CN109316630A

CN109316630A - 一种生物仿生基质的3d打印墨水及其制备方法

Info

Publication number: CN109316630A
Application number: CN201811375168.5A
Authority: CN
Inventors: 王富友; 张玲
Original assignee: Chongqing Ningjiao Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Chongqing Ningjiao Biology Technology Co ltd; First Affiliated Hospital of Army Medical University
Priority date: 2018-11-19
Filing date: 2018-11-19
Publication date: 2019-02-12
Anticipated expiration: 2038-11-19
Also published as: CN109316630B

Abstract

本发明涉及一种生物仿生基质的3D打印墨水及其制备方法，所述3D打印墨水中物质质量浓度为4～7mg/ml,其物质原料按质量比计由以下组成：胶原蛋白：琥珀酰化胶原蛋白：醛基化硫酸软骨素:醛基化透明质酸为35～45：35～45:10～15:5～15。由本发明的3D打印墨水，可以简单快速的得到无细胞毒性，凝胶强度好的胶原蛋白复合水凝胶，不需要任何额外的交联剂，且其材料力学强度好，体现出良好的软骨重建功能，细胞在复合水凝胶内分散性好，有望成为生物仿生基质的良好材料。

Description

一种生物仿生基质的3D打印墨水及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种生物仿生基质的3D打印墨水及其制备方法。

背景技术

胶原蛋白是生物高分子，动物结缔组织中的主要成分，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，占蛋白质总量的25％～30％，某些生物体甚至高达80％以上。因此胶原蛋白具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性，在食品、医药、组织工程、化妆品等领域获得广泛的应用。

目前研发胶原蛋白水凝胶作为生物修复材料或者软骨修复基质的很多报道，在前期凝胶制备过程中，使用EDAC(碳二亚胺)作为交联剂形成凝胶，尽管文献报道EDAC无毒性或毒性较小，但动物实验证实采用凝胶方式其毒性较强，原因是无法取出交联过程中的副产物及其残余的EDAC。在申请号为201310520057.X的“一种可水解逆转胶原蛋白的水凝胶及其制备方法”的专利中提到将醛基化和酰肼化衍生的糖胺聚糖和胶原蛋白反应，通过醛基衍生化产物和胶原蛋白肽链上的氨基NH₂进行共价键合形成亚胺，进而通过加入糖胺聚糖酰肼化产物实现原位聚合包埋胶原蛋白分子；但最后要形成真正意义上的胶原蛋白水凝胶，还需要加入二乙烯基砜、酰肼类化合物或碳化二亚胺中的一种或多种交联剂，而且这种反应时间较长。故急需对胶原蛋白水凝胶的新方法进行研发。

近年来兴起的生物3D打印技术在组织工程领域得到快速发展，可以通过构建三维立体和结构复杂的支架模型实现生物3D打印，可以更好地模拟细胞微环境，而且兼具高通量、可重复、自动化和精确可控等特点，还可以针对患者病情进行个性化治疗，可见3D生物打印在组织工程领域的发展前景非常广阔。

3D生物打印技术将生物材料在计算机辅助下通过逐层沉积方法组装，可用于组织工程，再生医学和其他生物学研究中活组织和器官的重建。目前，生物打印的材料通常是由水凝胶、微载体、细胞颗粒和脱细胞基质成分构成的的生物墨水。根据生物墨水的固化方式可将3D生物打印方法分为喷墨法、挤出沉积法、光固化成型和激光辅助成型等。其中，喷墨法需使用交联剂作为支撑，影响细胞存活率，挤出沉积法难以在打印材料的生物相容性和可行性之间找到平衡点，光固化成型法和激光辅助生物打印则用到紫外光和激光脉冲，都可能影响到细胞活性和功能。在申请号为201510684279.4的“一种用于3D打印的生物墨水”专利中提到利用有交联功能的水溶性合成聚合物和水溶性天然高分子自发形成生物活性组分，但墨水最后还需要通过紫外光光照固化成型，墨水成分以合成高分子为主，生物相容性有限，而且固化方式操作复杂不利于模型的快速成型。故急需研发操作简便，且生物相容性好的3D打印生物墨水。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种制备无细胞毒性，且凝固时间较快的胶原蛋白水凝胶的生物仿生基质的3D打印墨水，更提供墨水的制备方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1.一种生物仿生基质的3D打印墨水，墨水中物质质量浓度为4～7mg/ml,其物质原料按质量比计由以下组成：胶原蛋白：琥珀酰化胶原蛋白：醛基化硫酸软骨素:醛基化透明质酸为35～45:35～45:10～15:5～15,溶剂为水。

