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CN109406785A - 肿瘤血液标志物及其应用 - Google Patents

肿瘤血液标志物及其应用 Download PDF

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CN109406785A
CN109406785A CN201710712539.3A CN201710712539A CN109406785A CN 109406785 A CN109406785 A CN 109406785A CN 201710712539 A CN201710712539 A CN 201710712539A CN 109406785 A CN109406785 A CN 109406785A
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gapdh
tumor
cancer
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detecting
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王泽宋
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Shandong Zeji Biotechnology Co Ltd
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Abstract

本发明提供了一种肿瘤血液标志物及其应用，具体地说，本发明提供了检测血液样本中GAPDH的试剂在制备用于肿瘤筛查、受试者发生肿瘤的风险评估、肿瘤进展阶段的区分、肿瘤治疗疗效的鉴定和/或肿瘤进展的风险分析的检测用组合物中的应用。本发明还提供了用于检测血液样本中GAPDH浓度的试剂盒和检测方法。

Description

肿瘤血液标志物及其应用
技术领域
本发明是关于一种肿瘤血液标志物及其应用，具体是关于通过检测人血液中的GAPDH的含量对肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、结直肠癌等多种肿瘤进行诊断、预后评价和疗效监测的技术。本发明的标志物GAPDH可用于包括但不限于肿瘤筛查、受试者发生肿瘤的风险评估、肿瘤进展阶段的区分、肿瘤治疗疗效的鉴定以及肿瘤进展的风险分析。
背景技术
恶性肿瘤是全球性的常见病及多发病，是危害人类健康的重大疾病之一。我国2015年约有429.2万例新增癌症病例，平均每天新增1.2万例；同时约有281.4万人死于癌症，平均每天死亡例数达7500例。其中肺和支气管癌、胃癌、肝癌、食道癌和结直肠癌占所有癌症死亡情况的四分之三(CA Cancer J Clin.2016；66:115-132)。我国恶性肿瘤发病率近年来呈持续高发趋势，已成为国内居民的首要死因。
甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)是糖酵解过程中重要的酶，分子量37kDa，催化3-磷酸甘油醛(glyceraldehyde 3-phosphate)到1,3-二磷酸甘油酸的反应(D-glycerate 1,3-bisphosphate)。除此众所周知的代谢调控功能外，近几年研究证明GAPDH还参与了许多非代谢调控过程，包括转录激活(Oncogene.2007；26(18):2606–20)等。
有研究报道在黑色素瘤(Anticancer Research.2013；35(1):439–44)和非小细胞肺癌组织中(PLOS ONE.2013；8(4):e61262)GAPDH的mRNA水平显著上升，且表达水平与肿瘤恶性程度正相关。这是因为GAPDH在糖酵解过程中起到了重要作用，其抗凋亡功能对肿瘤细胞的增殖和保护也十分重要，例如GAPDH可以保护因化疗药物的作用导致的端粒缩短。但如果氧化压力等条件破坏了GAPDH的功能，细胞就会老化或者死亡(Clinical andExperimental Pharmacology&Physiology.2012；39(8):674–9)，GAPDH的缺失同样会导致肿瘤细胞老化(Biochemical and Biophysical Research Communications.2011；411(2):409–15)。曾有文章报道肿瘤中GAPDH的转录水平升高，例如利用荧光定量PCR方法检测乳腺癌患者血清中的游离DNA，结果发现84.5％的乳腺癌患者DNA检测为阳性，I～II期乳腺癌患者阳性率为84％(肿瘤2011；31(12)：1099-1102)。目前，相关研究主要集中在几个瘤种中GAPDH基因水平，特别是mRNA的表达量的变化与肿瘤的关系。
