CN109328297A - 容器组件以及使用该容器组件的试样制备方法 - Google Patents

Abstract

容器组件包括过滤单元(10)、以及相对于过滤单元可拆装的封闭单元(30)。过滤单元具备：壳体(11)，其一端设置有试样导入开口(18)，另一端设置有液体排出开口(19)；过滤器(21)，被固定于壳体(11)。过滤单元的壳体具有第一接合部，封闭单元具有构成为可与第一接合部接合的第二接合部。第一接合部以及第二接合部构成为，在两者接合的状态下，液体排出开口在空间上被封闭。以缩短两者的距离的方式压入过滤单元与封闭单元，使得封闭单元与过滤器之间的空间相对于试样收容空间成为正压。

Description

容器组件以及使用该容器组件的试样制备方法

技术领域

本发明涉及容器组件以及使用该容器组件的分析用试样的制备方法。

背景技术

离心过滤通过将液体透过过滤器，能够使固体与液体分离，因此固液分离性优异。在离心过滤中，使用容器组件(离心过滤试剂盒)，所述容器组件组合有如下部件：过滤单元，用于装填试样；回收容器，用于回收透过过滤单元的过滤器的液体(滤液)。回收容器具有可装填于离心分离机的外部形状，在组合了过滤单元与回收容器的状态下，进行离心分离，由此能够将试样中的液体成分回收到回收容器内。

例如，在液相色谱用试样的前处理中，为了从试样中去除粒子或沉淀物等的固体成分，使用注射器过滤或离心过滤。过滤后的滤液直接作为试样使用。

离心过滤也能够应用于与固体表面结合的成分(结合)和不与固体表面结合的成分(游离)的分离(B/F分离)。例如，在ELISA(酶联免疫吸附测定)等的免疫测量法中，为了分离与抗体结合的抗原(结合)和不与抗体结合的抗原以及其他杂质成分(游离)，进行B/F分离。在对象试样被固定于固体表面的情况下，能够回收在离心过滤后残留在过滤器上的固体。由此，能够选择性地将对象试样固定在固体表面，而将未固定于固体的杂质成分作为滤液去除。通过适当的方法回收残留在过滤单元内的、固定有对象物质的固体成分。例如，将液体添加到过滤单元而使固体成分悬浮，通过移液管回收该悬浮液即可。

作为利用B/F分离的试样的制备方法的例子，除了上述的免疫测量法以外，还能够列举通过与固定在纳米粒子表面上的蛋白酶反应，位置选择性地切割蛋白质以生成肽片段的方法(纳米表面分子导向限制性酶解；nSMOL法)(例如，专利文献1、非专利文献1以及非专利文献2)。

图8是nSMOL法的试样制备以及分析的流程图。首先，准备能够选择性地固定抗体等的分析对象物质的多孔质体(S10)。例如，被蛋白A或蛋白G等包覆的多孔质体选择性地与抗体的Fc区域结合。当在多孔质体的悬浮液中添加血液等的检体时,在多孔质体的细孔内选择性地固定抗体等的分析对象物质(S11)。

在多孔质体的表面，附着有膜蛋白质等的多种多样的杂质物。为了将这些夹杂物溶解去除，能够通过包含表面活性剂的溶液进行清洗(S21)。通过离心过滤，能够将清洗后的固体(多孔质体)与包含表面活性剂的溶液进行分离(S22)。然后，为了去除表面活性剂，通过PBS等的清洗液进行清洗(S23)。通过离心过滤，进行清洗后的固体与清洗液的分离(S24)。

准备在纳米尺寸的微粒子的表面固定有胰蛋白酶等蛋白酶的蛋白酶固定微粒子,在液体中,使其与上述的固体接触(S31)。在表面固定有抗体等的对象物质的多孔质体与蛋白酶固定微粒子在液体中共存的状态下，例如，通过在35～60℃的温度下培养3～30小时左右，进行蛋白酶解(S32)。被蛋白酶位置选择性地切割的肽片段，游离至液体中。

在微粒子的粒子直径大于多孔质体的细孔径的情况下，被固定在微粒子表面的蛋白酶能够接近多孔质体的细孔的表层附近(多孔质体与液相的界面附近)，但是不能接近细孔的深处位置。因此，蛋白酶能够选择性地接近(访问)固定在多孔质体的细孔内的蛋白质的特定的部位，并能够进行位置选择性地切割。

在培养后，对通过蛋白酶解产生的肽片段游离的液体进行回收(S41)，通过LC-MS等的分析，进行蛋白质的鉴定以及定量(S51)。

在该方法中，分析对象的蛋白质被位置选择性地蛋白酶解，因此液体试样中所含的肽的种类较少。例如，在抗体与多孔质体结合的情况下，蛋白酶向抗体与多孔质体的结合部位即抗体Fc区域的接近受到限制，因此含有抗体的互补决定区域(CDR)的Fab区域被蛋白酶选择性地切割。因此，在分析用试样中，相对于生成肽片段的总量包含高浓度的肽片段，该肽片段含有对抗体的结构鉴定来说重要的互补决定区的氨基酸序列，从而能够进行高精度的分析。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO2015/033479号小册子

非专利文献

非专利文献1：岩本典子等,《分析方法(Analytical Methods)》，2015年，第21期，第9177-9183页。

非专利文献2：岩本典子等,《生物分析(Bioanalysis)》,2016年,8(10),第1009-1020页。

发明内容

发明要解决的技术问题

在上述的试样制备方法中，通过离心过滤进行B/F分离后，实施蛋白酶处理而使分析对象物游离在液相中，对作为分析用试样的液体进行回收。如前所述，B/F分离的清洗后的固体的回收，一般通过移液管操作进行实施。在移液管操作中，有附着在过滤单元或移液管尖端内的固体未回收而残留的情况。因此，试样的回收率因操作者的熟练度等而不同，从而成为定量分析精度降低的要因。