进一步，其物质原料按质量比计由以下组成：胶原蛋白：琥珀酰化胶原蛋白：醛基化硫酸软骨素：醛基化透明质酸为40:40:15:5。

2.一种生物仿生基质的3D打印墨水的制备方法，包括如下步骤：

a.将胶原蛋白琥珀酰化至酰化程度40～70％；

b.再分别将硫酸软骨素和透明质酸醛基化，醛基化程度40～80％；

c.按照质量比将胶原蛋白和a、b步骤产物混合即可。

进一步，步骤a用琥珀酸酐进行酰化反应。

进一步，步骤a胶原蛋白琥珀酰化方法为：室温下，将pH7～7.5质量分数为1～10％的胶原蛋白水溶液，按胶原蛋白：琥珀酰酐质量比为100:15～50计的琥珀酰酐，分次加入胶原蛋白水溶液，并调节稳定pH值在7～7.5；加完后继续反应1～3h终止，再次调节pH值至7～7.5；将产物4℃下进行透析，透析完后离心收集样品进行冷冻干燥备用。

进一步，步骤a胶原蛋白琥珀酰化方法为：室温下，将pH7～7.5质量分数为10％的胶原蛋白水溶液，按胶原蛋白：琥珀酰酐质量比为100:20计的琥珀酰酐，分次加入胶原蛋白水溶液，并调节稳定pH值在7～7.5；加完后继续反应1～3h终止，再次调节pH值至7～7.5；将产物4℃下进行透析，透析完后离心收集样品进行冷冻干燥备用。

进一步，步骤b所述透明质酸醛基化的方法为：将高碘酸钠水溶液缓慢的加入到透明质酸溶液中，所述透明质酸：高碘酸钠质量比为1～3：1，室温条件下反应2～5h，再加入乙二醇使未反应的高碘酸钠失活；反应产物用水或者PBS缓冲液体系中进行透析24～48小时，冷冻干燥后即可。

进一步，所述透明质酸：高碘酸钠质量比为2:1。

进一步，步骤b所述高碘酸钠水溶液摩尔浓度为0.25mol/L；所述透明质酸水溶液的浓度为10mg/ml，高碘酸钠与乙二醇体积比为3～5:1。

进一步，步骤b所述硫酸软骨素醛基化的方法为：按照高碘酸钠与硫酸软骨素反应的物质的量比为1：2在硫酸软骨素水溶液中加入高碘酸钠，避光反应2～6h后，加入乙二醇终止反应，高碘酸钠与乙二醇体积比为3～5:1，30～60min之后，再加入氯化钠，充分溶解后以体积比1:2～4加入无水乙醇，搅拌数分钟后得到絮状沉淀，将反应产物在透析袋中用水或者PBS缓冲液体系中进行透析48～72小时，将产物进行冷冻干燥得醛基化硫酸软骨素。

进一步，所述硫酸软骨素水溶液的质量浓度为10～20mg/ml。

进一步，所述透析袋的截留分子量为8000～14000。

本发明的有益效果在于：本发明通过对胶原蛋白自身的琥珀酰化半改性，进一步少量结合醛基化的硫酸软骨素和透明质酸，可以简单快速的得到无细胞毒性，凝胶强度好的胶原蛋白复合水凝胶，不需要任何额外的交联剂，通过将胶原蛋白和琥珀酰化胶原蛋白按比例配置为溶液A，醛基化的硫酸软骨素和透明质酸按比例配置为溶液B，配合3D生物打印机快速制备成胶原蛋白复合水凝胶，且其材料力学强度好，体现出良好的软骨重建功能，细胞在复合水凝胶内分散性好，有望成为生物仿生基质的增材制作材料。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为骨髓间充质干细胞包埋于生物仿生基质水凝胶的复合材料内共培养第3天的共聚焦显微照片；