经查，未见关于肿瘤患者血清/血浆中GAPDH的含量与肿瘤的相关性的报道，其与肿瘤发生发展的关系更是有待进一步研究。
发明内容
本案发明人通过研究发现，血液(血清和/或血浆)中GAPDH的表达水平可用于肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、结直肠癌等多种肿瘤的诊断和分期分型以及肿瘤患者的病情监测和疗效评价。
从而，本发明提供了GAPDH作为肿瘤血液标志物的应用。
一方面，本发明提供了检测血液样本中GAPDH的试剂在制备用于肿瘤筛查、受试者发生肿瘤的风险评估、肿瘤进展阶段的区分、肿瘤治疗疗效的鉴定和/或肿瘤进展的风险分析的检测用组合物中的应用。
根据本发明的具体实施方案，本发明的上述应用中，所述血液样本为血清或血浆样本。
根据本发明的具体实施方案，本发明的上述应用中，所述肿瘤包括肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、结直肠癌、胰腺癌、宫颈癌、淋巴瘤或甲状腺瘤。
根据本发明的具体实施方案，本发明的上述应用中，所述检测血液样本中GAPDH的试剂包括采用以下方法检测血液样本中GAPDH浓度的试剂：蛋白免疫印记方法、酶联免疫夹心法。
根据本发明的具体实施方案，本发明的上述应用中，所述检测血液样本中GAPDH的试剂包括：与GAPDH或其多肽片段特异性结合的抗体。
根据本发明的具体实施方案，本发明的上述应用中，所述GAPDH具有如SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列，所述GAPDH的多肽片段包括GAPDH氨基酸序列N端第40-160位氨基酸(即SEQ ID No.1所示第40-160位氨基酸)组成的多肽片段、或第180-335位氨基酸(即SEQID No.1所示第180-335位氨基酸)组成的多肽片段。
根据本发明的具体实施方案，本发明的上述应用中，GAPDH是与至少一种其它肿瘤标志物进行联合诊断。具体地，进行肿瘤筛查、受试者发生肿瘤的风险评估、肿瘤进展阶段的区分、肿瘤治疗疗效的鉴定和/或肿瘤进展的风险分析时，包括检测血液样本中GAPDH以及至少一种其它肿瘤标志物，所述至少一种其他肿瘤标志物包括但不局限于：AFP、CEA、CA125、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA242、CA50、CYFRA21-1、AFU、SF、POA、TSGF。
另一方面，本发明还提供了一种用于肿瘤筛查、受试者发生肿瘤的风险评估、肿瘤进展阶段的区分、肿瘤治疗疗效的鉴定和/或肿瘤进展的风险分析的检测用试剂盒，其包括：检测血液样本中GAPDH的试剂。
根据本发明的具体实施方案，本发明的上述试剂盒中，所述检测血液样本中GAPDH的试剂包括采用以下方法检测血液样本中GAPDH浓度的试剂：蛋白免疫印记方法、酶联免疫夹心法、发光免疫分析法或胶体金法。
根据本发明的具体实施方案，本发明的上述试剂盒中，所述检测血液样本中GAPDH的试剂包括：与GAPDH或其多肽片段特异性结合的抗体；优选地，所述GAPDH的多肽片段包括GAPDH氨基酸序列N端第40-160位氨基酸组成的多肽片段、或第180-335位氨基酸组成的多肽片段。
根据本发明的具体实施方案，本发明的上述试剂盒还包括：96孔酶标版，标准品稀释液，样品稀释液，洗涤浓缩液，显色液和终止液。
在本发明一具体实施方案中，本发明的试剂盒包括：人源GAPDH蛋白(人源化的该蛋白在试剂盒中作为标准蛋白)、抗人源GAPDH蛋白的单克隆抗体、相关试剂(96孔酶标版，标准品稀释液，样品稀释液，洗涤浓缩液，显色液和终止液)。优选还进一步包括标注检测参数及相关判断参考值的说明书等，所述的检测参数例如：标准品的浓度，样品稀释倍数，标准曲线的监测范围、精度、最低检测限度，反应体系中各组分的量，反应温度和时间等，所述的判断参考值例如针对不同肿瘤的参考值等。
