CN109401157B - 一种非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米材料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米材料及其制备方法和应用，属于生物医用材料领域。在聚丙烯酸分子和镁离子协同稳定作用下，通过湿化学法制备出非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米材料。掺杂的聚丙烯酸分子可以络合钙离子，与镁离子共同阻碍晶体生成。与现有的磷酸钙晶体材料相比，非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米材料降解更快，可用于基因、药物等功能分子的包覆载体。例如在杂化材料中包覆荧光分子(如异硫氰酸荧光素、吲哚青绿)可以实现荧光显影效果。与传统的荧光显影制剂相比，非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米材料包覆荧光分子，具有在弱酸环境下快速释放荧光分子的功能，是一种生物相容性极佳的荧光载体。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，具体涉及一种非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米材料及其制备方法和应用。
背景技术
生物医用杂化材料结合了有机分子和无机材料各自具有的功能，在生物医用材料中已突显其日益重要的研究价值。目前，纳米杂化材料被广泛应用于基因载体、药物载体及牙齿修复及再生等[文献1：Wu,Y.et al.,Devising new lipid-coated calciumphosphate/carbonate hybrid nanoparticles to control release in endosome forefficient gene delivery.J.Mater.Chem.B,2017,5(34):p.7194-7203.文献2：Sailor,M.et al.,Hybrid Nanoparticles for Detection and Treatment ofCancer.Adv.Mater.,2012,24(28):p.3779-3802.文献3：Elsharkawy,S.et al.,Proteindisorder–order interplay to guide the growth of hierarchical mineralizedstructures.Nat.Commun.,2018,9(2145):p.1-12]。
荧光纳米颗粒是将荧光试剂通过包埋、共价键连接等手段引入有机或无机纳米材料中，并让纳米颗粒承担有机小分子荧光染料的检测、标记等功能。传统的荧光试剂载体包括二氧化硅、碳球等，在体内难以降解[文献4：Veeranarayanan,S.et al.,FITC labeledsilica nanoparticles as efficient cell tags:Uptake and photostability Studyin endothelial cells.J.Fluoresc.,2012,22(2):p.537-548.文献5：Li,C,et al.,Mesoporous carbon nanospheres featured fluorescent aptasensor for multiplediagnosis of cancer in vitro and in vivo.ACS Nano,2015,9(12):p.12096-12103.]。而磷酸钙作为人体内骨组织的主要成分，具有良好的生物相容性和降解性，降解产物可被人体再次利用[文献6：Rezwan,K.et al.,Biodegradable and bioactive porouspolymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue engineering,Biomaterials,2006,27(18):p.3413-3431.]，是一种生物相容性极佳的荧光载体。
发明内容
本发明目的是针对现有荧光试剂载体生物相容性差，在体内无法降解的问题，提供一种非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米材料及其制备方法和应用，该材料具有良好生物相容性、可降解，可用作荧光分子载体。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米材料的制备方法，该材料采用湿化学法制备，具体包括如下步骤：
(1)制备硝酸钙与硝酸镁的混合溶液；
