CN109316622A - 氯化壳聚糖抗菌材料及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种氯化壳聚糖抗菌材料及其制备方法和应用。本发明的抗菌材料包括基质和功能基团，所述基质为壳聚糖膜，所述功能基团为氯胺基即N‑Cl，包含在所述壳聚糖膜上。本发明的抗菌材料对革兰氏阳性菌及阴性菌都有很好的抗菌效果，抗菌性能与阳极电量呈正相关，细胞相容性好，制备工艺快速绿色可控。

Description

氯化壳聚糖抗菌材料及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种抗菌材料及其制备方法和应用，具体地涉及一种具有氯胺即N-Cl共价键结构的氯化壳聚糖抗菌材料及其制备方法和应用。

背景技术

皮肤作为人体最大的器官，在日常活动中受伤几率最大。皮肤一旦形成伤口，细菌极易侵入导致感染，延长伤口愈合时间，严重者会导致败血症危及生命。目前，临床上普遍采用的注射抗生素方法易导致耐药细菌的产生。因此，对非抗生素类抗菌型伤口敷料的研究开发受到广泛关注。

目前抗菌敷料的制备工艺主要包括聚合法、静电纺丝法、溶胶凝胶法等。这些方法都存在着制备过程复杂、使用大量有机试剂、生物相容性差、无法精确控制抗菌成分的含量等缺点。

因此，本领域迫切需要开发制备工艺简单且绿色、结构及功能可控、生物相容性好的抗菌伤口敷料。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有氯胺即N-Cl共价键结构的抗菌材料及其制备方法和应用。

本发明第一方面，提供一种抗菌材料，所述抗菌材料包括：

(1)基质，所述基质为壳聚糖膜；和

(2)功能基团，所述功能基团为氯胺基即N-Cl，包含在所述壳聚糖膜上。

在另一优选例中，所述抗菌材料为氯化壳聚糖膜。

在另一优选例中，通过电化学氯化法在所述基质上原位生成所述功能基团。无需添加接枝剂或浸泡在有机试剂中。

在另一优选例中，所述电化学氯化法为电化学阳极氯化法。

在另一优选例中，任选地改变阳极电量大小制备不同氯化程度的抗菌材料。

在另一优选例中，所述基质的重均分子量范围为5万-22万，较佳地为10万-20万，更佳地为12万-18万。

在另一优选例中，所述基质与功能基团的质量比范围为33000:1-40:1，较佳地为118:1-40:1，更佳地为49:1-40:1。

在另一优选例中，以含氯化钠的磷酸盐缓冲溶液为电解液，施加阳极电量后，溶液中Cl^-失去电子生成氯气，氯气进一步水解形成氧化剂HClO，HClO与壳聚糖中的伯胺和/或酰胺反应，生成伯胺氯胺功能基团和/或酰胺氯胺功能基团，结构式分别如下所示：

在另一优选例中，所述抗菌材料包含结构单元A：

且所述抗菌材料的重均分子量为5万-22万。

在另一优选例中，所述抗菌材料还包含结构单元B：

在另一优选例中，所述抗菌材料还包含以下一种或两种结构单元：

在另一优选例中，所述抗菌材料的紫外可见光谱中，在325nm处具有特征峰。

在另一优选例中，所述抗菌材料的X射线光电子能谱中，在273.2eV和200.6eV处具有特征峰。

在另一优选例中，所述抗菌材料的X射线光电子能谱各元素分谱中，在401.6eV和197.7eV和199.3eV和/或200.6eV和202.3eV处具有特征峰。

在另一优选例中，所述抗菌材料的X射线光电子能谱分谱中，N-Cl/N-H峰面积比范围为0-0.765，N-Cl/N-H峰面积比与阳极电量呈正相关。

在另一优选例中，所述功能基团水平为0.0096-228.74μg/(1cm²)。

在另一优选例中，所述功能基团水平为0.0096-6.48μmol/(1cm²)，较佳地为0.30-1.43μmol/(1cm²)，更佳地为2.64-4.26μmol/(1cm²)，最佳地为4.92-5.97μmol/(1cm²)。

在另一优选例中，所述功能基团水平为0.34-228.74μg/(1cm²)，较佳地为10.56-50.35μg/(1cm²)，更加地为93.19-150.53μg/(1cm²)，最佳地为173.68-210.90μg/(1cm²)。