特别是，在临床现场等同时处理多个检体的情况下，容易产生作业紊乱，操作越变得复杂，经由移液管操作等的操作者的操作对精度降低的影响越大。此外，若使试样移动到其他的容器的作业的次数增加，则除了回收损失导致的精度降低以外，产生拿错试样等的人为错误的风险也增大。因此，在临床试样等的分析用试样的制备中，优选尽可能减少容器更换的次数。

通过离心过滤排出滤液，使固体残留在过滤单元内(图8的S24),如果将蛋白酶固定微粒子的悬浮液添加到过滤单元内(图8中的S31)，则能够以不通过移液管操作等使固体移动的方式，而就在过滤单元内实施蛋白酶解(图8中的S32)。然而，在过滤单元的过滤器设置有0.1μm～5μm左右的细孔，因此储存在过滤器上的液体因毛细管现象而经由介质的细孔泄漏。如果是像通常的离心过滤那样的短时间的作业，则过滤单元内的液体不会泄露，但是在像蛋白酶解那样地进行长时间的反应的情况下，因毛细血管现象导致泄漏量较大，分析精度随着试样的损失而降低。

如上所述，如果通过离心过滤实施B/F分离后，进行将固体从过滤单元移动至其他容器的操作，则可能会产生分析精度降低的情况。另一方面，如果在过滤单元内长时间地持续固体与液体共存的状态，则会产生液体的泄漏。鉴于这样的技术问题，本发明的目的在于，提供一种容器以及试样制备方法，即使在不将固体从过滤单元移动至其他容器，而将固体与液体的混合物长时间保持在过滤单元内的情况下，也难以产生液体的泄漏。

用于解决上述技术问题的方案

本发明的容器组件构成为包括：过滤单元、以及相对于过滤单元可拆装的封闭单元，在过滤单元与封闭单元接合的状态下，过滤单元的试样收容空间变为负压。

过滤单元具备：壳体、以及固定在壳体内的过滤器，在由壳体以及过滤器围成的试样收容空间，能够收容试样(液体以及固体)。在壳体的一端设置有试样导入开口，用于将固体以及液体导入至试样收容空间。试样导入开口可以封闭，也可以是，例如，在将试样导入至试样收容空间时，试样导入开口为打开状态，除此以外的时间封闭试样导入开口。在壳体的另一端设置有液体排出开口，用于将透过过滤器向试样收容空间的外部移动的液体(滤液)排出。

过滤单元的壳体具有能够与封闭单元接合的第一接合部。封闭单元具有构成为能够与过滤单元的第一接合部接合的第二接合部。过滤单元的第一接合部与封闭单元的第二接合部构成为，两者接合从而处于气密状态，过滤单元的液体排出开口通过封闭单元而在空间上被封闭。此外，第一接合部以及第二接合部构成为，能够在维持气密状态下进一步压入，以使过滤器与封闭单元之间的距离缩短。在第一接合部与第二接合部为接合的状态下，以使过滤单元与封闭单元两者的距离靠近的方式压入，由此封闭单元与过滤器之间的空间相对于试样收容空间变为正压。

也可以是，容器组件除了过滤单元以及封闭单元以外，还包括相对于过滤单元可拆装的液体回收容器。液体回收容器优选具有能够装填于离心分离器的外部形状。在与封闭单元组合前，或者在将封闭单元脱离后的过滤单元与液体回收容器组合的状态下，进行离心过滤，由此能够存储透过过滤单元的过滤器的滤液。

本发明提供一种使用上述的容器组件的分析用试样的制备方法。试样的制备依次具有如下步骤：将检体中的特定的物质固定在固体表面的步骤；通过离心过滤将未固定在固体表面的杂质成分去除(B/F分离)的步骤；使回收对象物质从固定在固体表面的特定的物质游离至液体中的步骤；以及对游离在液体中的回收对象物质进行回收的步骤。

回收对象物质可以与被固定于固体表面的特定的物质相同，也可以是被固定于固体表面的物质的反应物或分解物等。例如，在抗体等的蛋白质固定在固体表面的情况下，根据溶液环境的变化，能够使蛋白质从固体表面游离至液体中。如果在蛋白质被固定在固体表面的状态下，进行蛋白酶解，则肽片段游离到液体中。

在本发明的方法中，通过使用上述的过滤器而实施离心过滤，进行未固定在固体表面的杂质成分的去除。然后，在将固体保持在过滤单元的试样收容空间的状态下，通过添加反应液等的液体，使回收对象物质游离至液体中。即，离心过滤与向回收对象物质的液体中的游离，使用相同的过滤单元进行实施。

在离心过滤后，通过将过滤单元与封闭单元接合，能够在过滤单元的液体排出开口在空间上封闭的状态下，进行回收对象物质向液体中的游离。

发明效果

本发明的容器组件构成为，在组合了过滤单元与封闭单元的状态下，封闭单元与过滤器之间的密闭空间为正压，过滤单元的试样收容空间为负压。因此，即使是在含有液体的试样被装填入试样收容空间的情况下，也能够防止液体经由过滤器而泄漏。