(2)将步骤(1)制备的硝酸钙与硝酸镁的混合溶液滴加至磷酸氢二铵与聚丙烯酸的混合溶液中，所得混合物料在室温下搅拌一定时间后生成乳浊液；
(3)将步骤(2)所得乳浊液依次经离心清洗和透析清洗后，再进行冷冻干燥，即获得所述非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米材料。
上述步骤(1)的过程具体为：首先将Ca(NO3)2·4H2O和Mg(NO3)2·6H2O分别溶解于去离子水中，得到硝酸钙溶液和硝酸镁溶液，再将硝酸钙溶液与硝酸镁溶液混合，得到硝酸钙与硝酸镁的混合溶液；其中：硝酸钙溶液的浓度为1-50g/L，硝酸镁溶液的浓度为0-8.14g/L，且满足溶液中Mg元素的摩尔百分比(Mg/(Ca+Mg))范围为0-15％。
上述步骤(2)中，所述磷酸氢二铵与聚丙烯酸的混合溶液是将磷酸氢二铵和聚丙烯酸溶解于去离子水中，并通过氨水调节pH后获得；其中：磷酸氢二铵的浓度为0.5-25g/L，聚丙烯酸的浓度为0.05-5g/L；磷酸氢二铵与聚丙烯酸的混合溶液的pH为7-10。
上述步骤(2)中，搅拌时间为30min-2h。
上述步骤(3)的过程具体为：将步骤(2)所得乳浊液离心去掉上清液，并加入去离子水超声分散沉淀物；然后使用透析膜透析去除未反应的聚丙烯酸试剂；最后冷冻干燥获得非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米材料粉体。
所述制备的非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米材料的颗粒尺寸范围为50-500nm。
所述非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米材料颗粒，能够被细胞吞噬，进而被溶酶体包覆溶解，具有良好的生物相容性。该材料应用于荧光分子包覆，所述荧光试剂包括异硫氰酸荧光素(FITC)和吲哚青绿(ICG)。
应用过程为：在制备该杂化纳米材料时，将荧光试剂加入硝酸钙与硝酸镁的混合溶液中，使所制备的杂化纳米材料中含有荧光试剂；使用的荧光试剂占所述杂化纳米材料的质量百分比为0.2-5％。制备的含有荧光试剂的杂化纳米材料可以在弱酸环境下(pH＝5.0-6.5)溶解，并释放荧光分子，从而实现增强显影功能。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
1.本发明在聚丙烯酸分子和镁离子协同稳定作用下，通过湿化学法制备出非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米材料。利用镁离子掺杂和聚丙烯酸杂化，可以有效提高杂化材料的稳定性。掺杂的聚丙烯酸分子可以络合钙离子，与镁离子共同阻碍晶体生成。
2、与现有的磷酸钙晶体材料相比，非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米材料降解更快，可用于基因、药物等功能分子的包覆载体。例如在杂化材料中包覆荧光分子(如异硫氰酸荧光素、吲哚青绿)可以实现荧光显影效果。
3.本发明方法制备的具有荧光显影功能的非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米材料，与现有的荧光试剂载体相比，非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化颗粒可以在弱酸环境下溶解并快速释放大量荧光分子，从而实现增强显影功能，例如在肿瘤部位实现增强显影，是一种生物相容性极佳的荧光载体。
附图说明
图1为非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米材料XRD结果。
图2为非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米材料粒径分布。
图3为非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米材料TEM形貌图。
图4为不同浓度的非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米材料与细胞共培养的细胞形貌图；其中：(A)70μg/mL，(B)35μg/mL，(C)17.5μg/mL，(D)8.8μg/mL，(E)4.4μg/mL，(F)空白对照组；标尺大小为100微米。
图5为非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米材料进入细胞的同步辐射软X射线成像。
图6为非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米材料与细胞共培养实验中细胞活死染液染色图；其中：(A)70μg/mL，(B)35μg/mL，(C)17.5μg/mL，(D)8.8μg/mL，(E)4.4μg/mL，(F)空白对照组；图中绿色为活细胞，红色为死细胞(标尺为100微米)。
