CN109406706A - 使用hplc校正因子法测定尼可地尔片剂有关物质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及使用HPLC校正因子法测定尼可地尔片剂有关物质的方法。该方法照中国药典2015年版四部通则0512所载的高效液相色谱法中的规范进行测定，用C18色谱柱，用三氟乙酸‑三乙胺‑四氢呋喃‑水混合液为流动相测定，能够同时定量测定的杂质包括杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E及相关未知杂质，并具有优良的方法学性能，例如检测线性范围宽、线性良好、检出限和定量限小，精密度良好。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及药物的质量控制方法，特别是涉及尼可地尔片剂的有关物质检测方法，更特别地是涉及使用HPLC校正因子法测定尼可地尔片剂有关物质的方法。本发明方法能够可靠地同时对尼可地尔片剂中的诸多有关物质例如杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E进行定量检测，并具有优良的方法学性能。
背景技术
尼可地尔(Nicorandil)，化学名为N-(2-羟乙基)-烟酰胺硝酸脂，N-[2-(Nitrooxy)ethyl]-3-pyridinecarboxamide，分子式C8H9N3O4，分子量211.17，其化学结构式为：
尼可地尔属硝酸酯类化合物，是一种ATP敏感性钾通道开放剂，临床上主要用于冠心病，心绞痛的治疗(Nicotinamide derivative；exhibits dual mechanism of actionas both nitrovasodilator and potassium channel activator.Prepn:H.Nagano etal.,DE 2714713(1977,Chugai)；Yasumi Uchida,M.D.,Nobuo Yoshinoto,et al.Effectof 2-Nicotinamidethyl Nitrate(SG 75)on Coronary Circulation,Jap.Heart J.,1978,19,112-124；戴诗文,许景峰.抗心绞痛新药-烟浪丁,新药与临床,1985,4(4),34-35；徐敏,姜丽丽.尼可地尔在心脏病治疗中的作用,中国新药杂志,1999,8(9),590-592)。国内尼可地尔片现行标准为国标WS-10001-(HD-0151)-2002(国家药典委员会.国家药品标准化学药品地方标准上升国家标准第二册.北京:中国医药科技出版社,2002,61)，未收载有关物质检查项，且其含量测定方法为紫外E值法，专属性较差，造成国内长期对尼可地尔片的有关物质情况了解不深入。目前英国药典虽有收载采用HPLC法的尼可地尔片有关物质检查项，且在其2017年版中对方法进行了变更，但是其新旧两个方法(TheBritishPharmacopoeia Commission Office.BP2016.London:The stationery on behalf ofMHRA,2016,905-907；The British Pharmacopoeia Commission Office.BP2017.London:The stationery on behalf of MHRA,2017,937-939)均无法有效分离分析国内尼可地尔片的有关物质，特别是例如本文提及的杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E等典型工艺方面的杂质，而对这些杂质的有效分离对于国内尼可地尔片的质量控制具有重要意义，例如对国内尼可地尔片剂中的有关物质进行有效分离分析，并用于仿制药一致性评价，这对于国内仿制药的质量一致性分析具有重要意义。
因此，本领域仍然期待有新的方法对尼可地尔片剂中的有关物质进行有效分离分析，特别是例如本文提及的杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E等进行有效的分析。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的方法，用于对尼可地尔片剂中的有关物质进行有效分离分析，特别是例如对其它的例如本文提及的杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E等进行有效的分析。已经出人意料地发现，使用本发明方法能够有效的对国产尼可地尔片剂中的有关物质特别是例如本文提及的杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E等典型杂质进行有效分离分析，本发明基于此发现而得以完成。
为此，本发明第一方面提供了一种使用高效液相色谱法对尼可地尔片剂中的有关物质进行检测的方法，其包括以下操作：
(1)照中国药典2015年版四部通则0512所载的高效液相色谱法中的规范进行测定；
