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CN109316601A - 药物组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种药物组合物，具体地，药物组合物包括第一组分和第二组分，第一组分为选自ASK1抑制剂及其前体、活性代谢产物、立体异构体、药学上可接受的盐、酯类和溶剂合物中的至少之一；第二组分为选自PPAR调节剂及其前体、活性代谢产物、立体异构体、药学上可接受的盐、酯类和溶剂合物中的至少一种。本发明的药物组合物可用于治疗和/或预防非酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪性肝炎。

Description

药物组合物及其用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体而言，本发明涉及一种药物组合物及其用途，尤其是涉及一种有效治疗或预防非酒精性脂肪肝病的药物组合物及其制备方法和应用。
背景技术
肝脏是脂肪代谢的重要器官，正常情况下脂肪占肝脏总重量的3％～5％，正常人每100g肝湿重含4～5g脂类，其中磷脂占50％以上，三酰甘油占20％，游离脂肪酸占20％，胆固醇约7％，其余为胆固醇脂等。当肝细胞内脂质蓄积超过肝湿重的5％，或组织学上每单位面积见1/3以上肝细胞脂肪变时即称为脂肪肝。非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fattyliver disease，NAFLD)指除酒精和其他明确的肝损伤(如药物性肝损伤)之外的因素所导致的肝细胞内脂肪过度沉积而引起的疾病，近年来发展迅速，成为最普遍的肝脏疾病之一。欧美等西方发达国家的成人NAFLD患病率为20％～33％，亚洲国家NAFLD患者数增长迅速且呈低龄化发病趋势，中国上海、广州和香港等发达地区成人NAFLD患病率约在15％。
NAFLD的疾病谱从非酒精性单纯性肝脏脂肪变性(Non alcoholic fatty liver，NAFL)到非酒精性脂肪性肝炎(Non alcoholic steatohepatitis，NASH)，以致发展为肝纤维化及肝硬化甚至肝细胞癌，其发病机制与胰岛素抵抗、氧化应激和脂质过氧化、胆汁酸代谢紊乱、自噬等有关。NAFLD中约有1/3～1/2为NASH，单纯性脂肪肝随访10～20年发展为肝硬化的概率为0.6％～3％，而NASH随访10～15年肝硬化的发生率高达15％～25％，其中30％～40％将会死于肝癌(发生肝硬化后以每年1％病例发生)、肝功能衰竭和移植后复发。因此非酒精性脂肪肝病已成为当代肝病领域的新挑战。
目前，治疗非酒精性脂肪肝病的药物尚待进一步研究。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明的一个目的在于提出一种有效治疗或预防非酒精性脂肪肝病及其关联病症的药物组合物。
根据本发明的一个方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明具体实施例的药物组合物包括：第一组分和第二组分。其中第一组分为选自ASK1抑制剂及其前体、活性代谢产物、立体异构体、药学上可接受的盐、酯类和溶剂合物中的至少一种；第二组分为选自PPAR调节剂及其前体、活性代谢产物、立体异构体、药学上可接受的盐、酯类和溶剂合物中的至少一种。
因此，本发明所述药物组合物具有降低总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、丙氨酸氨基转氨酶、天门冬氨酸氨基转移酶和/或碱性磷酸酶的水平，和/或降低肝系数，和/或降低纤维化标志物Col1a1表达水平和/或α-SMA表达水平，和/或升高高密度脂蛋白胆固醇，和/或改善NAS评分和/或纤维化评分的功效，进而在预防和/或治疗NAFLD及其关联的病症方面具有显著效果。所述NAFLD包括：非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性肝纤维化、非酒精性肝硬化。所述NAFLD关联的病症，包括但不限于，二次NAFLD，胰岛素抗性，高血糖，代谢综合征，肥胖伴高脂血症，2型糖尿病，心血管疾病，肝衰竭，肝癌等。
本发明所述药物组合物尤其对预防和/或治疗非酒精性脂肪肝病效果优异，特别是对预防、延缓和治疗非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎和非酒精性肝纤维化上效果优异，在改善NAS评分上效果显著。
非酒精性脂肪肝病活动性评分(NAS)被定义为脂肪变性(0～3)、小叶炎症(0～3)和气胀(0～2)的值的未加权和，由此提供0～8的NAS评分(参见Kleinen等，Design andValidation of a Histological Scoring System for Nonalcoholic Fatty LiverDisease，Hepatology，第41卷，第6期，2005，第1313-1321页)。不同程度纤维化患者NAS积分不同，其中NAS评分越高，纤维化程度越重。
