CN109374811A - 一种盐酸法舒地尔中5-异喹啉磺酸乙酯的检测方法 - Google Patents
一种盐酸法舒地尔中5-异喹啉磺酸乙酯的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于药物化学分析领域，具体地说，涉及一种盐酸法舒地尔中5‑异喹啉磺酸乙酯的检测方法。所述的方法为采用高效液相色谱‑质谱系统，分别将5‑异喹啉磺酸乙酯对照品溶液和盐酸法舒地尔供试品溶液进行检测。本发明的检测方法首先采用高效液相色谱法进行组分的分离，该色谱条件能够确定盐酸法舒地尔供试品溶液中5‑异喹啉磺酸乙酯色谱峰的位置，并将5‑异喹啉磺酸乙酯色谱峰与相邻的其他组分的色谱峰有效分离开来，且运行时间短；然后采用本发明的质谱条件进行三重四极杆质谱进行定量，其能够检测到ppm级别的5‑异喹啉磺酸乙酯，定量限可达ng/ml水平，因而能够对盐酸法舒地尔中的5‑异喹啉磺酸乙酯进行有效控制。
Description
技术领域
本发明属于药物化学分析领域，具体地说，涉及一种盐酸法舒地尔中5-异喹啉磺酸乙酯的检测方法。
背景技术
盐酸法舒地尔是一种新型异喹啉磺胺类衍生物，能够通过增加肌球蛋白轻链磷酸酶的活性扩张血管，降低内皮细胞的张力，改善脑组织微循环，保护缺血脑组织，同时可拮抗炎症因子，保护神经抗凋亡，促进神经再生。盐酸法舒地尔及其注射液于2004年在中国上市，主要用于蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛等引起的缺血性脑血管疾病症状的改善。
杂质控制是药品质量控制的重要内容之一，药品中的杂质是否能被全面准确地控制，直接关系到药品的质量的可控性与安全性。因此，规范地进行杂质研究，并将其控制在一个安全、合理的限度范围内，对药物的临床安全具有重要的意义。盐酸法舒地尔的合成路线会生成多种杂质，5-异喹啉磺酸乙酯是其中具有基因毒性作用的杂质，其可能在生产过程中传递到盐酸法舒地尔成品中，为保证产品的安全性和可靠性，需要对其进行相应的控制和检测。基因毒性杂质一般允许的含量限度很低，在ppm的水平，通常的检测方法难以达到检测限和定量限。目前，针对盐酸法舒地尔中杂质的检测通常是对一般物质的检测，尚未见针对5-异喹啉磺酸乙酯的检测。相关的技术中，申请人已开发了HPLC法测定盐酸法舒地尔中基因毒性杂质的方法(李开凤等，HPLC法测定盐酸法舒地尔中基因毒性杂质，海峡药学，2018年02期)，该方法采用高效液相色谱法，色谱柱：Thermo Scientific HypersilGOLS C8(4.6×150mm，3μm)，流动相：0.1％甲酸溶液-乙腈(98∶2)等度洗脱；检测波长：275nm，流速：0.9m L·min-1；进样量：20μL；柱温：30℃。该方法的定量浓度为0.337μg/ml，检测限浓度为0.084μg/ml，仍然较高，灵敏度不够，对盐酸法舒地尔中ppm水平的5-异喹啉磺酸甲酯不能有效检测。该方法不是针对5-异喹啉磺酸乙酯的检测方法，且运行时间较长，灵敏度不够。现有技术中也未见有关于5-异喹啉磺酸乙酯的检测方法的报道。
有鉴于此特提出本发明。
发明内容
现有的检测盐酸法舒地尔中5-异喹啉磺酸甲酯的方法，定量浓度为0.337μg/ml，检测限浓度为0.084μg/ml，对盐酸法舒地尔中ppm水平的5-异喹啉磺酸甲酯不能有效检测。该方法是针对5-异喹啉磺酸甲酯的检测，并未见针对5-异喹啉磺酸乙酯的检测。针对这一问题，本发明的目的是提供一种检测盐酸法舒地尔中5-异喹啉磺酸乙酯的方法，其运行时间非常短，灵敏度更高，定量浓度和检测限度均达到ppm水平，从而能够对盐酸法舒地尔中的5-异喹啉磺酸乙酯进行非常有效的控制。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种检测盐酸法舒地尔中5-异喹啉磺酸乙酯的方法，其中，所述的方法为采用高效液相色谱-质谱系统，分别将5-异喹啉磺酸乙酯对照品溶液和盐酸法舒地尔供试品溶液进行检测。