(2)色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(例如，色谱柱的规格为150～300mm(例如250mm)×4.6mm，5μm)，以三氟乙酸-三乙胺-四氢呋喃-水(3:5:3:989)为流动相A，以水：四氢呋喃：三乙胺：三氟乙酸(972:20:5:3)为流动相B，按下表所示梯度洗脱程序进行梯度洗脱，流速为1.2ml/min，柱温为25℃，检测波长为262nm，
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0.0 | 100 | 0 |
| 22 | 100 | 0 |
| 54 | 0 | 100 |
| 65 | 0 | 100 |
| 66 | 100 | 0 |
| 75 | 100 | 0 |
系统适用性试验溶液色谱图中，尼可地尔的保留时间在33～40min范围内(例如34～38min)，理论板数按尼可地尔峰计应不低于5000，尼可地尔与相邻杂质峰之间的分离度应大于3；
(3)溶液制备：
取相当于尼可地尔20mg的尼可地尔片剂研成的细粉，精密称定，置10ml量瓶中，用稀释液振摇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为有关物质检查用的供试品溶液(其浓度相当于2000μg/ml)；
取尼可地尔对照品20mg，精密称定，置10ml量瓶中，用上述稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度相当于2000μg/ml的对照品贮备液；精密量取对照品贮备液1ml，置100ml量瓶中，用上述稀释液稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液(其浓度相当于20μg/ml)；
杂质溶液：精密称取各杂质10mg，分别置10ml量瓶中，用上述稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，分别制成各杂质浓度相当于1000μg/ml的贮备液；分别精密量取各杂质贮备液1ml，置100ml量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀，作为各杂质溶液(其浓度相当于10μg/ml)；
系统适用性试验溶液：取尼可地尔对照品20mg，精密称定，置10ml量瓶中，另外向该量瓶中分别精密加入各杂质储备液0.1ml，用稀释液稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性试验溶液(其浓度相当于尼可地尔2000μg/ml、各杂质10μg/ml)；
(4)测定：
精密量取对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，读取色谱图中尼可地尔的保留时间、峰面积；
精密量取各个杂质溶液10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，读取色谱图中各个杂质的保留时间、峰面积，并确定各个杂质的保留时间；
精密量取系统适用性试验溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，读取色谱图中各个色谱峰的保留时间、峰面积，计算尼可地尔峰的理论板数、尼可地尔与相邻杂质峰之间的分离度，计算各杂质相对于尼可地尔的相对保留时间；
精密量取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，读取色谱图中尼可地尔及各杂质的面积；供试品溶液色谱图中如有已知杂质峰，以对照品溶液中尼可地尔峰面积为对照，用该杂质峰面积乘以其校正因子后按外标法计算该杂质在片剂中的含量。
根据本发明第一方面的方法，其中所述杂质选自杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E。
根据本发明第一方面的方法，其中杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E的化学结构式分别如下：
根据本发明第一方面的方法，其中还包括测定并计算各个杂质的校正因子的过程，具体是：使用对照品贮备液和各个杂质的贮备液，用稀释液稀释成在2μg/ml～50μg/ml浓度范围内的7个浓度点测试液，在262nm波长下测定，分别对尼可地尔和各杂质以浓度对峰面积进行线性回归，以尼可地尔线性斜率与各杂质线性斜率的比值计算杂质的校正因子。
根据本发明第一方面的方法，其中在计算杂质含量时，杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E的校正因子分别为0.67、0.76、1.40、1.45、1.26。
根据本发明第一方面的方法，其中色谱柱的规格为250mm×4.6mm，5μm，各杂质相对于尼可地尔的相对保留时间分别为：杂质A为0.117±0.010、杂质B为0.175±0.015、杂质C为0.258±0.025、杂质D为0.464±0.045、杂质E为1.367±0.130。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)溶液制备中，配制各种溶液所用的稀释液是流动相A。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)溶液制备中，配制各种溶液所用的稀释液是流动相A与三乙胺以体积比100：0.11～0.13比例的混合液，例如是流动相A与三乙胺以体积比100：0.12比例的混合液。
