CN109381699A

CN109381699A - 一种广谱hpv疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN109381699A
Application number: CN201811618897.9A
Authority: CN
Inventors: 吴喜林; 吴稚伟; 马晓花; 徐悦
Original assignee: Source Daolong (suzhou) Medical Technology Co Ltd
Current assignee: Nanjing Weixi Biomedical Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2018-08-31
Filing date: 2018-12-28
Publication date: 2019-02-26

Abstract

本发明涉及一种广谱HPV疫苗，其包含第一VLP和第二VLP，第一VLP由HPV16 L1蛋白和HPV16 L2蛋白包装而成，第二VLP由HPV18L1蛋白和HPV18 L2蛋白包装而成；还涉及上述广谱HPV疫苗的制备方法，包括在表达系统中分别表达第一VLP和第二VLP，并纯化第一VLP和第二VLP的步骤。本发明的HPV16/18 L1‑L2 VLP疫苗中HPV16和HPV18病毒样颗粒具有比市售HPV疫苗的病毒样颗粒更高的结构稳定性和均一性，能够诱导出更高滴度的抗血清。此外，本发明的HPV16/18 L1‑L2 VLP疫苗诱导的抗血清不仅可中和HPV16和18，还可中和HPV31和45。

Description

一种广谱HPV疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及HPV感染防治药物领域，更特别地，涉及一种广谱HVP疫苗及其制备方法和应用。

优先权

本申请要求本申请人于2018年8月31日提交的申请号为2018110114505的发明专利申请的优先权，其全部内容通过引用并入本文中。

背景技术

在女性癌症中，宫颈癌的发病率仅次于乳腺癌，是全球女性第二大癌症。全球每年约有宫颈癌新发病例52.8万，与宫颈癌相关的死亡人数达26.6万，2017年的研究数据显示我国每年约有13万宫颈癌新发病例，死亡病例为3万。科学研究表明，几乎所有宫颈癌是由人类乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)感染所致。

目前HPV已分离出100多种亚型，临床上根据不同亚型致病力大小或致癌危险性大小不同，可将HPV分为低危型和高危型两大类型。低危型主要引起肛门、外生殖器、尿道口、阴道下段等部位尖锐湿疣，以及低度宫颈上皮内瘤变CINⅠ，如HPV6、11、30、39、42、43、44亚型；高危型除可引起生殖器疣病外，更重要的是引起外生殖器癌、子宫颈癌和高度宫颈上皮内瘤变，科学研究发现至少有20种高危型HPV(hpv16、hpv18、hpv31、hpv33、hpv35、hpv45、hpv51、hpv52、hpv56、hpv58、hpv61等)与95％的早期浸润和浸润性子宫颈癌有关。

HPV基因组分为3个部分：早期基因区(E)、晚期基因区(L)及长调控区(LCR)。早期基因区(E)的E6、E7是致癌基因，编码的致癌蛋白是导致宫颈上皮癌变的重要因子。被感染细胞通过复制转录生产E6E7蛋白，E6E7蛋白与细胞周期调控因子(pRb蛋白，E2F转录因子，P53等)相互作用，细胞周期节点被废除,导致感染细胞的“永生”，最终导致宫颈癌的发生。晚期基因编码L1和L2蛋白。L1蛋白在一些表达系统中进行表达可形成不具感染性的病毒样颗粒(Viral like particle,VLP)。研究显示，一些包装好的VLP可用作疫苗来刺激机体产生针对HPV的抗体。

现有的基于HPV L1 VLP的疫苗，无论是二价、四价或是九价疫苗，仅可预防相应的高危型病毒感染及相关病变，对其他型没有交叉保护作用。

发明内容

为解决以上问题，本发明提供了一种广谱HPV疫苗，其包含第一VLP和第二VLP，所述第一VLP由HPV16 L1蛋白和HPV16L2蛋白包装而成，所述第二VLP由HPV18L1蛋白和HPV18L2蛋白包装而成。

在一个优选实施方案中，所述HPV16 L1蛋白的序列如SEQ ID NO:1所示，所述HPV16 L2蛋白的序列如SEQ ID NO:2所示；所述HPV18 L1蛋白的序列如SEQ ID NO:5所示，所述HPV18L2蛋白的序列如SEQ ID NO:6所示。

在一个优选实施方案中，所述疫苗还包含氢氧化铝佐剂，所述第一VLP与第二VLP和氢氧化铝佐剂的摩尔比为1:1。

本发明还提供了上述广谱HPV疫苗的制备方法，包括在表达系统中分别表达所述第一VLP和第二VLP，并纯化所述第一VLP和第二VLP的步骤。

在一个优选实施方案中，所述表达系统为哺乳动物细胞表达系统。

在一个优选实施方案中，所述表达系统为293T细胞。

在一个优选实施方案中，所述制备方法包括以下步骤：

S1：将第一VLP表达质粒和第二VLP表达质粒分别转入所述表达系统中，得到第一VLP表达系统和第二VLP表达系统，所述第一VLP表达质粒包含所述第一VLP的表达框，所述第二VLP表达质粒包含所述第二VLP的表达框；