盐酸法舒地尔的合成路线会生成多种杂质，5-异喹啉磺酸乙酯是其中具有基因毒性作用的杂质，其可能在生产过程中传递到盐酸法舒地尔成品中，为保证产品的安全性和可靠性，需要对其进行相应的控制和检测。基因毒性杂质一般允许的含量限度很低，在ppm的水平，通常的检测方法难以达到检测限和定量限。
具体地说，所述的方法包括如下步骤：
1)取5-异喹啉磺酸乙酯的对照品，制备对照品溶液，用高效液相色谱-质谱系统进行检测，得到标准曲线；
2)取待检的盐酸法舒地尔样品，制备供试品溶液，用高效液相色谱-质谱系统进行检测；
3)计算供试品溶液中5-异喹啉磺酸乙酯的峰面积，代入标准曲线方程，计算盐酸法舒地尔中5-异喹啉磺酸乙酯的含量。
进一步的，所述的高效液相色谱-质谱系统中，高效液相色谱条件中采用梯度洗脱的方式；流动相为A：0.1％甲酸-水溶液，B：0.1％甲酸-乙腈。
优选，所述的梯度洗脱采用如下洗脱程序进行：
0.01min，流动相A相所占的体积比为98％，流动相B相所占的体积比为2％；
0.1min，流动相A相所占的体积比为98％，流动相B相所占的体积比为2％；
1.3min，流动相A相所占的体积比为2％，流动相B相所占的体积比为98％；
1.79min，流动相A相所占的体积比为2％，流动相B相所占的体积比为98％；
1.8min，流动相A相所占的体积比为98％，流动相B相所占的体积比为2％；
2.3min，流动相A相所占的体积比为98％，流动相B相所占的体积比为2％。
进一步的，所述的高效液相色谱-质谱系统中，质谱为三重四极杆质谱，质谱条件为：离子模式为ESI+；一级质谱离子Q1为m/z 238.2(母离子)；二级质谱离子Q3为m/z 210.2(定量离子)。
进一步的，所述的高效液相色谱-质谱系统中，质谱参数为：去簇电压DP为80V，雾化气50psi，加热气50psi，电喷雾电压5500V，帘气20psi，离子化温度550℃，碰撞能CE为24eV，其中，所涉及参数上下浮动50％，优选上下浮动10％，更优选上下浮动5％；最优选质谱参数为：去簇电压DP为80V，雾化气50psi，加热气50psi，电喷雾电压5500V，帘气20psi，离子化温度550℃，碰撞能CE为24eV。
进一步的，所述的盐酸法舒地尔供试品溶液的浓度可以为0.01-2mg/ml，优选为0.05-1.5mg/ml，更优选为0.1-1.0mg/ml，再优选为0.4-0.6mg/ml，最优选为0.5mg/ml。
进一步的，制备盐酸法舒地尔供试品溶液的溶剂为水-乙腈，其中水和乙腈的体积比为3：7。
制备盐酸法舒地尔供试品溶液采用体积比为3：7的水-乙腈作为溶剂，能够有效溶解盐酸法舒地尔，溶剂在5-异喹啉磺酸乙酯的保留时间处没有干扰，且5-异喹啉磺酸乙酯的信噪比大于10。
进一步的，5-异喹啉磺酸乙酯对照品溶液的浓度为0.1-50ng/ml，优选为1-20ng/ml，更优选为5-10ng/ml，再优选为7.5ng/ml。
进一步的，所述的5-异喹啉磺酸乙酯对照品溶液的溶剂为水-乙腈，其中水和乙腈的体积比为3：7。
进一步的，其中，所述的高效液相色谱-质谱系统中，高效液相色谱条件中所用的色谱柱为反相色谱柱，优选为辛烷基硅烷键合硅胶，更优选为Diamonsil C8，长度为150mm，内径为4.6mm，填充剂粒径为3μm。
进一步的，所述的高效液相色谱-质谱系统中，高效液相色谱条件中流速为0.9ml/min，进样体积为10μl，运行时间为2.3min。
采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
