12、T2A、CD8α信号肽、MSLN scFv、胞内第一传导结构域NKp44(DAP12-T2A-CD8α信号肽-MSLN scFv-NKp44)。采用靶向MSLN抗原的MSLN scFv基因序列，将其VL与VH通过连接肽进行组合重排，搭载不同的信号肽组合，构建抗人MSLN CAR表达质粒，利用该质粒与慢病毒的包装质粒系统在293T细胞中包装病毒，感染T细胞，制备靶向MSLN抗原的CAR-T细胞。通过CAR-T细胞的体外功能验证，如细胞因子分泌和杀伤实验，筛选获得效果最优的嵌合抗原受体结构DAP12-T2A-CD8α-MSLN scFv-NKp44。该嵌合抗原受体结构利于CAR-T细胞受到胞外肿瘤抗原刺激时分泌更低水平的细胞因子，能够很好地保证临床应用的安全性，不仅在体外有良好的肿瘤杀伤作用，而且在临床治疗恶性实体肿瘤病人也展现出了显著疗效，而且细胞因子释放反应更为温和。与现有技术相比，该嵌合抗原受体显示了较高的抗肿瘤能力，由其修饰的免疫细胞具有较高的靶向识别肿瘤抗原的能力，增强了对肿瘤细胞的杀伤活性。

附图说明

图1是含有靶向MSLN抗原结合结构域的CAR结构，展示了本发明中所涉及的多种嵌合抗原受体组合结构图。

图2是mesoCAR-1、mesoCAR-2、mesoCAR-3、mesoCAR-4细胞感染慢病毒7天后通过流式细胞仪检测T细胞表面识别CAR结构的表达阳性率。

图3是CAR-T细胞感染不同CAR慢病毒后细胞增殖情况，CAR-T和NTD细胞在体外扩增10天，其中NTD为未转染CAR慢病毒的T细胞。

图4是CAR-T细胞在MSLN抗原刺激下IFN-γ的分泌情况，CAR-T细胞与靶细胞共培养24h。

图5是CAR-T细胞对MSLN抗原阳性细胞株杀伤作用，CAR-T细胞与靶细胞共培养杀伤8h。

图6是晚期胰腺癌患者治疗前后影像学评价图。

具体实施方式

本发明提供了一种靶向MSLN的嵌合抗原受体、免疫效应细胞及其在临床治疗实体肿瘤中的应用，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

本发明的新型嵌合抗原受体包含胞外信号肽结构，例如CD8α信号肽、4-1BB信号肽、GM-CSF信号肽或CD4信号肽，优选CD8α信号肽和GM-CSF信号肽。

本文所用的术语“胞内信号结构域”指的是能够传导细胞效应功能信号并指导细胞执行特定功能的蛋白质结构区域。胞内信号结构域可以包括第一信号传导结构域、第二信号传导结构域和/或跨膜结构域。

本文所用的术语氨基酸序列的“同一性”(identity)可以与“相似性”互换使用，指的是氨基酸序列之间通过序列比对软件例如BLAST确定的相似程度。氨基酸序列比对的方法和软件对于本领域技术人员是公知的。可以通过对已知氨基酸序列进行一个或几个(例如1-15个，例如2、3、5、8、10或12个)氨基酸残基的取代、缺失和/或添加而获得经改造的氨基酸序列。例如，通过常规蛋白质工程手段(例如氨基酸保守取代等)，对本发明SEQ IDNO.2所示的MSLN抗原结合结构域进行改造，可以获得与SEQ ID NO.2具有至少85％(例如85％～99％或90％～99％或95％～99％)序列同一性，并且具有基本相同的抗原结合结构域的变体序列。

本文所用的术语“抗原结合结构域”是包括具有功能的抗体部分，优选抗原结合和/或完整抗体的可变区。抗体片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv fragments、单链抗体scFv、单域抗体VHH及多特异性抗体。

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1、嵌合抗原受体制备

本发明提供一种优化的靶向MSLN抗原嵌合抗原受体。本发明的嵌合抗原受体由胞内第二传导结构域-T2A-胞外信号肽-靶向MSLN抗原结合结构域-胞内第一传导结构域顺序串联组成。因此需要分别构建含有不同刺激信号组合的病毒载体。本实施例中以NKp44为统一的胞内第一传导结构域的结构，分别需要构建如下4个嵌合抗原受体(图1)：

DAP12-T2A-CD8α信号肽-VH-Linker-VL-NKp44 (mesoCAR-1)

DAP12-T2A-CD8α信号肽-VL-Linker-VH-NKp44 (mesoCAR-2)

DAP12-T2A-GM-CSF信号肽-VH-Linker-VL-NKp44 (mesoCAR-3)

DAP12-T2A-GM-CSF信号肽-VL-Linker-VH-NKp44 (mesoCAR-4)

1、含有靶向MSLN嵌合抗原受体的基因序列

设计依次含有自然杀伤激活受体(简称DAP12)、T2A、CD8α信号肽、GM-CSF信号肽、VH-Linker-VL、VL-Linker-VH、自然细胞毒性受体(简称NKp44)，其结构如图1所示。其中DAP12的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，T2A的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；CD8α信号肽的核苷酸序列如SEQID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；GM-CSF信号肽的核苷酸序列如SEQ IDNO.14所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示；MSLN单链抗体的轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；MSLN单链抗体的重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；NKp44的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。