另一方面，本发明还提供了一种确定受试者是否患有肿瘤或处于患癌风险的方法，该方法包括：
a.获得受试者的血液样本；
b.测定受试者血清或血浆样本中GAPDH的浓度；
c.将受试者血清或血浆样本中GAPDH的浓度与参考浓度进行比较，样本中GAPDH的浓度大于或等于参考浓度时，该受试者被判定为肿瘤患者或具有罹患肿瘤的风险。
在本发明的一具体实施方式中，罹患肝癌的判定参考值是5.95μg/ml(也可四舍五入为6μg/ml)，即受试者血液样品中GAPDH的浓度在0-6μg/ml的范围内时被认为是正常值，如果受试者血液样品中GAPDH的浓度高于或等于6μg/ml则该受试者被判定患有肿瘤或有患癌风险。
在本发明中，受试者的检测结果在排除检测方法引起的误差后，上升或下降25％被视为具有同等判定意义，即针对肝癌的判定参考值是6μg/ml，当检测结果大于或等于4.5μg/ml时，也可判定该受试者患有肿瘤或有患癌风险。
另一方面，本发明还提供了一种区分肿瘤进展阶段的分类，该方法包括：
a.获得受试者的血液样本；
b.测定受试者血清或血浆样本中GAPDH的浓度；
c.将受试者血清或血浆样本中GAPDH的浓度与一系列参考浓度进行比较，判定肿瘤的进展阶段。
另一方面，本发明还提供了一种对肿瘤患者进行病情监测的方法，该方法包括：
获得受试者一段时间开始和结束时的血液样本；
测定受试者血清或血浆样本中GAPDH的浓度；
将受试者一段时间开始和结束时血清或血浆样本中GAPDH的浓度进行比较，如结束时样本GAPDH的浓度低于开始时，且降低百分比达到或超过设定的参考值，则判定病情缓解；如结束时样本GAPDH的浓度与开始时比较增多、无明显差异或变化幅度未达到或超过设定的参考值，则判定病情未缓解。
其中所述参考值可选自10-50％。在本发明的一具体实施方案中，该参考值为30％。并且，本发明中所述参考值±25％具有同等判定意义，即当所述参考值为30％、肿瘤患者血液样本中GAPDH的浓度降低22.5％时也可判定为病情进展较好。其中所述“一段时间”可根据病人病情发展而设定，“一段治疗”包括每天的治疗、一个周期的治疗和/或多周期的治疗。
另一方面，本发明还提供了一种对肿瘤患者进行疗效评价的方法，该方法包括：
a.获得受试者接受某次治疗的治疗前和治疗后血液样本；
b.测定受试者血清或血浆样本中GAPDH的浓度；
c.将受试者某次治疗的治疗前和治疗后血清或血浆样本中GAPDH的浓度进行比较，如治疗后样本GAPDH的浓度低于治疗前，且降低百分比达到或超过设定的参考值，则治疗方法或药物有益于病情缓解；如治疗后样本GAPDH的浓度与治疗前比较增多、无明显差异或变化幅度未达到或超过设定的参考值，则判定治疗方法或药物的疗效较差。
其中所述参考值可选自10-50％。在本发明的一个具体实施例中，一位肺癌患者治疗前血清中GAPDH浓度为22.63μg/ml，经过治疗后浓度降低为20.41μg/ml，降低9.81％，四舍五入后为10％；在本发明的另一个具体实施例中，一位肺癌患者治疗前血清中GAPDH浓度为46.51μg/ml，经过治疗后浓度降低为24.20μg/ml，降低47.97％，四舍五入后为50％。在本发明的一具体实施方案中，该参考值为30％。并且，所述参考值±25％具有同等判定意义，即当所述参考值为30％、肿瘤患者血液样本中
GAPDH的浓度降低22.5％时也可判定为疗效较好。其中所述“一段时间”可根据病人病情发展而设定，“一段治疗”包括每天的治疗、一个周期的治疗和/或多周期的治疗。
另一方面，本发明还提供了一种通过联合诊断确定受试者是否患有肿瘤或处于患癌风险中的方法，该方法包括：
a.获得受试者的血液样本；
b.测定受试者血清或血浆样本中GAPDH的浓度以及至少一种其它肿瘤标志物的浓度；
c.将受试者血清或血浆样本中GAPDH的浓度以及至少一种其它肿瘤标志物的浓度与设定的参考值进行比较，样本中GAPDH以及至少一种其它肿瘤标志物的浓度大于或等于参考浓度时，该受试者被鉴定为肿瘤患者或具有罹患肿瘤的风险。
其中所述GAPDH的浓度参考值为5.57-11.75μg/ml，且参考值±25％具有同等判定意义。