根据本发明第一方面的方法，其中所述尼可地尔片剂中包含2～15％的羧甲基淀粉钠。
根据本发明第一方面的方法，其中所用色谱柱为Waters Atlantis T3品牌的规格为250×4.6mm，5μm的色谱柱。
根据本发明第一方面的方法，其中所述尼可地尔片剂中包含2～15％的羧甲基淀粉钠，羧甲基淀粉钠是一种片剂中作为崩解剂最常使用的辅料，制药工业中作为片剂崩解剂的羧甲基淀粉钠其用量通常占片剂总重量的2～15％。本发明人在对收集到的各个生产厂商的尼可地尔片剂中均检测到包含羧甲基淀粉钠，并且经测定其中羧甲基淀粉钠含量达片剂总重量的2～15％范围。已经发现，由于羧甲基淀粉钠的存在，供试品在较长时间放置后其中的杂质A、B、C会有显著增长，并且会产生一系列次生杂质，干扰杂质C的测定。此外供试品溶液非常不稳定，在极短的时间内杂质D就会持续转化为杂质C，进一步影响测定，从这个意义上讲，本发明人根据这些发现，为制备更优良的尼可地尔片剂特别是稳定性更好的尼可地尔片剂提供了可能。另外的，已经出人意料的发现，使用本发明提供的色谱条件配合特定的色谱柱，例如Waters Atlantis T3(250×4.6mm，5μm)、X-select HSS T3(250×4.6mm，5μm)，并在配制各种测试溶液时，使用在流动相A基础上添加了约0.12％(v/v)三乙胺所得的混合液作为配液用溶剂，组合此三种技术特征后，提供的HPLC方法可以完美的将杂质C与干扰杂质分离，并能够有效地避免供试品溶液中杂质D的降低，准确的定量尼克地尔片产生的杂质，避免呈现杂质C假高且杂质D假低的假结果出现。
本发明人在试验中，通过将尼可地尔与羧甲基淀粉钠混合(本发明制备的片剂A，并以不添加羧甲基淀粉钠的片剂B比较)，在40℃相对湿度75％的加速试验条件下放置0、2、5、10天后按本发明方法测定有关物质，关注各杂质生成的变化并与尼克地尔的同条件加速试验进行比较。在比较中发现，与片剂B相比，片剂A通过与羧甲基淀粉钠的混合，样品中的杂质A、B、C显著增加，还有其他低含量未知杂质峰产生干扰杂质C的测定。因为羧甲基淀粉钠是一种片剂中作为崩解剂最常使用的辅料，国内企业目前在售产品中均含有此种辅料，所以在市售样品中也存在着这一现象，导致目前国内外药品标准及已公开的文献中的有关物质检查方法均无法有效定量检测国内尼克地尔片中的杂质含量，例如见图2、图3。在本发明片剂制备例的对比检测中，也证实了这一现象。
本发明通过创造性的建立基于梯度的色谱条件配合高载碳量和选择性的耐100％水相的色谱柱，既保证了尼可地尔的极性杂质可以得到良好的分离，又兼顾了尼可地尔及其极性小的杂质的洗脱分离，并有效的抑制了基线的波动对杂质检出的影响。此外，因为供试品溶液非常不稳定，在30分钟的时间内杂质D就会持续转化为杂质C，即便采取临用现制的方式，在超声溶解样品的过程中，杂质D也会持续降低，杂质C持续增加，影响杂质的定量。由此，解决溶液的不稳定性具有非常重要的现实意义。本发明人通过增补的试验发现在供试品溶液的稀释液中增加三乙胺1.2ml，可以大大提高溶液尤其是杂质D的稳定性，保证了有关物质测定的准确性。使用此稀释液配制的供试品溶液在室温或者2～6℃温度处放置4小时后，杂质D没有降低，解决了杂质D不稳定的问题。
在本发明上述制备方法的步骤中，虽然其描述的具体步骤在某些细节上或者语言描述上与下文具体实施方式部分的制备例中所描述的步骤有所区别，然而，本领域技术人员根据本发明全文的详细公开完全可以概括出以上所述方法步骤。
本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。下面对本发明作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
尼可地尔，俗称烟浪丁，化学名为N-(2-羟基乙基)烟酰胺硝酸酯，分子式为C8H9N3O4，是首个用于临床的ATP敏感的钾离子通道开放剂，临床研究证实，它适用于各类型心绞痛，包括劳力型心绞痛和痉挛性心绞痛，而且能显著减少心血管事件发生风险，改善预后。
尼可地尔最早由日本中外制药、三菱油化药品厂于1978年试制成功，1981年用于临床研究，1982年有了国际通用名称Nicorandil，1983年载尼可地尔药年鉴《心血管药物》第一卷，已经完成动物实验，药理毒性试验及临床试验等项研究工作。并达到实用阶段，1984年初在日本上市。目前市场上销售的烟浪丁商品名称包括：Ikorel(在英国，澳大利亚和欧洲大部分地区)，Dancor(瑞士)，Zynicor(在印度)，Aprior(菲律宾)，Sigmart(在日本，韩国和中国台湾)、欣地平(中国大陆-西安汉丰)等。
尼可地尔属硝酸酯类化合物，是一种ATP敏感性钾通道开放剂。与硝酸酯一样，烟浪丁可激活细胞质鸟苷酸环化酶，从而导致细胞内环磷酸鸟苷升高和细胞内钙的降低，同时引起血管平滑肌松弛.作为一种钾通道开放剂，烟浪丁增加了钾离子从细胞内的流出，静息膜电位负值增大，动作电位缩短，钙的内流减少，细胞内钙水平下降，导致血管平滑肌松弛和血管舒张(间接的钙通道阻断作用)，减少了ATP的消耗。