2、构建表达嵌合抗原受体的慢病毒载体

pELNS-DAP12-T2A质粒由南京卡提医学科技有限公司保存，或者根据文献(EnxiuWang et al.Generation of Potent T-cell Immunotherapy for Cancer Using DAP12-Based,Multichain,Chimeric Immunoreceptors.2015,Cancer Immunology Research,3(7):815)公开的方法进行构建，CD8α-VH-VL-NKp44、CD8α-VL-VH-NKp44、GM-CSF-VH-VL-NKp44、GM-CSF-VL-VH-NKp44基因合成由生工生物工程(上海)股份有限公司生物科技公司合成并提供pUC19-mesoCAR-1、pUC19-mesoCAR-2、pUC19-mesoCAR-3、pUC19-mesoCAR-4质粒，将质粒pELNS-DAP12-T2A分别和四个合成的基因片段通过AvrII、SalI双酶切(购自Takara公司)，酶切反应按说明书进行，酶切后再连接，获得表达嵌合抗原受体的慢病毒载体：

pELNS-DAP12-T2A-CD8α-VH-VL-NKp44(mesoCAR-1)

pELNS-DAP12-T2A-CD8α-VL-VH-NKp44(mesoCAR-2)

pELNS-DAP12-T2A-GM-CSF-VH-VL-NKp44(mesoCAR-3)

pELNS-DAP12-T2A-GM-CSF-VL-VH-NKp44(mesoCAR-4)。

将5μL慢病毒载体转化大肠杆菌TOP10感受态细胞中(购自南京安杰优生物科技有限公司)，37℃培养16h后挑取单克隆，挑取的单克隆在37℃条件下培养12h后用质粒抽提试剂盒(购自Takara公司)抽提质粒，具体方法见说明书。

3、慢病毒包装

本实施例包装慢病毒采用磷酸钙法，具体步骤如下：

(1)293T细胞隔天传代

每个T150细胞瓶种植5×10⁶个细胞。48小时后，细胞数目应该达到20-25百万/瓶。

(2)293T细胞铺瓶

a)以1个T150细胞培养瓶为例，用约15ml的1×PBS轻柔地洗细胞两次

b)加入3ml0.25％胰酶-2.21mM EDTA

c)等到细胞脱落，加入12ml 10％(wt)FBS(购自Gibico)的DMEM培养基(购自corning)至已经脱落的细胞中

d)收集并将细胞转移至无菌离心管，1000rpm,离心10分钟

e)吸掉上清，将沉淀重悬于10ml 10％(wt)FBS的DMEM培养液中。

f)细胞计数，根据细胞浓度计算12×10⁶个细胞所需要的体积

g)将细胞和25ml的10％(wt)FBS的DMEM培养液合并，放入T150细胞瓶中，轻摇，使得细胞均匀分布到细胞瓶底37℃，5％CO2培养箱中培养过夜。

(3)细胞转染

观察细胞，细胞密度大约达到80％-90％，此时就可以开始转染

a)在转染前30-60分钟，轻柔吸掉培养液。

b)混合质粒DNA和氯化钙溶液，以一个T150瓶为例，需要28ug pRSV.rev(购自Invitrogen公司)，28ug pGAG-Pol(购自Invitrogen公司)，11ug pVSVG(购自Invitrogen公司)，23ug重组慢病毒表达质粒mesoCAR-1/mesoCAR-2/mesoCAR-3/mesoCAR-4，加入到1.5ml氯化钙溶液中，混匀。

c)将1.5ml BBS溶液加入到15ml无菌离心管中，用1ml枪头把DNA-氯化钙溶液混匀后滴加到BBS溶液中，迅速混匀15-20下，室温孵育25-30分钟。

d)用5ml移液管把DNA-氯化钙-BBS混合物(购自上海碧云天生物技术有限公司)均匀逐滴加到T150瓶中。在含5％二氧化碳的37℃细胞培养箱内培养，6h换液。

e)6h后换液。轻轻晃动培养板数次以充分悬浮一些磷酸钙沉淀，吸去含磷酸钙沉淀的培养液，加入20ml新鲜的5％(wt)FBS的DMEM培养液，继续培养。

(4)初次收集病毒上清

a)将前一天转染的293T细胞培养上清收集到离心管，1000rpm离心5分钟，标记，暂存于4℃冰箱。

b)将事先预热的20ml 5％(wt)FBS的DMEM培养基加入细胞瓶中，37℃细胞培养箱继续培养过夜。

(5)第二次收集病毒上清液(48h/第四天)。

(6)过滤上清

将两次收集的上清液集中在一起，用0.45μm的滤膜过滤去除细胞碎片。

(7)病毒浓缩

4℃，12000-24000rpm离心过夜

(8)病毒储存

离心后，倾倒全部上清，加入新鲜5％(wt)FBS的DMEM培养基重悬，进行病毒分装，迅速存放于-80℃冰箱备用

(9)慢病毒滴度测定

a)病毒感染293T细胞

感染前将293T细胞铺至24孔板中，取已纯化浓缩病毒200μL加到293T细胞中，24h后用含10％FBS(wt)的DMEM培养基换液，感染72h后于1200r/min条件下离心5min以收集细胞，抽提基因组。

b)抽提基因组

基因组抽提试剂盒为购自于Takara公司，按试剂盒说明书操作

c)qPCR测定病毒滴度

反应体系如下：Probe qPCR Mix 12.5μL(购自Takara)，上游引物0.5μL(由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)，下游引物0.5μL(由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)，探针1μL(由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)，模板2μL，灭菌水8.5μL，反应体系为25μL，反应条件按照说明书设置，反应结束后，用分析软件分析数据，根据标准曲线计算病毒滴度。计算结果显示，病毒滴度为1×10⁷TU/ml。