S2：诱导所述第一VLP表达系统和所述第二VLP表达系统分别表达所述第一VLP和第二VLP；

S3：纯化所述第一VLP和第二VLP；

S4：将所述第一VLP与第二VLP混合，即得到所述HPV疫苗。

在一个优选实施方案中，所述第一VLP的表达框中，所述HPV16 L1蛋白的基因编码序列如SEQ ID NO:3所示，所述HPV16 L2蛋白的基因编码序列如SEQ ID NO:4所示；所述第二VLP的表达框中，所述HPV18 L1蛋白的基因编码序列如SEQ ID NO:7所示，所述HPV18 L2蛋白的基因编码序列如SEQ ID NO:8所示。

在一个优选实施方案中，所述第一VLP表达质粒通过将SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示序列插入到pcDNA3.1(WPRE)质粒的CMV启动子下游并使SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示序列共同转录分别翻译得到；所述第二VLP表达质粒通过将SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示序列插入到pcDNA3.1(WPRE)质粒的CMV启动子下游并使SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示序列共同转录分别翻译得到。

本发明的HPV16/18 L1-L2 VLP疫苗中HPV16和HPV18病毒样颗粒具有比市售HPV疫苗的病毒样颗粒更高的结构稳定性和均一性，并且能够诱导出更高滴度的抗血清。此外，本发明的HPV16/18 L1-L2 VLP疫苗诱导的抗血清不仅可中和HPV 16和18，还可中和HPV31和45。

附图说明

图1为HPV16 L1-L2 VLP表达质粒图；

图2为HPV18 L1-L2 VLP表达质粒图；

图3为HPV16 L1-L2 VLP表达系统表达产物进行密度梯度离心得到的个梯度层样品的SDS-PAGE电泳照片，由此确定HPV16 L1-L2 VLP所在的梯度层位置；

图4为HPV18 L1-L2 VLP表达系统表达产物进行密度梯度离心得到的个梯度层样品的SDS-PAGE电泳照片，由此确定HPV18 L1-L2 VLP所在的梯度层位置；

图5为多个HPV16 L1-L2 VLP表达系统克隆表达的HPV16 L1-L2 VLP的SDS-PAGE电泳照片；

图6为多个HPV18 L1-L2 VLP表达系统克隆表达的HPV18 L1-L2 VLP的SDS-PAGE电泳照片；

图7为图5的部分泳道的Western Blotting照片；

图8为图6的部分泳道的Western Blotting照片；

图9为HPV16 L1-L2 VLP的透射电镜照片；

图10为HPV18 L1-L2 VLP的透射电镜照片；

图11为HPV16 L1-L2 VLP(针对HPV16L1蛋白)和HPV18 L1-L2 VLP(针对HPV18 L1蛋白)分别各自免疫的新西兰大白兔和小鼠一定次数后的抗血清的效价统计图；

图12为HPV16 L1-L2 VLP(针对HPV16和HPV31)和HPV18 L1-L2 VLP(HPV18和HPV45)分别免疫新西兰大白兔后得到的抗血清在不同稀释度下的效价滴度统计图；

图13为用HPV16 L1-L2 VLP(针对HPV16和HPV31)和HPV18 L1-L2 VLP(HPV18和HPV45)分别免疫新西兰大白兔后得到的抗血清纯化的抗体的中和滴度统计图；

图14为本发明的双价HPV16/18 L1-L2 VLP疫苗与市售的GSK Cervarix(希瑞适)HPV16/18双价L1 VLP疫苗免疫诱导新西兰大白兔得到的抗血清针对HPV16 L1蛋白和HPV18L1蛋白的效价对比；

图15为本发明的双价HPV16/18 L1-L2 VLP疫苗与市售的GSK Cervarix(希瑞适)HPV16/18双价L1 VLP疫苗2免新西兰大白兔后的抗血清对HPV16、18、31和45的效价的对比。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1.HPV16 L1-L2表达质粒和HPV18 L1-L2表达质粒的构建

将编码HPV16 L1(氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)和L2(氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示)的基因进行密码子优化，分别得到SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。将SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4克隆到pcDNA3.1(WPRE)质粒表达载体中，使得这两条序列由CMV启动子驱动转录，并进行分别翻译，得到HPV16 L1-L2 VLP表达质粒(图1)。

将编码HPV18 L1(氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示)和L2(氨基酸序列如SEQ IDNO:6所示)的基因进行密码子优化，分别得到SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。将SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8克隆到pcDNA3.1(WPRE)质粒表达载体中，使得这两条序列由CMV启动子驱动转录，并进行分别翻译，得到HPV18 L1-L2 VLP表达质粒(图2)。

2.HPV16 VLP和HPV18 VLP的表达和纯化

将293T细胞培养在10％FBS+DMEM完全培养基培养中，当显微观察细胞密度达到70-80％时进行下述转染操作，分别转染HPV16 L1-L2 VLP表达质粒和HPV18 L1-L2 VLP表达质粒。

转染44-52h后，将细胞消化，收集，离心后，DPBS重悬细胞，转移至1.5ml低吸附管中，以DPBS洗涤2遍，0.5ml/遍。1000rpm，离心5min，弃去上清，加入1.5倍细胞团体积的DPBS重悬细胞。

加1/20总体积的10％Triton X-100，使Triton X-100终浓度为0.5％。再加1/40总体积的1M pH＝9的硫酸铵溶液。上下颠倒数次混匀。将其放入37度温箱中，成熟过夜。