图2为软骨细胞包埋于生物仿生基质墨水凝胶内体外培养6天的番红O染色照片。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

(1)胶原蛋白琥珀酰化：配置质量分数为10％的二型胶原蛋白水溶液，pH＝7.5，配置方法：称取计算所配置量的胶原盐酸溶液用蒸馏水进行稀释，调pH值至7.5，然后定容至10％。取一定量中性的10％二型胶原蛋白水溶液置于200ml烧杯，放置在恒温磁力搅拌器上，按胶原蛋白：琥珀酰酐质量比为100:20计算，称取琥珀酰酐，分次加入胶原蛋白水溶液，边搅拌边加入，反应过程中用2moL/L NaOH溶液调节pH值使其稳定在7.5；加完后继续反应3h终止，再次调节pH值至7.5。将琥珀酰化的胶原蛋白置于透析袋中4℃冰箱内进行透析，去出小分子其他杂质；边透析边搅拌，透析过程中每4-8小时换一次水；透析完成后离心收集样品可以直接使用，也可以进行冷冻干燥保存备用。

(2)透明质酸醛基化：将1g的透明质酸溶解在100mL水溶液中，室温条件下搅拌1～3h，随后将10mL的浓度为0.25mol/L高碘酸钠水溶液缓慢的加入到透明质酸溶液中，室温条件下反应2～5h，再加入与高碘酸钠体积比为3～5:1的乙二醇使未反应的高碘酸钠失活。反应产物在透析袋中用水或者PBS缓冲液体系中进行透析24～48小时，每4～8小时换一次液，得醛基化透明质酸，可以直接使用，也可以进行冷冻干燥保存备用。

(3)硫酸软骨素醛基化：将5g的硫酸软骨素溶解在100ml水中，按照高碘酸钠与硫酸软骨素反应的物质的量比为1：2加入高碘酸钠，避光反应4h后，加入乙二醇终止反应，30min～60min之后，加入100mg的氯化钠，充分溶解后以体积比1：2～4加入无水乙醇，搅拌数分钟后得到絮状沉淀，将反应产物在截留分子量为8000～14000的透析袋中用水或者PBS缓冲液体系中进行透析48～72小时，每4～8小时换一次液，得醛基化硫酸软骨素，可以直接使用，也可以进行冷冻干燥保存备用。

实施例2

对实施例1步骤(1)胶原蛋白琥珀酰化进行试验，考虑反应条件尽量简单条件下，反应温度固定在室温20～25℃，配制质量分数10％的胶原蛋白溶液，分别研究pH值(5、7、9)、琥珀酸酐用量(按胶原蛋白质量百分比计算20％，35％，50％)、反应时间(1h、2h、3h)分别对胶原蛋白琥珀酰化改性胶原蛋白酰化程度的影响。酰化程度按照茚三酮法测试：配制质量分数1％胶原蛋白溶液,取lml放入试管中，然后向试管中加入lml的茚三酮显色剂。摇匀，盖塞，在沸水浴中加热16min，取出，在20℃的水浴中冷却，再向试管中加入5ml的KIO₃稀释液，摇匀，在30min内用10mm的比色皿在570nm波长处测其吸光度，其中以蒸馏水/茚三酮溶液作空白，吸光度表示游离氨基与茚三酮溶液的反应程度，吸光度越大表示改性蛋白的酰化程度越低，也可以根据公式计算：

酰化反应程度＝(未改性胶原蛋白的OD值-改性胶原蛋白的OD值)/未改性胶原蛋白的OD值×100％。

并加入胶原蛋白、醛基化的透明质酸和硫酸软骨素同时检测其成凝胶时间，分别配置成质量分数为5mg/ml的溶液，按胶原蛋白：琥珀酰化胶原蛋白：醛基化硫酸软骨素：醛基化透明质酸体积比为3.5:3.5:1.5:1.5混合，分别于室温下和37℃下观察其成凝胶时间，每2分钟观察一次，成胶之前，溶胶粘稠、可以流动；成凝胶后，将凝胶倒置5min，不会发生流动。其结果如表1所示。