此外，在将封闭单元从过滤单元分离的状态下，过滤单元可作为离心过滤器使用。因此，能够使用同一过滤单元实施将试样长时间保持的操作(例如反应)与用于清洗或滤液回收等的离心过滤。像这样地，能够在一个容器内实施各种操作，能够降低将试样移动到其他容器的作业的次数，因此除了能够简化试样制备的作业以外，还能够提高定量分析等的分析精度。

附图说明

图1是本发明的容器组件的过滤单元以及封闭单元的概略立体图。

图2A是过滤单元的剖视图。

图2B是封闭单元的剖视图。

图3A是组合过滤单元与封闭单元的中途的状态的剖视图。

图3B是组合了过滤单元与封闭单元的状态的剖视图。

图4是容器组件的过滤单元，以及可组合至过滤单元的液体回收容器的概略立体图。

图5是容器组件的过滤单元以及封闭单元的剖视图。

图6是容器组件的过滤单元以及封闭单元的剖视图。

图7是容器组件的过滤单元以及封闭单元的概略立体图。

图8是表示nSMOL法的试样制备以及分析的概要的流程图。

具体实施方式

[容器组件的构成]

本发明的容器组件，包括过滤单元以及封闭单元。封闭单元相对于过滤单元可拆装。容器组件还可以包括相对于过滤单元可拆装的液体回收容器。

图1是由过滤单元10以及封闭单元30构成的容器组件的一实施方式的概略立体图，图2A以及图2B分别是过滤单元10以及封闭单元30的剖视图。

过滤单元10是与通常的离心柱的过滤杯相同或者相似的构成，过滤器21被固定在内壁面为圆筒形状的壳体11。在壳体11的一端设置有试样导入开口18，在另一端设置有液体排出开口19。过滤器21被固定在壳体11的液体排出开口19附近，被壳体11的内壁12以及过滤器21围成的空间构成试样收容空间15。试样收容空间15可收容从试样导入开口18导入的固体以及液体。

也可以是，过滤单元10的试样导入开口18，除了试样导入时以外可封闭。例如，在如图1所示的容器组件中，盖38经由铰链34而与封闭单元30的主体部31结合，在组合了过滤单元10与封闭单元30的状态下，通过盖38可封闭试样导入开口18。用于封闭试样导入开口的盖可以与过滤单元的壳体连接，也可以由独立于过滤单元以及封闭单元的盖而封闭试样导入开口。

作为过滤器21,例如能够使用由聚砜、乙酰纤维素、硝化纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、尼龙、聚偏二氟乙烯等聚合物构成的多孔质膜。过滤器21具有试样收容空间15内的液体可透过的过滤孔。过滤孔的孔径例如设定为0.1～5μm左右，以使试样收容空间15内的固体不透过。利用粘接剂进行粘接、或者利用热熔接、超声波熔接等进行接合、或者使用O型环等固定环,由此将过滤器21固定在壳体11内。如果在试样收容空间15内包含固体与液体的混合物的状态下进行离心过滤，则透过过滤器21的液体从液体排出开口19被排出至过滤单元的外部。

过滤单元10的壳体11的外壁面13为锥形形状，朝向与封闭单元13接合的接合一侧(图的下侧)缩径。该锥形形状的外壁面13成为过滤单元10与封闭单元30组合时的接合部。

封闭单元30具有底部封闭的筒状的主体部31，在主体部31的上表面设置有接合用开口36，用于插入过滤单元10。封闭单元的内壁面32为锥形形状，从接合用开口36侧朝向底部缩径。该内壁面32具有与过滤单元10的壳体11的外壁面13相同的锥形角，成为过滤单元10与封闭单元30组合时的接合部。即，过滤单元10的外表面锥形与封闭单元30的内表面锥形构成一对接合部，两者在气密状态下可接合。

将过滤单元10从封闭单元30的接合用开口36插入至由主体部31围成的空间35，由此过滤单元的壳体的外壁面13与封闭单元主体的内壁面嵌合。封闭单元30在内锥形的缩径侧具有封闭端，因此在过滤单元与封闭单元嵌合的状态下，过滤单元的液体排出开口在空间上被封闭，从而成为气密状态。

图3A是组合过滤单元10与封闭单元30的中途的状态的剖视图，图3B是组合了过滤单元10与封闭单元30的状态的剖视图。如图3A所示，过滤单元10的外壁面13与封闭单元30的内壁面32具有相同的锥形角，因此如果将过滤单元10插入至封闭单元30的空间35，则两者嵌合从而成为气密状态。

封闭单元主体部31的底部封闭，因此如果过滤单元10的外壁面13与封闭单元30的内壁面32接触，则过滤单元10的液体排出开口19在空间上被封闭单元30封闭。在这种状态下，过滤单元10的过滤器21与封闭单元30的主体部31成为气密状态，两者之间形成密闭空间39。

从过滤单元10的接合部(外壁面)与封闭单元30的接合部(内壁面)接合从而形成密闭空间39的状态开始，保持气密状态的同时，将过滤单元10进一步压入封闭单元30(图3B)。

在过滤单元的壳体以及封闭单元由聚丙烯树脂的弹性材料构成的情况下，能够将过滤单元压入封闭单元，使得过滤单元10的过滤器21与封闭单元30的距离缩短。如果将过滤单元压入封闭单元，则过滤单元的壳体11以及封闭单元的主体部31发生弹性压缩变形，通过其回弹力，能够保持作为第一接合部的壳体11的外壁面13与作为第二接合部的主体部31的内壁面32的接合状态。通过将过滤单元压入封闭单元，密闭空间39内的气体(空气)在过滤器21与封闭单元的主体部31之间被压缩。因此，封闭单元的主体部31与过滤器21之间的密闭空间成为正压。