成熟完毕后，将EP管置于冰上预冷，再于4℃离心机中以5000g离心5min，收集上清于另一新的低吸附管中；加2倍细胞团体积的DPBS，以枪尖将细胞团轻缓搅匀，使细胞重悬于DPBS中，于4℃离心机中以5000g离心5min，收集上清置于同一新低吸附管中；再加一倍细胞团体积的DPBS，同样的方法搅匀，于4℃离心机中以5000g离心5min，收集上清于同一新低吸附管中；最后加一倍细胞团体积的DPBS/0.8M NaCl，同法搅匀，于4℃离心机中以5000g离心5min，收集上清于同一新低吸附管中。此即为盐粗提的HPV16 VLP样品和HPV18 VLP样品。

根据盐粗提的VLP溶液的多少，利用不同梯度的optiprep进行密度梯度离心，其梯度为27％、33％、39％和46％。具体操作如下：用DPBS/0.8M NaCl稀释配制不同浓度的optiprep介质，浓度分别为46％，39％，33％，27％，向铺好的optiprep介质梯度中加入盐粗提的VLP样品，随后样品放入SW40Ti转子中，4℃40,000rpm离心4小时45分钟。离心结束后能观察到有明显的白色条带，收集各个梯度层样品，收集体积为0.6ml/份。

为了确定目标VLP蛋白的位置，取各个梯度层的20μl样品进行蛋白凝胶电泳。方法如下：蛋白样品和5xSDS加样缓冲液于100℃加热5min处理后，进行常规SDS-PAGE电泳，分离胶浓度为7.5％。结果显示HPV16从第7-17泳道显示明显的预期大小的目标条带(图3)；HPV18从第7-13均显示预期大小的目标蛋白(图4)。以上实验结果表明，通过密度梯度离心能获得的符合预期大小L1(55kDa)和L2(60kDa)的目标蛋白。

3.目标蛋白稳定性验证

为了进一步验证不同批次蛋白生产的稳定性，不同批次的HPV 16 L1-L2蛋白和HPV18 L1-L2蛋白进行SDS-PAGE胶验证；实验结果显示，不同批次制备的蛋白在目标位置均出现了稳定条带(图5和6)，提示不同批次的蛋白稳定性高。为了进一步确认目标蛋白为L1和L2蛋白，进行了Western blot实验，其中一抗为商品化的针对HPV16/18L1的多抗。方法如下：电泳结束后，电转至PVDF膜上，5％的脱脂奶粉封闭1个小时，孵育检测抗体，洗膜，1:10000稀释的带有荧光标记的羊抗鼠或羊抗兔的二抗室温孵育1个小时，洗膜，ODyssey荧光检测。结果显示在预期大小55kDa(L1蛋白大小)位置出现了清晰的目标条带(图7和8)。以上实验结果提示，所制备的HPV 16和HPV 18的L1和L2蛋白具有很高的稳定性，并且具有很高的纯度。

4.HPV16 L1-L2 VLP和HPV18 L1-L2 VLP透射电镜观察

使用透射电镜观察病毒样颗粒，方法如下：取10μl目标蛋白滴于封口膜上，使之形成表面突起的球状液滴碳支持膜正面向下吸附液滴5min，滤纸吸干残留液体；再将碳支持膜正面向下置于预先滴在封口膜上的10μl 2％的2％磷钨酸(pH 7.0)中负染4min。再次用滤纸吸干残留液体，正面向上放于之前画好的滤纸上，室温静置过夜。次日用JEM2100透射电镜观察颗粒。

电镜观察结果显示，HPV16 L1-L2 VLP蛋白在电子显微镜下呈现形态均一，颗粒大小为50nm左右，与野生的HPV病毒结构一致的病毒样颗粒(图9)；HPV18 L1-L2 VLP在电镜下也观察到类似大小均一的病毒颗粒(图10)。这些结果说明所构建的HPV16和HPV18的L1和L2蛋白均形成了VLP，并且结构稳定，均一性好；，与已上市的L1 VLP结构相比，形态更为均一VLP。VLP的形成以及均一性和稳定性都是最终成为疫苗免疫原性的非常重要的指标。

5.动物免疫以及抗血清鉴定

实验动物为未经任何免疫的雌性新西兰白兔4只，其中两只分别以我们制备的HPV16 L1-L2 VLP和HPV18 L1-L2 VLP为抗原，另外两只以GSK的cervarix(希瑞适)的L1-VLP为抗原。我们制备的HPV16/18 L1-L2 VLP与氢氧化铝佐剂(thermoscitific)以1:1比例进行混合。免疫方式为皮下注射，初次免疫剂量HPV16 L1-L2 VLP或HPV18 L1-L2 VLP各为20μg/只，此后分别于4、10周各加强免疫一次，加强免疫剂量100μg/只；以cervarix(希瑞适)为抗原进行免疫时，参照相同的免疫剂量和免疫时间进行免疫。加强免疫后一周采取外周静脉血，以备检测用。

结果显示，接受HPV18 L1-L2 VLP免疫的两只新西兰大白兔体内抗血清的效价随着免疫次数的增加而增强，5免后两只新西兰大白兔的抗血清效价达到1.968×10⁷倍，5免后接受HPV18 L1-L2 VLP免疫的3只小鼠也显示很高的抗血清效价。单独接受HPV16 L1-L2VLP免疫的新西兰大白兔和小鼠的抗血清也均显示非常高的抗血清效价(图11)。