本发明的检测方法首先采用高效液相色谱法进行组分的分离，该色谱条件能够确定盐酸法舒地尔供试品溶液中5-异喹啉磺酸乙酯色谱峰的位置，并将5-异喹啉磺酸乙酯色谱峰与相邻的其他组分的色谱峰有效分离开来，且运行时间短；然后采用本发明的质谱条件进行三重四极杆质谱进行定量，其能够检测到ppm级别的5-异喹啉磺酸乙酯，定量限可达ng/ml水平，因而能够对盐酸法舒地尔中的5-异喹啉磺酸乙酯进行有效控制。
本发明的方法稳定可靠，且耗时短，专属性好，检测灵敏度高，5-异喹啉磺酸乙酯的检测限浓度可达0.1538ng/ml，能够更好地控制盐酸法舒地尔中的基因毒性成分5-异喹啉磺酸乙酯，从而利于药物的安全性控制。
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。
附图说明
图1是本发明实施例1中空白溶剂色谱图；
图2是本发明实施例1中专属性溶液色谱图；
图3是本发明实施例1中对照品溶液色谱图；
图4是本发明实施例2中样品201201-01供试品溶液色谱图；
图5是本发明实施例2中样品201201-03供试品溶液色谱图。
需要说明的是，这些附图和文字描述并不旨在以任何方式限制本发明的构思范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本发明的概念。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
一、仪器与材料
1.主要仪器
质谱仪：AB SCIEX公司，型号API 4000。
液相色谱仪：Shimadzu公司，型号LC20AD。
电子天平：METTLER公司，XP205型。
2.实验材料
5-异喹啉磺酸乙酯对照品：昆药集团股份有限公司提供，纯度97.62％。
盐酸法舒地尔原料药：昆药集团股份有限公司，批号为201201-01。
二、实验方法
1.溶液配制
1.1 0.1％甲酸-水溶液：精密移取1ml甲酸至1000ml水中，混匀。
1.2稀释剂：量取300ml水与700ml乙腈，混匀。
1.3对照品储备液(50ng/ml)：取5-异喹啉磺酸乙酯对照品约2mg，精密称定，置200ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀；精密移取1.0ml，置200ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。
1.4对照品溶液(7.5ng/ml)：精密移取3.0ml对照品储备液，置20ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
1.5灵敏度溶液(0.5ng/ml)：精密移取1.0ml对照品储备液，置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为灵敏度溶液。
1.6配制专属性溶液：取盐酸法舒地尔供试品约10mg，精密称定，置20ml量瓶中，精密加入3.0ml对照品储备液，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为专属性溶液。
1.7供试品溶液(0.5mg/ml)：取盐酸法舒地尔原料药10mg，精密称定，置20ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
2.方法参数
方法参数见表1。
表1
3.系统适用性试验
3.1取空白溶剂(稀释剂)注入液相色谱仪，记录色谱图(见图1)。空白溶剂在5-异喹啉磺酸乙酯的保留时间处没有干扰。
3.2取专属性溶液注入液相色谱仪，记录色谱图(见图2)。5-异喹啉磺酸乙酯的信噪比大于10。
3.3取对照品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图(见图3)。连续5针对照品溶液中5-异喹啉磺酸乙酯峰面积的RSD为5.1％，见表2。
