CN109394598A - 一种祛痘浓缩物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种祛痘浓缩物，所述祛痘浓缩物是由以下方法制备而成的：(1)将乳酸杆菌接种到赤松叶提取物中发酵，得到发酵液；(2)将步骤(1)得到的发酵液灭菌、过滤，将得到的滤液浓缩，得到所述祛痘浓缩物。本发明还提供了一种祛痘液善肤均QUORASTOP和祛痘清洁水。本发明祛痘浓缩物、祛痘液善肤均和祛痘清洁水能通过有效的抑制痤疮丙酸杆菌的群体效应，能有效的平衡微生物组群从而达到治疗痤疮的效果。志愿者使用了含有2％善肤均的产品，在不杀死全部的痤疮丙酸杆菌，只是阻止痤疮丙酸杆菌的增殖，还不会产生细菌耐药性等条件下，痤疮肌肤也能得有效的治疗。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种祛痘浓缩物及其应用。
背景技术
痤疮丙酸杆菌(学名：Propionibacterium acnes)，是和皮肤疾病粉刺息息相关的一种生长相对缓慢的典型革兰氏阳性厌氧菌(杆状)。属于皮肤的正常菌群，一般寄居在皮肤的毛囊及皮脂腺中。随着青少年的发育成熟，毛囊口出现角栓，皮脂腺分泌功能也明显增加，因皮脂含有较多脂肪酸等成分，适合P.acnes的生长及繁殖，从而成为痤疮最主要的病因之一。传统认为：痤疮丙酸杆菌是造成青春痘的主要细菌，因此治疗青春痘更多使用的方法是直接杀死痤疮丙酸杆菌的方式来进行。
但有研究证明：健康肌肤上放线菌的含量占了细菌总量的45.6％，而痤疮丙酸杆菌和丙酸杆菌是放线菌中的其中一类。也就是说丙酸菌在皮肤健康中扮演着重要的角色，这个发现表明，有效的痤疮治疗不应该以杀死所有丙酸菌为目标，而是应该针对致病菌株或者保持或补充有益的菌株，以保持皮肤的健康状态，平衡微生物组群来达到治疗痤疮的效果。
群体效应(Quorum sensing)是近来日益受到广泛关注的一种细菌群体行为调控机制，很多细菌有这种能力，即分泌一种或多种自诱导剂(Autoinducer),细菌通过感应这些自诱导剂来判断菌群密度和周围环境变化，当菌群数达到一定的阀值(quorum,菌落或集落数)后，启动相应一系列基因的调节表达，以调节菌体的群体行为。不同类型的细菌具有不同的群体效应调节系统，很多细菌分泌同一种诱导剂，以此调控不同种类细菌间的作用行为。群体效应系统在自诱导剂与受体之间存在专一性，同时又在调节基因和信号传递系统中体现出多样性和复杂性。由于不少人或植物的病原菌的致病机制等受群体效应的调控，该机制已成为医学等领域的研究热点。细胞与细胞之间信息交流一般被认为只在多细胞生物中发生，而细菌往往被纯粹地看作单细胞生物。在20世纪60年代一种海洋费氏弧菌(Vibrio fischeri)的发光现象引起了科学家的兴趣，Nealson等在1970年首次报道了该菌的菌体密度与发光呈正相关，该发光现象受细菌本身的群体感应调节系统(Quorum-Sensing System简称QS系统)所控制。
近几十年来的研究证实,细菌群感效应QS参与很多生物学功能的调控。其中QS调控病原菌毒性因子的表达和生物膜的形成是目前倍受关注的问题。研究证实,病原菌对宿主细胞的致病作用一般需要毒性因子的表达,并且大多数病原菌的致病性是和生物膜的形成紧密联系在一起的。当这些病原菌形成生物膜时,它们对宿主细胞的致病性和对抗菌药的免疫性能就会成倍的增加。