实施例2、病毒感染T细胞

1、T细胞的分离活化及病毒感染

(1)人外周血单核细胞的分离

用含有抗凝剂的采血管采集外周血约10ml，室温(18-25℃)自然沉降约30min，收集上层血浆，将收集的上层血浆于5000r/min条件下离心10min，按体积比1:1加到淋巴细胞分离液(购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)上，梯度离心，3000r/min，离心30min，离心后，离心管由上之下分层：第一层为血浆层；第二层为淋巴细胞白膜层；第三层为透明分离液层；第四层红细胞层。吸取淋巴细胞白膜层，并用PBS洗涤2次，两次离心以1500r/min，离心10min，PBS重悬细胞，加入5％自体血浆+300IU/ml重组人IL-2+KBM581完全培养基培养人外周血单核细胞。

(2)慢病毒感染T淋巴细胞

用含5％自体血浆+300IU/ml重组人IL-2+KBM581完全培养基培养新制备的单个核细胞PBMC，IL-2购自R&D Systems，KBM581购自Corning，第0天加入CD3/CD28 Dynabeads免疫磁珠(购自invitrogen)活化T细胞，前3天进行慢病毒感染，加入0.25MOI对应的慢病毒载体，未感染的T淋巴细胞作为空白对照，48h后将培养基更换为含有5％自体血浆+300IU/ml重组人IL-2+KBM581完全培养基，继续培养7-9天。

2、T细胞中CAR阳性率的检测

将培养至第7天的已感染病毒的T细胞，1200r/min，离心5min，弃尽上清以收集细胞，用含有体积分数1％FBS的PBS溶液重悬细胞，并将细胞调整密度为1×10⁵个/ml，加入生物素标记羊抗鼠F(ab)₂(Jackson ImmunoResearch公司)，再加入Streptavidin-PE(BDBiosciences公司)，4℃孵育15min，PBS溶液洗涤2次，上流式细胞仪进行检测，结果显示经过7天的培养，CAR-T细胞CAR的阳性率：mesoCAR-1病毒感染组阳性率64.5％，mesoCAR-2病毒感染组阳性率50％，mesoCAR-3病毒感染组阳性率40.8％，mesoCAR-4病毒感染组阳性率61％(图2)。

实施例3、病毒感染CAR-T细胞对细胞增殖的影响

各组病毒感染完T细胞后，将T细胞用含体积分数5％自体血浆+300IU/ml重组人IL-2+KBM581完全培养基，每1-2天计数一次。然后观察T淋巴细胞生长情况，结果如图3所示。结果表明细胞在感染表达CAR的病毒后，依然能够形成典型的增殖克隆团，通过对细胞进行计数，绘制细胞增殖曲线可见mesoCAR-1、mesoCAR-2、mesoCAR-3、mesoCAR-4增殖相似，比未感染病毒的T细胞(图3中NTD)增殖能力稍弱。

实施例4、检测病毒感染meso CAR-T细胞的细胞因子分泌

(1)细胞因子检测采用Elisa的方法，使用R&D公司试剂盒进行。

(2)标准品的稀释：准备1ml离心管7支，依次编号号码，先在各离心管中加入标准品稀释液500μL，然后取原浓度标准品500μL加入到1只已编好号的离心管中，充分混匀，再在该离心管中取500μL加入第二支离心管中，充分混匀；再在该离心管中取500μL加入第三只离心管中，充分混匀；再在该离心管中取500μL加入第四只离心管中，充分混匀；再在该离心管中取500μL加入第五只离心管中，充分混匀；再在该离心管中取500μL加入第六只离心管中，充分混匀；再在该离心管中取500μL加入第七只离心管中，充分混匀。

(3)在酶标包被板上设标准品孔，依次加入不同浓度的标准品100μL，每个浓度2-3个平行孔。

(4)加样：分别设置空白孔(空白对照孔用水代替，酶标试剂及生物素标记的抗体操作照旧)、待测样品孔，在酶标包被板上待测样品孔中先加样品100μL，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀

(5)孵育：室温放置孵育2h

(6)洗涤：弃去液体，甩干，每孔加200μL洗涤液，静止30s后弃去，如此重复3次，拍干

(7)加抗体：酶标包被板上加入100μL检测抗体

(8)孵育：同操作(5)

(9)洗涤：同操作(6)

(10)加标记：每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记链霉亲和素

(11)孵育：避光室温放置孵育20min

(12)洗涤：同操作(6)