心肌缺血预适应对于缩小心肌梗死面积和减轻心律失常的严重程度有重要意义。心肌内有心肌和线粒体两种ATP敏感性钾通道.最新研究表明，在局部心肌缺血预处理(IPC)和心脏保护作用中起主导作用的是线粒体ATP敏感性钾通道。应用选择性线粒体ATP敏感性钾通道阻断剂5-HD(5-hydroxydecanote)可阻断烟浪丁对心肌细胞的保护作用，且具有浓度依赖性。
尼可地尔作为抗心绞痛药，具有阻止细胞内钙离子游离，增加细胞膜对钾离子的通透性，扩张冠状血管，持续性增加冠状动脉血流量，抑制冠状动脉痉挛的作用，在扩张冠状血管时，并不影响血压、心率、心肌收缩力以及心肌耗氧量；尼可地尔还具有抑制血小板聚集防止血栓形成的作用。尼可地尔的作用机理为：在体外实验条件下，是通过使冠状血管平滑肌的鸟苷酸环化酶活化导致环鸟苷酸的产生量增加，从而引起冠状血管扩张，与其他亚硝酸盐作用结果相似。另外，冠脉血流增加和冠状血管痉挛抑制的作用机理可通过细胞膜的超级化研究而得以阐明。尼可地尔的药理作用主要如下
(1)冠状血管扩张作用：以兰格德夫(Langendorff)犬为实验动物，在正常灌流压下，较细的冠状动脉扩张，而在低灌流压下所导致缺血时较粗的冠状动脉血管扩张。另外，对未麻醉犬静脉注射时，较粗的冠状动脉的扩张依赖于给药量而与血流量无关。
(2)对冠脉血流量的作用：1)对麻醉开胸犬静脉注射或在十二指肠内给以尼可地尔，冠脉血流量的增加及持续与本制剂的剂量有依赖性。使用苏醒犬、犬的心肺标本、兰格德夫(Langenforff)犬样本进行试验也得到同样的结果；2)对6例无左冠状动脉狭窄及左心室收缩异常的患者单次给以尼可地尔5mg，在实施右心房起搏使心率增加至120次/分以及未实施起搏的条件下，测定冠脉血流量(持续热稀释法)，结果显示出在任何心率下均有明显增加(118-120％)。
(3)缓解冠状血管痉挛作用：以冠状动脉部分狭窄的犬作实验，尼可地尔可以抑制周期性冠血流量的减少以及心电图的ST上升，在小型猪的冠状动脉内给以醋甲胆碱或去甲肾上腺素引起的冠状血管痉挛也可得以抑制。
(4)对心脏血流动力学的作用：1)对麻醉开胸犬静脉注射尼可地尔，血压的降低依赖于给药量，但程度轻微，在使冠状血管阻力显著降低的用量下，不影响心率、心肌收缩力、心肌氧消耗以及房室传导时间；2)对6例无左冠状动脉狭窄及左心室收缩异常的心绞痛患者单次给以本品(相当于尼可地尔5mg)，主动脉压及血压-心率乘积无明显变化。
尼可地尔的药动学：口服吸收快而完全，生物利用度为75％，服药后0.5～1小时血药浓度达峰值，半衰期(T1/2)约为1小时。主要分布在肝、心、肾、肾上腺及血液中。在体内经水解脱去硝基，代谢产物药理活性很小，主要从尿中排泄。
尼可地尔的代谢、排泄：对4名健康成人男子单次口服给以重氢标记的尼可地尔20mg，对代谢和排泄进行了调查，结果表明大部分尼可地尔可通过脱硝化形成N-(2-羟乙基)烟酰胺而被代谢。给以尼可地尔后0.5小时在血浆中出现代谢产物，2小时后达到最高浓度，8小时后几乎完全消失。24小时后累积尿中排泄率分别为：尼可地尔0.7-1.2％；代谢物N-(2-羟乙基)烟酰胺6.8-17.3％。
尼可地尔的血清蛋白结合率：人血清体外试验结果表明，血清蛋白结合率为34.2-41.5％(尼可地尔浓度为1-100μg/ml)。
尼可地尔的适应症：适用于冠心病，心绞痛的治疗。对于劳力型、自发型、梗死后或混合型心绞痛均有效。对伴有心房颤动、心脏扩大的心绞痛、对其它抗心绞痛药物需慎用的患者，可选用本品。
尼可地尔的用法用量：口服。一次1片5mg，一日3次；症状改善不明显时可增加剂量：一次2片，一日3次。
尼可地尔的临床应用情况：冠心病，尼可地尔可以有效扩张正常冠脉和狭窄冠脉，增加冠脉血流。并能明显改善冠心病患者预后，减少全因死亡。心绞痛，尼可地尔由于具有扩张冠脉、增加冠脉血流量而不增加心肌耗氧量、减轻心脏前后负荷等药理特性，故它对各型心绞痛的治疗均有明显疗效。临床试验证明一次口服尼可地尔可延长心绞痛病人运动至心绞痛发作和心电图ST段下降至1mm的时间，且用药量与延长的时间呈正相关，疗效可维持6h左右。它能控制心绞痛的发作，有效率达90％左右。随疗程延长，发作次数明显减少。保护心肌细胞，尼可地尔可以减少钙内流，并且使基质舒张，容积增加，从而促进心里替呼吸和能量生成，模拟缺血预适应，保护心肌细胞。其他由于微血管循环导致的疾病(例如肺动脉高压)。
通过本发明方法能够更加有效地对尼可地尔片剂进行质量监控。
附图说明
图1是本发明方法对一批典型的市售尼可地尔片进行检测的典型HPLC色谱图。
图2、图3是使用目前国内外药品标准及已公开的文献中的有关物质检查方法检测国内尼可地尔片中的杂质含量的色谱图。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。
片剂制备例：片剂A的配方(每片量)：尼可地尔5mg、甘露醇85mg、羧甲基淀粉钠9mg、硬脂酸镁1mg；制法：使尼可地尔、甘露醇、羧甲基淀粉钠和硬脂酸镁混均，干燥，压片，即得。片剂B的配方(每片量)：尼可地尔5mg、甘露醇85mg、硬脂酸镁1mg；制法：使尼可地尔、甘露醇和硬脂酸镁混均，干燥，压片，即得。