图7为包裹FITC荧光分子的非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米材料进入细胞的荧光染色图像(绿色为包裹荧光的杂化材料，蓝色部分为细胞核)。
图8为包裹ICG荧光分子的非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米材料红外图谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的做进一步说明：
本发明是湿化学法制备具有纳米级非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化材料的方法，该方法将硝酸钙与一定量的硝酸镁(荧光试剂)混合，溶于水后向磷酸氢二铵与聚丙烯酸的混合溶液中滴加。在室温下搅拌一定时间后生成乳浊液，离心清洗，进一步透析清洗，然后冷冻干燥获得非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米材料。
具体包括如下步骤：
(1)将Ca(NO3)2·4H2O、Mg(NO3)2·6H2O按一定的摩尔比溶解于去离子水中，得到溶液A。
(2)称量磷酸氢二铵和聚丙烯酸溶解于去离子水中，逐滴滴加氨水调节pH＝7-10，得到溶液B。
(3)将溶液A滴加入溶液B中，室温下搅拌1小时。
(4)反应后离心去掉上清液，并加入去离子水，超声分散沉淀物得到纳米颗粒分散液，使用透析膜透析去除分散液中未反应的聚丙烯酸。
(5)冷冻干燥获得具有非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米材料粉体。
(6)制备具有荧光显影的非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米材料，需要在上述步骤(1)中提到的溶液A中加入一定量的荧光分子。继续上述步骤(2)－(5)，即可制备具有荧光显影功能的非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米材料。
实施例1
溶液配制：称量240mg的Ca(NO3)2·4H2O和36mg的Mg(NO3)2·6H2O溶于50mL去离子水中，搅拌均匀得到混合溶液A。称量110mg的(NH4)2HPO4和40mg的PAA溶于200mL去离子水中，搅拌均匀得到混合溶液B，逐滴滴加氨水，调节pH至9.5。
湿化学沉淀：将上一步配制好的混合溶液A，以1mL/min的速度滴加入混合溶液B中。以500rpm的转速磁力搅拌，时间为1小时。
清洗：反应结束后，离心处理，转速为4000rpm。离心后去除上清液，收集沉淀物，并加入50mL去离子水，超声分散得到分散液。
透析：将分散液注入8000-14000Da的透析膜中，透析清洗24小时，每6小时换水一次。目的是去除未包裹的聚丙烯酸分子。
干燥：透析后的分散液放入-20℃冰箱中冷冻12小时，然后放入冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米材料(其中镁掺杂的摩尔百分比Mg/(Ca+Mg))＝10％)。XRD检测结果显示该材料为非晶态(图1)，平均粒径为244nm(图2)。图3为纳米材料的微观形貌图。
与细胞共培养实验显示细胞生长状态良好(图4)。利用软X射线成像显示非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米颗粒可以被细胞吞噬(图5)，进而被溶酶体包覆溶解。活死染色法证明细胞存活状态良好(图6)。上述结果证明非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米材料无细胞毒性，具有良好的生物相容性。
实施例2
溶液配制：称量267mg Ca(NO3)2·4H2O溶于50mL去离子水中，搅拌均匀得到混合溶液A。称量110mg(NH4)2HPO4和40mg PAA溶于200mL去离子水中，搅拌均匀得到混合溶液B，逐滴滴加氨水，调节pH至9.5。
湿化学沉淀：将上一步配制好的混合溶液A，以1mL/min的速度滴加入混合溶液B。以500rpm的转速磁力搅拌，时间为1小时。
清洗：反应结束后，离心处理，转速为4000rpm。离心后去除上清液，收集沉淀物，并加入50mL去离子水，超声分散得到分散液。
透析：将分散液注入8000-14000Da的透析膜中，透析清洗24小时，每6小时换水一次。目的是去除未包裹的聚丙烯酸分子。
干燥：透析后的分散液放入-20℃冰箱中冷冻12小时，然后放入冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米材料。
实施例3