根据本公开治疗NASH的患者在治疗前可显示出≥4的NAS评分，其中对于脂肪变性和小叶炎症各自的最小评分为1，加上气胀或至少为1的窦纤维变性，以及可能或确切的脂肪性肝炎的发现。在给药/治疗后(例如一年)，患者可显示出的复合NAS评分为≤3、≤2或≤1，而且纤维变性没有恶化。作为另一选择，患者可显示出NAS中至少两个NAS分量改善了≥2的值，而且纤维变性没有恶化。作为另一选择，患者可显示出NAS评分改善了≥3、4、5、6、7或8。
脂肪变性可广义理解为描述了涉及脂质在肝脏中的异常积聚的过程，其妨碍了正常的肝功能。肝活组织检查能够分析患者的脂肪变性并对其评分，评分范围为0～3。根据本公开治疗NASH的患者的脂肪变性评分可以为1、2或3，如约2～约3。治疗后，期望患者表现出脂肪变性没有恶化，或者脂肪变性评分下降了至少1，或者脂肪变性评分下降了2或3。脂肪变性通常分级如下：评分为1表示小于33％的肝细胞存在脂肪滴，评分为2表示33％～66％的肝细胞中观察到脂肪滴，评分为3表示大于66％的肝细胞中观察到脂肪滴。
小叶炎症也可经肝活组织检查评价，并以0～3的值来评分。要治疗NASH的患者的小叶炎症评分可以是1、2或3，或者1～2或2～3的范围。治疗后，患者的小叶炎症评分可下降至少1，或者小叶炎症评分下降2或3，以及小叶炎症评分至少没有恶化。
肝细胞的气胀通常以0～2的值来评分，并且根据本公开治疗NASH的患者的气胀评分可为0～2，包括1或2的具体值，或者1～2的分数范围。治疗后，患者可显示出气胀评分至少没有恶化，或者气胀评分值下降了至少1，或者气胀评分值下降了2。
纤维变性也可经肝活组织检查评价，并以0～4的值评分，该评分定义如下：0表示无纤维变性；1表示窦周或门静脉周纤维变性；1a表示轻度区域3的窦周纤维变性；1b表示中度区域3的窦周纤维变性；1c表示门静脉/门静脉周纤维变性；2表示窦周和门静脉/门静脉周纤维变性；3表示桥脉纤维变性；且4表示肝硬化。根据本公开治疗的患者的纤维变性阶段评分可以为0～3，包括0、1、1a、1b、1c、2或3，并且纤维变性阶段评分可至少为1a。治疗后，患者的纤维变性评分可以至少不比基线评分差，或者纤维变性阶段评分下降了至少一级，或者至少两或三级。
根据本发明的实施例，所述第一组分为选自5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-N-[6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-2-基]-4-甲基苯甲酰胺(GS-4997)、4-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-N-[3-(4-环丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)苯基]吡啶-2-甲酰胺和6-氨基-9-[(3R)-1-(丁-2-炔酰基)吡咯烷-3-基]-7-(4-苯氧基苯基)-7,9-二氢-8H-嘌呤中的至少一种。
根据本发明的实施例，所述第二组分为PPARα/δ双重激动剂和/或PPARα/δ/γ泛激动剂。根据本发明的具体实施例，所述第二组分为2-[2,6-二甲基-4-[3-[4-(甲硫基)苯基]-3-氧-1-丙烯基]苯氧基]-2-甲基丙酸(GFT505)、4-[1-(1,3-苯并噻唑-6-基磺酰基)-5-氯-1H-吲哚-2-基]丁酸(IVA337)和2-[2-(4-氟苯甲酰基)苯基)氨基]-3-(4-(2-卡巴唑基乙氧基)苯基)-丙酸钠(CS-038)中的至少一种。
凋亡信号调节激酶-1(ASK1)又被称为MAP3K5，是一种在体内具有广泛生物学效应的激酶。大量研究表明，ASK1在许多应激相关疾病中发挥了重要作用，包括肿瘤，心血管疾病，神经退行性疾病等。
过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)δ作为能量调节剂，可减少细胞内TG的沉积，提高细胞β氧化和氧化磷酸化的解偶联作用，以及减轻体重；同时PPARδ又能精确调控机体的炎症反应，抑制巨噬细胞产生MCP1、IL1β、MMP9等炎症介质，同时还能抑制内毒素诱导的COX2表达，从而减轻炎症。PPARα与PPARδ在肝实质细胞和巨噬细胞发挥交叉对话(cross-talk)作用，PPARα能增加肝脂肪酸和脂蛋白代谢，PPARδ抑制巨噬细胞产生炎症因子，从而改善代谢综合症。常用的PPARα/δ双重激动剂有：天然激动剂，例如：亚油酸、亚麻酸和二十碳五烯酸(EPA)；合成激动剂，例如：噻唑烷二酮(thiazolidinedione,TZD)，羧酸类激动剂。