实施例1：使用HPLC校正因子法测定尼可地尔片剂有关物质的方法学研究
1、方法与结果
尼可地尔对照品、杂质A对照品(中国食品药品检定研究院)、杂质B、C、D工作对照品(自制)、杂质E工作对照品(加拿大TLC公司)、尼可地尔片样品均来源于市场抽样。
色谱条件采用Atlantis T3C18色谱柱，(4.6×250mm，5μm)，以三氟乙酸-三乙胺-四氢呋喃-水(3:5:3:989)为流动相A，以水：四氢呋喃：三乙胺：三氟乙酸(972:20:5:3)为流动相B，按下表进行梯度洗脱，流速为1.2ml/min，柱温为25℃，检测波长为262nm。
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0.0 | 100 | 0 |
| 22 | 100 | 0 |
| 54 | 0 | 100 |
| 65 | 0 | 100 |
| 66 | 100 | 0 |
| 75 | 100 | 0 |
取尼可地尔片剂细粉适量(约相当于尼可地尔20mg)，精密称定，置10ml量瓶中，用稀释液振摇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。取尼可地尔对照品20mg，精密称定，置10ml量瓶中，用稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置100ml量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。本实施例所用稀释液是流动相A与三乙胺以体积比100：0.12比例的混合液。
精密量取供试品溶液、对照品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品溶液色谱图中如有已知杂质峰，以对照品溶液中尼可地尔峰面积为对照，杂质峰面积乘以相应校正因子后按外标法计算。
试验中还采用类似于上述尼可地尔片和尼可地尔对照品的配制方法，配制杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E溶液以及包含这些杂质以及尼可地尔的系统适用性试验溶液，以进行方法学试验。
通过专属性试验可得在本色谱条件下，溶剂对测定无干扰，尼可地尔片经酸碱氧化高温高湿光照破坏后均有降解产物峰，但降解产物均能和主峰良好分离，不影响测定。各杂质和主成分在2μg/ml～50μg/ml浓度范围内，r＝1.0000，线性良好。尼可地尔检出限为0.6μg/ml，定量限为2μg/ml。尼可地尔在20μg/ml的对照品溶液浓度下，6针峰面积RSD为0.7％，精密度良好。采用三个不同批号的色谱柱及三台不同品牌的色谱仪对尼可地尔片样品进行了测定，考察了杂质峰与主峰，杂质峰之间的分离度，均符合要求。使用对照品贮备液和各个杂质的贮备液，用稀释液稀释成在2μg/ml～50μg/ml浓度范围内的7个浓度点测试液，在262nm波长下测定，分别对尼可地尔和各杂质以浓度对峰面积进行线性回归，以尼可地尔线性斜率与各杂质线性斜率的比值计算杂质的校正因子。杂质A、B、C、D、E的校正因子分别为0.67、0.76、1.40、1.45、1.26。通过样品测定，某同一厂商生产的三批尼可地尔片剂样品杂质均值分别为杂质A0.15％，杂质B0.13％，杂质C10.60％，杂质D0.87％，杂质E0.53％，杂质总量13.34％。
2、色谱系统与波长选择
尼可地尔为弱碱性药物，首先尝试不加入离子对试剂，其在pH为7附近的缓冲液体系中以化合物状态存在，有利于其在色谱系统中的保留，但经试验，降低有机相的比例虽可显著增加尼可地尔在色谱系统中的保留但无法改善尼可地尔极性杂质的分离。加入离子对试剂可以改善极性化合物在C18色谱系统中的保留，通过对不同流动相比例的摸索，最终确定在三氟乙酸-三乙胺-四氢呋喃-水(3:5:3:989)的流动相条件下配合高碳载量的色谱柱，尼可地尔的极性杂质可以得到良好的分离。因为在该色谱系统中，尼可地尔保留过强，所以采取梯度洗脱的方式加快尼可地尔及其极性小的杂质的洗脱。为降低基线的波动对杂质检出的影响并兼顾杂质的洗脱时间限制，经反复试验，确定本发明色谱条件。本发明色谱条件中尼可地尔及其大部分降解杂质均在262nm±2nm波长处有最大吸收，所以选定262nm为方法的检测波长。
3、色谱柱的选择
在本实施例上述试验中，因流动相中水相比例较高，接近99％，所以色谱柱优先选择各主流厂商的耐100％水相的色谱柱。在本发明人进行的方法优化过程中，先后分别采用5个厂商共8种耐100％水相的色谱柱，结果显示Waters Atlantis T3(250×4.6mm，5μm)对杂质的分离效果最好，同时只有与其同公司且填料相近的色谱柱X-select HSS T3(250×4.6mm，5μm)及Thermo公司的Syncronis AQ(250×4.6mm，5μm)色谱柱有与其相近的分离效果，选择测试的其它品牌、型号的色谱柱均无法将所有杂质有效分离，故将WatersAtlantis T3(250×4.6mm，5μm)作为本方法色谱柱推荐型号，X-select HSS T3(250×4.6mm，5μm)柱和Syncronis AQ(250×4.6mm，5μm)亦尚可选用。