(13)显色：每孔加入显色液100μL，轻轻震荡混匀，避光室温放置孵育20min

(14)终止：每孔加入终止液50μL，终止反应

(15)测定：以空白值校零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)，测定应在加入终止液后15min内进行。

选择MSLN抗原表达水平具有差异的靶细胞与mesoCAR-1、mesoCAR-2、mesoCAR-3、mesoCAR-4的CAR-T细胞共培养，检测CAR-T受到抗原刺激产生响应作用分泌IFN-γ水平，meso抗原靶细胞选择OVCAR3(MSLN阳性)和293T(MSLN阴性)，以此来显示出CAR-T在受到MSLN抗原刺激时所特异性分泌出IFN-γ，结果反映出4种CAR-T细胞对于抗原表达水平具有差异的靶细胞产生了不同的响应作用。4种CAR-T细胞在与MSLN阳性靶细胞OVCAR3共培养时显著分泌IFN-γ(图4)，表明mesoCAR-1、mesoCAR-2、mesoCAR-3、mesoCAR-4的CAR-T细胞对于抗原阳性的肿瘤细胞均具有响应作用，但DAP12-T2A-CD8α-VH-VL-NKp44(mesoCAR-1)嵌合抗原受体结构效果最好。

实施例5、病毒感染靶向meso CAR-T细胞体外杀伤效果评估

(1)靶向MSLN抗原杀伤：培养靶细胞OVCAR3(MSLN阳性)、293T(MSLN阴性)和效应细胞mesoCAR-1、mesoCAR-2、mesoCAR-3、mesoCAR-4的CAR-T；

(2)收集靶细胞和效应细胞，1500rpm/min，离心5min，弃上清

(3)用10％FBS+1640完全培养基重悬靶细胞和效应细胞

(4)利用实时细胞分析系统(RTCA)，在E-Plate16的空中加入50μL 1640培养基

(5)利用RTCA检测基线，确定所选孔接触正常

(6)设置效靶比为0:1、1:1、5:1、10:1

(7)取出E-Plate16，按照效靶比，在每孔中加入混合均匀的靶细胞悬液100μL，使每孔种细胞数目为10⁴cells/100μL。

(8)将E-Plate16置于培养箱中，以37℃，5％CO2条件下，过夜放置

(9)第二天，将E-Plate16取出，加入50μL相应的效应细胞，计算加入效应细胞8h后的杀伤率。

检测结果如图5所示。mesoCAR-1、mesoCAR-2、mesoCAR-3、mesoCAR-4的CAR-T对MSLN抗原阳性细胞杀伤作用显著，明显高于NTD组，其中嵌合抗原受体DAP12-T2A-CD8α-VH-VL-NKp44(mesoCAR-1)效果最好。体外杀伤实验结果表明嵌合抗原受体DAP12-T2A-CD8α-MSLN scFv-NKp44靶向MSLN抗原具备很强的抗肿瘤活性。

实施例6、mesoCAR-1修饰的自体T细胞对MSLN阳性的晚期胰腺癌患者的临床试验治疗效果

采集MSLN阳性的晚期胰腺癌患者100ml外周血，分离纯化获得T细胞(实施例2)，添加5％自体血浆、300IU/ml重组人IL-2和CD3/CD28磁珠体外激活1天后转导CAR1慢病毒载体。以0.8～1.5×10⁶/mL的培养密度每天进行扩大培养9～12天。

将mesoCAR-1分别转导至来自5例不同MSLN阳性的晚期胰腺癌患者的T细胞中，转导后的细胞命名为mesoCAR-T1、mesoCAR-T2、mesoCAR-T3、mesoCAR-T4、mesoCAR-T5。

以下以mesoCAR-1针对MSLN阳性的晚期胰腺癌患者的治疗为例。

mesoCAR-T1患者：

胰头部恶性肿瘤术后、放射性粒子植入术后，胆囊切除术后。PET/CT示腹腔动脉旁淋巴结转移可能。CT报告下腹部肠管间可疑软组织灶伴强化，临床诊断为胰腺癌。免疫组化检测结果为MSLN阳性，经医院推荐，通过伦理审查，病人签署知情同意书，然后进行mesoCAR-1细胞治疗的临床试验研究。

mesoCAR-1修饰的自体T细胞治疗过程为：采集患者外周血，体外分选获得T细胞，T细胞体外激活与扩增，制备mesoCAR-1细胞制剂，制剂质量控制与放行，分三个时间点分三次通过静脉回输至病人体内，共计输注约1.35×10⁸CAR-T细胞。

mesoCAR-T1病人回输mesoCAR-1细胞后，出现温和的发热反应，体温在最后一次回输后1天升高至37.5，随后迅速恢复，细胞因子检测结果显示白介素6(IL-6)分泌水平较基线期提高4倍。国外报道的MSLN CAR-T治疗胰腺癌副反应较少出现，但更多情况是MSLNCAR-T临床治疗无效。本临床试验结果表明本发明所涉及的优化的靶向MSLN嵌合抗原受体修饰的T细胞在治疗晚期胰腺癌有着更温和的反应，对患者无副作用。在回输后的1个月对患者病灶进行影像学评价。如图6所示，治疗前肿瘤病灶大小约50×45mm，治疗后肿瘤病灶大小约43×39mm。结合影像学评价结果表明：该病人经过本发明提供的CAR3细胞治疗后，肿瘤缩小约25％，达到临床部分缓解。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权力要求书所限定的范围。