近来研究表明ASK1抑制剂及PPAR激动剂的效果及安全性取得较好结论。据报道，ASK1抑制剂(GS-4997)对NASH患者有一定疗效：患者接受GS-4997治疗24周后，在肝脏疾病严重程度多个评价指标方面均表现出改善，包括肝纤维化回归(regression)、肝硬化进程、肝脏硬度(采用磁共振弹性成像技术评价，MRE)、肝脂肪含量(采用磁共振成像-质子密度脂肪分数评价，MRI-PDFF)。但GS-4997和单抗类药物simtuzumab(SIM)联合用药，效果没有显示比单独使用GS-4997更好。
另外，据报道，PPARα/δ双重激动剂GFT505在改善NAS评分方面也具有一定作用。PPARα/δ/γ泛激动剂(IVA337)在MCD和foz/foz动物模型上也显示对NAS评分有改善。
本发明实验具体研究了GS-4997与GFT505、或者GS-4997与IVA337、或者GS-4997与CS038的联合用药，令人惊讶的发现，上述联合用药取得了意料不到的技术效果，二者发挥协同作用，对NAFLD，包括非酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪性肝炎的治疗比各有效成分单独用药有明显促进作用。
根据本发明，所述药物组合物中第一组分与第二组份的重量比为1：(0.1～400)，优选为1：(0.5～200)。由此通过采用上述配比，可以进一步提高二者协同效应，进而提高治疗NAFLD，特别是非酒精性脂肪肝和NASH的效果。
在本发明的优选实施方式中，所述药物组合物中GS-4997和GFT505的重量比为1：(0.5～40)，优选为1：(1.5～20)；所述药物组合物中GS-4997和IVA337的重量比为＝1：(10～400)，优选为1：(20～200)；所述药物组合物中GS-4997和CS038的重量比为＝1：(2～40)，优选为1：(4～20)。
根据本发明，上述药物组合物中各种活性成分(即，ASK1抑制或PPAR调节剂)每天的治疗或预防有效剂量的非限制性范围分别为0.01～100mg/kg体重，优选为0.02～80mg/kg体重，更优选0.05～50mg/kg体重。值得注意的是，计量值可以随需要缓解的症状的严重程度和根据因素如受试者的疾病状态、年龄、性别和体重发生变化。
在本发明的优选实施方案中，所述药物组合物中，GS-4997每天的治疗或预防有效剂量的非限制性范围为0.01～1mg/kg体重，优选为0.02～0.6mg/kg体重，更优选0.04～0.4mg/kg体重；IVA337每天的治疗或预防有效剂量的非限制性范围为1～50mg/kg体重，优选为3～35mg/kg体重，更优选5～25mg/kg体重；GFT505每天的治疗或预防有效剂量的非限制性范围为0.1～10mg/kg体重，优选为0.25～5mg/kg体重，更优选0.5～3mg/kg体重；CS038每天的治疗或预防有效剂量的非限制性范围为0.05～5mg/kg体重，优选为0.1～3.5mg/kg体重，更优选0.2～2.5mg/kg体重。
应当进一步理解，对于任何特定的受试者，应当根据个体需要和给药或监督组合物施用人的专业判断，随着时间调整具体剂量方案以提高最佳的治疗反应，且本文所述剂量范围仅是示例性的并不旨在限制请求保护的组合物的范围或实践。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种药物制剂，该药物制剂包括前面所述的药物组合物作为活性成分。由此该制剂发挥活性成分的药理作用，进而具有该药物组合物的所用功效。具体地，该制剂具有降低总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、丙氨酸氨基转氨酶、天门冬氨酸氨基转移酶和/或碱性磷酸酶水平，和/或降低肝系数，和/或降低纤维化标志物Col1a1表达水平和/或α-SMA表达水平，和/或升高高密度脂蛋白胆固醇，和/或改善NAS评分和/或纤维化评分的功效，进而在预防和/或治疗NAFLD及其关联的病症方面具有显著效果。所述NAFLD包括：非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性肝纤维化、非酒精性肝硬化。所述NAFLD关联的病症，包括但不限于，二次NAFLD，胰岛素抗性，高血糖，代谢综合征，肥胖伴高脂血症，2型糖尿病，心血管疾病，肝衰竭，肝癌等。
本发明所述药物制剂尤其对预防和/或治疗非酒精性脂肪肝病效果优异，特别是对预防、延缓和治疗非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎和非酒精性肝纤维化上效果优异，在改善NAS评分上效果显著。