4、供试品溶液稀释溶剂的选择
由于在初始的22min内流动相A为100％运行，为使溶剂对色谱系统影响最小，本发明人曾经当然地采用流动相A作为稀释液来配制各种测试溶液，然而令人遗憾的发现，采用流动相A为溶剂配制的各种供试品溶液十分不稳定，在15分钟的时间内杂质D就会持续、大量地转化为杂质C，影响样品的测定。
5、补充试验
本发明在接着的试验中，尝试在制备供试品溶液所用的稀释液中增加适量三乙胺(其它试验操作同本实施例1之“1、方法与结果”部分记载的方法)，出人意料地发现，当使用每100ml流动相A中添加0.12ml三乙胺所配制的混合液作为稀释液，用此稀释液配制HPLC测试的各种测试溶液时，完全可以避免供试品溶液中短时间内杂质D转化为杂质C的现象。然而，当三乙胺添加量低于或高于上述0.12ml时，均呈现供试品溶液中的杂质不稳定进而影响检测准确性的不可接受的结果；即，当三乙胺增加量不足即低于等于0.10ml时则在供试品溶液放置30分钟的时间内杂质D就会持续转化为杂质C，当三乙胺增加过量即高于等于0.14ml时则在供试品溶液放置5分钟内杂质C就会发生氨解逐渐转化为杂质B；具体试验如以下各个补充试验所示：
补充试验A：参照本实施例1上文“1、方法与结果”，用100ml流动相A添加0.1ml三乙胺所得混合液作为配液用的稀释液，分别配制杂质C、D的0.1mg/ml的对照品溶液，接着分别于0，0.5，1，2小时进样，杂质C溶液在2小时内基本保持稳定，但杂质D溶液在0.5小时时已经有少量转化为杂质C，在2小时时转化率约为35％，并且已经发现稀释液中添加的三乙胺量越低，则杂质D至C这种转化速度越快；
补充试验B：参照本实施例1上文“1、方法与结果”，用100ml流动相A添加0.14ml三乙胺所得混合液作为配液用的稀释液，分别配制杂质C、D的0.1mg/ml的对照品溶液，接着分别于0，0.5，1，2小时进样，则杂质C溶液在临用新制时就有约20％转化为杂质B，在1小时后转化率就以高达80％，2小时后就全部转化为杂质B，杂质D溶液在2小时内基本保持稳定，并且已经发现稀释液中添加的三乙胺量越高，则杂质C至B这种转化速度越快；
补充试验C：当用100ml流动相A添加0.11～013ml三乙胺时，未发现上述明显的杂质D至C或者杂质C至B的转化，结果与添加0.12ml三乙胺基本相同；
补充试验D：使用100ml流动相A添加0ml、0.1ml、0.12ml、0.14ml、0.2ml三乙胺组成的五种混合液作为配制溶液的稀释液，使用包括尼可地尔、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E以重量比100：1：1：1：1：1比例组成的混合物为测试物，已经发现测试溶液在室温处放置2小时后：
使用流动相A/三乙胺＝100/0.12稀释液时五种成分的测试结果与其理论含量吻合，
使用流动相A/三乙胺＝100/0以及100/0.1稀释液时五种成分的测试结果显示尼可地尔、杂质A、杂质B、杂质E与其理论含量吻合但是如补充试验A那样杂质D含量显著减少而杂质C含量显著增加，
使用流动相A/三乙胺＝100/0.14以及100/0.2稀释液时五种成分的测试结果显示尼可地尔、杂质A、杂质D、杂质E与其理论含量吻合但是如补充试验B那样杂质C含量显著减少而杂质B含量显著增加。
因此，在本发明一个实施方案中，配制溶液所用稀释液是每100ml流动相A添加0.11～013ml三乙胺所得混合液。
实施例2：使用HPLC校正因子法测定尼可地尔片剂有关物质
使用高效液相色谱法对尼可地尔片剂中的有关物质进行检测，操作步骤如下：
(1)照中国药典2015年版四部通则0512所载的高效液相色谱法中的规范进行测定；
(2)色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(本例使用WatersAtlantis T3柱，250×4.6mm，5μm)，以三氟乙酸-三乙胺-四氢呋喃-水(3:5:3:989)为流动相A，以水：四氢呋喃：三乙胺：三氟乙酸(972:20:5:3)为流动相B，按下表所示梯度洗脱程序进行梯度洗脱，流速为1.2ml/min，柱温为25℃，检测波长为262nm，
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0.0 | 100 | 0 |
| 22 | 100 | 0 |
| 54 | 0 | 100 |
| 65 | 0 | 100 |
| 66 | 100 | 0 |
| 75 | 100 | 0 |
系统适用性试验溶液色谱图中，尼可地尔的保留时间在33～40min范围内(例如34～38min，特别35～37min)，理论板数按尼可地尔峰计应不低于5000，尼可地尔与相邻杂质峰之间的分离度应大于3；
(3)溶液制备：
取相当于尼可地尔20mg的尼可地尔片剂研成的细粉，精密称定，置10ml量瓶中，用稀释液(取100ml流动相A加0.12ml三乙胺混合均匀)振摇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为有关物质检查用的供试品溶液(其浓度相当于2000μg/ml)；