如上所述，过滤器单元10的接合部13是朝向将过滤单元10压入封闭单元30时的压入方向而缩径的外表面锥形形状。封闭单元30的接合部32是通过与过滤单元10的接合部13嵌合而能够构成气密状态的内表面锥形形状。

过滤单元以及封闭单元的接合部的锥形角并没有特别地限定。为了在保持了接合部的气密性的状态下可将两者压入，锥形角优选为0.1～10°左右，更优选为0.2～5°左右。接合部的锥形形状也可以根据各种规格来设计。例如，如果锥形角为3°，则能够构成广泛用于医疗用品或实验室用器具中的鲁尔锁紧方式的接合部(鲁尔锥度)。

在过滤单元的壳体11的上部设置向外部突出的卡止部17的情况下，压入过滤单元，直到卡止部17与封闭单元的接合用开口的外缘部37抵接，由此能够可靠地使过滤器与封闭单元之间的空间为正压状态。也可以压入过滤单元，直到过滤单元的底部与封闭单元的底部抵接。

过滤器21与封闭单元30之间的空间成为正压，由此，以过滤器21作为边界，过滤器单元10的试样收容空间15相对地成为负压。如果试样收容空间内存在液体，则因毛细管现象，产生液体经由过滤器的过滤孔漏出到试样收容空间外的作用。如果过滤器与封闭单元之间的空间为正压，则起到气体经由过滤孔流入至成为负压的试样收容空间的作用。因此，即使在液体被收容在试样收容空间的情况下，也能够防止毛细管现象引起液体经由过滤器而泄漏。

使用过滤单元10，通过离心过滤对固体与液体进行分离以后，如果组合过滤单元10与封闭单元30，则即使是在将液体加入至过滤单元的试样收容空间15内并长时间保持的情况下，也能够抑制液体经由过滤器21而泄漏。因此，在离心过滤后，即使不使残留在过滤单元的固体移动到其他的容器而将液体加入过滤单元实施反应等，也能够确保试样的定量性。此外，由于无需通过移液管等使固体移动到其他的容器，所以除了能简化试样制备的操作以外，还能够防止固体的回收损失等引起的定量性的降低。

如果将过滤单元10与封闭单元30分离，则过滤单元10可以再次作为离心过滤器使用。例如，在固体与液体共存的状态下实施反应之后，若实施离心过滤，则可以将反应后的液体作为滤液进行回收。可以在离心过滤后，将残留在过滤器上的固体作为试样进行回收。

容器组件除了过滤单元以及封闭单元以外，可以还包括相对于过滤单元可拆装的液体回收容器。图4是与过滤单元10可组合的液体回收容器50的概略立体图。

液体回收容器50可以构成为：其主体51具有能够装填于离心分离器的外部形状，且可存储已经透过过滤单元10的过滤器21的滤液。能够装填于离心分离器的外部形状可以根据离心分离器的转子的形状等适当地设计。例如，对于1mL以下的少量的试样，能够使用微管或者与其类似的形状的容器作为液体回收容器。在过滤单元10和液体回收容器50组合的状态下无需具有气密性。

在图4所示的方式中，盖58经由铰链54而与液体回收容器50的主体部51结合，在组合了过滤单元10与液体回收容器50的状态下，可由盖58封闭试样导入开口18。

如上所述，在组合过滤单元10与封闭单元30之前，使用过滤单元10，能够通过离心过滤进行固体与液体的分离。若在组合了过滤单元10与液体回收容器50的状态下进行离心过滤，则能够将滤液回收至液体回收容器50内。此外，在组合了过滤单元10与封闭单元30的状态下，长时间地保持液体并进行反应等以后,也能使用过滤单元10进行离心过滤。此时，如果通过将液体回收容器50与过滤单元10组合，而实施离心过滤，则能够将滤液回收至液体回收容器内。

在组合了过滤单元10与封闭单元30的状态下，与组合了过滤单元10与液体回收容器50的状态相比，容器的高度较小。如果将适配器安装到封闭单元30的底部来调整容器的高度，则容易利用管支架。此外，也可以是，在比接合部更靠下侧，设置封闭单元，以使其具有用于提高容器高度的空间。

在图1～3所示的方式中，试样收容空间15的侧壁的外壁面13为锥形形状，构成用于接合封闭单元的接合部。过滤单元的接合部可以设置在远离试样收容空间的位置。

例如，图5的剖视图所示的过滤单元110的、过滤器121与液体排出开口119之间的壳体外壁面123为朝向液体排出开口119侧缩径的外表面锥形形状。与该过滤单元110组合地使用的封闭单元130的内壁面132为从底部朝向接合用开口136缩径的内表面锥形形状。

在本实施方式中，过滤单元110的外表面锥形123与封闭单元130的内表面锥形132构成一对的接合部。如果过滤单元110的壳体111，贯通封闭单元130的接合用开口136而插入至封闭单元内的空间135，则过滤单元110的接合部(外表面锥形)123与封闭单元130的接合部(外表面锥形)123相互地嵌合，从而成为气密状态。

如果在维持两者的嵌合的气密状态的同时，将过滤单元110进一步压入封闭单元130内,则形成于过滤器121与封闭单元130的底部之间的空间内的空气被压缩。因此，封闭单元与过滤器之间的密闭空间成为正压。

本发明的容器组件还可以构成为通过将封闭单元插入过滤单元内而使封闭单元和过滤器之间的空间为正压。例如，图6的剖视图所示的过滤单元210的、过滤器221与液体排出开口219之间的壳体内壁面222为从液体排出开口119侧朝向过滤器221侧缩径的内表面锥形形状。与该过滤单元210组合地使用的封闭单元230的侧面233为从底部朝向上部平面235侧缩径的外表面锥形形状。