序列表

<110> 南京卡提医学科技有限公司

<120> 嵌合抗原受体DAP12-T2A-CD8α-MSLN scFv-NKp44及其用途

<130> 2018

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

caggtacaac tgcagcagtc tgggcctgag ctggagaagc ctggcgcttc agtgaagata 60

tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact ggctacacca tgaactgggt gaagcagagc 120

catggaaaga gccttgagtg gattggactt attactcctt acaatggtgc ttctagctac 180

aaccagaagt tcaggggcaa ggccacatta actgtagaca agtcatccag cacagcctac 240

atggacctcc tcagtctgac atctgaagac tctgcagtct atttctgtgc aagggggggt 300

tacgacggga ggggttttga ctactggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctcaggt 360

ggaggcggtt caggcggcgg tggctctagc ggtggtggat cggacatcga gctcactcag 420

tctccagcaa tcatgtctgc atctccaggg gagaaggtca ccatgacctg cagtgccagc 480

tcaagtgtaa gttacatgca ctggtaccag cagaagtcag gcacctcccc caaaagatgg 540

atttatgaca catccaaact ggcttctgga gtcccaggtc gcttcagtgg cagtgggtct 600

ggaaactctt actctctcac aatcagcagc gtggaggctg aagatgatgc aacttattac 660

tgccagcagt ggagtaagca ccctctcacg tacggtgctg ggacaaagtt ggaaatcaaa 720

<210> 2

<211> 240

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Leu Ile Thr Pro Tyr Asn Gly Ala Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Asp Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Ser Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile

130 135 140

Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser

145 150 155 160

Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser

165 170 175

Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro

180 185 190

Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile

195 200 205

Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Asp Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp

210 215 220

Ser Lys His Pro Leu Thr Tyr Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

225 230 235 240

<210> 3

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

atggggggac ttgaaccctg cagcaggttc ctgctcctgc ctctcctgct ggctgtaagt 60

ggtctccgtc ctgtccaggt ccaggcccag agcgattgca gttgctctac ggtgagcccg 120

ggcgtgctgg cagggatcgt gatgggagac ctggtgctga cagtgctcat tgccctggcc 180

gtgtacttcc tgggccggct ggtccctcgg gggcgagggg ctgcggaggc agcgacccgg 240

aaacagcgta tcactgagac cgagtcgcct tatcaggagc tccagggtca gaggtcggat 300

gtctacagcg acctcaacac acagaggccg tattacaaa 339

<210> 4

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

Met Gly Gly Leu Glu Pro Cys Ser Arg Phe Leu Leu Leu Pro Leu Leu

1 5 10 15

Leu Ala Val Ser Gly Leu Arg Pro Val Gln Val Gln Ala Gln Ser Asp

20 25 30

Cys Ser Cys Ser Thr Val Ser Pro Gly Val Leu Ala Gly Ile Val Met

35 40 45

Gly Asp Leu Val Leu Thr Val Leu Ile Ala Leu Ala Val Tyr Phe Leu

50 55 60

Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala Glu Ala Ala Thr Arg

65 70 75 80

Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln Glu Leu Gln Gly

85 90 95

Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln Arg Pro Tyr Tyr

100 105 110

Lys

<210> 5

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

ggagagggca gaggaagtct tctaacatgc ggtgacgtgg aggagaatcc cggccct 57

<210> 6

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn

1 5 10 15

Pro Gly Pro

<210> 7

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccg 63

<210> 8

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 9

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

actgcaggag ccagacaagc ccctgagtct ccatctacca tccctgtccc ttcacagcca 60

cagaactcca cgctccgccc tggccctgca gcccccattg ccctggtgcc tgtgttctgt 120

ggactcctcg tagccaagag cctggtgctg tcagccctgc tcgtctggtg gggggacata 180

tggtggaaaa ccatgatgga gctcaggagc ctggataccc aaaaagccac ctgccacctt 240

caacaggtca cggaccttcc ctggacctca gtttcctcac ctgtagagag agaaatatta 300

tatcacactg ttgcaaggac taagataagc gatgatgatg atgaacacac tttgtga 357

<210> 10

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

Thr Ala Gly Ala Arg Gln Ala Pro Glu Ser Pro Ser Thr Ile Pro Val

1 5 10 15

Pro Ser Gln Pro Gln Asn Ser Thr Leu Arg Pro Gly Pro Ala Ala Pro

20 25 30

Ile Ala Leu Val Pro Val Phe Cys Gly Leu Leu Val Ala Lys Ser Leu

35 40 45

Val Leu Ser Ala Leu Leu Val Trp Trp Gly Asp Ile Trp Trp Lys Thr

50 55 60

Met Met Glu Leu Arg Ser Leu Asp Thr Gln Lys Ala Thr Cys His Leu

65 70 75 80

Gln Gln Val Thr Asp Leu Pro Trp Thr Ser Val Ser Ser Pro Val Glu

85 90 95

Arg Glu Ile Leu Tyr His Thr Val Ala Arg Thr Lys Ile Ser Asp Asp

100 105 110

Asp Asp Glu His Thr Leu

115

<210> 11

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Asp Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Lys His Pro Leu Thr

