CN109355365A - 一种小rna高通量测序检测微生物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新的通过RNA捕获‑小RNA高通量测序(RNA capture and sRNA‑seq，RC&sRNA‑seq)检测病毒、细菌和真菌等微生物的方法。该方法可以一次性检测样品中几千种微生物，并可以达到极高的灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体提出了一种基于小RNA高通量测序(small RNAsequencing，sRNA-seq)检测病毒、细菌和真菌等微生物的方法。根据本发明的方法可以一次性检测样本中几千种微生物，并可以达到极高的灵敏度。这种方法由南开大学高山和中国农科院陈泽等在国际上首次提出，并命名为RNA捕获-小RNA高通量测序(RNA captureand sRNA-seq，RC&sRNA-seq)。
背景技术
基于高通量测序检测微生物的方法具有灵敏度高、覆盖种类多和能够检测新病毒等优势，已成为微生物检测领域的一类重要方法。小RNA(small RNA，sRNA)是长度在200nt以下的RNA分子的总称，小RNA高通量测序是高通量测序的一种。2013年，南开大学高山等在国际微生物大会(WCM 2013)上首次提出小RNA高通量测序可以用于临床病毒检测，并通过大数据挖掘检测到六类严重危害人类健康的病毒，分别是人乳头状瘤病毒(HPV)、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、艾滋病病毒(HIV)、松鼠猴病毒(SMRV)和EB病毒(EBV)。但是，由于哺乳动物(特别是人类等高级哺乳动物)生命系统的复杂性，常规的小RNA高通量测序检测的信噪比(病毒序列与宿主序列比例)一直难以提高。直到2016年，南开大学高山和中国农科院陈泽等通过开发新的RNA捕获-小RNA高通量测序的方法，将病毒检测信噪比大大提高，并推广到可以检测细菌和真菌，为这一方法的广泛应用奠定了基础。
发明内容
本发明提供了一种通过RNA捕获-小RNA测序(RNA capture and sRNA-seq，RC&sRNA-seq)检测微生物的方法。所述方法包括以下步骤：
(1)提取生物样品中的总RNA，通过酶切或物理打断得到片段化的RNA；
(2)将步骤(1)中所述片段化的RNA与带有标记物(如生物素Biotin)的DNA探针进行杂交，得到经标记的RNA-DNA杂交产物；
(3)将步骤(2)中所述经标记的RNA-DNA杂交产物与表面带有与所述标记物特异性结合的配体(如链霉亲和素Streptavidin，SAV)的磁珠混合，使磁珠吸附所述经标记的RNA-DNA杂交产物，洗脱除去未杂交的DNA探针与污染物；
(4)加热使磁珠上的RNA-DNA杂交产物变性，洗脱回收RNA，向回收物中加入DNA酶降解DNA片段；
(5)将接头连接到步骤(4)中回收的RNA的3′端，得到带有3′端接头的RNA；
(6)将步骤(5)中所述带有3′端接头的RNA与反转录引物退火杂交，得到RNA-引物杂交产物；
(7)将5′端接头连接到步骤(6)得到的所述RNA-引物杂交产物的RNA的5′端，得到带5′端接头的RNA-引物杂交产物；
(8)以步骤(7)中所述带5′端接头的RNA-引物杂交产物中RNA片段为模板进行反转录PCR，得到扩增的cDNA片段，选择长度在130-200bp范围内的cDNA片段进行测序，测序长度在50bp以上；
(9)去除步骤(8)中测序获得的序列(即原始读段)3′端的测序接头，再去除15bp长度以下的序列，得到清理后的序列；
(10)使用bowtie或BWA软件，将清理后的序列与目标微生物基因组序列进行比对，将与所述目标微生物基因组序列的比对区域相比存在至多1个碱基不同的所述清理后的序列确定为目标小RNA序列；对目标小RNA序列进行计数，将5′端或3′端比对到所述目标微生物基因组序列中相同位置的所有目标小RNA序列计数为一次；如果样品中目标小RNA序列计数值超过指定阈值，则将该样品中该目标微生物的检测结果确定为阳性。
优选地，其中步骤(8)中扩增cDNA片段所用的引物为Illumina公司的PCR引物。
优选地，所述目标小RNA序列与所述目标微生物基因组序列的比对区域完全相同。
优选地，所述微生物包括病毒、细菌和真菌。
优选地，所述DNA探针的序列为来自病毒、细菌和/或真菌基因的特异序列；优选地，所述特异序列的长度范围为21到50个核苷酸。
优选地，所述DNA探针的序列与步骤(10)中所述目标微生物基因组序列来源的微生物种类相同。
优选地，当所述目标微生物为病毒时，其指定阈值为100；当所述目标微生物为细菌和真菌时，其指定阈值为1000。
在某些优选实施方案中，所述生物样品为来源于动物(例如人)的血液、唾液、尿液、粪便、各种组织和/或细胞系；更优选地，为血液或患病组织。
