CN109355425A - 一种与小麦赤霉病抗性qtl连锁的分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与小麦赤霉病抗性QTL连锁的分子标记及其应用，该分子标记是以小麦品种苏麦3号的DNA为模板，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对PCR扩增后电泳，获得的大小为500bp的DNA片段；该分子标记可以应用于小麦赤霉病抗性材料的筛选及分子标记辅助选择育种，即通过检测小麦中是否存在该分子标记，可以判断小麦对赤霉病的抗性，其扩增效率较高，扩增结果特异性好，可缩短育种时间，宜于推广应用。
Description
技术领域
本发明属于小麦遗传育种和分子生物学领域，特别是一种与小麦赤霉病抗性QTL连锁的分子标记及其应用。
背景技术
赤霉病是世界范围内的小麦主要病害之一，严重影响小麦的产量和品质。小麦赤霉病在我国长江中下游冬麦区和东北春小麦区大面积发生，一般流行年份可引起5-10％的产量损失，大流行年份可导致部分田块绝收。近年来随着耕作模式改变和气候变化，小麦赤霉病已经向我国其他的小麦主产区蔓延。此外，病麦粒携带的真菌毒素影响种子质量，危害人和动物的健康，成为威胁粮食安全的隐患之一。利用赤霉病抗性基因进行品种改良是减轻小麦赤霉病危害的根本途径。
小麦赤霉病的抗性是由少数主效基因加众多微效基因控制的复杂的数量性状。已从普通小麦或近缘种中定位了超过100个与赤霉病抗侵染、抗扩展或DON毒素抗性相关的QTL。在独立实验中重现性较好的主效QTL有：位于3B染色体短臂上的抗扩展位点Fhb1、位于6BS短臂上的抗扩展位点Fhb2、和位于5A染色体短臂上的抗侵染位点Qfhs.ifa-5A。Waldron等利用“苏麦3号×Stoa”重组自交系首次将一个抗扩展的主效QTL定位于3BS上。Liu等开发了27个STS标记用于加密QFhs-3BS，通过筛选和鉴定重组子的方法将其精细定位到1.2cM的区间内，并命名为Fhb1。另外，Cuthbert等利用苏麦3号衍生品系构建的重组自交系群体对6BS上的抗性QTL进行了精细定位，定位在Xgwm133-Xgwm644之间，标记之间的遗传距离约为4cM。在苏麦3号的衍生系CM82036和望水白的5A染色体短臂的近着丝粒附近都检测到一个与抗赤霉病侵染相关的QTL(Qfhs.ifa-5A),可以解释超过20％的表型变异。利用Nanda2419×望水白的重组自交系，抗侵染位点被精细定位在遗传距离为0.3cM的Xwmc415-Xgwm304之间。Buerstmayr利用苏麦3号的衍生系“CM-82036”将其定位在遗传距离为23.9cM的Xgwm293-Xgwm156标记之间。
“苏麦3号”是公认的优质的赤霉病抗源，通过分子标记辅助选择已将Fhb1和Qfhs.ifa-5A导入不同的小麦品种中，形成新的品种或品系的赤霉病抗性均有不同程度的提高。目前，关于小麦2B染色体长臂上的QTL位点“QFHB.2BL”连锁的分子标记目前尚未见报道。
发明内容
针对上述问题，本发明通过全基因组关联分析和物理位置比对获得了一个新的小麦赤霉病抗性QTL位点“QFHB.2BL”，并根据该位点开发一个新的分子标记JAAS52433R1，通过检测小麦植株中是否含有该小麦赤霉病抗性QTL位点“QFHB.2BL”紧密连锁的分子标记，判断小麦植株的赤霉病抗性，筛选小麦抗赤霉病材料，加快抗赤霉病育种进程。
具体而言，本发明是这样实现的：
本发明首先提供了一种与小麦赤霉病抗性QTL连锁的分子标记，该分子标记是以苏麦3号的DNA为模板，以核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列为引物进行PCR扩增，扩增产物在质量百分数为1％的琼脂糖凝胶上电泳后，获得的大小为500bp的DNA片段；该分子标记与一个新的小麦赤霉病抗性QTL位点“QFHB.2BL”紧密连锁，申请人将该分子标记自命名为JAAS52433R1。
其次，本发明还提供了上述分子标记在预测小麦赤霉病的抗性中的应用，其具体步骤如下：以样品小麦DNA为模板，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为引物进行PCR扩增，扩增产物在质量百分数为1％的琼脂糖凝胶上电泳后，若存在大小为500bp的DNA片段(即JAAS52433R1)，则预测该样品小麦对赤霉病的抗性至少达到中抗水平。
本发明中，是按照中华人民共和国农业行业标准NY/T2954-2016《小麦区域实验品种抗赤霉病鉴定技术规程》进行小麦赤霉病抗性检测的，所述“对赤霉病达到中抗水平”是指小麦品种对赤霉病抗性达到中抗或抗水平，其平均严重度小于3。
第三，本发明还提供了一对用于预测小麦对赤霉病抗性的引物对，该引物对的核苷酸序列分别如NO.1和SEQ ID NO.2所示。
第四，本发明还提供了上述引物对在预测小麦赤霉病的抗性中的应用，其具体步骤如下：以样品小麦DNA为模板，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为引物进行PCR扩增，扩增产物在质量百分数为1％的琼脂糖凝胶上电泳后，若存在大小为500bp的条带，则预测该样品小麦对赤霉病的抗性至少达到中抗水平。