根据本发明的实施例，上述药物制剂除以前面所述的药物组合物作为活性成分外，还包括药学上可接受的载体。根据本发明的实施例，所述药学可接受的载体为选自药学上可接受的溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、粘合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗粘合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂、高分子骨架材料和成膜材料中的至少一种。由此可以使得所述药物组合物能够制剂成型，呈现临床用药物制剂适于给药的形式。
根据本发明，所述药物制剂中的活性成分中的第一组分的含量为1mg～100mg，优选为5mg～50mg；第二组分的含量为1mg～1500mg，优选为5mg～1200mg。
在本发明的优选实施方式中，所述药物制剂中的活性成分中GS-4997的含量为1mg～50mg，优选为2mg～20mg；IVA337的含量为100mg～1500mg，优选为200mg～1200mg；GFT505的含量为10mg～150mg，优选为40mg～120mg；CS038的含量为10mg～150mg，优选为15mg～100mg。
在本发明的第三方面，本发明提出了前面所述的药物组合物或药物制剂在制备药物中的用途，所述药物用于：降低总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、丙氨酸氨基转氨酶、天门冬氨酸氨基转移酶和/或碱性磷酸酶水平，和/或降低肝系数，和/或降低纤维化标志物Col1a1表达水平和/或α-SMA表达水平，和/或升高高密度脂蛋白胆固醇，和/或改善NAS评分和/或纤维化评分。
在本发明的第四方面，本发明提出了前面所述的药物组合物或药物制剂在制备药物中的用途，所述药物用于：预防和/或治疗NAFLD或NAFLD关联病症。
根据本发明的具体实施例，所述药物用于：预防和/或治疗非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性肝纤维化、非酒精性肝硬化、胰岛素抗性、高血糖、代谢综合征、肥胖伴高脂血症、2型糖尿病、心血管疾病、肝衰竭、和/或肝癌。
在本发明的第五方面，本发明提出了前面所述的药物组合物或药物制剂在制备预防和/或治疗NASH药物中的用途。
在本发明的第六方面，本发明提出了前面所述的药物组合物或药物制剂在制备预防和/或治疗非酒精性脂肪肝药物中的用途。
根据本发明的具体实施例，药物组合物在制备药物中的用途中，药物组合物的给药方式采用口服的方式，或以混合物形式给药，或给予不同时间的先后次序形式给药。
根据本发明的具体实施例，药物组合物在制备药物中的用途中，药物组合物的用药剂量为1～1500mg/天。
在本发明的第七方面，本发明提出了选自ASK1抑制剂及其前体、活性代谢产物、立体异构体、药学上可接受的盐、酯类和溶剂合物中的至少一种与选自PPAR调节剂及其前体、活性代谢产物、立体异构体、药学上可接受的盐、酯类和溶剂合物中的至少一种的联合在制备药物中的用途。
所述药物用于：降低总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、丙氨酸氨基转氨酶、天门冬氨酸氨基转移酶和/或碱性磷酸酶水平，和/或降低肝系数，和/或降低纤维化标志物Col1a1表达水平和/或α-SMA表达水平，和/或升高高密度脂蛋白胆固醇，和/或改善NAS评分和/或纤维化评分。
所述药物用于：预防或治疗NAFLD或其关联的病症，例如：预防和/或治疗非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性肝纤维化、非酒精性肝硬化、胰岛素抗性、高血糖、代谢综合征、肥胖伴高脂血症、2型糖尿病、心血管疾病、肝衰竭、和/或肝癌。
所述药物用于预防和/或治疗NASH。
所述药物用于预防和/或治疗非酒精性脂肪肝。
所述ASK1抑制剂优选为5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-N-[6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-2-基]-4-甲基苯甲酰胺(GS-4997)、4-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-N-[3-(4-环丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)苯基]吡啶-2-甲酰胺和6-氨基-9-[(3R)-1-(丁-2-炔酰基)吡咯烷-3-基]-7-(4-苯氧基苯基)-7,9-二氢-8H-嘌呤中的至少一种。
所述PPAR调节剂优选为PPARα/δ双重激动剂和/或PPARα/δ/γ泛激动剂。
所述PPAR调节剂进一步优选为2-[2,6-二甲基-4-[3-[4-(甲硫基)苯基]-3-氧-1-丙烯基]苯氧基]-2-甲基丙酸(GFT505)、4-[1-(1,3-苯并噻唑-6-基磺酰基)-5-氯-1H-吲哚-2-基]丁酸(IVA337)和2-[2-(4-氟苯甲酰基)苯基)氨基]-3-(4-(2-卡巴唑基乙氧基)苯基)-丙酸钠(CS-038)中的至少一种。