在本实施方式中，过滤单元210的内表面锥形222与封闭单元230的外表面锥形233构成一对接合部。以堵住过滤单元210的液体排出开口219的方式插入封闭单元230，由此过滤单元210的接合部(内表面锥形)222与封闭单元230的接合部(外表面锥形)233相互地嵌合，从而成为气密状态。

如果维持着气密状态的同时，进一步将封闭单元230压入至过滤器210内，则形成于过滤器221与封闭单元230的上部平面235之间的空间内的空气被压缩。因此，封闭单元与过滤器之间的密闭空间成为正压。

过滤单元的接合部与封闭单元的接合部的形状不限于锥形形状，只要能够维持两者接合的气密状态,并能够以缩短过滤器与封闭单元的距离的方式压入即可。

例如，过滤单元以及封闭单元的接合部，可以是相互地咬合的螺杆形状。在以螺杆咬合的方式接合的状态下，使封闭单元相对于过滤单元相对地旋转，由此，过滤器与封闭单元的距离缩短，两者之间的空间被压缩而成为正压状态。如果接合部是锥形螺杆形状，则可以更可靠地形成气密状态。此外，通过螺杆的卡止作用，即使是在过滤器与封闭单元之间的空间的压力变高的情况下，也能够维持接合状态。

可以在连接器单元以及封闭单元的至少一方的接合部设置密封材料等的密封部件，使过滤器与封闭单元成为气密状态。在过滤器的接合部与封闭单元的接合部之间夹着密封部件而具有气密性的状态下，如果为了缩短过滤器与封闭单元的距离而相对于一方相对地压入另一方,则两者间的密闭空间被压缩而成为正压状态。

在上述的方式中，过滤单元的接合部与封闭单元的接合部具有相互地嵌合的形状，因此，能够形成气密状态。作为使过滤单元与封闭单元形成气密状态的其他方法，能够列举出使用具有气密密合性以及延伸性的薄膜部件的方法。

图7的立体图所示的容器组件包括过滤单元510以及封闭单元530。过滤单元510的构成，与上述的各实施方式相同，在壳体511的一端设置有试样导入开口518，在其另一端设置有液体排出开口519。壳体511的外壁面以及内壁面可以是锥形形状，也可以是直管形状。在壳体511的液体排出开口519的附近固定有过滤器521，由过滤器521以及壳体511围成的空间构成试样收容空间515。

封闭单元530具有能够使过滤单元的液体排出开口通过的接合用开口，以堵住接合用开口的方式固定有薄膜部件536。薄膜部件536，例如通过粘接剂、热熔接、超声波熔接等方式而固定于封闭单元主体部531。

薄膜部件536是具有气密密合性以及延伸性的薄膜。薄膜部件65可以透明，也可以不透明。作为薄膜部件65，能够使用用于管道的接合部的密封带(用于密封的四氟乙烯树脂未烧结带)、或乙烯醋酸乙烯酯(EVA)、聚乙烯、聚偏二氯乙烯、聚氯乙烯等的主要用于食品用保鲜膜的薄膜材料、由毕马时软包装(Bemis Flexible Packaging)公司制造的“Parafilm”，由Diversified Biotech公司制造的“Dura Seal”等。在使液体以及固体共存在过滤单元内并长时间保持时，薄膜部件优选具有该使用环境下的耐热性以及耐溶剂性。例如，优选使用软化点为70℃以上的聚乙烯类薄膜。

将过滤单元510的壳体511的端部的液体排出开口519抵接于设置在封闭单元的连接用开口的薄膜部件536，由此能够形成气密状态，过滤器521与薄膜部件536之间成为密闭空间。即，在本实施方式中，液体排出开口519的外周的壳体511为过滤单元510的接合部，薄膜部件536对应于封闭单元530的接合部。

在通过薄膜部件536将过滤单元510的液体排出开口519封闭的状态下,如果将过滤单元510以插入至封闭单元530的空间535的方式压入,则薄膜部件536与壳体511密合,并保持液体排出开口519的气密状态而延伸。通过此时的压缩力，过滤器521与薄膜部件536之间的空间相对于试样收容空间515成为正压。

在图7所示的封闭单元530中，以覆盖微型管531的开口的方式设置薄膜部件536，但是封闭单元不需要为容器形状。封闭单元可以以覆盖过滤单元可通过的开口的方式固定薄膜部件，也可以是将薄膜部件固定在环状的成形体的构成。此外，也可以是在微型管支架的表面贴合薄膜部件、利用薄膜部件覆盖支架用的孔的简单的构成。

上述的容器组件的各实施方式，构成为将一个封闭单元与一个过滤单元组合，但是容器组件可以是构成为将多个过滤单元与一个封闭单元组合。例如，若以覆盖能够并列收容多个微型管的微型管支架的表面整体的方式贴合薄膜部件,则设置于各个支架孔的薄膜部件作为接合部发挥功能,因此能够在一个封闭单元中组合收容多个过滤单元。

此外，可以使用在板状部件的表面设置有多个图2B的内壁面32或图5的内壁面132那样的内锥形形状的孔作为封闭单元。可以使用在板状部件的表面设置有多个图6的侧面233那样的外锥形形状的凸部作为封闭单元。像这样地，如果使用构成为具有多个接合部且各自的接合部能够与过滤单元接合的封闭单元,则能够提高在同时处理多个检体的情况下的作业效率。

[试样制备方法]