溶液配制：称量227mg Ca(NO3)2·4H2O和54mg Mg(NO3)2·6H2O溶于50mL去离子水中，搅拌均匀得到混合溶液A。称量110mg(NH4)2HPO4和40mg PAA溶于200mL去离子水中，搅拌均匀得到混合溶液B，逐滴滴加氨水，调节pH至9.5。
湿化学沉淀：将上一步配制好的混合溶液A，以1mL/min的速度滴加入混合溶液B。以500rpm的转速磁力搅拌，时间为1小时。
清洗：反应结束后，离心处理，转速为4000rpm。离心后去除上清液，收集沉淀物，并加入50mL去离子水，超声分散得到分散液。
透析：将分散液注入8000-14000Da的透析膜中，透析清洗24小时，每6小时换水一次。目的是去除未包裹的聚丙烯酸分子。
干燥：透析后的分散液放入-20℃冰箱中冷冻12小时，然后放入冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米材料(其中镁掺杂的摩尔百分比Mg/(Ca+Mg))＝15％)。
实施例4
溶液配制：称量240mg Ca(NO3)2·4H2O，36mg Mg(NO3)2·6H2O和8mg FITC溶于50mL去离子水中，搅拌均匀得到混合溶液A。称量110mg(NH4)2HPO4和40mg PAA溶于200mL去离子水中，搅拌均匀得到混合溶液B，逐滴滴加氨水，调节pH至9.5。
湿化学沉淀：将上一步配制好的混合溶液A，以1mL/min的速度滴加入混合溶液B。以500rpm的转速磁力搅拌，时间为1小时。
清洗：反应结束后，离心处理，转速为4000rpm。离心后去除上清液，收集沉淀物，并加入50mL去离子水，超声分散得到分散液。
透析：将分散液注入8000-14000Da的透析膜中，透析清洗24小时，每6小时换水一次。目的是去除未包裹的荧光分子和聚丙烯酸分子。
干燥：透析后的分散液放入-20℃冰箱中冷冻12小时，然后放入冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到具有荧光显影的非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米材料(其中镁掺杂的摩尔百分比Mg/(Ca+Mg))＝10％，荧光分子重量百分比约为3％)。与细胞共培养后，荧光染色图像(图7)显示非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米材料进入细胞，具有较好的荧光强度。
实施例5
溶液配制：称量267mg Ca(NO3)2·4H2O和8mg FITC溶于50mL去离子水中，搅拌均匀得到混合溶液A。称量110mg(NH4)2HPO4和40mg PAA溶于200mL去离子水中，搅拌均匀得到混合溶液B，逐滴滴加氨水，调节pH至9.5。
湿化学沉淀：将上一步配制好的混合溶液A，以1mL/min的速度滴加入混合溶液B。以500rpm的转速磁力搅拌，时间为1小时。
清洗：反应结束后，离心处理，转速为4000rpm。离心后去除上清液，收集沉淀物，并加入50mL去离子水，超声分散得到分散液。
透析：将分散液注入8000-14000Da的透析膜中，透析清洗24小时，每6小时换水一次。目的是去除未包裹的荧光分子和聚丙烯酸分子。
干燥：透析后的分散液放入-20℃冰箱中冷冻12小时，然后放入冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到具有荧光显影的非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米材料(其中荧光分子重量百分比为3％)。
实施例6
溶液配制：称量240mg Ca(NO3)2·4H2O，36mg Mg(NO3)2·6H2O和8mg ICG溶于50mL去离子水中，搅拌均匀得到混合溶液A。称量110mg(NH4)2HPO4和40mg PAA溶于200mL去离子水中，搅拌均匀得到混合溶液B，逐滴滴加氨水，调节pH至9.5。
湿化学沉淀：将上一步配制好的混合溶液A，以1mL/min的速度滴加入混合溶液B。以500rpm的转速磁力搅拌，时间为1小时。
清洗：反应结束后，离心处理，转速为4000rpm。离心后去除上清液，收集沉淀物，并加入50mL去离子水，超声分散得到分散液。
透析：将分散液注入8000-14000Da的透析膜中，透析清洗24小时，每6小时换水一次。目的是去除未包裹的荧光分子和聚丙烯酸分子。
干燥：透析后的分散液放入-20℃冰箱中冷冻12小时，然后放入冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到具有荧光显影的纳米非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化材料(其中镁掺杂的摩尔百分比Mg/(Ca+Mg))＝10％，荧光分子重量百分比为3％)。红外结果证明非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米材料成功包裹ICG荧光试剂(图8)。