在所述药物中，ASK1抑制剂与PPAR调节剂的重量比为1：(0.1～400)，优选为1：(0.5～200)。
优选，在所述药物中，GS-4997和GFT505的重量比为1：(0.5～40)，优选为1：(1.5～20)。
优选，在所述药物中，GS-4997和IVA337的重量比为＝1：(10～400)，优选为1：(20～200)。
优选，在所述药物中，GS-4997和CS038的重量比为＝1：(2～40)，优选为1：(4～20)。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1显示了根据本发明的实施例5-7，各组小鼠血清AST水平；其中：MCS：正常蛋氨酸-胆碱补充饲料对照组；MCD：蛋氨酸-胆碱缺乏饲料模型组；GS：MCD+5mg/kg GS-4997；GFT：MCD+3mg/kg GFT505；GG：MCD+2.5mg/kg GS-4997+1.5mg/kg GFT505；IVA：MCD+10mg/kgIVA337；GI：MCD+2.5mg/kg GS-4997+5mg/kg IVA337；CS：MCD+10mg/kg CS-038；GC：MCD+2.5mg/kg GS-4997+5mg/kg CS-038；
图2显示了根据本发明的实施例5-7，各组小鼠血清ALT水平；其中，MCS：正常蛋氨酸-胆碱补充饲料对照组；MCD：蛋氨酸-胆碱缺乏饲料模型组；GS：MCD+5mg/kg GS-4997；GFT：MCD+3mg/kg GFT505；GG：MCD+2.5mg/kg GS-4997+1.5mg/kg GFT505；IVA：MCD+10mg/kgIVA337；GI：MCD+2.5mg/kg GS-4997+5mg/kg IVA337；CS：MCD+10mg/kg CS-038；GC：MCD+2.5mg/kg GS-4997+5mg/kg CS-038；
图3显示了根据本发明的实施例5-7，各组小鼠肝脏TG水平；其中，MCS：正常蛋氨酸-胆碱补充饲料对照组；MCD：蛋氨酸-胆碱缺乏饲料模型组；GS：MCD+5mg/kg GS-4997；GFT：MCD+3mg/kg GFT505；GG：MCD+2.5mg/kg GS-4997+1.5mg/kg GFT505；IVA：MCD+10mg/kgIVA337；GI：MCD+2.5mg/kg GS-4997+5mg/kg IVA337；CS：MCD+10mg/kg CS-038；GC：MCD+2.5mg/kg GS-4997+5mg/kg CS-038；
图4显示了根据本发明的实施例5-7，各组小鼠肝脏TC水平；其中，MCS：正常蛋氨酸-胆碱补充饲料对照组；MCD：蛋氨酸-胆碱缺乏饲料模型组；GS：MCD+5mg/kg GS-4997；GFT：MCD+3mg/kg GFT505；GG：MCD+2.5mg/kg GS-4997+1.5mg/kg GFT505；IVA：MCD+10mg/kgIVA337；GI：MCD+2.5mg/kg GS-4997+5mg/kg IVA337；CS：MCD+10mg/kg CS-038；GC：MCD+2.5mg/kg GS-4997+5mg/kg CS-038；
图5显示了根据本发明的实施例5-7，各组小鼠NAS评分；其中，MCS：正常蛋氨酸-胆碱补充饲料对照组；MCD：蛋氨酸-胆碱缺乏饲料模型组；GS：MCD+5mg/kg GS-4997；GFT：MCD+3mg/kg GFT505；GG：MCD+2.5mg/kg GS-4997+1.5mg/kg GFT505；IVA：MCD+10mg/kg IVA337；GI：MCD+2.5mg/kg GS-4997+5mg/kg IVA337；CS：MCD+10mg/kg CS-038；GC：MCD+2.5mg/kgGS-4997+5mg/kg CS-038；
图6显示了根据本发明的实施例5-7，各组小鼠肝脏天狼星红染色面积比；其中，MCS：正常蛋氨酸-胆碱补充饲料对照组；MCD：蛋氨酸-胆碱缺乏饲料模型组；GS：MCD+5mg/kgGS-4997；GFT：MCD+3mg/kg GFT505；GG：MCD+2.5mg/kg GS-4997+1.5mg/kg GFT505；IVA：MCD+10mg/kg IVA337；GI：MCD+2.5mg/kg GS-4997+5mg/kg IVA337；CS：MCD+10mg/kg CS-038；GC：MCD+2.5mg/kg GS-4997+5mg/kg CS-038；