而生物被膜是大多数细菌在自然状态下的一种生长方式，使菌体具有浮游态时不具有的优势。它的形成和发展受到群体感应系统的调控，该系统是细菌依赖于群体密度而调控其生理行为的一种机制。其中LuxS/2型自诱导物(autoinducer2，AI-2)群体感应系统又称种间群体感应系统，广泛存在于G+及G－菌中。其信号分子AI-2被认为是种间通用的信号分子，参与调控多种细菌的生物被膜。此外，目前已发现多种LuxS/AI-2型群体感应系统抑制剂，它们可以影响许多细菌生物被膜的形成。
韩国红松作为韩国的本土松树，在东方医学的原理和实践中被提及(被称为“东医宝鉴”)，拥有松树的本质是如此的特别，以至于它的一部分都不应该被浪费掉。这是一种具有强大生命力的树，据说昆虫并不能感染韩国红松，而且它的抗菌应用也能提高痤疮免疫力。而清酒乳杆菌，是一种对人体特别有益的微生物，它创造了一种阻碍和控制细菌生长的酸性环境。作为一个例子，在泡菜的发酵过程中清酒乳杆菌能抑制有害菌的出现，防止泡菜受破坏。
本发明制备的祛痘液善肤均QUORASTOP(丁二醇，水，羟丙基环糊精，双丙甘醇，赤松(PINUS DENSIFLORA)叶提取物，乳酸杆菌发酵产物)正是结合了韩国红松的抗菌性+清酒乳杆菌的生物保鲜性的协同效应，基于群体效应来开发的产品。其可以抑制细菌中LuxS酶的活性；减少自诱导物AI-2的生成；抑制生物膜的生成；而在皮肤细胞中则可以抑制受体TLR-2的表达和减少TNF-α&IL-1α的表达，通过这种干扰痤疮丙酸杆菌的细胞间的通讯(群体效应)来达到控制炎症性痤疮的功效。
经检索,关于祛痘产品的专利很多，但跟本发明的机理相近的不多。
中国专利CN105796624A一种改善生物体表健康的方法公开了易一种至多种益生菌或益生菌和益生元的混合物为功能成分，以化妆品、护肤品、外用药剂等形态为使用载体，直接或间接改变体表菌群的构成，达到改善体表微生态、调节生物体表病理及生理状态的目的。
中国专利CN103462881B一种可促进皮肤微生态平衡的组合物及其制备方法公开了一种可促进皮肤微生态平衡的组合物及其制备方法，该组合物以皮肤益生元a-葡聚糖寡糖、果寡糖、β-葡聚糖，植物提取物，酵母提取物及天然抗菌剂明串球菌/萝卜根发酵产物滤液为主要成份。此发明组合物从根本上调节皮肤的微生态平衡，维护皮肤健康，克服了传统化妆品/护肤品治标不治本和易产生副作用的缺陷，同时具有保湿、柔软、紧致的多重修复功效，为解决皮肤问题提供了新的思路。
中国专利CN105997593A一种调节皮肤菌群失衡缓解湿疹的益生元功能配方公开了一种筛选出的调节皮肤菌群失衡缓解湿疹的益生元配方，改配方火星组分群有蕲艾(Artemisia arygi ev.qiai)精油(Essential oil)、菊粉(Inulin)和a-葡聚糖寡糖(a-Glucan Oligosaccharide)按不同比例组成，简称AeIG益生元；AeIG能明显预防并调节皮炎性湿疹病变皮肤中的菌群失衡，抑制金黄色葡萄球菌等潜在致病菌的繁殖，并促进双歧杆菌等益生菌的生长。
中国专利CN105796624A一种改善生物体表健康的方法仅涉及一种改善生物体表健康的方法，未提供具体的体内体外测试数据，换言之，不能确定多少添加量才算有效果。
中国专利CN103462881B一种可促进皮肤微生态平衡的组合物及其制备方法仅涉及调节皮肤的微生态平衡，未涉及抑制痤疮丙酸杆菌群体效应的功效。
中国专利CN105997593A一种调节皮肤菌群失衡缓解湿疹的益生元功能配方仅涉及预防并调节皮炎性湿疹病变皮肤中的菌群失衡，抑制金黄色葡萄球菌等潜在致病菌的繁殖，并促进双歧杆菌等益生菌的生长，未涉及抑制痤疮丙酸杆菌群体效应的功效。
正确的处理痤疮丙酸杆菌策略是通过抑制痤疮丙酸杆菌的增殖，平衡微生物组群。
发明内容
