CN109337902A - 一种用于野外精细化采集植物特定组织样本时的长效稳定保存rna的便捷方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于野外精细化采集植物特定组织样本时的长效稳定保存RNA的便捷方法，将采集好的植物特定组织样本，迅速用无RNA酶水冲洗，然后放入丙酮溶液，进行超低温冷藏固定处理；待解剖操作获取到特定目标组织后液氮速冻，并保存于超低温环境。本发明操作便捷且成本价格低廉，通过丙酮固定+干冰超低温冷藏的方法，保证了野外采集的植物材料可以顺利带回实验室进行显微解剖以获取特定组织，提取出的RNA的质量能满足实验要求。
Description
技术领域
本发明涉及植物RNA样品保存领域，具体涉及一种用于野外精细化采集植物特定组织样本时的长效稳定保存RNA的便捷方法。
背景技术
核糖核酸(RNA)是以脱氧核糖核酸(DNA)为模板转录而成的重要遗传物质，是遗传信息传递过程中的重要桥梁。随着近年人类对基因表达机理认识的逐步深入，越来越多的证据清楚地表明，RNA在生命进程中所起的作用远比我们早前设想的更为重要。RNA在生物体内的很多细胞生理过程中发挥非常重要的作用，如染色质重组装、细胞内的转录调控、前体mRNA的加工、基因沉默、翻译调控等。随着越来越多的基因组序列相继被测定，生命科学的研究已经从结构基因组学过渡到功能基因组学(包括转录组学、蛋白质组学、代谢组学等)，其中转录组学是率先发展起来以及目前应用最广泛的组学技术。
转录组学是研究特定细胞、组织或器官在特定生长发育阶段或某种生理状态下所有转录组的科学。广义上，转录组(transcriptome)是指特定的组织或细胞在某一生长阶段或功能状态下所转录出来的RNA总和，包括编码蛋白质的mRNA和各种非编码RNA(ncRNA)，如rRNA、tRNA、snoRNA、snRNA、microRNA，以及其他非编码RNA等。
RNA是由核糖核苷酸经磷酯键缩合而成的长链状分子，其具有不耐碱、不耐热、极易被RNA酶降解的特性。植物组织离开活体后RNA极不稳定，如不及时保护而暴露，通常会在几个小时之内完全降解。对于生物芯片、基因表达矩阵分析(Array Analysis)、定量RT-PCR等实验来说，采样后立即稳定样品里的RNA以保存当时RNA的表达状态，是精确或定量研究基因表达分析的重要前提。
一般情况下，取下的新鲜植物材料需要迅速放置于液氮中速冻，并保存于超低温环境中(液氮或-80℃冰箱)，从植物组织离体到液氮速冻的整个过程需要在3～5min之内完成，从而保证样品中RNA状态的稳定。但是在实际采样中往往会遇到植物材料需要进行显微解剖以获取特定组织样本RNA的情况。在野外采样中，不仅不具备显微解剖的条件，且液氮也不便携带，无法实现“现采现剖后立即速冻”的操作。因此，在野外采样后如何保存取下的新鲜植物材料，稳定RNA状态延缓其降解，以便将样品带回实验室进行显微解剖操作是取样能否成功的关键。
发明内容
发明目的：针对目前野外植物采样中很难实现“现采现剖”的精细化操作以获取其特定组织RNA样本的情况，本发明的目的是提供一种处理植物鲜样、稳定保存RNA的便捷方法，可以有效延缓植物材料中的RNA降解以保证精细化取样的顺利进行，样品保存48h后提取出的RNA的质量能满足后续实验需求。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种用于野外精细化采集植物特定组织样本时的长效稳定保存RNA的便捷方法，将采集好的植物特定组织样本，迅速用无RNA酶水冲洗，然后放入丙酮溶液，进行超低温冷藏固定处理；待解剖操作获取到特定目标组织后液氮速冻，并保存于超低温环境。
所述的用于野外精细化采集植物特定组织样本时的长效稳定保存RNA的便捷方法，超低温冷藏为采用干冰冷藏。