表1不同条件胶原蛋白琥珀酰化程度及对成胶影响

实施例3

(1)胶原蛋白琥珀酰化：配置质量分数为10％的二型胶原蛋白水溶液，pH＝7.5，配置方法：称取计算所配置量的胶原盐酸溶液用蒸馏水进行稀释，调pH值至7.5，然后定容至10％。取一定量中性的10％二型胶原蛋白水溶液置于200ml烧杯，放置在恒温磁力搅拌器上，按胶原蛋白：琥珀酰酐质量比为100:35计算，称取琥珀酰酐，分次加入胶原蛋白水溶液，边搅拌边加入，反应过程中用2moL/L NaOH溶液调节pH值使其稳定在7.5；加完后继续反应3h终止，再次调节pH值至7.5。将琥珀酰化的胶原蛋白置于透析袋中4℃冰箱内进行透析，去除小分子其他杂质；边透析边搅拌，透析过程中每4～8小时换一次水。透析完成后离心收集样品进行低温冻干保存备用。

(2)透明质酸醛基化：将1g的透明质酸溶解在100mL水溶液中，室温条件下搅拌1～3h，随后将10mL的浓度为0.25mol/L高碘酸钠水溶液缓慢的加入到透明质酸溶液中，室温条件下反应2～5h，再加入与高碘酸钠体积比为3～5:1的乙二醇使未反应的高碘酸钠失活。反应产物在截留分子量为8000～14000的透析袋用水或者PBS缓冲液体系中进行透析24～48小时，每4-8小时换一次液，得到醛基化透明质酸。

(3)硫酸软骨素醛基化：将5g的硫酸软骨素溶解在100ml水中，按照高碘酸钠与硫酸软骨素反应的物质的量比为1：2加入高碘酸钠，避光反应4h后，加入乙二醇终止反应，30min～60min之后，加入100mg的氯化钠，充分溶解后以体积比1：2～4加入无水乙醇，搅拌数分钟后得到絮状沉淀，将反应产物在截留分子量为8000～14000的透析袋用中用水或者PBS缓冲液体系中进行透析48～72小时，每4～8小时换一次液，得醛基化硫酸软骨素，可以直接使用，也可以进行冷冻干燥保存备用。

分别取胶原蛋白及以上的胶原蛋白酰化产物，透明质酸醛基化产物和硫酸软骨素醛基化产物配置成质量分数为5mg/ml的溶液，按照表2的体积配比加入各物质，考察不同配比下凝胶形成的时间。

表2各产物原料体积配比

实施例4体外细胞毒性实验

我国医用高分子材料的研究起步比较早发展较快，从上世纪五十年代中期就开展了人工血管的研制，各种生物医学材料的应用为医学、药学、生物学等学科的发展提供了丰富的物质基础。生物医学材料是一种具有特殊性能、特种功能，用于人工器官、外科修复、理疗康复、诊断、检查治疗疾患等医疗、保健领域，而对人体组织、血液不产生任何不良影响的材料。生物材料的生物相容性研究一直是生物医学材料研究中的一个重要内容，而体外细胞毒性实验是一种快速、简便、安全、重复性好又廉价的检测材料生物相容性方法。

取实施例3各组合的产物灭菌后按照0.1g/mL的浓度加入细胞培养液中，37℃下浸提24h。取对数生长期的L929成纤维细胞，调节细胞浓度为5.0×10⁴个/mL，接种于96孔细胞培养板(每孔100ul，每个样品一板设置12个平行孔，分别设置3板，在不同时间段观察统计)。细胞培养24h(RPMI1640培养液+10％胎牛血清，37℃，5％CO₂)后，将培养液换成水凝胶浸提液。设立正常对照组，空白对照组，每组12个平行孔。培养24、48、72小时时倒置显微镜下观察细胞生长情况，并用MTT法测定492nm处光吸收值(OD值)计算细胞相对增殖率(RGR)。计算公式为：

细胞增殖率(RGR)％＝(实验组OD平均值－空白对照组OD平均值)/(正常对照OD平均值－空白对照组OD平均值)×100％

细胞毒性分级：0级，RGR≥100％；1级，99％＞RGR≥75％；2级，74％＞RGR≥50％；3级，49％＞RGR≥25％；4级，24％＞RGR≥1％；5级，RGR等于0％。