另一方面，本发明还提供了一种通过联合诊断对肿瘤进展阶段进行分类的方法，该方法包括：
a.获得受试者的血液样本；
b.测定受试者血清或血浆样本中GAPDH以及至少一种其它肿瘤标志物的浓度；
c.将受试者血清或血浆样本中GAPDH以及至少一种其它肿瘤标志物的浓度与一系列参考浓度进行比较，判定肿瘤的进展阶段。
另一方面，本发明还提供了一种通过联合诊断对肿瘤患者进行病情监测的方法，该方法包括：
获得受试者一段时间开始和结束时的血液样本；
测定受试者血清或血浆样本中GAPDH以及至少一种其它肿瘤标志物的浓度；
将受试者一段时间开始和结束时血清或血浆样本中GAPDH以及至少一种其它肿瘤标志物的浓度进行比较，如结束时样本GAPDH以及至少一种其它肿瘤标志物的浓度低于开始时，且降低百分比达到或超过设定的参考值，则判定病情缓解；如结束时样本GAPDH以及至少一种其它肿瘤标志物的浓度与开始时比较增多、无明显差异或变化幅度未达到或超过设定的参考值，则判定病情未缓解。
另一方面，本发明还提供了一种通过联合诊断对肿瘤患者进行疗效评价的方法，该方法包括：
a.获得受试者接受某次治疗的治疗前和治疗后血液样本；
b.测定受试者血清或血浆样本中GAPDH以及至少一种其它肿瘤标志物的浓度；
c.将受试者某次治疗的治疗前和治疗后血清或血浆样本中GAPDH以及至少一种其它肿瘤标志物的浓度进行比较，如治疗后样本GAPDH以及至少一种其它肿瘤标志物的浓度低于治疗前，且降低百分比达到或超过设定的参考值，则治疗方法或药物有益于病情缓解；如治疗后样本GAPDH以及至少一种其它肿瘤标志物的浓度与治疗前比较增多、无明显差异或变化幅度未达到或超过设定的参考值，则判定治疗方法或药物的疗效较差。
本发明的上述方法中，所述肿瘤包括但不局限于肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、结直肠癌、胰腺癌、宫颈癌、淋巴瘤或甲状腺瘤。
本发明的上述方法中，所述至少一种其他肿瘤标志物包括但不局限于：AFP、CEA、CA125、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA242、CA50、CYFRA21-1、AFU、SF、POA、TSGF。
本发明所涉及的“肿瘤”表示但不限于恶性肿瘤，同时适用于良性肿瘤或肿瘤发生的早期阶段。
本发明中，通过检测人血液样本中的GAPDH的含量，能对肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、结直肠癌等肿瘤进行诊断、预后评价和疗效监测，可用于包括但不限于肿瘤筛查、受试者发生肿瘤的风险评估、肿瘤进展阶段的区分、肿瘤治疗疗效的鉴定以及肿瘤进展的风险分析。
附图说明
图1是不同肿瘤患者血浆中GAPDH的蛋白免疫印记结果。
图2是肝癌患者相对于健康人的ROC曲线。
图3是肺癌患者相对于健康人的ROC曲线。
图4是胃癌患者相对于健康人的ROC曲线。
图5是结直肠癌患者相对于健康人的ROC曲线。
图6是胰腺癌患者相对于健康人的ROC曲线。
图7是多种肿瘤患者血清GAPDH含量检测结果汇总。
图8显示GAPDH蛋白的二级结构、亲水性、柔韧性、抗原指数和表面可能性。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本发明中所述“肿瘤”表示但不限于恶性肿瘤，本发明所涉及的肿瘤标志物及其检测试剂盒同样适用于良性肿瘤或肿瘤发生的早期阶段。
本发明中所述“血液样本”是指从受试者的血液获得的样本，具体包括血清和/或血浆样本。
本发明中所述“健康人”是指未经生化、影像或病理学方法确诊，暂被认为非肿瘤患者的人群。
本发明中所述“灵敏度”是指用病理学方法检测为肿瘤的病例，其试剂盒检测结果同样是阳性的概率。
本发明中所述“特异度”是指健康人群的试剂盒检测结果同样是阴性的概率。
实施例1
收集健康人与不同类型肿瘤患者的血浆，采用蛋白免疫印记的方法(Westernblot)检测血浆中GAPDH的浓度，证明GAPDH可用作肿瘤标志物。
具体实验方法如下：
1.样本收集
分别收集健康人和病理学诊断为胃癌、肺癌、肝癌的患者的血液，收集血液装抗凝管中，颠倒8-10次。离心分离血浆(800-1000转/分钟，10分钟)，将血浆分装至EP管中(每份50μL)，迅速放置于-20℃冷冻保存。