第五，本发明还提供了一种预测小麦赤霉病抗性的方法，其具体步骤为：以样品小麦DNA为模板，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为引物进行PCR扩增后电泳，若存在大小为500bp的DNA片段，则预测该样品小麦对赤霉病的抗性至少达到中抗水平。
上述PCR反应体系：10×buffer 1μl，浓度为25mM的MgCl20.5μl,浓度为2.5mM的dNTP0.5μl，浓度为10μM的引物SEQ ID NO.10.1μl，浓度为10μM的引物SEQ ID NO.2 0.1μl，浓度为5U/μl的Taq聚合酶0.2μl，模板DNA 50ng，ddH2O补足至10μl；
PCR反应程序：94℃ 3分钟；94℃ 15秒，54.5℃ 30秒，72℃ 30秒延伸，30个循环；72℃延伸5分钟。
本发明的有益效果：在小麦抗赤霉病育种中，在早期世代即可以通过本分子标记的检测结果对小麦的赤霉病抗性进行选择，加快育种进程。本发明中的分子标记引物对通过人工比对和校正而获得，人工比对保证了扩增序列的特异性，人为调整引物末端位置锚定变异位点保证了扩增产物的准确性，所获得引物对扩增效率较高，扩增结果特异性好，结果判定准确有效。
附图说明
图1为软件设计分子标记P1和P2引物对在抗感品种中的扩增结果；
其中，M：分子量标准DL2000,1-8泳道分别为小麦品种宁麦9号、宁麦13号、望水白、苏麦3号、济麦22、安农8455、淮麦18和小偃54。
图2为分子标记JAAS52433R1的引物对在抗感品种中的扩增结果；
其中，M：分子量标准DL2000,1-8泳道分别为小麦品种宁麦9号、宁麦13号、望水白、苏麦3号、济麦22、安农8455、淮麦18和小偃54。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例涉及的核苷酸序列：
SEQ ID NO.1：GTCTTCCCTAAGCGACGGTATCAT；
SEQ ID NO.2：GAAACAGGTCAAGATGATGAAAAGAT；
SEQ ID NO.3:GAAACAGGTCAAGATGATGAAAAGTT；
SEQ ID NO.4:ATCCTGGAGATGTGATGTGTGTTGA；
SEQ ID NO.5:CTTCTTGAAGATTTGGATGATCGT；
SEQ ID NO.6:GCCCTCTAATGACAAGACTGCTAAA。
实施例涉及的材料来源：
以下实施例涉及的苏麦3号等小麦品种或品系(表1)：由江苏省农业科学院农业生物技术研究所小麦研究室保藏；
赤霉菌：为亚洲镰刀菌Fa0609，由江苏省农业科学院粮食作物研究所麦类作物研究室保藏。
实施例1分子标记JAAS52433R1在抗感品种中的验证
本实施例里PCR扩增的DNA模板为：宁麦9号、宁麦13号、望水白和苏麦3号，这些小麦品种平均严重度分别为2.25、2.53、0.96和1.33，是对赤霉病达到中抗或中抗以上的小麦品种；济麦22、安农8455、淮麦18和小偃54平均病小穗率分别为8.41、8.14、7.44和7.94，为感病品种。利用CTAB法提取小麦叶片基因组DNA，并采用微量分光光度计Nanodrop对基因组DNA进行定量。
通过软件Primer Premier5.0对变异位点进行分子标记引物设计时，引物设计软件无法进行序列比对和校正，无法对变异位点进行锚定，也无法调整引物末端碱基种类。采用软件设计的引物对P1(其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示)和P2((其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示)以上述抗感品种为模板进行PCR扩增：
PCR反应体系为10μl：10×buffer 1μl，MgCl2(25mM)0.5μl,dNTP(2.5mM)0.5μl，引物SEQ ID NO.1(10μM)0.1μl，SEQ ID NO.3引物(10uM)0.1μl，Taq聚合酶(5U/μl)0.2μl，模板DNA 50ng，ddH2O补足至10μl；
PCR反应程序：94℃ 3分钟；94℃ 15秒，54.5℃ 30秒，72℃ 30秒延伸，30个循环；72℃延伸5分钟；
扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果如图1所示，引物对P1和P2扩增产物中含有非特异性扩增条带，扩增结果不能对抗感品种进行有效鉴定。
申请人在此基础上，在对变异位点序列进行人工比对和校正的基础上，人为调整引物对末端的锚定位置和调整末端碱基种类，并对SEQ ID NO.3序列第25碱基进行人为改变，由“T”变为“A”，进而获得分子标记JAAS52433R1引物对(SEQ ID NO.1和SEQ ID.2)，再次以上述品种基因组DNA为模板，利用分子标记JAAS52433R1的引物对SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2进行PCR扩增：
上述PCR反应体系为10μl体系，适合高通量样本的筛选：10×buffer 1μl，MgCl2(25mM)0.5μl,dNTP(2.5mM)0.5μl，引物SEQ ID NO.1(10μM)0.1μl，SEQ ID NO.2引物(10uM)0.1μl，Taq聚合酶(5U/μl)0.2μl，模板DNA 50ng，ddH2O补足至10μl。