实施例7
溶液配制：称量267mg Ca(NO3)2·4H2O和8mg ICG溶于50mL去离子水中，搅拌均匀得到混合溶液A。称量110mg(NH4)2HPO4和40mg PAA溶于200mL去离子水中，搅拌均匀得到混合溶液B，逐滴滴加氨水，调节pH至9.5。
湿化学沉淀：将上一步配制好的混合溶液A，以1mL/min的速度滴加入混合溶液B。以500rpm的转速磁力搅拌，时间为1小时。
清洗：反应结束后，离心处理，转速为4000rpm。离心后去除上清液，收集沉淀物，并加入50mL去离子水，超声分散得到分散液。
透析：将分散液注入8000-14000Da的透析膜中，透析清洗24小时，每6小时换水一次。目的是去除未包裹的荧光分子和聚丙烯酸分子。
干燥：透析后的分散液放入-20℃冰箱中冷冻12小时，然后放入冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到具有荧光显影的非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米材料(其中荧光分子重量百分比为3％)。
Claims (7)
1.一种非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米材料的制备方法，其特征在于：该材料采用湿化学法制备，具体包括如下步骤：
（1）制备硝酸钙与硝酸镁的混合溶液；其中：硝酸钙溶液的浓度为1-50g/L，硝酸镁溶液的浓度为0-8.14g/L，且满足混合溶液中Mg元素的摩尔百分比(Mg/(Ca+Mg))范围为0-15%；
（2）将步骤（1）制备的硝酸钙与硝酸镁的混合溶液滴加至磷酸氢二铵与聚丙烯酸的混合溶液中，所得混合物料在室温下搅拌30min-2h后生成乳浊液；所述磷酸氢二铵与聚丙烯酸的混合溶液是将磷酸氢二铵和聚丙烯酸溶解于去离子水中，并通过氨水调节pH后获得；其中：磷酸氢二铵的浓度为0.5-25g/L，聚丙烯酸的浓度为0.05-5g/L；磷酸氢二铵与聚丙烯酸的混合溶液的pH为7-10；
（3）将步骤（2）所得乳浊液依次经离心清洗和透析清洗后，再进行冷冻干燥，即获得所述非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米材料；
步骤（1）的过程具体为：首先将Ca(NO3)2·4H2O和Mg(NO3)2·6H2O分别溶解于去离子水中，得到硝酸钙溶液和硝酸镁溶液，再将硝酸钙溶液与硝酸镁溶液混合，得到硝酸钙与硝酸镁的混合溶液。
2.根据权利要求1所述的非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米材料的制备方法，其特征在于：步骤（3）的过程具体为：将步骤（2）所得乳浊液离心去掉上清液，并加入去离子水超声分散沉淀物；然后使用透析膜透析去处未反应的聚丙烯酸试剂；最后冷冻干燥获得非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米材料粉体。
3.一种利用权利要求1所述方法制备的非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米材料，其特征在于：该材料的颗粒尺寸范围为50-500nm。
4.根据权利要求3所述的非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米材料，其特征在于：所述非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米材料颗粒，能够被细胞吞噬，进而被溶酶体包覆溶解，具有良好的生物相容性。
5.根据权利要求3所述的非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米材料的应用，其特征在于：该材料应用于荧光分子包覆，所述荧光试剂包括异硫氰酸荧光素（FITC）和吲哚青绿（ICG）。
6.根据权利要求5所述的非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米材料的应用，其特征在于：应用过程为：在制备该杂化纳米材料时，将荧光试剂加入硝酸钙与硝酸镁的混合溶液中，使所制备的杂化纳米材料中含有荧光试剂；使用的荧光试剂占所述杂化纳米材料的质量百分比为0.2-5%。
7.根据权利要求6所述的非晶磷酸钙－聚丙烯酸杂化纳米材料的应用，其特征在于：制备的含有荧光试剂的杂化纳米材料可以在pH＝5.0-6.5的弱酸环境下溶解，并释放荧光分子，从而实现增强显影功能。
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