85 90 95

Tyr Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 12

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 12

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Leu Ile Thr Pro Tyr Asn Gly Ala Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Asp Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 13

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 13

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 14

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 14

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

atccca 66

<210> 15

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 15

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro

20

<210> 16

<211> 1593

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 16

atggggggac ttgaaccctg cagcaggttc ctgctcctgc ctctcctgct ggctgtaagt 60

ggtctccgtc ctgtccaggt ccaggcccag agcgattgca gttgctctac ggtgagcccg 120

ggcgtgctgg cagggatcgt gatgggagac ctggtgctga cagtgctcat tgccctggcc 180

gtgtacttcc tgggccggct ggtccctcgg gggcgagggg ctgcggaggc agcgacccgg 240

aaacagcgta tcactgagac cgagtcgcct tatcaggagc tccagggtca gaggtcggat 300

gtctacagcg acctcaacac acagaggccg tattacaaag tcgagggcgg cggagagggc 360

agaggaagtc ttctaacatg cggtgacgtg gaggagaatc ccggccctag gatggcctta 420

ccagtgaccg ccttgctcct gccgctggcc ttgctgctcc acgccgccag gccgggatcc 480

caggtacaac tgcagcagtc tgggcctgag ctggagaagc ctggcgcttc agtgaagata 540

tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact ggctacacca tgaactgggt gaagcagagc 600

catggaaaga gccttgagtg gattggactt attactcctt acaatggtgc ttctagctac 660

aaccagaagt tcaggggcaa ggccacatta actgtagaca agtcatccag cacagcctac 720

atggacctcc tcagtctgac atctgaagac tctgcagtct atttctgtgc aagggggggt 780

tacgacggga ggggttttga ctactggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctcaggt 840

ggaggcggtt caggcggcgg tggctctagc ggtggtggat cggacatcga gctcactcag 900

tctccagcaa tcatgtctgc atctccaggg gagaaggtca ccatgacctg cagtgccagc 960

tcaagtgtaa gttacatgca ctggtaccag cagaagtcag gcacctcccc caaaagatgg 1020

atttatgaca catccaaact ggcttctgga gtcccaggtc gcttcagtgg cagtgggtct 1080

ggaaactctt actctctcac aatcagcagc gtggaggctg aagatgatgc aacttattac 1140

tgccagcagt ggagtaagca ccctctcacg tacggtgctg ggacaaagtt ggaaatcaaa 1200

gctagcggtg gcggaggttc tggaggtggg ggttccactg caggagccag acaagcccct 1260

gagtctccat ctaccatccc tgtcccttca cagccacaga actccacgct ccgccctggc 1320

cctgcagccc ccattgccct ggtgcctgtg ttctgtggac tcctcgtagc caagagcctg 1380

gtgctgtcag ccctgctcgt ctggtggggg gacatatggt ggaaaaccat gatggagctc 1440

aggagcctgg atacccaaaa agccacctgc caccttcaac aggtcacgga ccttccctgg 1500

acctcagttt cctcacctgt agagagagaa atattatatc acactgttgc aaggactaag 1560

ataagcgatg atgatgatga acacactttg tga 1593

<210> 17

<211> 1593

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 17

atggggggac ttgaaccctg cagcaggttc ctgctcctgc ctctcctgct ggctgtaagt 60

ggtctccgtc ctgtccaggt ccaggcccag agcgattgca gttgctctac ggtgagcccg 120

ggcgtgctgg cagggatcgt gatgggagac ctggtgctga cagtgctcat tgccctggcc 180

gtgtacttcc tgggccggct ggtccctcgg gggcgagggg ctgcggaggc agcgacccgg 240

aaacagcgta tcactgagac cgagtcgcct tatcaggagc tccagggtca gaggtcggat 300

gtctacagcg acctcaacac acagaggccg tattacaaag tcgagggcgg cggagagggc 360

agaggaagtc ttctaacatg cggtgacgtg gaggagaatc ccggccctag gatggcctta 420

ccagtgaccg ccttgctcct gccgctggcc ttgctgctcc acgccgccag gccgggatcc 480

gacatcgagc tcactcagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 540

atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc 600

acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggagt cccaggtcgc 660

ttcagtggca gtgggtctgg aaactcttac tctctcacaa tcagcagcgt ggaggctgaa 720

gatgatgcaa cttattactg ccagcagtgg agtaagcacc ctctcacgta cggtgctggg 780

acaaagttgg aaatcaaagg tggaggcggt tcaggcggcg gtggctctag cggtggtgga 840

tcgcaggtac aactgcagca gtctgggcct gagctggaga agcctggcgc ttcagtgaag 900

atatcctgca aggcttctgg ttactcattc actggctaca ccatgaactg ggtgaagcag 960

agccatggaa agagccttga gtggattgga cttattactc cttacaatgg tgcttctagc 1020

tacaaccaga agttcagggg caaggccaca ttaactgtag acaagtcatc cagcacagcc 1080

tacatggacc tcctcagtct gacatctgaa gactctgcag tctatttctg tgcaaggggg 1140

ggttacgacg ggaggggttt tgactactgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 1200