本发明提供了一种祛痘浓缩物及其应用，采用该祛痘浓缩液能够实现了通过抑制痤疮丙酸杆菌群体效应来达到祛痘的功效。
为实现上述目的，所采取的技术方案：一种祛痘浓缩物，所述祛痘浓缩物是由以下方法制备而成的：
(1)将乳酸杆菌接种到赤松叶提取物的水溶液中发酵，得到发酵液；
(2)将步骤(1)得到的发酵液灭菌、过滤，将得到的滤液浓缩，得到所述祛痘浓缩物。
优选地，所述步骤(1)中乳酸杆菌的接种量为750-850cfu/g。更优选地，所述步骤(1)中乳酸杆菌的接种量为800cfu/g。
优选地，所述步骤(1)中赤松叶提取物为赤松叶水提取物。相比其他溶剂提取，水提取物活性成分更加丰富及更安全，其他溶剂会或多或少的带入某些风险性或者刺激性，同时成本更低。
优选地，所述发酵温度为36.5-37.5℃，发酵时间为47.75-48.25小时。所述发酵温度为37℃，发酵时间为48小时。
本发明提供了一种祛痘液，所述祛痘液是在上述所述的祛痘浓缩物中加入丁二醇、羟丙基环糊精和双丙甘醇，然后过滤，得到滤液，即为所述祛痘液。
丁二醇的作用是保湿，提高体系的防腐能力；羟丙基环糊精是作为增加活性物的稳定性、提高活性物生物利用度；双丙甘醇是作为溶剂和保湿的作用。
本发明将祛痘浓缩物与各种溶剂复配，以优选出在不含防腐剂时祛痘液善肤均的防腐性、功效性、稳定性及温和性的较佳溶剂比例和最佳溶剂比例，较佳地，所述丁二醇、水、羟丙基环糊精、双丙甘醇与祛痘浓缩物的重量比为49～51:42.25～43.75：3.2～3.4：1.9～2.1:1.40～1.50。最佳地，所述丁二醇、水、羟丙基环糊精、双丙甘醇与祛痘浓缩物的重量比为50:43.25:3.3:2:1.45。
本发明提供了一种祛痘的清洁水，所述清洁水包括上述所述的祛痘浓缩物或者上述所述的祛痘液。
优选地，所述祛痘液在所述清洁水中的重量百分含量为2％。
本发明提供了上述所述的祛痘浓缩物、上述所述的祛痘液在制备祛痘产品中的应用。
本发明的关键点是善肤均(丁二醇，水，羟丙基环糊精，双丙甘醇，祛痘浓缩物)的创新祛痘机理，有针对性的抑制痤疮丙酸杆菌的群体效应，在祛痘的同时不会产生耐药性。
现有的祛痘产品大部分还是以杀死痤疮丙酸杆菌的主要手段，这样会把皮肤上的有益及有害细菌全部杀掉，如果停用后一段时间会产生爆痘现象，同时用多了也会产生耐药性；还有一部分是添加了益生元的祛痘产品，可以调节皮肤的微生态平衡，维护皮肤健康，但此部分是调节整个皮肤菌群的微生态平衡，在祛痘效果上需要的时间会更长一些。
有益效果：本发明提供了一种祛痘浓缩物，本发明还提供了一种祛痘液和祛痘清洁水。本发明祛痘浓缩物、祛痘液善肤均(丁二醇，水，羟丙基环糊精，双丙甘醇，痘浓缩物)和祛痘清洁水能通过有效的抑制痤疮丙酸杆菌的群体效应，能有效的平衡微生物组群从而达到治疗痤疮的效果。志愿者使用了含有2％善肤均的产品，在不杀死全部的痤疮丙酸杆菌，只是阻止痤疮丙酸杆菌的增值，还不会产生细菌耐药性等条件下，痤疮肌肤也能得有效的治疗。
附图说明
图1为本发明祛痘液对AI-2生成的影响。
图2为本发明祛痘液对LuxS酶活性的影响。
图3为本发明祛痘液对生物膜形成的影响。
图4为本发明祛痘液对TLR-2表达的影响。
图5为本发明祛痘液对TNF-α、IL-1α表达的影响。
图6为本发明祛痘液对痤疮肌肤的影响。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本实施例祛痘浓缩物的制备方法如下：
(1)将乳酸杆菌以800cfu/g的接种量接种到赤松叶提取物的水溶液中在37℃发酵48小时，得到发酵液；