本发明的容器组件，例如能够用于试样制备，该试样制备包括：由离心过滤分离固体与液体的操作、以及需要在容器内长时间保持液体的操作(例如化学反应)。在进行离心过滤时，将过滤单元的液体排出开口设为打开状态,将滤液从液体排出开口向过滤单元外排出。此时，如果将液体回收容器安装于过滤单元,则能够将从液体排出开口排出的滤液回收到液体回收容器内。

在通过离心过滤排出滤液后的试样收容空间中,在过滤器上残留有固体。在该状态下,将过滤单元的接合部与封闭单元的接合部接合而封闭过滤单元的液体排出开口。通过将过滤单元压入封闭单元,密闭在封闭单元与过滤器之间的气体被压缩,相对于试样收容空间成为正压。

在组合了过滤单元与封闭单元的状态下，将包含液体的试样从过滤单元的试样导入开口导入至试样收容空间内。过滤单元的试样收容空间相对于封闭单元与过滤器之间的空间为负压，因此能够防止液体因毛细管现象而经由过滤器的泄漏。

另外，即使在将液体导入至过滤单元的试样收容空间后,如果是几分钟左右的较短时间,则几乎不会产生由毛细管现象引起的液体的泄漏。因此,也可以是，在将液体导入至试样收容空间后组合过滤单元与封闭单元。

将液体保持在试样收容空间内的状态下，在经过规定时间后(例如反应结束后)进行试样的回收。分离过滤单元与封闭单元，并打开液体排出开口，由此能够通过离心过滤将试样收容空间内的液体和固体过滤分离。此时，如果将液体回收容器安装于过滤单元，则能够将从液体排出开口排出的滤液回收至液体回收容器内。

如图8的流程图所示，在使用本发明的容器组件的试样制备方法的一方式中，根据血液等检体进行分析用试样的制备。

首先，准备能够将检体中的特定的物质固定于表面的固体(S10)。作为特定的物质，能够列举核酸、蛋白质、糖、脂质、抗体、受体、抗原、配体等来自生物体的物质或细胞等。在目标物质为来自生物体物质的情况下，也可以通过分子识别等将目标物质固定于固体表面。例如，在目标物质为核酸的情况下，通过使用涂布有二氧化硅的粒子,能够使核酸特异性地吸附于粒子表面。此外，在目标物质为抗体(例如标记抗体)、受体、抗原及配体等的情况下,粒子表面的氨基、羧基、环氧基、嘧啶、生物素、地高辛配基、蛋白A、蛋白G等，能够选择性地固定于固体表面。

如果使用具有多个细孔的多孔质珠子作为固体,则比表面积较大，因此能够有效地将目标物质固定于固体表面。此外，在nSMOL法中，能够通过使用多孔质体,设置空间上的接近限制,对目标物质进行位置选择性地蛋白酶解。

通过将检体添加至上述固体，使两者进行混合，能够将检体中的特定的物质固定于固体表面(S11)。固体与检体的混合可以在过滤单元内实施，也可以在其他的容器内实施。

在检体中的特定的物质在被固定在固体表面的状态下进行清洗，由此去除附着在固体表面的杂质成分。在杂质成分容易凝聚且牢固地附着的情况下,优选使用表面活性剂或离液剂等使杂质成分变性,使其溶解于液体中(S21)。在进行包含表面活性剂等的液体的处理后，进行离心过滤，去除包含杂质物的滤液(S22)。也可以多次重复实施利用表面活性剂等的处理与离心过滤。

进行表面活性剂处理后,使用不含表面活性剂的液体进行清洗，清洗附着于固体表面的表面活性剂(S23)。然后，通过离心过滤去除清洗液(S24)。可以多次重复实施清洗与离心过滤。

通过离心过滤去除未固定在固体表面的杂质成分以后，将过滤单元与封闭单元组合,将在过滤器上残留有固体的试样收容空间作为相对的负压,防止由毛细管现象引起的液体的泄漏。将液体添加至试样收容空间，通过在规定温度下保持规定时间，能够使回收对象物质从固定在固体表面的特定的物质游离至液体中。

固定于固体表面的特定的物质既可以与回收对象物质相同也可以不同。例如，在二氧化硅包覆粒子的表面结合有核酸情况下，通过添加含有水或者低浓度的盐的缓冲液，二氧化硅与核酸之间的相互作用变小，因此核酸从二氧化硅表面游离。在该情况下，固定在固体表面的特定的物质与回收对象物相同。

如果使固定于在固体表面的特定的物质在液体中参与化学反应,则与固定于固体表面的特定的物质不同的回收对象物质游离到液体中。例如，在蛋白质被固定于固体表面的情况下，如果通过蛋白酶对蛋白质实施酶解，则肽片段游离到液体中。在检体中的蛋白质被固定于多孔质体的细孔内的情况下，使被固定于具有比多孔质体的细孔径大的粒子直径的微粒子的表面的蛋白酶与固定于细孔内的蛋白质接触，则蛋白酶的可接近空间被限制，因此，能够位置选择性地对蛋白质进行蛋白酶解。在表面固定有蛋白酶的微粒子，例如作为悬浮液从试样导入用开口添加到过滤单元的试样收容空间内即可(S32)。

在位置选择性地对蛋白质进行蛋白酶解的情况下，优选固体表面与蛋白质位置选择性(部位选择性)结合。例如,蛋白A或蛋白G与抗体的Fc区域选择性地结合。因此,如果使用由蛋白A或蛋白G包覆的多孔质体,则抗体的Fc区域被固定在细孔内的表面,能够控制配向性使得抗体的Fab区域朝向细孔的外侧。特别是,由于蛋白A与Fc区域的结合的位置选择性较高,因此为了提高蛋白酶解的位置选择性,优选使用由蛋白A包覆的多孔质体。