gctagcggtg gcggaggttc tggaggtggg ggttccactg caggagccag acaagcccct 1260

gagtctccat ctaccatccc tgtcccttca cagccacaga actccacgct ccgccctggc 1320

cctgcagccc ccattgccct ggtgcctgtg ttctgtggac tcctcgtagc caagagcctg 1380

gtgctgtcag ccctgctcgt ctggtggggg gacatatggt ggaaaaccat gatggagctc 1440

aggagcctgg atacccaaaa agccacctgc caccttcaac aggtcacgga ccttccctgg 1500

acctcagttt cctcacctgt agagagagaa atattatatc acactgttgc aaggactaag 1560

ataagcgatg atgatgatga acacactttg tga 1593

<210> 18

<211> 1596

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 18

atggggggac ttgaaccctg cagcaggttc ctgctcctgc ctctcctgct ggctgtaagt 60

ggtctccgtc ctgtccaggt ccaggcccag agcgattgca gttgctctac ggtgagcccg 120

ggcgtgctgg cagggatcgt gatgggagac ctggtgctga cagtgctcat tgccctggcc 180

gtgtacttcc tgggccggct ggtccctcgg gggcgagggg ctgcggaggc agcgacccgg 240

aaacagcgta tcactgagac cgagtcgcct tatcaggagc tccagggtca gaggtcggat 300

gtctacagcg acctcaacac acagaggccg tattacaaag tcgagggcgg cggagagggc 360

agaggaagtc ttctaacatg cggtgacgtg gaggagaatc ccggccctag gatgcttctc 420

ctggtgacaa gccttctgct ctgtgagtta ccacacccag cattcctcct gatcccagga 480

tcccaggtac aactgcagca gtctgggcct gagctggaga agcctggcgc ttcagtgaag 540

atatcctgca aggcttctgg ttactcattc actggctaca ccatgaactg ggtgaagcag 600

agccatggaa agagccttga gtggattgga cttattactc cttacaatgg tgcttctagc 660

tacaaccaga agttcagggg caaggccaca ttaactgtag acaagtcatc cagcacagcc 720

tacatggacc tcctcagtct gacatctgaa gactctgcag tctatttctg tgcaaggggg 780

ggttacgacg ggaggggttt tgactactgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 840

ggtggaggcg gttcaggcgg cggtggctct agcggtggtg gatcggacat cgagctcact 900

cagtctccag caatcatgtc tgcatctcca ggggagaagg tcaccatgac ctgcagtgcc 960

agctcaagtg taagttacat gcactggtac cagcagaagt caggcacctc ccccaaaaga 1020

tggatttatg acacatccaa actggcttct ggagtcccag gtcgcttcag tggcagtggg 1080

tctggaaact cttactctct cacaatcagc agcgtggagg ctgaagatga tgcaacttat 1140

tactgccagc agtggagtaa gcaccctctc acgtacggtg ctgggacaaa gttggaaatc 1200

aaagctagcg gtggcggagg ttctggaggt gggggttcca ctgcaggagc cagacaagcc 1260

cctgagtctc catctaccat ccctgtccct tcacagccac agaactccac gctccgccct 1320

ggccctgcag cccccattgc cctggtgcct gtgttctgtg gactcctcgt agccaagagc 1380

ctggtgctgt cagccctgct cgtctggtgg ggggacatat ggtggaaaac catgatggag 1440

ctcaggagcc tggataccca aaaagccacc tgccaccttc aacaggtcac ggaccttccc 1500

tggacctcag tttcctcacc tgtagagaga gaaatattat atcacactgt tgcaaggact 1560

aagataagcg atgatgatga tgaacacact ttgtga 1596

<210> 19

<211> 1596

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 19

atggggggac ttgaaccctg cagcaggttc ctgctcctgc ctctcctgct ggctgtaagt 60

ggtctccgtc ctgtccaggt ccaggcccag agcgattgca gttgctctac ggtgagcccg 120

ggcgtgctgg cagggatcgt gatgggagac ctggtgctga cagtgctcat tgccctggcc 180

gtgtacttcc tgggccggct ggtccctcgg gggcgagggg ctgcggaggc agcgacccgg 240

aaacagcgta tcactgagac cgagtcgcct tatcaggagc tccagggtca gaggtcggat 300

gtctacagcg acctcaacac acagaggccg tattacaaag tcgagggcgg cggagagggc 360

agaggaagtc ttctaacatg cggtgacgtg gaggagaatc ccggccctag gatgcttctc 420

ctggtgacaa gccttctgct ctgtgagtta ccacacccag cattcctcct gatcccagga 480

tccgacatcg agctcactca gtctccagca atcatgtctg catctccagg ggagaaggtc 540

accatgacct gcagtgccag ctcaagtgta agttacatgc actggtacca gcagaagtca 600

ggcacctccc ccaaaagatg gatttatgac acatccaaac tggcttctgg agtcccaggt 660

cgcttcagtg gcagtgggtc tggaaactct tactctctca caatcagcag cgtggaggct 720

gaagatgatg caacttatta ctgccagcag tggagtaagc accctctcac gtacggtgct 780

gggacaaagt tggaaatcaa aggtggaggc ggttcaggcg gcggtggctc tagcggtggt 840

ggatcgcagg tacaactgca gcagtctggg cctgagctgg agaagcctgg cgcttcagtg 900

aagatatcct gcaaggcttc tggttactca ttcactggct acaccatgaa ctgggtgaag 960

cagagccatg gaaagagcct tgagtggatt ggacttatta ctccttacaa tggtgcttct 1020

agctacaacc agaagttcag gggcaaggcc acattaactg tagacaagtc atccagcaca 1080

gcctacatgg acctcctcag tctgacatct gaagactctg cagtctattt ctgtgcaagg 1140

gggggttacg acgggagggg ttttgactac tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 1200