疫苗的评价除了观察免疫后的血清效价滴度，另外一个重要指标是检测血清的中和滴度，由于兔抗血清体积相对比较多，因此我们将兔抗血清进行了针对HPV不同亚型的假病毒中和实验，实验结果显示，HPV18 L1-L2 VLP诱导的兔抗血清能很好的中和HPV18假病毒感染，ND50分别为2818000和2199000倍稀释，该抗血清针对HPV31的感染也具有很好的中和活性，ND50为276039和2986，然而针对HPV16和HPV45假病毒的感染没有中和效果；同样HPV16 L1-L2 VLP诱导的抗血清能很好的中和HPV16假病毒感染，ND50分别为1114000和2964000倍稀释，同时来自HPV16 L1-L2 VLP的R03抗血清还能中和HPV45假病毒感染(图12)。

为了进一步确定以上抗血清的中和效果是否依赖于抗体，我们将上述抗血清进行纯化，纯化的抗体进行中和实验检测。结果如图12和13所示，纯化的抗体中和实验结果与抗血清的中和结果一致，均具有高强度中和活性；与阳性对照Heparin相比，来自HPV16 L1-L2VLP免疫的抗体针对HPV16病毒的IC₅₀分别为2.774和5.06ng/ml，而Heparin的IC₅₀为25200ng/ml，由此可见诱导的抗体中和活性显著高于阳性对照Heparin；同时来自HPV16VLP免疫的抗体还能中和HPV45病毒感染，IC₅₀为3671ng/ml；来自HPV18 VLP免疫的抗体和抗血清的中和结果基本一致，显示很强的针对自身病毒HPV18的中和能力，IC₅₀显著高于阳性对照Heparin，同时来自HPV18 VLP免疫的抗体和抗血清还能中和HPV31。以上结果提示我们所制备的L1-L2 VLP能诱导高滴度的抗血清和高强度的中和抗体以及广谱的中和抗体。

6.双价HPV16/18 L1-L2 VLP疫苗的制备以及与市售VLP疫苗的对比

将我们构建的HPV16 L1-L2 VLP、HPV18 L1-L2 VLP以及氢氧化铝佐剂按1：1：25比例混合，得到HPV16/18 L1-L2 VLP双价疫苗。购买市售的GSK Cervarix(希瑞适)HPV16/18双价L1 VLP疫苗作为对比参照，来评估我们构建的HPV16/18 L1-L2 VLP双价疫苗的特性。使用我们构建HPV16/18 L1-L2 VLP双价疫苗和GSK Cervarix各免疫两只新西兰大白兔每周免疫之后的次一周抽取外周静脉血，分离血清，以备检测用。

结果如图14所示，我们的HPV16/18 L1-L2 VLP疫苗诱导的抗血清针对HPV16 L1蛋白具有更高滴度的效价，针对HPV18 L1蛋白的滴度没有显著性差异；针对HPV16和HPV18假病毒感染均具有高强度的中和活性。与GSK疫苗相比，我们的抗血清能中和HPV33和HPV45；以上结果表明我们的HPV16/18 L1-L2 VLP能诱导出同等强度的针对HPV16和HPV18的高滴度抗血清，同时我们的HPV16/18 L1-L2 VLP诱导的抗血清更为广谱，除了能有效中和HPV16和HPV18感染外，还能中和HPV33和HPV45假病毒感染。以上结果提示，与GSK的杆状细胞表达的HPV16/18双价疫苗相比，我们利用哺乳动物表达的含有L1和L2蛋白的HPV16/18 L1-L2VLP能诱导出高滴度的抗血清和更为广谱的中和抗血清。

为了进一步对比我们的HPV16/18 L1-L2 VLP与GSK的HPV16/18希瑞适L1-VLP效果，我们进行了抗血清的中和实验，因为衡量HPV疫苗除了VLP和抗血清效价外的另外一个金标准为检测诱导的抗血清中和不同亚型HPV病毒的中和能力。结果如图15所示，来自我们的HPV16/18 L1-L2 VLP(标记为YCL-01和YCL-02)和来自GSK的VLP所诱导的抗血清(标记为GSK-01和GSK-02)针对HPV16和HPV18均有相似强度的中和效果；令人惊喜的是来自YCL的抗血清还能中和HPV31和HPV45病毒感染。实验结果提示，来自YCL的HPV16/18 L1-L2 VLP能诱导出高效中和抗体和更为广谱的中和抗体。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 源道隆（苏州）医学科技有限公司

<120> 一种广谱HPV疫苗及其制备方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 505

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ser Leu Trp Leu Pro Ser Glu Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val

1 5 10 15

Pro Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Ala Arg Thr Asn

20 25 30

Ile Tyr Tyr His Ala Gly Thr Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro

35 40 45

Tyr Phe Pro Ile Lys Lys Pro Asn Asn Asn Lys Ile Leu Val Pro Lys

50 55 60

Val Ser Gly Leu Gln Tyr Arg Val Phe Arg Ile His Leu Pro Asp Pro

65 70 75 80

Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro Asp Thr Gln

85 90 95

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100 105 110

Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Leu Asp Asp

115 120 125

Thr Glu Asn Ala Ser Ala Tyr Ala Ala Asn Ala Gly Val Asp Asn Arg

130 135 140

Glu Cys Ile Ser Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Leu Ile Gly

145 150 155 160

Cys Lys Pro Pro Ile Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Ser Pro Cys Thr

165 170 175

Asn Val Ala Val Asn Pro Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Asn

180 185 190

Thr Val Ile Gln Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met

195 200 205

Asp Phe Thr Thr Leu Gln Ala Asn Lys Ser Glu Val Pro Leu Asp Ile

210 215 220

Cys Thr Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Ile Lys Met Val Ser Glu