所述的用于野外精细化采集植物特定组织样本时的长效稳定保存RNA的便捷方法，保存于超低温环境为温度低于-80℃的环境。
所述的用于野外精细化采集植物特定组织样本时的长效稳定保存RNA的便捷方法，具体步骤如下：
步骤S1：准备好采样所需的工具及试剂；
步骤S2：用解剖刀将目标部位从植株上取下，尖头镊夹住，然后用无RNA酶水冲洗；
步骤S3：将冲洗后的鲜样放入装有丙酮的西林瓶中，盖上橡胶塞，利用注射器迅速抽真空直至没有明显气泡逸出；
步骤S4：将抽好真空的西林瓶放入便携式保温箱中，利用干冰超低温冷藏；
步骤S5：将固定处理后的植物材料带回实验室，在体视显微镜下进行解剖操作，获取到特定目标组织后液氮速冻，并保存于超低温环境中。
步骤S1中，准备好采样所需的工具及试剂，并进行灭菌处理。工具包括：解剖刀、尖头镊、西林瓶(戴橡皮塞)、注射器、便携式保温箱；试剂包括：无RNA酶水、丙酮、干冰。
步骤S2中，用解剖刀将目标部位从植株上取下，尖头镊夹住，然后用无RNA酶水冲洗，去除RNA酶。
步骤S3中，将冲洗后的鲜样放入装有丙酮的西林瓶中(注：丙酮和植物鲜样的体积比不小于5)，盖上橡胶塞，利用注射器迅速抽真空直至没有明显气泡逸出，使丙酮快速充分渗透进植物组织内部。
步骤S4中，将抽好真空的西林瓶放入便携式保温箱中，利用干冰低温冷藏，至少可保存48h。
步骤S5中，将固定处理后的植物材料带回实验室，在体视显微镜下进行解剖操作(操作台垫上干冰以保持超低温状态)，获取到特定目标组织后液氮速冻，并保存于低温环境中(液氮或-80℃冰箱)。
有益效果：与现有技术相比，本发明的优点在于：通过对植物鲜样的处理有效延缓了RNA的降解，解决了长期以来野外采样中很难实现精细化解剖操作以获取其特定组织样本的难题，在保证RNA样品质量合格的同时还具有成本价格低廉的优势。检测后结果表明RNA样品质量合格，可以有效满足转录组测序建库等实验需求。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
实施例1
一种用于野外精细化采集植物特定组织样本时的长效稳定保存RNA的便捷方法，将采集好的植物特定组织样本，迅速用无RNA酶水冲洗，然后放入丙酮溶液，进行超低温冷藏固定处理；待解剖操作获取到特定目标组织后液氮速冻，并保存于超低温环境。该方法的具体操作如下：
1、对照组(D0)
用解剖刀将紫玉兰(Yulania liliflora)的营养芽从植株上取下，尖头镊夹住，用无RNA酶水冲洗。然后将芽转移至玻璃培养皿中，添加适量无RNA酶水，下面垫上冰袋，在体视显微镜下进行解剖操作，仔细去除外层苞片和叶后将营养顶端用解剖针取下，迅速放入2.5mL离心管中，液氮速冻。整个操作过程控制在3～5min。20个营养顶端为1份样，做3个生物学重复。实施例1为。
2、处理组(C1～3)
用解剖刀将紫玉兰的营养芽从植株上取下，尖头镊夹住，用无RNA酶水冲洗。将冲洗后的营养芽放入装有丙酮的西林瓶中(注：丙酮和营养芽的体积比不小于5)，盖上橡胶塞，利用注射器迅速抽真空直至没有明显气泡逸出，使固定液快速充分渗透进植物组织内部。将抽好真空的西林瓶分别保存在3种温度条件下(室温25℃、冰袋、干冰)，固定48h(48h足以满足野外精细化采样的顺利完成)，具体处理方法见表1。
将处理过的营养芽转移至玻璃培养皿中，添加适量丙酮，下面垫上干冰，在体视显微镜下进行解剖操作，仔细去除外层苞片和叶后将营养顶端用解剖针取下，迅速放入2.5mL离心管中，液氮速冻。20个营养顶端为1份样，做3个生物学重复。
3、处理组(C4～6)