2.样本处理
每例血浆样本稀释20倍后加入5×上样缓冲液，100℃加热10分钟。
3.样本检测
采用蛋白免疫印记方法对处理后样本中的GAPDH进行检测。
4.结果分析
如图1所示，采用蛋白免疫印记方法对健康人和不同肿瘤患者血浆样本中的GAPDH进行检测，胃癌、肺癌、肝癌患者血浆中GAPDH含量明显高于健康人，说明血液中GAPDH可被用作肿瘤标志物，区分健康人与肿瘤患者。
实施例2
收集健康人与肝癌患者的血液，采用酶联免疫夹心法(Enzyme linkedimmunosorbent assay，Elisa)检测血清中GAPDH的浓度，对GAPDH在肝癌诊断中的有效性进行评价。
具体实验方法如下：
1.样本选择
健康人：未经生化、影像或病理学方法确诊，暂被认为非肿瘤患者的人群。
肝癌患者：经病理学诊断确诊为肝癌的患者，包括肝癌的不同类型和不同分期。
2.样本收集
分别收集健康人和肝癌患者的血液，收集血液室温静置20分钟，离心分离血清(800-1000转/分钟，10分钟)，将血清分装至EP管中(每份50μL)，迅速放置于-20℃冷冻保存。
对接受药物治疗的肝癌患者样本的收集时间点为：治疗开始前收集血清样本1次，治疗周期结束后收集样本1次。
3.样本检测
采用Elisa方法对收集的血清样本中GAPDH的浓度进行检测。
4.数据分析
统计临床样本中GAPDH的浓度值，将真阳性(灵敏度)和假阳性(1－特异度)分别作为纵坐标和横坐标绘制受试者工作特征曲线(Receiver Operating Characteristiccurve，ROC曲线)，并计算ROC曲线下面积和95％CI得出GAPDH与肿瘤的相关性，以评价辅助诊断的价值。
5.研究结果
(1)样本构成
(2)ROC曲线及评价标准(图2)
(3)药物治疗前后疗效评价
实施例3
一方面收集健康人与肺癌患者的血清，采用Elisa方法检测血清中GAPDH的浓度，对GAPDH在肺癌诊断中的有效性进行评价。另一方面对部分肺癌患者进行跟踪，收集患者在治疗前和治疗后的血样，检测其血清中GAPDH浓度的变化，对GAPDH在病情监测和疗效评价方面的有效性进行评价。
具体实验方法如下：
1.样本选择
健康人：未经生化、影像或病理学方法确诊，暂被认为非肿瘤患者的人群。
肺癌患者：经病理学诊断确诊为肺癌的患者，包括肺癌的不同类型和不同分期。
2.样本收集
分别收集健康人和肺癌患者的血液，收集血液室温静置20分钟，离心分离血清(800-1000转/分钟，10分钟)，将血清分装至EP管中(每份50μL)，迅速放置于-20℃冷冻保存。
3.样本检测
采用Elisa方法对收集的血清样本中GAPDH的浓度进行检测。
4.数据分析
统计临床样本中GAPDH的浓度值，将真阳性(灵敏度)和假阳性(1－特异度)分别作为纵坐标和横坐标绘制ROC曲线，并计算ROC曲线下面积和95％CI得出GAPDH与肿瘤的相关性，以评价辅助诊断的价值。
5.研究结果
(1)样本构成
(2)ROC曲线及评价标准(图3)
(3)药物治疗前后疗效评价
实施例4
一方面收集健康人与胃癌患者的血液，采用Elisa方法检测血清中GAPDH的浓度，对GAPDH在胃癌诊断中的有效性进行评价。另一方面对部分胃癌患者进行跟踪，收集患者在治疗前和治疗后的血样，检测其血清中GAPDH浓度的变化，对GAPDH在病情监测和疗效评价方面的有效性进行评价。
具体实验方法如下：
1.样本选择
健康人：未经生化、影像或病理学方法确诊，暂被认为非肿瘤患者的人群。
胃癌患者：经病理学诊断确诊为胃癌的患者，包括胃癌的不同类型和不同分期。
2.样本收集
分别收集健康人和胃癌患者的血液，收集血液室温静置20分钟，离心分离血清(800-1000转/分钟，10分钟)，将血清分装至EP管中(每份50μL)，迅速放置于-20℃冷冻保存。
对接受药物治疗的胃癌患者样本的收集时间点为：治疗开始前收集血清样本1次，治疗周期结束后收集样本1次。
3.样本检测
采用Elisa方法对收集的血清样本中GAPDH的浓度进行检测。
4.数据分析
统计临床样本中GAPDH的浓度值，将真阳性(灵敏度)和假阳性(1－特异度)分别作为纵坐标和横坐标绘制ROC曲线，并计算ROC曲线下面积和95％CI得出GAPDH与癌症的相关性，以评价辅助诊断的价值。
5.研究结果
(1)样本构成
(2)ROC曲线及评价标准(图4)
(3)药物治疗前后疗效评价