225 230 235 240

Pro Tyr Gly Asp Ser Leu Phe Phe Tyr Leu Arg Arg Glu Gln Met Phe

245 250 255

Val Arg His Leu Phe Asn Arg Ala Gly Ala Val Gly Glu Asn Val Pro

260 265 270

Asp Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gly Ser Thr Ala Asn Leu Ala Ser

275 280 285

Ser Asn Tyr Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Asp Ala

290 295 300

Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln Gly His Asn

305 310 315 320

Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr

325 330 335

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340 345 350

Thr Thr Tyr Lys Asn Thr Asn Phe Lys Glu Tyr Leu Arg His Gly Glu

355 360 365

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370 375 380

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<210> 2

<211> 473

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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130 135 140

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165 170 175

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245 250 255

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340 345 350

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgagcctgt ggctgcccag cgaggccacc gtgtacctgc cccccgtgcc cgtgagcaag 60

gtggtgagca ccgacgagta cgtggccagg accaacatct actaccacgc cggcaccagc 120

aggctgctgg ccgtgggcca cccctacttc cccatcaaga agcccaacaa caacaagatc 180

ctggtgccca aggtgagcgg cctgcagtac agggtgttca ggatccacct gcccgacccc 240

aacaagttcg gcttccccga caccagcttc tacaaccccg acacccagag gctggtgtgg 300

gcctgcgtgg gcgtggaggt gggcaggggc cagcccctgg gcgtgggcat cagcggccac 360

cccctgctga acaagctgga cgacaccgag aacgccagcg cctacgccgc caacgccggc 420

gtggacaaca gggagtgcat cagcatggac tacaagcaga cccagctgtg cctgatcggc 480

tgcaagcccc ccatcggcga gcactggggc aagggcagcc cctgcaccaa cgtggccgtg 540

aaccccggcg actgcccccc cctggagctg atcaacaccg tgatccagga cggcgacatg 600

gtggacaccg gcttcggcgc catggacttc accaccctgc aggccaacaa gagcgaggtg 660

cccctggaca tctgcaccag catctgcaag taccccgact acatcaagat ggtgagcgag 720

ccctacggcg acagcctgtt cttctacctg aggagggagc agatgttcgt gaggcacctg 780

ttcaacaggg ccggcgccgt gggcgagaac gtgcccgacg acctgtacat caagggcagc 840

ggcagcaccg ccaacctggc cagcagcaac tacttcccca cccccagcgg cagcatggtg 900

accagcgacg cccagatctt caacaagccc tactggctgc agagggccca gggccacaac 960

aacggcatct gctggggcaa ccagctgttc gtgaccgtgg tggacaccac caggagcacc 1020

aacatgagcc tgtgcgccgc catcagcacc agcgagacca cctacaagaa caccaacttc 1080

aaggagtacc tgaggcacgg cgaggagtac gacctgcagt tcatcttcca gctgtgcaag 1140

atcaccctga ccgccgacgt gatgacctac atccacagca tgaacagcac catcctggag 1200

gactggaact tcggcctgca gccccccccc ggcggcaccc tggaggacac ctacaggttc 1260

gtgaccagcc aggccatcgc ctgccagaag cacacccccc ccgcccccaa ggaggacccc 1320

ctgaagaagt acaccttctg ggaggtgaac ctgaaggaga agttcagcgc cgacctggac 1380

cagttccccc tgggcaggaa gttcctgctg caggccggcc tgaaggccaa gcccaagttc 1440

accctgggca agaggaaggc cacccccacc accagcagca ccagcaccac cgccaagagg 1500

aagaagagga agctgtga 1518

<210> 4

<211> 1422

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgaggcaca agaggagcgc caagaggacc aagagggcca gcgccaccca gctgtacaag 60