本发明中，所述功能基团水平是指单位面积抗菌材料中含有的功能基团的物质的量或质量。

本发明第二方面，提供一种如本发明第一方面所述的抗菌材料的制备方法，包括步骤：

(a)提供一电极回路，铂片电极作为工作电极，其同时作为制备抗菌材料的模板；

(b)将所述工作电极浸入含有壳聚糖的电解液后，施加阴极电压，在所述工作电极上沉积一层壳聚糖水凝胶膜；

(c)将经步骤(b)处理的工作电极浸入含氯化钠的电解液中，施加阳极电压，得到所述抗菌材料。

在另一优选例中，所述制备方法中采用的电极回路为三电极体系，即包含工作电极，辅助电极和参比电极。

在另一优选例中，所述电解液中壳聚糖溶液的浓度为5-20mg/ml，较佳地为6-15mg/ml，更佳地为8-10mg/ml。

在另一优选例中，含有壳聚糖的电解液为壳聚糖的盐酸溶液。在另一优选例中，所述壳聚糖的盐酸溶液的pH为4.8-6.8，较佳地为5.0-6.0，更佳地为5.2-5.8。

在另一优选例中，施加的阴极电压为1-3V，沉积时间为1-10min。

在另一优选例中，施加的阴极电压为2V，沉积时间为300s。

在另一优选例中，所述步骤(c)中所述电解液中氯化钠的浓度为0.1-1mol/L。

在另一优选例中，所述步骤(c)中所述电解液中氯化钠的浓度为0.3-0.8或0.4-0.6或0.5mol/L。

在另一优选例中，所述步骤(c)中，施加电压产生阳极电量为0.51-20.53C

在另一优选例中，所述制备方法还包括将所述抗菌材料从工作电极上剥离下来，得到自支持的抗菌材料。

在另一优选例中，所述功能基团水平与阳极电量呈正相关。

在另一优选例中，所述抗菌材料的抗菌性能与阳极电量呈正相关。

在另一优选例中，所述三电极体系具有选自下组的一个或多个特征：

(a)工作电极包括铂片；

(b)辅助电极包括铂丝；

(c)参比电极包括银/氯化银；

(d)沉积条件为恒电压沉积；

(e)阴极电压范围1V-3V；和/或

(f)步骤(d)中沉积时间为1-10min(较佳地为3-6min)。

在另一优选例中，所述含有壳聚糖的电解液的配制如下：配制壳聚糖水溶液，加盐酸调节pH至5-6；搅拌过夜后离心去除未溶解部分得到壳聚糖溶液。在三电极系统中以上述壳聚糖溶液为电解液，施加阴极电压，在阴极沉积一层壳聚糖水凝胶。

在另一优选例中，所述步骤(c)中，所述电解液中氯化钠的浓度为0.1-1M(较佳地为0.3-0.6M，更佳为0.5M(mol/L))。

在另一优选例中，含氯化钠的电解液为含氯化钠的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液包含：磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、或其组合。

在另一优选例中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01-0.20M(较佳地为0.05-0.15M)，和/或pH为6.8-7.8(较佳地为7.0-7.6)。

在另一优选例中，所述制备方法还包括步骤：用超纯水多次洗涤所述抗菌材料，去除材料中残余的HClO。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：

(a)提供阴极电沉积的壳聚糖水凝胶作为基质；

(b)将所述沉积在电极表面的壳聚糖水凝胶浸入含氯化钠的磷酸盐缓冲溶液中，施加阳极电量，得到所述抗菌材料，用超纯水多次洗涤所述材料，去除材料中残余的HClO，任选地改变阳极电量大小制备不同氯化程度的抗菌材料；

(c)将所述抗菌材料从电极表面剥离，得到自支撑的氯化壳聚糖抗菌材料；

本发明第三方面，提供一种如本发明第一方面所述的抗菌材料的应用，用于制备促进人体创面部位组织愈合的抗菌材料。

在另一优选例中，所述抗菌材料用于制备促进人体表皮创面愈合的抗菌材料。

本发明的抗菌材料对革兰氏阳性菌及阴性菌都有很好的抗菌效果，抗菌性能与阳极电量呈正相关，细胞相容性好，制备工艺快速绿色可控。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为Chit和Chit-Cl的紫外可见光谱图。