取尼可地尔对照品20mg，精密称定，置10ml量瓶中，用上述稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度相当于2000μg/ml的对照品贮备液；精密量取对照品贮备液1ml，置100ml量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液(其浓度相当于20μg/ml)；
杂质溶液：精密称取各杂质(杂质A、B、C、D、E)10mg，分别置10ml量瓶中，用上述稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，分别制成各杂质浓度相当于1000μg/ml的贮备液；分别精密量取各杂质贮备液1ml，置100ml量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀，作为各杂质溶液(其浓度相当于10μg/ml)；
系统适用性试验溶液：取尼可地尔对照品20mg，精密称定，置10ml量瓶中，另外向该量瓶中分别精密加入各杂质储备液0.1ml，用稀释液稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性试验溶液(其浓度相当于尼可地尔2000μg/ml、各杂质10μg/ml)；
(4)测定：
精密量取对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，读取色谱图中尼可地尔的保留时间、峰面积；
精密量取各个杂质溶液10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，读取色谱图中各个杂质的保留时间、峰面积，并确定各个杂质的保留时间；
精密量取系统适用性试验溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，读取色谱图中各个色谱峰的保留时间、峰面积，计算尼可地尔峰的理论板数、尼可地尔与相邻杂质峰之间的分离度，计算各杂质相对于尼可地尔的相对保留时间；
精密量取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，读取色谱图中尼可地尔及各杂质的面积；供试品溶液色谱图中如有已知杂质峰，以对照品溶液中尼可地尔峰面积为对照，用该杂质峰面积乘以其校正因子后按外标法计算该杂质在片剂中的含量。
本实施例测定结果如下：
在系统适用性试验溶液色谱图中，尼可地尔的保留时间约为36.0min，因流速、柱温等因素波动可能会对保留时间造成±0.5min的影响；理论板数按尼可地尔峰计大于5000，尼可地尔与相邻杂质峰之间的分离度大于3，各相邻杂质峰相互之间的分离度均大于1.5；
使用对照品贮备液和各个杂质的贮备液，用稀释液稀释成在2μg/ml～50μg/ml浓度范围内的7个浓度点测试液，在262nm波长下测定，分别对尼可地尔和各杂质以浓度对峰面积进行线性回归，以尼可地尔线性斜率与各杂质线性斜率的比值计算杂质的校正因子。杂质A、B、C、D、E的校正因子分别为0.67、0.76、1.40、1.45、1.26；
使用本实施例的上述方法测定，各杂质相对于尼可地尔的相对保留时间分别为：杂质A为0.117±0.010、杂质B为0.175±0.015、杂质C为0.258±0.025、杂质D为0.464±0.045、杂质E为1.367±0.130；
通过专属性试验可得在本实施例色谱条件下，溶剂对测定无干扰，尼可地尔片经酸碱氧化高温高湿光照破坏后均有降解产物峰，但降解产物均能和主峰良好分离，不影响测定；
各杂质和主成分在2μg/ml～50μg/ml浓度范围内，r＝1.0000，线性良好；
尼可地尔检出限为0.6μg/ml，定量限为2μg/ml；
尼可地尔在20μg/ml的对照品溶液浓度下，6针峰面积RSD为0.6％，精密度良好。
使用本实施例2的方法，对从市场抽取的2个生产商的共18批次尼可地尔片剂样品(每个厂商8～10批)，经测定，A厂商的全部批次样品杂质A含量在0.1～0.4％范围内、杂质B含量在0.1～0.3％范围内、杂质C含量在5.6～17.2％范围内、杂质D含量在0.3～1.0％范围内、杂质E含量在0.4～0.7％范围内；B厂商的全部批次样品杂质A含量在0.0～0.1％范围内、杂质B含量在0.0～0.1％范围内、杂质C含量在0.3～1.8％范围内、杂质D含量在0.3～0.5％范围内、杂质E含量在0.3～0.4％范围内。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
Claims (10)
1.使用高效液相色谱法对尼可地尔片剂中的有关物质进行检测的方法，其包括以下操作：
(1)照中国药典2015年版四部通则0512所载的高效液相色谱法中的规范进行测定；
(2)色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(例如，色谱柱的规格为150～300mm(例如250mm)×4.6mm，5μm)，以三氟乙酸-三乙胺-四氢呋喃-水(3:5:3:989)为流动相A，以水：四氢呋喃：三乙胺：三氟乙酸(972:20:5:3)为流动相B，按下表所示梯度洗脱程序进行梯度洗脱，流速为1.2ml/min，柱温为25℃，检测波长为262nm，