图7显示了根据本发明的实施例5-7，各组小鼠α-SMA水平；其中，MCS：正常蛋氨酸-胆碱补充饲料对照组；MCD：蛋氨酸-胆碱缺乏饲料模型组；GS：MCD+5mg/kg GS-4997；GFT：MCD+3mg/kg GFT505；GG：MCD+2.5mg/kg GS-4997+1.5mg/kg GFT505；IVA：MCD+10mg/kgIVA337；GI：MCD+2.5mg/kg GS-4997+5mg/kg IVA337；CS：MCD+10mg/kg CS-038；GC：MCD+2.5mg/kg GS-4997+5mg/kg CS-038；
图8显示了根据本发明的实施例5-7，各组小鼠肝脏Col1a1表达水平；其中，MCS：正常蛋氨酸-胆碱补充饲料对照组；MCD：蛋氨酸-胆碱缺乏饲料模型组；GS：MCD+5mg/kg GS-4997；GFT：MCD+3mg/kg GFT505；GG：MCD+2.5mg/kg GS-4997+1.5mg/kg GFT505；IVA：MCD+10mg/kg IVA337；GI：MCD+2.5mg/kg GS-4997+5mg/kg IVA337；CS：MCD+10mg/kg CS-038；GC：MCD+2.5mg/kg GS-4997+5mg/kg CS-038。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，应理解，在阅读了本发明所记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。
本发明化合物采用现有技术进行制备(CN104080771A、CN1257893C、CN101248044A、CN1688532A)。
实施例1制备5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-N-[6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-2-基]-4-甲基苯甲酰胺(Selonsertib，GS-4997)
(1)步骤一：中间体C的制备
制备化合物A：取含有2-甲氧基羰基-6-氨基吡啶(480g，3.15mol)的MeOH溶液(9L)，加入水合肼(315g，6.30mol)。将此反应混合物回流加热5小时，然后冷却至室温。过滤收集该混合物中形成的沉淀物，以EA洗涤，然后真空干燥得到白色固体状的化合物A(460g，收率96％)。
制备化合物B：取化合物A(350g，2.30mol)的二甲基甲酰胺-二甲基乙缩醛(DMF-DMA)混合物(5L)，回流加热24小时，冷却至室温，然后减压浓缩。用EA(500mL×2)吸收残留物并以55℃加热30分钟，冷却到室温后，过滤收集固体并真空干燥得到白色固体状的化合物B(531g，收率88％)。
制备化合物C：取化合物B(524.64g，2mol)的CH3CN-AcOH混合物(5L，4:1)，加入丙-2-胺(591.1g，10mL)，将所得混合物回流加热24小时，冷却至室温，然后减压去除溶剂。用水(2.5L)溶解残留物，并加入饱和NaOH水溶液直到pH为8.0。过滤收集沉淀，并用EA(400mL×4)提取滤液。用无水Na2SO4干燥合并的有机相，然后浓缩至120mL体积。冰浴下，缓慢地向该混合物加入PE(400mL)，并过滤所得悬液。然后合并固相从EA-PE重结晶，得到白色固体状的中间体C(252g，收率62％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ8.24(s,1H)，7.52(m,2H)，6.51(dd,J＝1.6,7.2Hz,1H)，5.55(m,1H)，4.46(bs,2H)，1.45(d,J＝6.8Hz,6H)。MS(ESI+)M/Z：204(M+1)+。
(2)步骤二：制备5-氨基-2-氟-4-甲基苯甲腈-------(化合物2)
从5-溴-4-氟-2-甲基苯胺(1)开始，将其(31g，150mmol)溶解在无水1-甲基吡咯烷酮(150mL)中，并加入铜(I)氰化物(26.9g，300mmol)。在185℃下加热反应3.5小时，冷却至室温，加入水(350mL)和浓氢氧化氨(350mL)。将混合物搅拌50分钟，并用EA(300mL×3)萃取。用硫酸镁干燥所得的合并萃取物，然后减压去除溶剂。用乙烷(100mL×3)洗涤油状残留物，用二氯甲烷溶解该固体并装载到硅胶柱上。用0至25％EA的乙烷梯度溶液洗脱，得到5-氨基-2-氟-4-甲基苯甲腈(15.32g，收率68％)。MS(ESI+)M/Z：151(M+1)+。(3)步骤三：制备5-(2-环丙基-2-氧代乙基氨基)-2-氟-4-甲基苯甲腈-------(化合物3)
取5-氨基-2-氟-4-甲基苯甲腈(6g，40mmol)，在氮气环境下溶解在无水N,N-二甲基甲酰胺(100mL)中，然后加入固体碳酸钾(6.64g，48mmol)和碘化钾(7.31mL，44mmol)，同时搅拌。在室温下搅拌反应10分钟，然后加入溴甲基环丙基酮(10.12mL，90mmol)。将反应混合物加热至65℃反应4小时，然后减压除去溶剂。将残余物溶解于EA(100mL)中，并用水(200mL×2)洗涤。将有机层用硫酸镁干燥，并在减压下除去溶剂。将残余物重新溶解于最小量的EA中，并以乙烷：EA＝3:1的体积比加入乙烷。产物从溶液中析出，并通过过滤收集，得到5-(2-环丙基-2-氧代乙基氨基)-2-氟-4-甲基苯甲腈(7.80g，收率84％)。MS(ESI+)M/Z：233(M+1)+。