图2为Chit和Chit-Cl的X射线光电子能谱图。

图3为Chit和不同阳极电量制备的Chit-Cl的X射线光电子能谱各元素分谱图。

图4为碘量滴定法对不同阳极电量制备的Chit-Cl中氯胺即N-Cl含量的表征结果图。

图5为不同阳极电量制备的Chit-Cl抗菌能力图。

图6为不同阳极电量制备的Chit-Cl细胞相容性结果图。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，首次通过电化学阳极氯化法研发出一种具有氯胺即N-Cl结构的抗菌材料，所述抗菌材料为一种氯胺改性的壳聚糖膜。本发明的抗菌材料中，功能基团氯胺即N-Cl的水平与阳极电量呈正相关，材料的抗菌性能优异，且与阳极电量呈正相关。在此基础上，完成了本发明。

术语说明

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

如本文所用，Chit代表壳聚糖，Chit-Cl代表氯化壳聚糖膜，Chit-Cl _{x C}的下标x C代表阳极电量。

如本文所用，“抗菌材料”、“氯化壳聚糖膜”、“抗菌敷料”均具有相同的含义，可互换使用。

伯胺氯胺功能基团和酰胺氯胺功能基团

所述功能基团包括伯胺氯胺功能基团和酰胺氯胺功能基团。

所述伯胺氯胺功能基团和酰胺氯胺功能基团的结构如下：

抗菌材料

本发明的抗菌材料，包括基质和功能基团，相较于壳聚糖，在325nm、401.6eV、197.7eV和199.3eV和/或200.6eV和202.3eV处均具有典型的N-Cl特征峰。

在另一优选例中，所述抗菌材料中的氯胺功能基团具有强氧化性，结构中的氯原子呈现+1价，氯胺能够通过接触细菌或释放氯正离子，破坏细菌细胞壁，氧化细菌细胞内蛋白质或关键酶等物质，从而杀死细菌，所述抗菌材料对革兰氏阳性菌及阴性菌都有很好的抗菌效果。

本发明的抗菌材料中对各种致病菌具有很好的抗菌活性，结构及功能能够通过电信号进行调控，制备方法快速绿色且成本低，适用范围广。

壳聚糖

壳聚糖分子中的氨基和羟基具有较高的反应活性。此外，壳聚糖生物相容性好，来源广。本发明以电沉积壳聚糖水凝胶作为基质，通过电化学阳极氯化法使壳聚糖基质中原位生成功能基团氯胺，对多种致病菌具有良好的抗菌活性。

本发明采用的壳聚糖水凝胶，可以采用本领域已知的各种方法制备，没有特别的限制。优选地，本发明的壳聚糖的脱乙酰化程度范围75-85％。

氯胺

氯胺化合物是结构中具有一个或多个N-Cl共价键的化合物，通常由伯胺、酰胺或亚胺的氯化过程得到。

本发明提供的抗菌材料通过阳极氯化使壳聚糖上的伯胺或酰胺发生氯化，生成氯胺功能基团。

在另一优选例中，所述功能基团水平为0.0096-6.48μmol/(1cm²)，较佳地为0.30-1.43μmol/(1cm²)，更佳地为2.64-4.26μmol/(1cm²)，最佳地为4.92-5.97μmol/(1cm²)。

在另一优选例中，所述功能基团水平为0.34-228.74μg/(1cm²)，较佳地为10.56-50.35μg/(1cm²)，更加地为93.19-150.53μg/(1cm²)，最佳地为173.68-210.90μg/(1cm²)。

电化学技术

本发明首先采用电化学阴极沉积法在阴极沉积一层壳聚糖水凝胶，再通过阳极氯化法使壳聚糖基质中原位生成氯胺功能基团，通过调节阳极电量对抗菌材料的结构及抗菌性能进行调控，制备过程简单且绿色。

抗菌活性

本发明的抗菌材料通过氯胺抗菌，抗菌活性与阳极电量呈正相关，且不会像抗生素那样产生细菌耐药性。

在另一优选例中，当阳极电量为7.89C-20.53C时，抗菌材料对阴性菌和阳性菌(10⁵CFU/ml)均具有100％的抗菌效果。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明利用电化学阴极沉积和阳极氯化两步法制备抗菌材料，制备方法快速绿色，且能够通过电信号对材料的结构及抗菌性能进行调控。

(2)本发明的抗菌材料通过氯胺抗菌，对革兰氏阴性菌和阳性菌均具有优异的抗菌效果，且不会产生细菌耐药性。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