在某些优选实施方案中，所述病毒包括人乳头状瘤病毒(HPV)、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、艾滋病病毒(HIV)、松鼠猴病毒(SMRV)、EB病毒(EBV)和严重急性呼吸道综合症冠状病毒(SARS-CoV)；优选地，所述细菌为布鲁氏菌；优选地，所述真菌为烟曲霉菌。
在某些优选实施方案中，所述特异序列包括病毒特异序列、细菌特异序列或真菌特异序列；优选地，所述病毒特异序列包括人乳头状瘤病毒(HPV)特异序列、乙肝病毒(HBV)特异序列、丙肝病毒(HCV)特异序列、艾滋病病毒(HIV)特异序列、松鼠猴病毒(SMRV)特异序列、EB病毒(EBV)特异序列和严重急性呼吸道综合症冠状病毒(SARS-CoV)特异序列；优选地，所述细菌特异序列为布鲁氏菌特异序列；优选地，所述真菌特异序列为烟曲霉菌特异序列。
发明的有益效果
本发明提供的通过RNA捕获-小RNA高通量测序检测微生物的方法可以一次性检测样品中几千种微生物；且与常规的通过小RNA高通量测序(不经过RNA捕获)检测微生物的方法相比，可以提高病毒、细菌和真菌检测的信噪比，从而具有更高的灵敏度。
附图说明
图1为本发明的小RNA高通量测序检测微生物的方法的流程图。
具体实施方式
实施例1
根据来自HPV-18病毒基因组参考序列(GenBank数据库索引为M20325.1)的2个25bp的特异性片段(ATGGCGCGCTTTGAGGATCCAACAC和AGATTAGCAGGTAGTAGAATAATGA)制备探针。从感染HPV-18病毒的Hela细胞中提取总RNA，然后根据本发明提供的通过RNA捕获-小RNA高通量测序检测微生物的方法的步骤(1)到(10)检测HPV-18病毒，步骤(8)中高通量测序使用Illumina公司的Hiseq 2000测序仪，测序方式为单端50bp。其中，步骤(8)经测序得到的序列(即原始读段)为15,210,932条，进一步经步骤(9)得到的清理后的序列为12,076,158条，上述清理后的序列经步骤(10)处理后得到的目标小RNA序列计数值为6,038。因此确定该样品的HPV-18病毒检测结果呈阳性。定义所述目标小RNA序列计数值与所述清理后的序列数量之比为信噪比，得到根据本发明的方法检测HPV-18病毒的信噪比为0.05％(6,038/12,076,158)，显著高于常规的小RNA高通量测序(不经过RNA捕获)方法检测HPV-18病毒的信噪比0.01％(1,228/12,285,476)。
实施例2
根据来自布鲁氏菌基因组参考序列(GenBank数据库索引为CP013964.1)的3个25bp长度的特异性片段(AGGGAAACTTGTGCTAATACCGTAT、GAGTGATCAAGTGTCTTAAGGGCAT和CCTGGTGGTTATGGCGGAGCGGCTG)制备探针。从感染布鲁氏菌的猪的血液中提取总RNA，然后根据本发明提供的通过RNA捕获-小RNA高通量测序检测微生物的方法的步骤(1)到(10)检测布鲁氏菌，步骤(8)中高通量测序使用Illumina公司的Hiseq 2000测序仪，测序方式为单端50bp。其中，步骤(8)经测序得到的序列(即原始读段)21,504,891条，进一步经步骤(9)得到所述清理后的序列18,461,371条，上述清理后的序列经步骤(10)处理后得到的目标小RNA序列计数值为960,613。因此确定该样品的布鲁氏菌检测结果呈阳性。定义所述目标小RNA序列计数值与所述清理后的序列数量之比为信噪比，得到根据本发明的方法检测布鲁氏菌的信噪比为5.2％(960,613/18,461,371)，显著高于常规的小RNA高通量测序(不经过RNA捕获)方法检测布鲁氏菌的信噪比0.93％(160,613/17,260,345)。
实施例3
根据来自烟曲霉菌基因组参考序列(GenBank数据库索引为NC_007194.1)的一个20bp长度的特异性片段(UGGCUCAGAAUUCUGAGCCA)制备探针。从感染烟曲霉菌基因组的细胞中提取总RNA，然后根据本发明提供的通过RNA捕获-小RNA高通量测序检测微生物的方法的步骤(1)到(10)检测烟曲霉菌，步骤(8)中高通量测序使用Illumina公司的Hiseq 2000测序仪，测序方式为单端50bp。其中，步骤(8)经测序得到的序列(即原始读段)为16,014,040条，进一步经步骤(9)得到所述清理后的序列13,951,269条，上述清理后的序列经步骤(10)处理后得到的目标小RNA序列计数值为960,613。因此确定该样品的烟曲霉菌检测结果呈阳性。定义所述目标小RNA序列与所述清理后的序列数量之比为信噪比，得到根据本发明的方法检测烟曲霉菌的信噪比为0.8％(112,003/13,951,269)，显著高于常规的小RNA高通量测序(不经过RNA捕获)方法检测烟曲霉菌的信噪比0.53％(72,003/13,564,430)。