在如上所述的多孔质体的细孔内控制抗体的配向的情况下，由于蛋白酶向与多孔质体的结合部位即抗体Fc区域的接近被限制，因此含有抗体的的互补决定区域(CDR)的Fab区域被蛋白酶位置选择性地切割。因此，游离到液体中的肽片段，含有高浓度的肽片段，该肽片段含有对鉴定抗体而言重要的互补决定区域的氨基酸序列。

用如上所述的蛋白酶进行蛋白质的酶解，通常需要在35～60℃的温度下培养3～30小时左右(S32)。即使是在将含有液体的试样收容于过滤单元的试样收容空间内的状态下长时间保持的情况，如果将过滤器作为边界，试样收容空间为负压，则能够防止液体经由过滤器的过滤孔而泄漏。因此，能够不损失试样而维持定量性。

回收对象物质向液体中游离后，过滤单元与封闭单元脱离。通过离心过滤，将过滤单元内的回收对象物质游离后的液体，作为滤液回收至试样回收容器内(S41)。

通过上述的方法得到的试样，根据需要进行稀释、脱盐、纯化等后，进行分析(S51)。例如，通过使用LC/MS/MS的多重反应监测(多反应监测；MRM)，能够对通过nSMOL法制备的肽片段实施定量分析。

[实施例]

以下示出使用本发明的容器组件，基于前述的非专利文献2(Iwamoto et.al,Bioanalysis,2016,8(10),1009-1020.)所记载的协议，通过nSMOL法实施试样制备的方法的一例。另外，本发明并不限于下述的实施例。

将表面由蛋白A包覆的多孔质体的悬浮液(TOYOPEARLAF-rProtein A HC-650F；东曹制,粒子径30～60μm，空孔率86％,树脂浓度50重量％,IgG静态吸附量80g/L)25μL分取到2mL的微型管中。在此,加入含有0.1％的辛基β-D-吡喃葡萄糖苷磷酸缓冲生理盐水(PBS)90μL作为表面活性剂、以及10μL的血浆试样作为检体。进行15分钟平稳地搅拌。通过这些操作,血浆中的抗体被固定于蛋白A包覆树脂的表面。

将试样固定后的蛋白A包覆树脂悬浮液转移到过滤单元，并以10000g进行1分钟的离心过滤。将150μL的含有0.1％的辛基β-D-吡喃葡萄糖苷的PBS加入到过滤单元，以10000g进行1分钟的离心过滤。重复三次该操作，去除表面活性剂的杂质物(附着在蛋白A包覆树脂表面上的膜蛋白质等)。然后，将150μL的PBS加入到过滤单元，以10000g进行1分钟的离心过滤。重复三次该操作，将表面活性剂进行清洗去除。

将过滤单元插入至封闭单元从而将两者组合，将过滤单元的液体排出开口堵住而成为密闭状态。进而，压入过滤单元，直到过滤单元的卡止部抵接于封闭单元。由此，过滤单元与封闭单元之间的空气被压缩成为正压，收容有蛋白A包覆树脂的过滤单元内的试样收容空间相对地成为负压。

将75μL的25mM的Tris-HCl(pH8.0)以及10μL的表面固定有胰蛋白酶且由聚甲基丙烯酸缩水甘油酯包覆的铁氧体纳米颗粒(FG珠；多摩川精机制造，粒子径约200nm)的悬浮液(20mg/mL)加入至过滤单元。将过滤单元与封闭单元的组合体在50℃的饱和蒸汽压下，平稳地搅拌6小时，所述过滤单元收容有固定了胰蛋白酶的纳米粒子、以及固定了检体中的抗体的多孔树脂的悬浮液。

由于蛋白A选择性地与抗体的Fc区域结合，因此在蛋白A包覆树脂的细孔内,抗体的Fab区域被固定为朝向外侧。纳米粒子的粒子径比蛋白A包覆树脂的细孔径大，因此被固定在纳米粒子的表面的胰蛋白酶，不能接近细孔内的蛋白A与抗体的Fc区域的结合部位附近。因此，抗体的Fab区域选择性地被胰蛋白酶切割，游离至液相。

为了通过胰蛋白酶完成蛋白质的切割并确保定量性，需要将液体长时间(例如，如上所述6小时)地保持在容器内。在本实施例中，由于过滤单元与封闭单元组合，因此过滤单元的试样收容空间侧成为负压。因此，即使在试样收容空间内长时间保持液体的情况下，也能够防止液体经由过滤器而泄漏，能够确保定量性。

将5μL10％的甲酸加入到在50°下保持了6小时后的试样并进行稀释后，将封闭单元从过滤单元分离，将新的回收容器与过滤单元组合。以10000g进行1分钟的离心过滤，对回收容器内的滤液进行回收。通过该滤液的LC-MC分析能够进行检体所包含的抗体的鉴定以及定量分析。

在本实施例中，不在中途使固体移动至其他的容器，而使用一个过滤单元，从而进行固定了抗体的固体的清洗、与胰蛋白酶的酶反应、以及酶反应后的液相的回收。因此，除了试样的制备作业简化以外，也能够防止人为的操作的不规律等引起的固体的回收损失。此外，如上所述，与在过滤单元内的蛋白酶反应时，通过过滤单元与封闭单元组合，能够抑制液体的泄漏。因此，能够进行定量性高的分析用试样的制备。

附图标记说明

10 过滤单元

11 壳体

15 试样收容空间

18 试样导入开口

19 液体排出开口

21 过滤器

13 锥形形状外壁面(第一接合部)