实施例5
收集健康人与结直肠癌患者的血清，采用Elisa方法检测血清中GAPDH的浓度，对GAPDH在结直肠癌诊断中的有效性进行评价。
具体实验方法如下：
1.样本选择
健康人：未经生化、影像或病理学方法确诊，暂被认为非肿瘤患者的人群。
结直肠癌患者：经病理学诊断确诊为结直肠癌的患者，包括结直肠癌的不同类型和不同分期。
2.样本收集
分别收集健康人和结直肠癌患者的血液，收集血液室温静置20分钟，离心分离血清(800-1000转/分钟，10分钟)，将血清分装至EP管中(每份50μL)，迅速放置于-20℃冷冻保存。
3.样本检测
采用Elisa方法对收集的血清样本中GAPDH的浓度进行检测。
4.数据分析
统计临床样本中GAPDH的浓度值，将真阳性(灵敏度)和假阳性(1－特异度)分别作为纵坐标和横坐标绘制ROC曲线，并计算ROC曲线下面积和95％CI得出GAPDH与肿瘤的相关性，以评价辅助诊断的价值。
5.研究结果
(1)样本构成
(2)ROC曲线及评价标准(图5)
实施例6
一方面收集健康人与胰腺癌患者的血液，采用Elisa方法检测血清中GAPDH的浓度，对GAPDH在胰腺癌诊断中的有效性进行评价。另一方面对部分胰腺癌患者进行跟踪，收集患者在治疗前和治疗后的血样，检测其血清中GAPDH浓度的变化，对GAPDH在病情监测和疗效评价方面的有效性进行评价。
具体实验方法如下：
1.样本选择
健康人：未经生化、影像或病理学方法确诊，暂被认为非肿瘤患者的人群。
胰腺癌患者：经病理学诊断确诊为胰腺癌的患者，包括胰腺癌的不同类型和不同分期。
2.样本收集
分别收集健康人和胰腺癌患者的血液，收集血液室温静置20分钟，离心分离血清(800-1000转/分钟，10分钟)，将血清分装至EP管中(每份50μL)，迅速放置于-20℃冷冻保存。
对接受药物治疗的胰腺癌患者样本的收集时间点为：治疗开始前收集血清样本1次，治疗周期结束后收集样本1次。
3.样本检测
采用Elisa方法对收集的血清样本中GAPDH的浓度进行检测。
4.数据分析
统计临床样本中GAPDH的浓度值，将真阳性(灵敏度)和假阳性(1－特异度)分别作为纵坐标和横坐标绘制ROC曲线，并计算ROC曲线下面积和95％CI得出GAPDH与肿瘤的相关性，以评价辅助诊断的价值。
5.研究结果
(1)样本构成
(2)ROC曲线及评价标准(图6)
实施例7
收集健康人与不同类型肿瘤患者的血液，采用Elisa方法检测血清中GAPDH的浓度，证明GAPDH可用作多种肿瘤的标志物。
具体实验方法如下：
1.样本收集
分别收集健康人和病理学诊断肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、结直肠癌、胰腺癌、宫颈癌、淋巴瘤、甲状腺瘤的患者的血液，收集血液室温静置20分钟，离心分离血清(800-1000转/分钟，10分钟)，将血清分装至EP管中(每份50μL)，迅速放置于-20℃冷冻保存。
2.样本检测
采用Elisa方法对收集的血清样本中GAPDH的浓度进行检测。
3.结果分析
如图7所示，肝癌、肺癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、食道癌、宫颈癌、淋巴瘤、甲状腺瘤患者血清中GAPDH含量明显高于健康人，说明血液中GAPDH可被用作多种肿瘤的标志物，区分健康人与肿瘤患者。
本实施例中所测得的不同肿瘤患者血清中GAPDH的浓度参见下表。
实施例8
本实施例中，首先从NCBI数据库中获得GAPDH的氨基酸序列，再利用DNASTARProtean软件对GAPDH的二级结构和抗原域进行预测。该软件使用Gamier-Robson和Chou-Fasman算法对蛋白质的二级结构(α螺旋、β折叠、转角和无规则卷曲)进行了预测；使用Kyte-Doolittle算法对蛋白的亲水性进行了预测；使用Karplus-Schultz算法对蛋白的柔韧性进行了预测；使用Jameson-Wolf算法对蛋白的抗原指数进行了预测；使用Plot-Emini算法对蛋白的表面可能性进行了预测。综合以上二级结构、亲水性、柔韧性、抗原指数和表面可能性的预测结果(图8)，本实施例分别针对SEQ ID No.1所示第40-160位和第180-335位氨基酸序列组成的肽段制备配对抗体。
抗体具体制备过程可参照现有技术进行，简述如下：