表2、系统适用性试验结果－对照品溶液
结论：系统适用性满足要求，本方法的专属性良好。
4.线性范围
线性储备液(50ng/ml)：取对照品储备液作为线性储备液。
照表3制备线性测试液，注入色谱仪，记录色谱图，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归分析，得到线性回归方程，得出线性相关系数r及斜率，具体结果见表4。
表3、线性测试溶液制备
| 水平 | 浓度(ng/ml) | 线性储备液(ml) | 终体积(ml) |
| L1(2ppm) | 1 | 1 | 50 |
| L2(5ppm) | 2.5 | 1 | 20 |
| L3(10ppm) | 5 | 2 | 20 |
| L4(15ppm) | 7.5 | 3 | 20 |
| L5(20ppm) | 10 | 2 | 10 |
表4、5-异喹啉磺酸乙酯线性结果
结果显示：5-异喹啉磺酸乙酯在1.03ng/ml～10.25ng/ml浓度范围内的线性方程为y＝10660x-73400，相关系数r为0.9950，斜率为10660。
结论：5-异喹啉磺酸乙酯在1.03ng/ml～10.25ng/ml浓度范围内线性关系良好。
5.定量限与检测限
定量限溶液：取4项下的2ppm的线性溶液作为定量限溶液，精密移取5.0ml置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为定量限溶液。
检测限溶液：精密移取3.0ml定量限溶液置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为检测限溶液。
取上述溶液注入液相色谱-质谱仪，记录色谱图。结果见表5。
表5、5-异喹啉磺酸乙酯定量限和检测限结果
结果显示：5-异喹啉磺酸乙酯的定量限浓度为0.5127ng/ml，浓度水平为1ppm，连续6针溶液峰面积的RSD为3.1％，信噪比均大于10；5-异喹啉磺酸乙酯的检测限浓度为0.1538ng/ml，浓度水平为0.3ppm，信噪比为6.7。
结论：表明本方法的检测灵敏度可以满足要求。
6.准确度与精密度
配制准确度供试品溶液(5ppm)：取盐酸法舒地尔供试品约10mg，精密称定，置20ml量瓶中，精密加入1.0ml对照品储备液，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为准确度供试品溶液，平行配制6份。
将供试品溶液、对照品溶液、准确度供试品溶液注入液相色谱-质谱仪，记录色谱图，并计算回收率。结果见表6。
表6、盐酸法舒地尔基因毒性杂质5-异喹啉磺酸乙酯准确度&精密度结果
结果显示：6份加标样品中5-异喹啉磺酸乙酯的回收率在89.9％～101.5％范围内；平均回收率为95.4％，RSD为4.4％。
结论：表明该方法的准确度和精密度良好。
7.溶液稳定性
取对照品溶液和专属性溶液，在0天进行检测，按照方法计算专属性溶液中5-异喹啉磺酸乙酯的含量。将对照品溶液与专属性溶液分装成两份，一份储存于室温下，另一份储存于4℃下，于1天后进样检测，并按照当天新配制的对照溶液计算对照品溶液的浓度及专属性溶液中5-异喹啉磺酸乙酯的含量。与0天数据进行对比，计算相对偏差，结果见下表7。
表7、溶液稳定性试验结果
结果显示：对照品溶液在室温与4℃条件下保存1天，与0天数据相比5-异喹啉磺酸乙酯浓度的相对偏差小于10％。专属性溶液在室温与4℃条件下保存1天，与0天数据相比5-异喹啉磺酸乙酯含量的相对偏差小于10％。
结论：对照品溶液与样品溶液在室温与4℃条件下1天内稳定。
实施例2、采用本发明方法对盐酸法舒地尔进行质量分析
盐酸法舒地尔原料药来自昆药集团股份有限公司，共3个批次，批号分别为201201-01、201201-02、201201-03。