结果发现在24小时和48小时时倒置显微镜下观察的L929细胞生长状态良好，72小时时各组细胞有收缩，但和正常对照一致。MTT法测定各水凝胶浸提液的细胞毒性结果见表3，结果显示实验组的吸光值和细胞增殖率比对照组略高，但无显著差异，说明水凝胶对细胞生长无明显抑制作用，细胞毒性为0级。

表3实施例3各组凝胶细胞毒性实验结果

实施例5

1)墨水的配置：按照墨水浓度为5mg/ml,配置1000ml。在4℃环境下，取胶原蛋白1.75g，琥珀酰化胶原蛋白冻干粉2.25g用500ml无菌去离子水溶解成生物仿生基质墨水A，再将醛基化硫酸软骨素冻干粉0.65g和醛基化透明质酸冻干粉0.35g用另一份500ml无菌去离子水溶解成生物仿生基质墨水B。

2)利用3D生物打印机将生物仿生基质墨水A和生物仿生基质墨水B按照建好的数字模型，由0～4℃的墨水注射筒经A、B针头交叉打印到35～37℃的接收平台上，打印后，在35～37℃环境下储存3分钟等待墨水进一步凝固，形成生物仿生基质水凝胶的复合材料。

3)将打印的圆柱状生物仿生基质水凝胶的复合材料支架置于电子万能材料测试机承压板上，于室温下加压测试凝胶的压缩性能，压缩速率为5mm/min。试样形状为圆柱形，尺寸大小为Φ35×18。由于生物仿生基质水凝胶的复合材料具有类似橡胶的高弹性，试样难以压碎。因此，在所有压缩试验过程中，将试样压缩至应变量为50％时即停止压缩。计算压缩模量为55.23±0.66kPa，25％应变下的应力为15.79±0.35kPa，充分体现本发明生物仿生基质墨水所制备的水凝胶的复合材料力学强度好。

打印时为微量反应凝固时间比测试的凝固时间更短。

实施例6

1)墨水的配置：按照墨水浓度为5mg/ml,配置1000ml。在4℃环境下，取胶原蛋白2g，琥珀酰化胶原蛋白冻干粉2g用500ml无菌去离子水溶解成生物仿生基质墨水A，再将醛基化硫酸软骨素冻干粉0.75g和醛基化透明质酸冻干粉0.25g用另一份500ml无菌去离子水溶解成生物仿生基质墨水B。

2)将自生物体中提取的骨髓间充质干细胞进行传代培养，取第三代骨髓间充质干细胞用PBS洗涤2次、离心去除PBS，用含胎牛血清的α-MEM培养液重悬并计数。

3)在生物仿生基质墨水B中加入经计数的骨髓间充质干细胞。

4)利用3D生物打印机将生物仿生基质墨水A和混合骨髓间充质干细胞的墨水B按照建好的数字模型，由墨水注射筒经A、B针头交叉打印到接收平台上，打印后，在35～37℃环境下储存3分钟等待墨水进一步凝固。

5)将打印的骨髓间充质干细胞-生物仿生基质水凝胶的复合材料放入含胎牛血清的α-MEM培养液中培养。

6)复合材料培养3天后，从培养基中取出，用H33258染色3～5min，然后PBS溶液清洗3min，用共聚焦荧光显微镜观察骨髓间充质干细胞的增殖与分布情况，如图1所示。由图1可知，骨髓间充质干细胞在生物仿生基质水凝胶的复合材料内呈均匀分布，且数量增殖明显，充分体现本发明生物仿生基质墨水所制备的水凝胶的复合材料细胞分散性好。

实施例7

1)墨水的配置：按照墨水浓度为5mg/ml,配置1000ml。在4℃环境下，取胶原蛋白1.9g，琥珀酰化胶原蛋白冻干粉2.1g用500ml无菌去离子水溶解成生物仿生基质墨水A，再将醛基化硫酸软骨素冻干粉0.75g和醛基化透明质酸冻干粉0.25g用另一份500ml无菌去离子水溶解成生物仿生基质墨水B。