1制备抗原。分别针对SEQ ID No.1所示第40-160位和第180-335位氨基酸序列进行基因合成，构建载体并利用原核表达系统表达抗原。
2获得单克隆杂交瘤细胞。使用抗原免疫BALB/c小鼠获得抗血清并对抗原进行检测，检测成功后分离B细胞并与骨髓瘤细胞融合制备单克隆杂交瘤细胞。
3获得配对抗体。对不同杂交瘤细胞产生的不同单克隆抗体进行两两配对，并用原核表达的全长蛋白作为抗原进行检测，获得至少一对满足检测要求的配对抗体。
实施例9
本实施例提供了一种检测血液样本中GAPDH的试剂盒。
所述试剂盒包含GAPDH标准蛋白，抗GAPDH的单克隆抗体(包括一抗和二抗)，96孔酶标版，标准品稀释液，样本稀释液，洗涤浓缩液，显色液和终止液以及其它实验辅助材料。
应用所述试剂盒检测待测个体血液样本中GAPDH的方法简述如下：
1.将50μl稀释好的标准品或样本加入包被好的96孔酶标板，37℃放置30-60min。
2.弃去孔内液体，每孔加300μl洗涤液洗涤三次。
3.每孔加入50μl二抗溶液，37℃放置30-60min。
4.弃去孔内液体，每孔加300μl洗涤液洗涤三次。
5.每孔加入100μl显色剂，37℃避光放置10-15min。
6.每孔加入50μl终止液，450nm波长处读取吸光值。
本试剂盒检测的标准曲线范围为0-10μg/ml，最低检测限度为0.10μg/ml。
本实施例中，分别采用按照上述实施例8制备的抗体、或者商购抗GAPDH的单克隆抗体，提供了不同的检测血液样本中GAPDH的试剂盒。这些试剂盒对不同癌症的检测灵敏度结果参见下表。
上述结果表明，本发明的检测血液样本中GAPDH的试剂盒具有良好的检测灵敏度。
序列表
<110> 山东泽济生物科技有限公司
<120> 肿瘤血液标志物及其应用
<130> GAI17CN2276
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 335
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
Met Gly Lys Val Lys Val Gly Val Asn Gly Phe Gly Arg Ile Gly Arg
1 5 10 15
Leu Val Thr Arg Ala Ala Phe Asn Ser Gly Lys Val Asp Ile Val Ala
20 25 30
Ile Asn Asp Pro Phe Ile Asp Leu Asn Tyr Met Val Tyr Met Phe Gln
35 40 45
Tyr Asp Ser Thr His Gly Lys Phe His Gly Thr Val Lys Ala Glu Asn
50 55 60
Gly Lys Leu Val Ile Asn Gly Asn Pro Ile Thr Ile Phe Gln Glu Arg
65 70 75 80
Asp Pro Ser Lys Ile Lys Trp Gly Asp Ala Gly Ala Glu Tyr Val Val
85 90 95
Glu Ser Thr Gly Val Phe Thr Thr Met Glu Lys Ala Gly Ala His Leu
100 105 110
Gln Gly Gly Ala Lys Arg Val Ile Ile Ser Ala Pro Ser Ala Asp Ala
115 120 125
Pro Met Phe Val Met Gly Val Asn His Glu Lys Tyr Asp Asn Ser Leu
130 135 140
Lys Ile Ile Ser Asn Ala Ser Cys Thr Thr Asn Cys Leu Ala Pro Leu
145 150 155 160
Ala Lys Val Ile His Asp Asn Phe Gly Ile Val Glu Gly Leu Met Thr
165 170 175
Thr Val His Ala Ile Thr Ala Thr Gln Lys Thr Val Asp Gly Pro Ser
180 185 190
Gly Lys Leu Trp Arg Asp Gly Arg Gly Ala Leu Gln Asn Ile Ile Pro