(4)步骤四：制备5-(4-环丙基-2-巯基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-甲基苯甲腈-------(化合物4)
取5-(2-环丙基-2-氧代乙基氨基)-2-氟-4-甲基苯甲腈(5.69g，24.5mmol)溶解于冰醋酸(150mL)。加入固体硫氰酸钾(4.76g，48.96mmol)，同时搅拌。将反应混合物加热至115℃并保持4小时，然后减压除去溶剂。将残余物溶于二氯甲烷(100mL)中，用150mL水洗涤。用二氯甲烷(200mL×2)萃取水性萃取液，合并有机萃取液并用硫酸镁干燥。减压除去溶剂，将油状残余物再溶解于EA(40mL)和120mL乙烷中。形成深色层后，向烧瓶中加入搅拌棒。剧烈搅拌下，产品沉淀为桃红色固体。过滤收集产物，得到5-(4-环丙基-2-巯基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-甲基苯甲腈(5.83g，收率87％)。MS(ESI+)M/Z：274(M+1)+。
(5)步骤五：制备5-(4-环丙基-1H-咪唑-2-基)-2-氟-4-甲基苯甲腈-------(化合物5)
在三颈圆底烧瓶中加入乙酸(100mL)、水(20mL)及过氧化氢(30％，4.98mL，43.92mmol)。在氮气环境下将混合物搅拌加热至45℃，同时检测内部温度。然后，在30分钟内分小份加入固体5-(4-环丙基-2-巯基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-甲基苯甲腈(4g，14.64mmol)，同时保持内部温度低于55℃，当完成硫代咪唑的加入后，在45℃，下搅拌30分钟，然后冷却至室温，并缓慢加入20％wt/wt的亚硫酸钠(6mL)水溶液。将混合物搅拌30分钟后，减压除去溶剂。将残余物悬浮在300mL水中，并加入饱和氢氧化铵水溶液直至pH约为10。用二氯甲烷(150mL×3)萃取混合物，合并有机相，并用硫酸镁干燥，然后在减压下除去溶剂。将残余物溶解在30mL的EA中，边搅拌边加入100mL乙烷。将溶剂洗掉，余下油状残余物。重复该过程，获得粘稠油状的产物5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2氟-4-甲基苯甲腈(1.48g，收率42％)。MS(ESI+)M/Z：242(M+1)+。
(6)步骤六：制备5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-甲基苯甲酸盐酸盐-------(化合物6)
取5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4甲基苯甲腈(7.48g，31.00mmol)置于装配有回流冷凝器的圆底烧瓶中，并将其悬浮在38％的盐酸(150mL)中。将混合物加热至100℃并保持5小时，然后冷却至室温。减压除去溶剂，得到粉红色固体，向其中加入100mL EA。过滤收集固体产物，并用3×100mL的EA洗涤。向所得固体产物中加入100mL含10％甲醇的二氯甲烷溶液，搅拌混合物，并过滤收集滤液。用100mL含10％甲醇的二氯甲烷溶液重复该步骤2次。合并滤液，并在减压下除去溶剂，得到粗5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-甲基苯甲酸盐酸盐。未进行进一步纯化(7.86g，收率85％)。MS(ESI+)M/Z：261(M+1)+。
(7)步骤七：制备5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-N-[6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-2-基]-4-甲基苯甲酰胺(Selonsertib，GS-4997)