30 封闭单元

36 接合用开口

32 锥形形状内壁面(第二接合部)

Claims (12)

1.一种容器组件,包括过滤单元以及相对于所述过滤单元可拆装的封闭单元，

所述过滤单元具备：壳体，其一端设置有可封闭的试样导入开口，其另一端设置有液体排出开口；以及过滤器，固定于所述壳体，

所述试样导入开口能够将固体以及液体导入至由所述壳体以及所述过滤器围成的试样收容空间，

所述液体排出开口能够将透过所述过滤器的滤液排出，

所述过滤单元的壳体具有第一接合部，

所述封闭单元具有构成为能够与所述第一接合部接合的第二接合部，

所述过滤单元的第一接合部以及所述封闭单元的第二接合部构成为，两者接合从而处于气密状态，使得所述液体排出开口在空间上由所述封闭单元封闭，且构成为在维持气密状态下能够进一步压入，使得过滤器与封闭单元之间的距离缩短，

通过所述过滤单元与所述封闭单元之间的压入，使得所述封闭单元与所述过滤器之间的空间相对于所述试样收容空间变为正压。

2.如权利要求1所述的容器组件,其特征在于，所述过滤单元的第一接合部与所述封闭单元的第二接合部具有能够相互嵌合的形状。

3.如权利要求2所述的容器组件,其特征在于，所述过滤单元的第一接合部与所述封闭单元的第二接合部均为锥形形状。

4.如权利要求3所述的容器组件,其特征在于，

所述过滤单元的第一接合部是朝向相对于所述封闭单元压入所述过滤单元时的压入方向缩径的外表面锥形形状，

所述封闭单元的第二接合部是能够与所述第一接合部嵌合的内表面锥形形状。

5.如权利要求1所述的容器组件，其特征在于，

所述封闭单元具有接合用开口，能够使所述壳体的液体排出开口侧的端部通过，

所述壳体贯通所述接合用开口从而插入至所述封闭单元,由此所述过滤单元的壳体的外壁面的第一接合部与所述封闭单元的内壁面的第二接合部相互地嵌合。

6.如权利要求1所述的容器组件，其特征在于，

所述过滤单元的所述液体排出开口的外周的壳体构成第一接合部，

所述封闭单元具有能够使所述第一接合部通过的接合用开口,并以堵住所述接合用开口的方式固定有作为第二接合部的薄膜部件，

所述薄膜部件具有气密密合性以及延伸性，

所述壳体贯通所述接合用开口而插入至所述封闭单元,使得所述薄膜部件在维持封闭所述液体排出开口的状态下被进一步压入,所述薄膜部件发生延伸，由此使得所述薄膜部件与所述过滤介器之间的空间相对于所述试样收容空间成为正压。

7.如权利要求1～6的任一项所述的容器组件，其特征在于，所述封闭单元构成为具有多个第二接合部而能够与多个过滤单元接合。

8.如权利要求1～6的任一项所述的容器组件，其特征在于，

还包括相对于所述过滤单元可拆装的液体回收容器，

所述液体回收容器构成为具有能够装填于离心分离器的外部形状,且能够储存透过了所述过滤器的滤液。

9.一种分析用试样的制备方法，是利用检体制备分析用试样的方法，其特征在于，

依次具有如下步骤：

将检体中的特定的物质固定在固体表面的步骤；

通过离心过滤将未固定在固体表面的杂质成分去除的步骤；

使回收对象物质从固定在固体表面的特定的物质游离至液体中的步骤；以及

对游离在液体中的回收对象物质进行回收的步骤，

使用同一过滤单元实施离心过滤与回收对象物质向液体中的游离，

所述过滤单元具备：壳体，其一端设置有可封闭的试样导入开口，其另一端设置有液体排出开口；以及过滤器，固定于所述壳体，

所述试样导入开口能够将固体以及液体导入至由所述壳体以及所述过滤器围成的试样收容空间，

所述液体排出开口能够将透过所述过滤器的滤液排出，

在离心过滤后，所述过滤单元与所述封闭单元接合，由此在所述液体排出开口在空间上被封闭的状态下进行回收对象物质向液体中的游离，

所述过滤单元的壳体具有第一接合部，

所述封闭单元具有构成为能够与所述第一接合部接合的第二接合部，

所述过滤单元的第一接合部以及所述封闭单元的第二接合部构成为，在两者接合的状态下，所述液体排出开口在空间上被所述封闭单元封闭，

在保持两者的接合状态的同时，进一步压入所述过滤单元以缩短所述过滤器与所述封闭单元之间的距离，由此在使所述封闭单元与所述过滤器之间的空间相对于所述试样收容空间为正压的状态下,实施回收对象物质向液体中的游离。

10.如权利要求9所述的分析用试样的制备方法，其特征在于，

在回收对象物质向液体中游离后，对所述过滤单元与所述封闭单元进行分离，

通过离心过滤对回收对象物质游离后的液体进行回收。

11.如权利要求9或10所述的分析用试样的制备方法，其特征在于，

固定于所述固体表面的特定的物质为蛋白质，

通过利用蛋白酶进行蛋白质的酶解,使作为所述回收对象物质的肽片段游离至液体中。

12.如权利要求11所述的分析用试样的制备方法，其特征在于，

所述固体为多孔质体,在多孔质体的细孔内固定有检体中的蛋白质，

使固定于微粒子的表面的蛋白酶与固定于多孔质体的细孔内的蛋白质接触,由此所述蛋白质被位置选择性地切割,肽片段游离到液体中。