195 200 205
Ala Ser Thr Gly Ala Ala Lys Ala Val Gly Lys Val Ile Pro Glu Leu
210 215 220
Asn Gly Lys Leu Thr Gly Met Ala Phe Arg Val Pro Thr Ala Asn Val
225 230 235 240
Ser Val Val Asp Leu Thr Cys Arg Leu Glu Lys Pro Ala Lys Tyr Asp
245 250 255
Asp Ile Lys Lys Val Val Lys Gln Ala Ser Glu Gly Pro Leu Lys Gly
260 265 270
Ile Leu Gly Tyr Thr Glu His Gln Val Val Ser Ser Asp Phe Asn Ser
275 280 285
Asp Thr His Ser Ser Thr Phe Asp Ala Gly Ala Gly Ile Ala Leu Asn
290 295 300
Asp His Phe Val Lys Leu Ile Ser Trp Tyr Asp Asn Glu Phe Gly Tyr
305 310 315 320
Ser Asn Arg Val Val Asp Leu Met Ala His Met Ala Ser Lys Glu
325 330 335

Claims (10)

1.检测血液样本中GAPDH的试剂在制备用于肿瘤筛查、受试者发生肿瘤的风险评估、肿瘤进展阶段的区分、肿瘤治疗疗效的鉴定和/或肿瘤进展的风险分析的检测用组合物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述血液样本为血清或血浆样本。
3.根据权利要求1所述的应用，其中，所述肿瘤包括肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、结直肠癌、胰腺癌、宫颈癌、淋巴瘤或甲状腺瘤。
4.根据权利要求1所述的应用，其中，所述检测血液样本中GAPDH的试剂包括采用以下方法检测血液样本中GAPDH浓度的试剂：蛋白免疫印迹法、酶联免疫法、发光免疫分析法或胶体金法。
5.根据权利要求1所述的应用，其中，所述检测血液样本中GAPDH的试剂包括：与GAPDH或其多肽片段特异性结合的抗体。
6.根据权利要求5所述的应用，其中，所述GAPDH的多肽片段包括GAPDH氨基酸序列N端第40-160位氨基酸组成的多肽片段、或第180-335位氨基酸组成的多肽片段。
7.根据权利要求1～6任一项所述的应用，其中，进行肿瘤筛查、受试者发生肿瘤的风险评估、肿瘤进展阶段的区分、肿瘤治疗疗效的鉴定和/或肿瘤进展的风险分析时，包括检测血液样本中GAPDH以及至少一种其它肿瘤标志物，所述至少一种其他肿瘤标志物包括但不局限于：AFP、CEA、CA125、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA242、CA50、CYFRA21-1、AFU、SF、POA、TSGF。
8.一种用于肿瘤筛查、受试者发生肿瘤的风险评估、肿瘤进展阶段的区分、肿瘤治疗疗效的鉴定和/或肿瘤进展的风险分析的检测用试剂盒，其包括：
检测血液样本中GAPDH的试剂。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其中，所述检测血液样本中GAPDH的试剂包括采用以下方法检测血液样本中GAPDH浓度的试剂：蛋白免疫印记方法、酶联免疫夹心法、发光免疫分析法或胶体金法。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其中，所述检测血液样本中GAPDH的试剂包括：与GAPDH或其多肽片段特异性结合的抗体；优选地，所述GAPDH的多肽片段包括GAPDH氨基酸序列N端第40-160位氨基酸组成的多肽片段、或第180-335位氨基酸组成的多肽片段；
更优选地，所述的试剂盒还可以进一步包括：
96孔酶标版，标准品稀释液，样品稀释液，洗涤浓缩液，显色液和终止液。
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