acctgcaagc aggccggcac ctgccccccc gacatcatcc ccaaggtgga gggcaagacc 120

atcgccgacc agatcctgca gtacggcagc atgggcgtgt tcttcggcgg cctgggcatc 180

ggcaccggca gcggcaccgg cggcaggacc ggctacatcc ccctgggcac caggcccccc 240

accgccaccg acaccctggc ccccgtgagg ccccccctga ccgtggaccc cgtgggcccc 300

agcgacccca gcatcgtgag cctggtggag gagaccagct tcatcgacgc cggcgccccc 360

accagcgtgc ccagcatccc ccccgacgtg agcggcttca gcatcaccac cagcaccgac 420

accacccccg ccatcctgga catcaacaac accgtgacca ccgtgaccac ccacaacaac 480

cccaccttca ccgaccccag cgtgctgcag ccccccaccc ccgccgagac cggcggccac 540

ttcaccctga gcagcagcac catcagcacc cacaactacg aggagatccc catggacacc 600

ttcatcgtga gcaccaaccc caacaccgtg accagcagca cccccatccc cggcagcagg 660

cccgtggcca ggctgggcct gtacagcagg accacccagc aggtgaaggt ggtggacccc 720

gccttcgtga ccacccccac caagctgatc acctacgaca accccgccta cgagggcatc 780

gacgtggaca acaccctgta cttcagcagc aacgacaaca gcatcaacat cgcccccgac 840

cccgacttcc tggacatcgt ggccctgcac aggcccgccc tgaccagcag gaggaccggc 900

atcaggtaca gcaggatcgg caacaagcag accctgagga ccaggagcgg caagagcatc 960

ggcgccaagg tgcactacta ctacgacctg agcaccatcg accccgccga ggagatcgag 1020

ctgcagacca tcacccccag cacctacacc accaccagcc acgccgccag ccccaccagc 1080

atcaacaacg gcctgtacga catctacgcc gacgacttca tcaccgacac cagcaccacc 1140

cccgtgccca gcgtgcccag caccagcctg agcggctaca tccccgccaa caccaccatc 1200

cccttcggtg gcgcctacaa catccccctg gtgagcggcc ccgacatccc catcaacatc 1260

accgaccagg cccccagcct gatccccatc gtgcccggca gcccccagta caccatcatc 1320

gccgacgccg gcgacttcta cctgcacccc agctactaca tgctgaggaa gaggaggaag 1380

aggctgccct acttcttcag cgacgtgagc ctggccgcct ga 1422

<210> 5

<211> 507

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Ala Leu Trp Arg Pro Ser Asp Asn Thr Val Tyr Leu Pro Pro Pro

1 5 10 15

Ser Val Ala Arg Val Val Asn Thr Asp Asp Tyr Val Thr Arg Thr Ser

20 25 30

Ile Phe Tyr His Ala Gly Ser Ser Arg Leu Leu Thr Val Gly Asn Pro

35 40 45

Tyr Phe Arg Val Pro Ala Gly Gly Gly Asn Lys Gln Asp Ile Pro Lys

50 55 60

Val Ser Ala Tyr Gln Tyr Arg Val Phe Arg Val Gln Leu Pro Asp Pro

65 70 75 80

Asn Lys Phe Gly Leu Pro Asp Thr Ser Ile Tyr Asn Pro Glu Thr Gln

85 90 95

Arg Leu Val Trp Ala Cys Ala Gly Val Glu Ile Gly Arg Gly Gln Pro

100 105 110

Leu Gly Val Gly Leu Ser Gly His Pro Phe Tyr Asn Lys Leu Asp Asp

115 120 125

Thr Glu Ser Ser His Ala Ala Thr Ser Asn Val Ser Glu Asp Val Arg

130 135 140

Asp Asn Val Ser Val Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Ile Leu Gly

145 150 155 160

Cys Ala Pro Ala Ile Gly Glu His Trp Ala Lys Gly Thr Ala Cys Lys

165 170 175

Ser Arg Pro Leu Ser Gln Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Lys Asn

180 185 190

Thr Val Leu Glu Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Tyr Gly Ala Met

195 200 205

Asp Phe Ser Thr Leu Gln Asp Thr Lys Cys Glu Val Pro Leu Asp Ile

210 215 220

Cys Gln Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Gln Met Ser Ala Asp

225 230 235 240

Pro Tyr Gly Asp Ser Met Phe Phe Cys Leu Arg Arg Glu Gln Leu Phe

245 250 255

Ala Arg His Phe Trp Asn Arg Ala Gly Thr Met Gly Asp Thr Val Pro

260 265 270

Gln Ser Leu Tyr Ile Lys Gly Thr Gly Met Arg Ala Ser Pro Gly Ser

275 280 285

Cys Val Tyr Ser Pro Ser Pro Ser Gly Ser Ile Val Thr Ser Asp Ser

290 295 300

Gln Leu Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu His Lys Ala Gln Gly His Asn

305 310 315 320

Asn Gly Val Cys Trp His Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr

325 330 335

Thr Arg Ser Thr Asn Leu Thr Ile Cys Ala Ser Thr Gln Ser Pro Val

340 345 350

Pro Gly Gln Tyr Asp Ala Thr Lys Phe Lys Gln Tyr Ser Arg His Val

355 360 365

Glu Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Thr Ile Thr Leu

370 375 380

Thr Ala Asp Val Met Ser Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Ser Ile Leu

385 390 395 400

Glu Asp Trp Asn Phe Gly Val Pro Pro Pro Pro Thr Thr Ser Leu Val

405 410 415

Asp Thr Tyr Arg Phe Val Gln Ser Val Ala Ile Thr Cys Gln Lys Asp

420 425 430

Ala Ala Pro Ala Glu Asn Lys Asp Pro Tyr Asp Lys Leu Lys Phe Trp

435 440 445

Asn Val Asp Leu Lys Glu Lys Phe Ser Leu Asp Leu Asp Gln Tyr Pro

450 455 460

Leu Gly Arg Lys Phe Leu Val Gln Ala Gly Leu Arg Arg Lys Pro Thr

465 470 475 480

Ile Gly Pro Arg Lys Arg Ser Ala Pro Ser Ala Thr Thr Ser Ser Lys

485 490 495

Pro Ala Lys Arg Val Arg Val Arg Ala Arg Lys

500 505

<210> 6

<211> 462

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Val Ser His Arg Ala Ala Arg Arg Lys Arg Ala Ser Val Thr Asp