通用材料和方法

1.壳聚糖：购自西格玛奥德里奇，粘度(1wt％溶于1％醋酸)200-800cP。

2.培养基：购自上海疾控中心。

3.杀菌率测试方法：通过梯度稀释涂板得到存活的细菌数目。

杀菌率＝(初始细菌数目-存活细菌数目)/初始细菌数目*100％。

实施例1：抗菌材料1的制备

(1)阴极沉积制备壳聚糖水凝胶

称取0.5g壳聚糖于45mL超纯水中，在搅拌器上搅拌2-3h，随后用2ml HCl(1M)调节pH至5-6。搅拌过夜，离心去除极少量未溶解部分，得到10mg/mL的壳聚糖水溶液。

利用电化学工作站CHI 660E在三电极系统中以壳聚糖溶液为电解液，选取铂片作为工极，铂丝作为辅助电极，银/氯化银作为参比电极，施加阴极电压，采用恒电压-2V沉积，沉积时间5分钟，在阴极沉积一层壳聚糖水凝胶。

(2)制备含0.5M NaCl的PB缓冲溶液

称取适量Na₂HPO₄·12H₂O和KH₂PO₄溶于超纯水中，调节pH至7.0，配制成0.1M的PB缓冲溶液。称取1.17g NaCl固体，溶于40mL PB缓冲溶液中，配制成含0.5M NaCl的PB缓冲液。

(3)阳极氯化制备抗菌材料1

将对电极和参比电极用超纯水冲洗干净，与沉积有壳聚糖膜的工作电极一起浸入电解液中，与电化学工作站连接，选择恒电压法，施加不同阳极电量(0.51-20.53C)，得到不同氯化程度的壳聚糖膜。用镊子将氯化壳聚糖膜从电极上剥落，超纯水多次洗涤，获得抗菌材料1。

实施例2：抗菌材料的表征

Chit和Chit-Cl的紫外可见光谱图如图1所示，相对于壳聚糖水凝胶，抗菌材料1在325nm处出现一个宽吸收峰，对应于N-Cl键的解离，表明壳聚糖氯化的发生。

Chit和Chit-Cl的X射线光电子能谱图如图2所示，相比于壳聚糖水凝胶Chit，抗菌材料Chit-Cl谱图中出现Cl 2s和Cl 2p信号峰，表明氯化壳聚糖中N-Cl键的存在。

实施例3：抗菌材料的化学结构表征

Chit和不同阳极电量制备的Chit-Cl的X射线光电子能谱各元素分谱图如图3所示。在N 1s分谱图中，相比于Chit，Chit-Cl在401.6eV处出现N-Cl信号峰，随着阳极电量的增加，N-Cl/N-H的比例逐渐增大，定性表明N-Cl即氯胺含量与阳极电量呈正相关。Cl 2p谱图中，Chit没有Cl信号峰出现。当阳极电量相对较低，为0.51C时，Chit-Cl_0.51C谱图中出现伯胺氯胺信号峰，即-NH-Cl结构。而当阳极电量增加，Chit-Cl_7.89C、Chit-Cl_18.37C和Chit-Cl_20.53C时，Cl 2p谱图中进一步出现酰胺氯胺信号峰，即O＝C-N-Cl结构，表明只有消耗更多阳极电量时才会发生酰胺的氯化。C 1s谱图中，与Chit相比，Chit-Cl谱图中C＝O/O-C-O/C-O/C-N的比例增大，且随着阳极电量的增加而增大，表明HClO将壳聚糖上的-OH氧化生成-CHO，阳极电量可对Chi-Cl结构含量进行调控。

实施例4：抗菌材料N-Cl含量的表征

碘量滴定原理：N-Cl能够将I^-氧化为能够与淀粉发生显色反应的I₂，使溶液变为蓝色，通过滴加硫代硫酸钠溶液能够将形成的碘单质还原，溶液变成无色时为滴定终点。实验过程中观察到，N₂气氛下Chit不能将KI氧化为I₂，溶液呈无色。根据反应方程式，通过消耗的硫代硫酸钠溶液的体积可推出N-Cl的物质的量，从而得到单位面积上的N-Cl含量。

采用不同阳极电量制备的Chit-Cl的N-Cl含量如图4所示。当阳极电量较低，为0.51±0.032C时，Chit-Cl中N-Cl的含量很小，为0.0096±0.00022μmol/cm²。随着阳极电量的升高，Chit-Cl膜中的N-Cl含量逐渐增加，最高为6.48±0.57μmol/cm²，表明Chit-Cl中N-Cl含量与阳极电量正相关。