系统适用性试验溶液色谱图中，尼可地尔的保留时间在33～40min范围内(例如34～38min)，理论板数按尼可地尔峰计应不低于5000，尼可地尔与相邻杂质峰之间的分离度应大于3；
(3)溶液制备：
取相当于尼可地尔20mg的尼可地尔片剂研成的细粉，精密称定，置10ml量瓶中，用稀释液振摇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为有关物质检查用的供试品溶液(其浓度相当于2000μg/ml)；
取尼可地尔对照品20mg，精密称定，置10ml量瓶中，用上述稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度相当于2000μg/ml的对照品贮备液；精密量取对照品贮备液1ml，置100ml量瓶中，用上述稀释液稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液(其浓度相当于20μg/ml)；
杂质溶液：精密称取各杂质10mg，分别置10ml量瓶中，用上述稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，分别制成各杂质浓度相当于1000μg/ml的贮备液；分别精密量取各杂质贮备液1ml，置100ml量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀，作为各杂质溶液(其浓度相当于10μg/ml)；
系统适用性试验溶液：取尼可地尔对照品20mg，精密称定，置10ml量瓶中，另外向该量瓶中分别精密加入各杂质储备液0.1ml，用稀释液稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性试验溶液(其浓度相当于尼可地尔2000μg/ml、各杂质10μg/ml)；
(4)测定：
精密量取对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，读取色谱图中尼可地尔的保留时间、峰面积；
精密量取各个杂质溶液10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，读取色谱图中各个杂质的保留时间、峰面积，并确定各个杂质的保留时间；
精密量取系统适用性试验溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，读取色谱图中各个色谱峰的保留时间、峰面积，计算尼可地尔峰的理论板数、尼可地尔与相邻杂质峰之间的分离度，计算各杂质相对于尼可地尔的相对保留时间；
精密量取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，读取色谱图中尼可地尔及各杂质的面积；供试品溶液色谱图中如有已知杂质峰，以对照品溶液中尼可地尔峰面积为对照，用该杂质峰面积乘以其校正因子后按外标法计算该杂质在片剂中的含量。
2.根据权利要求1的方法，其中所述杂质选自如下杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E：
3.根据权利要求1的方法，其中还包括测定并计算各个杂质的校正因子的过程。
4.根据权利要求3的方法，所述过程是：使用对照品贮备液和各个杂质的贮备液，用稀释液稀释成在2μg/ml～50μg/ml浓度范围内的7个浓度点测试液，在262nm波长下测定，分别对尼可地尔和各杂质以浓度对峰面积进行线性回归，以尼可地尔线性斜率与各杂质线性斜率的比值计算杂质的校正因子。
5.根据权利要求1的方法，其中在计算杂质含量时，杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E的校正因子分别为0.67、0.76、1.40、1.45、1.26。
6.根据权利要求1的方法，其中色谱柱的规格为250mm×4.6mm，5μm，各杂质相对于尼可地尔的相5对保留时间分别为：杂质A为0.117±0.010、杂质B为0.175±0.015、杂质C为0.258±0.025、杂质D为0.464±0.045、杂质E为1.367±0.130。
7.根据权利要求1的方法，其中步骤(3)溶液制备中，配制各种溶液所用的稀释液是流动相A。
8.根据权利要求1的方法，其中步骤(3)溶液制备中，配制各种溶液所用的稀释液是流动相A与三乙胺以体积比100：0.11～0.13比例的混合液，例如是流动相A与三乙胺以体积比100：0.12比例的混合液。
9.根据权利要求1的方法，其中所述尼可地尔片剂中包含2～15％的羧甲基淀粉钠。
10.根据权利要求1的方法，其中所用色谱柱为Waters Atlantis T3品牌的规格为250×4.6mm，5μm的色谱柱。
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2018
- 2018-11-29 CN CN201811446229.2A patent/CN109406706A/zh active Pending
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