2)将自生物体中提取的软骨细胞进行传代培养，取第三代软骨细胞用PBS洗涤2次、离心去除PBS，用含小牛血清的高糖DMEM培养液重悬并计数。

3)在墨水B中加入经计数的软骨细胞。

4)利用3D生物打印机将生物仿生基质A和混合软骨细胞的墨水B按照建好的数字模型，由墨水注射筒经A、B针头交叉打印到接收平台上，打印后，在35～37℃环境下储存3分钟等待墨水进一步凝固。

5)将打印的软骨细胞-生物仿生基质水凝胶的复合材料放入含小牛血清的高糖DMEM培养液中培养。

6)复合材料培养6天后，从培养基中取出，以中性福尔马林固定24小时，再经梯度酒精脱水、浸蜡、包埋，石蜡切片，采用番红O染色观察细胞形貌及分布，如图2所示。

由图2可知，软骨细胞在水凝胶内呈均匀分布，经过6天体外培养，形成软骨陷窝并分泌粘多糖基质，水凝胶结构完整，充分体现本发明生物仿生基质墨水所制备的水凝胶的复合材料的软骨重建功能好。

本发明生物仿生基质墨水中还可以根据组织工程需要添加人类胚胎干细胞hESCs、骨髓充质间干细胞、小鼠正常肝细胞AML12、小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3、小鼠心肌细胞HL1细胞，或者BMP、肿瘤生长因子(TGF)-P、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、膜岛素样生长因子(IGF)等诱导因子。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种生物仿生基质的3D打印墨水，其特征在于，墨水中物质质量浓度为4～7mg/ml,其物质原料按质量比计由以下组成：胶原蛋白：琥珀酰化胶原蛋白：醛基化硫酸软骨素:醛基化透明质酸为35～45:35～45:10～15:5～15。

2.根据权利要求1所述的生物仿生基质的3D打印墨水，其特征在于，其物质原料按质量比计由以下组成：胶原蛋白：琥珀酰化胶原蛋白：醛基化硫酸软骨素:醛基化透明质酸为40:40:15:5。

3.根据权利要求1或2所述的生物仿生基质的3D打印墨水的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

a.将胶原蛋白琥珀酰化至酰化程度40～70％；

c.按照质量比将胶原蛋白和a、b步骤产物混合即可。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤a用琥珀酸酐进行酰化反应。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，胶原蛋白琥珀酰化方法为：室温下，将pH7～7.5质量分数为1～10％的胶原蛋白水溶液，按胶原蛋白：琥珀酰酐质量比为100:15～50计的琥珀酰酐，分次加入胶原蛋白水溶液，并调节稳定pH值在7～7.5；加完后继续反应1～3h终止，再次调节pH值至7～7.5；将产物4℃下进行透析，透析完后离心收集样品进行冷冻干燥备用。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述透明质酸醛基化的方法为：将高碘酸钠水溶液缓慢的加入到透明质酸溶液中，所述透明质酸：高碘酸钠质量比为1～3：1，室温条件下反应2-5h，再加入乙二醇使未反应的高碘酸钠失活；反应产物用水或者PBS缓冲液体系中进行透析24～48小时，冷冻干燥后即可。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述高碘酸钠水溶液摩尔浓度为0.25mol/L；所述透明质酸水溶液的浓度为10mg/ml，高碘酸钠与乙二醇体积比为3～5:1。

8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述硫酸软骨素醛基化的方法为：按照高碘酸钠与硫酸软骨素反应的物质的量比为1:2在硫酸软骨素水溶液中加入高碘酸钠，避光反应2～6h后，加入乙二醇终止反应，高碘酸钠与乙二醇体积比为3～5:1，30～60min之后，再加入氯化钠，充分溶解后以体积比1:2～4加入无水乙醇，搅拌数分钟后得到絮状沉淀，将反应产物在透析袋中用水或者PBS缓冲液体系中进行透析48～72小时，将产物进行冷冻干燥得醛基化硫酸软骨素。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述硫酸软骨素水溶液的质量浓度为10～20mg/ml。

10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述透析袋的截留分子量为8000～14000。