(2)将步骤(1)得到的发酵液灭菌、过滤，过滤掉灭活的乳酸杆菌和其他的大分子代谢废物，将得到的滤液浓缩，得到浓缩物，即为所述祛痘浓缩物。
本实施例祛痘液善肤均的制备方法如下：
在本实施例祛痘浓缩物中加入丁二醇、水、羟丙基环糊精和双丙甘醇，然后过滤，得到滤液，即为所述祛痘液。
实施例2
本发明通过祛痘浓缩物与不同溶剂复配组合以优选出在不含防腐剂时祛痘液善肤均(丁二醇，水，羟丙基环糊精，双丙甘醇，祛痘浓缩物)的防腐性、功效性、稳定性及温和性的最佳溶剂比例，试验过程如下表1：
表1复配方案
1、稳定性测试：
试验组1：稳定性测试通过但防腐测试不通过。
试验组2：稳定性测试通过但防腐测试不通过。
试验组3：稳定性测试通过且防腐测试通过。
试验组4：稳定性测试不通过但防腐测试通过。
试验组5：稳定性测试通过且防腐测试通过。
试验组6：稳定性测试通过且防腐测试通过。
试验组7：稳定性测试通过且防腐测试通过。
试验组8：稳定性测试通过且防腐测试通过。
从以上测试中选取稳定性及防腐测试均通过的试验组3、试验组5、试验组6、试验组7和试验组8的优选比例组再进行皮肤刺激性测试：
2、测试方法：鸡胚实验
测试浓度：将上述试验组稀释成含10wt％祛痘液的溶液。
测试结果按过敏严重程度分级：Ⅰ级(严重过敏)Ⅱ级(明显过敏)Ⅲ级(中度过敏)Ⅳ级(轻微过敏)Ⅴ(无过敏)
测试结果如下表2：
表2测试结果
| 测试组 | 测试结果 |
| 试验组3 | V |
| 试验组5 | V |
| 试验组6 | IV |
| 试验组7 | V |
| 试验组8 | V |
以上测试优选组为：试验组3、试验组5、试验组7和试验组8
从以上优选组：试验组3、试验组5、试验组7和试验组8进行功效性测试：
采用体外测试的测试方法(具体测试方法如下文)：
测试结果如下表3：
表3测试结果
以上测试得到最佳优选组为：试验组3：丁二醇：水：羟丙基环糊精：双丙甘醇：祛痘浓缩物＝50:43.25:3.3:2:1.45。
试验组3的测试过程具体如下：
1.体外测试：
a)抑制AI-2的生成
测试方法：在善肤均存在的条件下，培养痤疮丙酸杆菌在72小时内37℃，无氧条件。AI-2是由埃尔曼分析法来测量的。结果如图1所示：
·AI-2自诱物是在群体感应中使用的信号分子家族中的一员。
·AI-2的产量减少了45％
·抑制AI-2的生成
b)抑制LuxS酶的活性
测试方法：在善肤均存在的条件下，培养痤疮丙酸杆菌和SAH反应1小时在37℃，无氧条件。LuxS活性是由埃尔曼分析法来测量的。
-核糖高半胱氨酸裂合酶(LuxS)参与AI-2自诱物的合成，这在群体效应中起到重要作用。
结果如图2所示：LuxS活性减少了49％
C)抑制痤疮丙酸杆菌的生物膜生成：
测试方法：人类表皮角化细胞(HaCaT)培养液在48小时内(37℃，二氧化碳：5％)在与痤疮丙酸杆菌培养基的培养基中进行培养。通过RT-PCR分析了mRNA的表达水平。
生物膜在许多人类感染的发病机理中起着重要的作用。痤疮丙酸杆菌可以在各种生物材料上形成高度耐药的生物膜。结果如图3所示：
善肤均抑制了生物膜形成的38％
D)皮肤细胞的抗炎症效果：
测试方法：人类表皮角化细胞(HaCaT)培养液在48小时内(37℃，二氧化碳：5％)在痤疮丙酸杆菌的培养基中进行培养。用蛋白质印迹法分析了蛋白质的表达水平。
关于Toll样受体TLR-2
–是一种蛋白质，它在先天免疫系统中起着关键作用。
–通过刺激TLR-2，先天免疫系统能够识别微生物成分，然后诱导分泌细胞因子/趋化因子。
结果如图4所示：
善肤均抑制了TLR-2表达
参考：*J Immunol.2002 Aug 1；169(3):1535-41.