PCR反应程序：94℃ 3分钟；94℃ 15秒，54.5℃ 30秒，72℃ 30秒延伸，30个循环；72℃延伸5分钟；
扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统记录结果。检测结果如图2所示，含有分子标记JAAS52433R1特异性扩增产物条带(500bp)的有宁麦9号、宁麦13号、望水白和苏麦3号，不含有特异性扩增产物条带(500bp)的有济麦22、安农8455、淮麦18和小偃54。以上结果可以推定：宁麦9号、宁麦13号、望水白和苏麦3号对赤霉病的抗性为：至少达到中抗水平；济麦22、安农8455、淮麦18和小偃54为感赤霉病品种。
以上结果表明：通过分子标记推定的抗性结果与实际抗性水平相符，可以通过检测小麦品种中是否含有分子标记JAAS52433R1特异性条带，来判断其对赤霉病的抗性，检测结果正确有效。
实施例2利用分子标记JAAS52433R1筛选抗赤霉病病小麦材料
供试品种(系)为小麦品种“宁麦”系列：宁麦3号、宁麦6号、宁麦7号、宁麦8号、宁麦9号、宁麦10号、宁麦11号、宁麦12号、宁麦13号、宁麦14号、宁麦15号、宁麦16号、宁麦18号和宁麦20号，由江苏省农业科学院粮食作物研究所育成，为商业化的小麦品种；小麦品系有：宁0076、宁0149、宁0311、宁0320、宁0331、宁05450、宁05-51、宁0588、宁06-174、宁0668、宁0670、宁07169、宁0798、宁07-F307、宁61799、宁7840、宁8940、宁894013、宁894037、宁9-11、宁9181和宁9大78。
以实施例1中建立的分子标记JAAS52433R1的检测方法，对上述小麦品种(系)进行检测，标记检测结果记为“有”或“无”。
田间抗性鉴定采用单花滴注法：培养强致病力小麦赤霉病菌F0609分生孢子液(5×105个分生孢子/ml)，将分生孢子液滴注到扬花初期麦穗中部的1个小花中，每品种10穗，塑料袋套袋保湿3天后，每天喷水雾3-4次，每次5分钟左右，以达到保湿效果。接种后21天调查接种麦穗的严重度，并计算平均严重度，平均严重度小于2的小麦品种判定为“中抗”，平均严重度大于等于2且小于3的小麦品种判定为“中抗”；平均严重度大于等于3的小麦品种，判定为“感”，即中感或高感赤霉病小麦品种(农业行业标准NY/T2954-2016)。
标记检测及判定结果和田间鉴定及判定结果如表1所示：
表1利用分子标记JAAS52433R1筛选抗赤霉病小麦品种(系)
由表1可见，利用分子标记JAAS52433R1判定结果与田间鉴定结果一致，证明该分子标记可以进行小麦赤霉病抗性的筛选。
序列表
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种与小麦赤霉病抗性QTL连锁的分子标记及其应用
<141> 2018-12-12
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gccctctaat gacaagactg ctaaa 25
Claims (6)
1.一种与小麦赤霉病抗性QTL连锁的分子标记，该分子标记是以苏麦3号的DNA为模板，以核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列为引物进行PCR扩增，扩增产物在质量百分数为1%的琼脂糖凝胶上电泳后，获得的大小为500bp的DNA片段。
2.如权利要求1所述与小麦赤霉病抗性QTL连锁的分子标记在预测小麦赤霉病抗性中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，具体步骤如下：以样品小麦DNA为模板，SEQID NO.1和SEQ ID NO.2为引物进行PCR扩增后电泳，若存在大小为500bp的DNA片段，则预测该样品小麦对赤霉病的抗性至少达到中抗水平。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，PCR扩增体系：10× buffer 1µl，浓度为25mM的MgCl2 0.5 µl, 浓度为2.5mM的dNTP0.5 µl，浓度为10µM的引物SEQ ID NO.1 0.1 µl，浓度为10µM的引物SEQ ID NO.2 0.1 µl，浓度为5U/µl的Taq聚合酶 0.2 µl，模板 DNA50 ng，ddH2O补足至 10 µl；
PCR扩增程序：94˚C 3分钟；94˚C 15秒，54.5˚C 30秒，72˚C 30秒延伸，30个循环；72˚C延伸5分钟。
5.一对用于预测小麦对赤霉病抗性的引物对，所述引物对的核苷酸序列分别如NO.1和SEQ ID NO.2所示。
6.一种小麦对赤霉病抗性的预测方法，其特征在于，具体步骤如下：以样品小麦DNA为模板，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为引物进行PCR扩增后电泳，若存在大小为500bp的DNA片段，则预测该样品小麦对赤霉病的抗性至少达到中抗水平。
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