1 5 10 15

Leu Tyr Lys Thr Cys Lys Gln Ser Gly Thr Cys Pro Pro Asp Val Val

20 25 30

Pro Lys Val Glu Gly Thr Thr Leu Ala Asp Lys Ile Leu Gln Trp Ser

35 40 45

Ser Leu Gly Ile Phe Leu Gly Gly Leu Gly Ile Gly Thr Gly Ser Gly

50 55 60

Thr Gly Gly Arg Thr Gly Tyr Ile Pro Leu Gly Gly Arg Ser Asn Thr

65 70 75 80

Val Val Asp Val Gly Pro Thr Arg Pro Pro Val Val Ile Glu Pro Val

85 90 95

Gly Pro Thr Asp Pro Ser Ile Val Thr Leu Ile Glu Asp Ser Ser Val

100 105 110

Val Thr Ser Gly Ala Pro Arg Pro Thr Phe Thr Gly Thr Ser Gly Phe

115 120 125

Asp Ile Thr Ser Ala Gly Thr Thr Thr Pro Ala Val Leu Asp Ile Thr

130 135 140

Pro Ser Ser Thr Ser Val Ser Ile Ser Thr Thr Asn Phe Thr Asn Pro

145 150 155 160

Ala Phe Ser Asp Pro Ser Ile Ile Glu Val Pro Gln Thr Gly Glu Val

165 170 175

Ala Gly Asn Val Phe Val Gly Thr Pro Thr Ser Gly Thr His Gly Tyr

180 185 190

Glu Glu Ile Pro Leu Gln Thr Phe Ala Ser Ser Gly Thr Gly Glu Glu

195 200 205

Pro Ile Ser Ser Thr Pro Leu Pro Thr Val Arg Arg Val Ala Gly Pro

210 215 220

Arg Leu Tyr Ser Arg Ala Tyr Gln Gln Val Ser Val Ala Asn Pro Glu

225 230 235 240

Phe Leu Thr Arg Pro Ser Ser Leu Ile Thr Tyr Asp Asn Pro Ala Phe

245 250 255

Glu Pro Val Asp Thr Thr Leu Thr Phe Asp Pro Arg Ser Asp Val Pro

260 265 270

Asp Ser Asp Phe Met Asp Ile Ile Arg Leu His Arg Pro Ala Leu Thr

275 280 285

Ser Arg Arg Gly Thr Val Arg Phe Ser Arg Leu Gly Gln Arg Ala Thr

290 295 300

Met Phe Thr Arg Ser Gly Thr Gln Ile Gly Ala Arg Val His Phe Tyr

305 310 315 320

His Asp Ile Ser Pro Ile Ala Pro Ser Pro Glu Tyr Ile Glu Leu Gln

325 330 335

Pro Leu Val Ser Ala Thr Glu Asp Asn Asp Leu Phe Asp Ile Tyr Ala

340 345 350

Asp Asp Met Asp Pro Ala Val Pro Val Pro Ser Arg Ser Thr Thr Ser

355 360 365

Phe Ala Phe Phe Lys Tyr Ser Pro Thr Ile Ser Ser Ala Ser Ser Tyr

370 375 380

Ser Asn Val Thr Val Pro Leu Thr Ser Ser Trp Asp Val Pro Val Tyr

385 390 395 400

Thr Gly Pro Asp Ile Thr Leu Pro Ser Thr Thr Ser Val Trp Pro Ile

405 410 415

Val Ser Pro Thr Ala Pro Ala Ser Thr Gln Tyr Ile Gly Ile His Gly

420 425 430

Thr His Tyr Tyr Leu Trp Pro Leu Tyr Tyr Phe Ile Pro Lys Lys Arg

435 440 445

Lys Arg Val Pro Tyr Phe Phe Ala Asp Gly Phe Val Ala Ala

450 455 460

<210> 7

<211> 1524

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atggccctct ggagaccatc cgataacaca gtgtacttgc ccccacccag cgtcgcccgg 60