–Activation of toll-like receptor 2 in acne triggers inflammatorycytokine responses.
–E)皮肤细胞的抗炎症效果：
测试方法：人类表皮角化细胞(HaCaT)培养液在48小时内(37℃，二氧化碳：5％)在痤疮丙酸杆菌的培养基中进行培养。通过RT-PCR分析了mRNA的表达水平。
–肿瘤坏死因子(TNF-α)是一种细胞信号蛋白(细胞因子)，涉及到全身炎症。
–白介素(IL-1α)负责炎症的产生，以及促进发烧和败血症。
结果如图5所示：
善肤均降低了
–TNF-α的表达:50％↓
–IL-1α的表达:71％
2.体内测试：
改善痤疮肌肤：
–志愿者：8名年龄在14岁至27岁之间的男性和女性。
–配方：清洁水，含2％善肤均。
–使用方法：14天每天两次。
–分析方法：拍照对比(使用前后)
结果如图6所示：本发明祛痘液善肤均明显改善了痤疮肌肤。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种祛痘浓缩物，其特征在于，所述祛痘浓缩物是由以下方法制备而成的：
(1)将乳酸杆菌接种到赤松叶提取物的水溶液中发酵，得到发酵液；
(2)将步骤(1)得到的发酵液灭菌、过滤，将得到的滤液浓缩，得到所述祛痘浓缩物。
2.根据权利要求1所述的祛痘浓缩物，其特征在于，所述步骤(1)中乳酸杆菌的接种量为750-850cfu/g；优选地，所述步骤(1)中乳酸杆菌的接种量为800cfu/g。
3.根据权利要求1所述的祛痘浓缩物，其特征在于，所述步骤(1)中赤松叶提取物为赤松叶水提取物。
4.根据权利要求1所述的祛痘浓缩物，其特征在于，所述发酵温度为36.5-37.5℃，发酵时间为47.75-48.25小时；优选地，所述发酵温度为37℃，发酵时间为48小时。
5.一种祛痘液，其特征在于，所述祛痘液是在如权利要求1-4任一所述的祛痘浓缩物中加入丁二醇、羟丙基环糊精和双丙甘醇，然后过滤，得到滤液，即为所述祛痘液。
6.根据权利要求5所述的祛痘液，其特征在于，所述丁二醇、水、羟丙基环糊精、双丙甘醇与祛痘浓缩物的重量比为49～51:42.25～43.75：3.2～3.4：1.9～2.1:1.40～1.50。
7.根据权利要求5所述的祛痘液，其特征在于，所述丁二醇、水、羟丙基环糊精、双丙甘醇与祛痘浓缩物的重量比为50:43.25:3.3:2:1.45。
8.一种祛痘的清洁水，其特征在于，所述清洁水包括如权利要求1-4任一所述的祛痘浓缩物或者如权利要求5-7任一所述的祛痘液。
9.根据权利要求7所述的清洁水，其特征在于，所述祛痘液在所述清洁水中的重量百分含量为2％。
10.如权利要求1-4任一所述的祛痘浓缩物、如权利要求5-7任一所述的祛痘液在制备祛痘产品中的应用。
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