实施例5：抗菌材料的抗菌能力检测

以大肠杆菌(E.coli，购自中国微生物菌种中心)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA，购自中国微生物菌种中心)为细菌模型，以正常菌液作为空白对照组(Control组)，以壳聚糖膜(Chit)作为材料对照组。

在50％营养肉汤培养基中，将抗菌材料与细菌共培养，通过梯度稀释涂板记录菌落数并计算杀菌率。

取10mg实施例1中的材料Chit和Chit-Cl分别与1mL细菌溶液(大肠杆菌/金黄色葡萄球菌，10⁵CFU/mL，50％营养肉汤)在37℃孵育，24h后将菌液梯度稀释，取200μL涂板，37℃培养15h，记录菌落数并计算杀菌率。

抗菌材料的抗菌能力如图5所示，Chit几乎不能抑制细菌的生长，Chit-Cl的抗菌性能显著优于Chit。阳极电量较高时，Chit-Cl_7.89C、Chit-Cl_18.37C和Chit-Cl_20.53C对E.coli和MRSA的杀菌率均达到100％，而Chit-Cl _0.51C对E.coli和MRSA的杀菌率分别为50％和18％，表明N-Cl含量越高，抗菌性能越强，Chit-Cl膜的抗菌性能取决于阳极氯化电量的高低。

实施例6：抗菌材料细胞相容性表征

以人表皮细胞HaCaT(购自中科院细胞库)为细胞模型，以1×10⁵/cm²的密度接种到细胞培养板上，贴壁生长24h后移除细胞培养液，分别加入Chit、不同阳极电量制备的Chit-Cl和新的培养液，孵育24h后取出材料加入噻唑蓝(MTT)(1mg/ml)，37℃孵育4h后加入DMSO，10min后取孵育液200μL测492nm处的吸光值。

生物相容性结果如图6所示，以未加任何材料的空白细胞为对照组，Chit组和Chit-Cl组HaCaT细胞存活率都在100％左右，说明Chit和Chit-Cl均具有良好的细胞相容性，不同N-Cl含量的Chit-Cl膜的细胞相容性无统计学差异，表明实验所用的N-Cl含量在0.0063μmol/cm²至6.48μmol/cm²范围内的Chit-Cl膜细胞相容性良好，具有用于生物医学应用的潜力。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种抗菌材料，其特征在于，所述抗菌材料包括：

(1)基质，所述基质为壳聚糖膜；和

(2)功能基团，所述功能基团为氯胺基即N-Cl，包含在所述壳聚糖膜上。

2.如权利要求1所述的抗菌材料，其特征在于，所述基质的重均分子量范围为5万-22万。

3.如权利要求1所述的抗菌材料，其特征在于，所述基质与功能基团的质量比范围为33000:1-40:1。

4.如权利要求1所述的抗菌材料，其特征在于，所述功能基团水平为0.0096-228.74μg/(1cm²)。

5.如权利要求1所述的抗菌材料，其特征在于，所述抗菌材料包含结构单元A：

且所述抗菌材料的重均分子量为5万-22万。

6.如权利要求5所述的抗菌材料，其特征在于，所述抗菌材料还包含结构单元B：

7.如权利要求5或6所述的抗菌材料，其特征在于，所述抗菌材料还包含以下一种或两种结构单元：

8.一种如权利要求1所述的抗菌材料的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

(a)提供一电极回路，铂片电极作为工作电极，其同时作为制备抗菌材料的模板；

(b)将所述工作电极浸入含有壳聚糖的电解液后，施加阴极电压，在所述工作电极上沉积一层壳聚糖水凝胶膜；

(c)将经步骤(b)处理的工作电极浸入含氯化钠的电解液中，施加阳极电压，得到所述抗菌材料。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包含以下一个或多个特征：

(1)所述步骤(a)中，所述电极回路采用三电极体系，即包含工作电极，辅助电极和参比电极；

(2)所述步骤(b)中，所述电解液中壳聚糖的浓度为5-20mg/ml；

(3)所述步骤(b)中，施加的阴极电压为1V-3V，沉积时间为1-10min；

(4)所述步骤(c)中，所述电解液中氯化钠的浓度为0.1-1mol/L；

(5)所述步骤(c)中，施加电压产生阳极电量为0.51-20.53C；

10.如权利要求1所述的抗菌材料的应用，其特征在于，用于制备促进人体创面部位组织愈合的抗菌材料。