gtggtgaaca cagacgacta cgtcaccaga acctcaatct tctaccacgc cgggtccagc 120

cggctgctga ccgtgggcaa cccctacttc cgcgtgcccg ccggcggcgg aaacaaacaa 180

gacatcccca aagtcagcgc ctatcagtac cgggtgttcc gcgtccaact gcccgatccc 240

aacaagttcg gcctgcccga cacctccatc tacaaccccg agacccagag gctggtctgg 300

gcttgcgccg gcgtcgagat cgggaggggc caacccctgg gcgtggggtt gtccggccac 360

cccttctaca acaagctgga cgataccgag tccagccacg cagcaaccag caacgtctcc 420

gaagatgtgc gcgataacgt cagcgtggac tacaaacaaa cccaactgtg catcctggga 480

tgcgcacccg ccatcggcga gcattgggcc aaggggaccg cctgcaagag caggcccctg 540

agccaagggg actgtccacc cctggagttg aagaataccg tgctcgagga cggcgacatg 600

gtggacaccg gctacggcgc tatggatttc tccaccctcc aggacaccaa gtgcgaagtg 660

cccctcgaca tctgccaaag catctgcaag taccccgact acctccagat gagcgccgac 720

ccctacggcg acagcatgtt cttctgtctc agaagggaac aattgttcgc ccgccacttc 780

tggaaccggg ccggcacaat gggagataca gtcccccaga gcctgtacat caaggggacc 840

ggaatgaggg ccagccccgg gtcctgcgtc tacagcccaa gcccctccgg gagcatcgtc 900

acaagcgata gccaactctt caacaagccc tactggctcc acaaagccca aggccacaat 960

aacggggtgt gttggcacaa ccagctgttc gtgaccgtcg tggacacaac caggtccaca 1020

aacctgacca tctgcgccag cacccaaagc cccgtgcccg gccagtacga cgccacaaag 1080

ttcaaacaat actctcggca cgtggaagag tacgacctcc aattcatctt ccaactctgc 1140

accatcaccc tcaccgccga cgtgatgagc tacatccact ccatgaactc ctccatcctg 1200

gaagactgga atttcggcgt gccaccaccc cctaccacct ccctcgtcga cacctacaga 1260

ttcgtgcaga gcgtggccat cacatgccag aaagacgccg cccccgccga gaacaaagac 1320

ccatacgaca aactgaaatt ctggaacgtc gacctgaaag agaaattcag cctggatctg 1380

gaccagtacc cattgggcag gaagttcctc gtgcaagccg gcctcaggag aaaaccaaca 1440

atcgggccca ggaagaggag cgcccccagc gcaaccacca gcagcaagcc cgcaaaaagg 1500

gtcagagtga gggcacgcaa atga 1524

<210> 8

<211> 1389

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atggtcagcc atagggctgc caggaggaag agagccagcg tgaccgatct gtacaagacc 60

tgcaagcaga gcggcacctg cccccccgac gtggtgccca aagtcgaagg gacaaccctg 120

gccgacaaga tcctccagtg gagctctttg ggcatcttcc tcggcggctt ggggatcggc 180

accgggtccg gcaccggcgg caggaccggc tatatccccc tcgggggcag gagcaacacc 240

gtcgtcgacg tgggccccac caggcctccc gtcgtgatcg agcccgtcgg gcctaccgat 300

cccagcatcg tgaccctgat cgaagatagc tccgtcgtga ccagcggcgc cccccgcccc 360

accttcaccg ggaccagcgg cttcgacatc accagcgccg gcaccaccac ccccgccgtg 420

ctcgacatta cccccagcag cacaagcgtc agcatcagta ccacaaactt cacaaacccc 480

gccttcagcg accccagcat catcgaggtg ccccagaccg gcgaagtcgc cggcaacgtg 540

ttcgtgggca cacccaccag cggcacccac ggctacgaag agatccccct gcagaccttc 600

gccagcagcg gcaccggcga agagccaatc tcctccacac ccctccccac cgtcagaagg 660

gtggccggcc caaggttgta ttcccgcgct tatcagcaag tcagcgtcgc caatcccgaa 720

ttcctgacca ggcccagcag cctgatcacc tacgataacc ccgctttcga acccgtcgat 780

accaccctga ccttcgaccc caggtccgac gtgcccgaca gcgacttcat ggacatcatt 840

aggttgcacc gccccgccct gaccagccgc aggggcaccg tgaggttctc ccggctgggc 900

cagagagcca ccatgttcac aaggtctggc acccagatcg gcgcccgcgt gcatttctat 960

cacgacatct cccccatcgc ccccagcccc gagtacatcg agctccaacc cctcgtgagc 1020

gctaccgaag ataacgatct cttcgacatc tacgccgacg atatggatcc cgccgtcccc 1080

gtgcccagca ggagcaccac aagcttcgcc ttcttcaagt acagcccaac catcagcagc 1140

gctagcagtt actccaacgt gaccgtgccc ctgacaagta gctgggacgt ccccgtgtat 1200

accggccccg acatcaccct gcccagcacc acaagcgtgt ggccaatcgt gagcccaacc 1260

gctcccgcta gcacccaata catcggcatc cacggcaccc actactacct ctggcccctg 1320

tactacttca tccccaagaa gaggaagagg gtgccatact tcttcgccga cgggttcgtc 1380

gccgcttga 1389

Claims

1.一种广谱HPV疫苗，其特征在于，包含第一VLP和第二VLP，所述第一VLP由HPV16 L1蛋白和HPV16 L2蛋白包装而成，所述第二VLP由HPV18L1蛋白和HPV18 L2蛋白包装而成。

2.根据权利要求1所述的广谱HPV疫苗，其特征在于，所述HPV16 L1蛋白的序列如SEQID NO:1所示，所述HPV16 L2蛋白的序列如SEQ ID NO:2所示；所述HPV18 L1蛋白的序列如SEQ ID NO:5所示，所述HPV18 L2蛋白的序列如SEQ ID NO:6所示。

3.根据权利要求1或2所述的广谱HPV疫苗，其特征在于，还包含氢氧化铝佐剂，并且所述第一VLP与第二VLP的摩尔比为1:1。

4.权利要求1-3中任一项所述的广谱HPV疫苗的制备方法，其特征在于，包括在表达系统中分别表达所述第一VLP和第二VLP，并纯化所述第一VLP和第二VLP的步骤。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述表达系统为哺乳动物细胞表达系统。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述表达系统为293T细胞。

7.根据权利要求4-6中任一项所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S3：纯化所述第一VLP和第二VLP；

S4：将所述第一VLP与第二VLP混合，即得到所述HPV疫苗。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述第一VLP的表达框中，所述HPV16L1蛋白的基因编码序列如SEQ ID NO:3所示，所述HPV16L2蛋白的基因编码序列如SEQ IDNO:4所示；所述第二VLP的表达框中，所述HPV18 L1蛋白的基因编码序列如SEQ ID NO:7所示，所述HPV18 L2蛋白的基因编码序列如SEQ ID NO:8所示。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述第一VLP表达质粒通过将SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4所示序列插入到pcDNA3.1(WPRE)质粒的CMV启动子下游并使SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4所示序列共同转录分别翻译得到；所述第二VLP表达质粒通过将SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8所示序列插入到pcDNA3.1(WPRE)质粒的CMV启动子下游并使SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8所示序列共同转录分别翻译得到。