供试品溶液(0.5mg/ml)的制备：取盐酸法舒地尔原料药10mg，精密称定，置20ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
取上述供试品溶液注入高效液相色谱连用三重四级杆质谱仪，记录色谱图(201201-01批次的图谱见图4，201201-02批次的图谱与图4相似，201201-03批次的图谱见图5)，按照4项下线性方程计算供试品中基因毒性杂质5-异喹啉磺酸乙酯的含量。结果见表8。
表8、盐酸法舒地尔基因毒性杂质5-异喹啉磺酸乙酯测定结果
| 样品批号 | 含量 |
| 201201-01 | 未检出 |
| 201201-02 | 未检出 |
| 201201-03 | 0.8ppm |
结果显示：3批样品中，5-异喹啉磺酸乙酯的含量均小于15ppm。
实施例3
该实施例同实施例1，所不同的是盐酸法舒地尔供试品溶液的浓度为0.4mg/ml，5-异喹啉磺酸乙酯对照品溶液的浓度为0.1ng/ml。
实施例4
该实施例同实施例1，所不同的是盐酸法舒地尔供试品溶液的浓度为0.6mg/ml，5-异喹啉磺酸乙酯对照品溶液的浓度为50ng/ml。
实施例5
该实施例同实施例1，所不同的是盐酸法舒地尔供试品溶液的浓度为0.1mg/ml，5-异喹啉磺酸乙酯对照品溶液的浓度为1ng/ml。
实施例6
该实施例同实施例1，所不同的是盐酸法舒地尔供试品溶液的浓度为1.0mg/ml，5-异喹啉磺酸乙酯对照品溶液的浓度为20ng/ml。
实施例7
该实施例同实施例1，所不同的是盐酸法舒地尔供试品溶液的浓度为0.05mg/ml，5-异喹啉磺酸乙酯对照品溶液的浓度为5ng/ml。
实施例8
该实施例同实施例1，所不同的是盐酸法舒地尔供试品溶液的浓度为1.5mg/ml，5-异喹啉磺酸乙酯对照品溶液的浓度为10ng/ml。
实施例9
该实施例同实施例1，所不同的是盐酸法舒地尔供试品溶液的浓度为0.01mg/ml，5-异喹啉磺酸乙酯对照品溶液的浓度为7.5ng/ml。
实施例10
该实施例同实施例1，所不同的是盐酸法舒地尔供试品溶液的浓度为2mg/ml。
实施例11
该实施例同实施例1，所不同的是质谱参数为：去簇电压DP为120V，雾化气75psi，加热气75psi，电喷雾电压8250V，帘气30psi，离子化温度825℃，碰撞能CE为36eV。
实施例12
该实施例同实施例1，所不同的是质谱参数为：去簇电压DP为40V，雾化气25psi，加热气25psi，电喷雾电压2750V，帘气10psi，离子化温度275℃，碰撞能CE为12eV。
实施例13
该实施例同实施例1，所不同的是质谱参数为：去簇电压DP为80V，雾化气45psi，加热气45psi，电喷雾电压5125V，帘气25psi，离子化温度500℃，碰撞能CE为30eV。
通过对本发明方法的专属性、系统适用性、线性范围、定量限、检测限、准确度，精密度及溶液稳定性的方法学研究，表明本发明方法适用于盐酸法舒地尔基因毒性杂质5-异喹啉磺酸乙酯的检测，方法稳定可靠，检测时间短，灵敏度高。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本发明的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许变动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。
Claims (10)
1.一种检测盐酸法舒地尔中5-异喹啉磺酸乙酯的方法，其特征在于，所述的方法为采用高效液相色谱-质谱系统，分别将5-异喹啉磺酸乙酯对照品溶液和盐酸法舒地尔供试品溶液进行检测。
2.根据权利要求1所述的检测盐酸法舒地尔中5-异喹啉磺酸乙酯的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