tcagctagcg gtggcggagg ttctggaggt gggggttcca ctgcaggagc cagacaagcc 1260

cctgagtctc catctaccat ccctgtccct tcacagccac agaactccac gctccgccct 1320

ggccctgcag cccccattgc cctggtgcct gtgttctgtg gactcctcgt agccaagagc 1380

ctggtgctgt cagccctgct cgtctggtgg ggggacatat ggtggaaaac catgatggag 1440

ctcaggagcc tggataccca aaaagccacc tgccaccttc aacaggtcac ggaccttccc 1500

tggacctcag tttcctcacc tgtagagaga gaaatattat atcacactgt tgcaaggact 1560

aagataagcg atgatgatga tgaacacact ttgtga 1596

<210> 20

<211> 530

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 20

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1 5 10 15

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Cys Ser Cys Ser Thr Val Ser Pro Gly Val Leu Ala Gly Ile Val Met

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100 105 110

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Met Asp Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

245 250 255

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260 265 270

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

275 280 285

Ser Ser Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile

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Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser

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Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser

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Thr Leu

530

<210> 21

<211> 530

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 21

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Thr Leu

530

<210> 22

<211> 531

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 22

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Leu Ala Val Ser Gly Leu Arg Pro Val Gln Val Gln Ala Gln Ser Asp

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Cys Ser Cys Ser Thr Val Ser Pro Gly Val Leu Ala Gly Ile Val Met

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530

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<211> 531

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 23

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Leu Ala Val Ser Gly Leu Arg Pro Val Gln Val Gln Ala Gln Ser Asp

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Cys Ser Cys Ser Thr Val Ser Pro Gly Val Leu Ala Gly Ile Val Met

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Gly Asp Leu Val Leu Thr Val Leu Ile Ala Leu Ala Val Tyr Phe Leu

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Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala Glu Ala Ala Thr Arg

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515 520 525

His Thr Leu

530

Claims (10)

1.一种嵌合抗原受体DAP12-T2A-CD8α-MSLN scFv-NKp44，其特征在于，所述嵌合抗原受体由胞内第二传导结构域DAP12、T2A、CD8α信号肽、抗人MSLN单克隆抗体ss1轻链和重链可变区MSLN scFv、胞内第一传导结构域NKp44串联构成。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体DAP12-T2A-CD8α-MSLN scFv-NKp44，其特征在于，所述嵌合抗原受体含有针对人MSLN抗原的单链抗体MSLN scFv，其核酸序列如SEQ IDNO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或与其具有85％-99％同一性的氨基酸序列；所述单链抗体的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)之间由连接肽(Linker)连接，包含GSLinker如(G₃S)₄或(G₄S)₃等，优选GGGGSGGGGSSGGGS连接肽。

3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体DAP12-T2A-CD8α-MSLN scFv-NKp44，其特征在于，第二传导结构域DAP12通过T2A与胞外信号肽和抗原结合结构域串联；优选的，所述DAP12核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽；所述T2A核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQID NO.6所示，或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽。

4.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体DAP12-T2A-CD8α-MSLN scFv-NKp44，其特征在于，胞外信号肽选自核苷酸如SEQ ID NO.7所示的CD8α信号肽，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽；胞内第一传导结构域选自核苷酸如SEQ ID NO.9所示的NKp44，NKp44氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽。

5.一种编码如权利要求1-4中任一项所述的靶向MSLN嵌合抗原受体的核酸。其特征在于，所述嵌合抗原受体的核酸序列如SEQ ID NO.16所示；所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.20所示，或与其具有85％-99％同一性的氨基酸序列。

6.一种重组表达载体，其特征在于包含权利要求5所述的核酸分子。

7.一种制备权利要求1所述的嵌合抗原受体修饰的T细胞的方法，其特征在于该方法包括分离和激活待修饰的T细胞，然后以权利要求6所述的重组表达载体转导该T细胞。

8.一种如权利要求6所述的重组表达载体的嵌合抗原受体的细胞；其特征在于所述的细胞选自免疫细胞；所述的细胞选自T淋巴细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、间充质干细胞、造血干细胞、多能干细胞或胚胎干细胞培养分化的免疫细胞。

9.一种药物组合物，其特征在于包含有效量的权利要求8中任一项所述的细胞和药学上可接受的载体。

10.权利要求1-4中任一项所述的靶向MSLN嵌合抗原受体，权利要求5中任一项所述的核酸，权利要求6所述的重组表达载体以及权利要求8所述的宿主细胞在制备哺乳动物肿瘤治疗药物中的应用；优选在制备恶性实体肿瘤治疗药物中的应用。