Claims (6)
1.一种通过RNA捕获-小RNA测序检测微生物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取生物样品中的总RNA，通过酶切或物理打断得到片段化的RNA；
(2)将步骤(1)中所述片段化的RNA与带有标记物的DNA探针进行杂交，得到经标记的RNA-DNA杂交产物；
(3)将步骤(2)中所述经标记的RNA-DNA杂交产物与表面带有与所述标记物特异性结合的配体的磁珠混合，使磁珠吸附所述经标记的RNA-DNA杂交产物，洗脱除去未杂交的DNA探针与污染物；
(4)加热使磁珠上的RNA-DNA杂交产物变性，洗脱回收RNA，向回收物中加入DNA酶降解DNA片段；
(5)将接头连接到步骤(4)中回收的RNA的3′端，得到带有3′端接头的RNA；
(6)将步骤(5)中所述带有3′端接头的RNA与反转录引物退火杂交，得到RNA-引物杂交产物；
(7)将5′端接头连接到步骤(6)得到的所述RNA-引物杂交产物的RNA的5′端，得到带5′端接头的RNA-引物杂交产物；
(8)以步骤(7)中所述带5′端接头的RNA-引物杂交产物中RNA片段为模板进行反转录PCR，得到扩增的cDNA片段，选择长度在130-200bp范围内的cDNA片段进行测序，测序长度在50bp以上；
(9)去除步骤(8)中测序获得的序列3′端的测序接头，再去除15bp长度以下的序列，得到清理后的序列；
(10)使用bowtie或BWA软件，将清理后的序列与目标微生物基因组序列进行比对，将与所述目标微生物基因组序列的比对区域相比存在至多1个碱基不同的所述清理后的序列确定为目标小RNA序列；对目标小RNA序列进行计数，将5′端或3′端比对到所述目标微生物基因组序列中相同位置的所有目标小RNA序列计数为一次；如果样品中目标小RNA序列计数值超过指定阈值，则将该样品中该目标微生物的检测结果确定为阳性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物包括病毒、细菌和真菌；优选地，所述病毒包括人乳头状瘤病毒(HPV)、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、艾滋病病毒(HIV)、松鼠猴病毒(SMRV)、EB病毒(EBV)和严重急性呼吸道综合症冠状病毒(SARS-CoV)；优选地，所述细菌为布鲁氏菌；优选地，所述真菌为烟曲霉菌。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样品为来源于动物(例如人)的血液、唾液、尿液、粪便、各种组织和/或细胞系；更优选地，为血液或患病组织。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述标记物为生物素，所述配体为链霉亲和素。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述DNA探针的序列为来自病毒、细菌或真菌基因的特异序列；优选地，所述特异序列的长度范围为21到50个核苷酸。。
6.根据权利要求1所述的方法，其中当所述目标微生物为病毒时，其指定阈值为100；当所述目标微生物为细菌和真菌时，其指定阈值为100。
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| CN201811452689.6A CN109355365A (zh) | 2018-11-25 | 2018-11-25 | 一种小rna高通量测序检测微生物的方法 |
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| CN101835907A (zh) * | 2007-10-23 | 2010-09-15 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 用于基于溶液的序列富集和基因组区域分析的方法和系统 |
| CN103403186A (zh) * | 2011-01-26 | 2013-11-20 | 雷蒙特亚特特拉维夫大学有限公司 | 利用小rna测序消减和组装检测微生物感染 |
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2018
- 2018-11-25 CN CN201811452689.6A patent/CN109355365A/zh active Pending
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