1)取5-异喹啉磺酸乙酯的对照品，制备对照品溶液，用高效液相色谱-质谱系统进行检测，得到标准曲线；
2)取待检的盐酸法舒地尔样品，制备供试品溶液，用高效液相色谱-质谱系统进行检测；
3)计算供试品溶液中5-异喹啉磺酸乙酯的峰面积，代入标准曲线方程，计算盐酸法舒地尔中5-异喹啉磺酸乙酯的含量。
3.根据权利要求2所述的检测盐酸法舒地尔中5-异喹啉磺酸乙酯的方法，其特征在于，所述的高效液相色谱-质谱系统中，高效液相色谱条件中采用梯度洗脱的方式；流动相为A：0.1％甲酸-水溶液，B：0.1％甲酸-乙腈；
优选，所述的梯度洗脱采用如下洗脱程序进行：
0.01min，流动相A相所占的体积比为98％，流动相B相所占的体积比为2％；
0.1min，流动相A相所占的体积比为98％，流动相B相所占的体积比为2％；
1.3min，流动相A相所占的体积比为2％，流动相B相所占的体积比为98％；
1.79min，流动相A相所占的体积比为2％，流动相B相所占的体积比为98％；
1.8min，流动相A相所占的体积比为98％，流动相B相所占的体积比为2％；
2.3min，流动相A相所占的体积比为98％，流动相B相所占的体积比为2％。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的检测盐酸法舒地尔中5-异喹啉磺酸乙酯的方法，其特征在于，所述的高效液相色谱-质谱系统中，质谱为三重四极杆质谱，质谱条件为：离子模式为ESI+；一级质谱离子Q1为母离子m/z 238.2；二级质谱离子Q3为定量离子m/z 210.2。
5.根据权利要求4所述的检测盐酸法舒地尔中5-异喹啉磺酸乙酯的方法，其特征在于，所述的高效液相色谱-质谱系统中，质谱参数为：去簇电压DP为80V，雾化气50psi，加热气50psi，电喷雾电压5500V，帘气20psi，离子化温度550℃，碰撞能CE为24eV，其中，所涉及参数上下浮动50％，优选上下浮动10％，更优选上下浮动5％；最优选质谱参数为：去簇电压DP为80V，雾化气50psi，加热气50psi，电喷雾电压5500V，帘气20psi，离子化温度550℃，碰撞能CE为24eV。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的检测盐酸法舒地尔中5-异喹啉磺酸乙酯的方法，其特征在于，所述的盐酸法舒地尔供试品溶液的浓度为0.01-2mg/ml，优选为0.05-1.5mg/ml，更优选为0.1-1.0mg/ml，再优选为0.4-0.6mg/ml，最优选为0.5mg/ml。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的检测盐酸法舒地尔中5-异喹啉磺酸乙酯的方法，其特征在于，制备盐酸法舒地尔供试品溶液的溶剂为水-乙腈，其中水和乙腈的体积比为3：7。
8.根据权利要求1-7任意一项所述的检测盐酸法舒地尔中5-异喹啉磺酸乙酯的方法，其特征在于，5-异喹啉磺酸乙酯对照品溶液的浓度为0.1-50ng/ml，优选为1-20ng/ml，更优选为5-10ng/ml，再优选为7.5ng/ml。
9.根据权利要求8所述的检测盐酸法舒地尔中5-异喹啉磺酸乙酯的方法，其特征在于，所述的5-异喹啉磺酸乙酯对照品溶液的溶剂为水-乙腈，其中水和乙腈的体积比为3：7。
10.根据权利要求1-9任意一项所述的检测盐酸法舒地尔中5-异喹啉磺酸乙酯的方法，其特征在于，所述的高效液相色谱-质谱系统中，高效液相色谱条件中所用的色谱柱为反相色谱柱，优选为辛烷基硅烷键合硅胶，更优选为Diamonsil C8，长度为50mm，内径为4.6mm，填充剂粒径为5μm。
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