用解剖刀将紫玉兰的营养芽从植株上取下，尖头镊夹住，用无RNA酶水冲洗。将冲洗后的营养芽放入装有RNA保护液的西林瓶中(注：RNA保护液和营养芽的体积比不小于5)，盖上橡胶塞，利用注射器迅速抽真空直至没有明显气泡逸出，使固定液快速充分渗透进植物组织内部。将抽好真空的西林瓶分别保存在3种温度条件下(室温25℃、冰袋、干冰)，固定48h(48h足以满足野外精细化采样的顺利完成)，具体处理方法见表1。
将处理过的营养芽转移至玻璃培养皿中，添加适量RNA保护液(RNA KeeperTissue Stabilizer，Vazyme Cat.R501-01)，下面垫上冰袋，在体视显微镜下进行解剖操作，仔细去除外层苞片和叶后将营养顶端用解剖针取下，迅速放入2.5mL离心管中，液氮速冻。20个营养顶端为1份样，做3个生物学重复。
表1对新鲜植物材料的不同处理方法
由于不同固定液的凝固点不同，操作中发现处理组C1～5在固定48h之后未凝固，可以顺利解剖；而处理组C6在干冰保存48h后固定液(RNA保护液)凝固，无法进行解剖操作。
提取对照组(D0)和处理组(C1～5)样品的RNA后对其质量进行检测，综合考虑RNA样本的浓度、总量、28S/18S和RIN值，对样品质量进行评估，结果如表2所示。处理组(C3、C5)3个重复的RNA质量接近对照组(D0)，提取出的RNA样品基本可以满足转录组测序建库等实验的需求。
表2不同处理下植物样品的RNA质量
综合考虑RNA保存效果、成本等因素，本实施例的丙酮固定+干冰超低温保存的处理具有较大的优势，一方面可以有效延缓植物材料中RNA降解，材料超低温固定处理48h足以保证野外样本采集、室内精细化解剖的顺利完成，提取出的RNA质量完全可以满足转录组测序建库等实验的需求，另一方面相对于价格高昂的RNA保护液，丙酮可以极大降低实验成本。
Claims (7)
1.一种用于野外精细化采集植物特定组织样本时的长效稳定保存RNA的便捷方法，其特征在于，将采集好的植物特定组织样本，迅速用无RNA酶水冲洗，然后放入丙酮溶液，进行超低温冷藏固定处理；待解剖操作获取到特定目标组织后液氮速冻，并保存于超低温环境。
2.根据权利要求1所述的用于野外精细化采集植物特定组织样本时的长效稳定保存RNA的便捷方法，其特征在于，超低温冷藏为采用干冰冷藏。
3.根据权利要求1所述的用于野外精细化采集植物特定组织样本时的稳定保存RNA的便捷方法，其特征在于，保存于超低温环境为温度低于-80℃的环境。
4.根据权利要求1所述的用于野外精细化采集植物特定组织样本时的长效稳定保存RNA的便捷方法，其特征在于，具体步骤如下：
步骤S1：准备好采样所需的工具及试剂；
步骤S2：用解剖刀将目标部位从植株上取下，尖头镊夹住，然后用无RNA酶水冲洗；
步骤S3：将冲洗后的鲜样放入装有丙酮的西林瓶中，盖上橡胶塞，利用注射器迅速抽真空直至没有明显气泡逸出；
步骤S4：将抽好真空的西林瓶放入便携式保温箱中，利用干冰超低温冷藏；
步骤S5：将固定处理后的植物材料带回实验室，在体视显微镜下进行解剖操作，获取到特定目标组织后液氮速冻，并保存于超低温环境中。
5.根据权利要求4所述的用于野外精细化采集植物特定组织样本时的长效稳定保存RNA的便捷方法，其特征在于：步骤S1中，采样工具进行灭菌处理，以去除工具表面的RNA酶。
6.根据权利要求4所述的用于野外精细化采集植物特定组织样本时的长效稳定保存RNA的便捷方法，其特征在于：步骤S3中，丙酮和植物鲜样的体积比不小于5。
7.根据权利要求4所述的用于野外精细化采集植物特定组织样本时的长效稳定保存RNA的便捷方法，其特征在于：步骤S5中，将固定处理的样本带回实验室并在体视显微镜下精细化解剖，显微解剖在超低温及RNA酶干扰较少的环境下进行，防止RNA受高温或RNA酶的影响而降解。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20190215 |