取5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-甲基苯甲酸盐酸盐(1.25g，4.23mmol)，在室温下悬浮在无水1,2-二氯乙烷(23mL)中。在氮气搅拌并加入草酰氯(0.479mL，5.49mmol)，然后加入N,N-二甲基甲酰胺(0.037mL，0.423mmol)。在室温下搅拌混合物5小时，然后减压除去溶剂。将残余物溶解在25mL无水二氯甲烷中。在氮气环境下搅拌并迅速加入6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-2-胺(0.94g，4.65mmol)(中间体C)和4-二甲基吡啶(0.52g，4.23mmol)。在室温下搅拌反应混合物2小时，并加入水饱和的NaHCO3(18mL)。搅拌混合物10分钟，分离各层，并用二氯甲烷(30×2mL)洗涤水性层。并将合并的有机层干燥(MgSO4)、过滤并浓缩。将残余物溶解在最小量的CH3CN中，并缓缓加入水，直至混合物中析出固体颗粒。过滤收集固体并干燥，得到96％纯度的5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-N-[6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-2-基]-4-甲基苯甲酰胺(1.15g，收率61％)。MS(ESI+)M/Z：446.2(M+1)+。
1H-NMR(DMSO)：δ11.12(s，1H)，9.41(s，1H)，9.32(s，1H)，8.20(d,J＝8.4Hz,1H),8.07(t,J＝8.4Hz,1H)，7.95(d,J＝6.4Hz,1H)，7.92(d,J＝7.6Hz，1H)，7.79(s,1H)，7.59(d,J＝10.4Hz,1H)，5.72(sept,J＝6.8Hz,1H)，2.29(s,3H)，2.00-2.05(m,1H)，1.44(d,J＝6.8Hz,6H)，1.01-1.06(m,2H)，0.85-0.89(m,2H)。
实施例2 2-[2,6-二甲基-4-[3-[4-(甲硫基)苯基]-3-氧-1-丙烯基]苯氧基]-2-甲基丙酸(Elafibranor，GFT505)
(1)步骤一：制备1-[4-甲硫基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-羟基苯基]丙-2-烯-1-酮(中间体3)
化合物1(4.2g，25mmol)和化合物2(3.8g，25mmol)溶于饱和有盐酸气的乙醇溶液中。在室温下搅拌反应约8小时，然后真空蒸发除去溶剂。通过硅胶色谱纯化得到中间体3(6.5g，收率88％)。
(2)步骤二：制备1-[4-甲硫基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-异丙氧基羰基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮(中间体4)
将中间体3(8.67g，29.1mmol)溶于乙腈中。然后加入卤化衍生物(30.229g，145.3mmol)和碳酸钾(20.086g，145.3mmol)。将反应介质在回流下有力搅拌约12小时。过滤除去盐，真空蒸发脱除溶剂和多余的试剂，目的产物通过硅胶色谱法纯化，得到中间体4(11.7g，收率94％)。
(3)步骤三：制备2-[2,6-二甲基-4-[3-[4-(甲硫基)苯基]-3-氧-1-丙烯基]苯氧基]-2-甲基丙酸(Elafibranor，GFT505)
将中间体4(13.3g，31.2mmol)溶于二氯甲烷中，加入三氟乙酸(45.668g，400.6mmol)，混合物在室温下搅拌12小时。所得产物通过硅胶色谱或者再结晶法纯化。得到GFT-505(11.0g，收率92％)。
1H NMR DMSOδppm：1.39(s,6H)，2.22(s，6H)，2.57(s,3H)，7.40(d,J＝8.55Hz，2H)，7.57(s,2H)，7.62(d,J＝15.5Hz,1H)，7.83(d,J＝15.5Hz,1H)8.10(d,J＝8.55Hz,2H)，12.97(s,1H)。MS(ESI-)M/Z：383.3(M-1)-。
实施例3 4-[1-(1,3-苯并噻唑-6-基磺酰基)-5-氯-1H-吲哚-2-基]丁酸(IVA337)
(1)步骤一：制备6-(5-氯-2-硝基苯基)-己-5-炔酸甲酯(中间体3)
混合25.4g(89mmol)4-氯-2-碘-硝基苯、370mL三乙胺、2.06g(1.8mmol)四(三苯基膦)合钯、0.51g碘化亚铜和37mL二甲基甲酰胺(DMF)。然后在室温下，搅拌加入10g(89mmol)5-己炔酸甲酯(化合物2)，反应混合物在室温下搅拌24小时。加入75mL甲苯，减压除去溶剂。用120mL乙酸乙酯和60mL 1N盐酸处理蒸发残余物。分离有机相，用水洗涤，然后用硫酸镁干燥，减压浓缩。使用环己烷/乙酸乙酯混合物(9/1，V/V)作为洗脱剂，通过硅胶色谱纯化得到17.0g中间体3，黄色固体(收率68％)
(2)步骤二：制备6-(2-氨基-5-氯苯基)-己-5-炔酸甲酯(中间体4)
将45.3g(200mmol)氯化亚锡、35mL乙酸乙酯和11mL乙醇加到圆底烧瓶中。混合物在室温下搅拌15min，然后缓慢加入中间体3(10.8g)。反应混合物在室温下搅拌24小时，然后倒入200g冰和200mL 1N氢氧化钠溶液的混合物中。得到的混合物用150mL乙酸乙酯萃取两次；合并有机相，用水洗涤，用硫酸镁干燥，减压浓缩。使用环己烷/乙酸乙酯混合物(80/20，v/v)作为洗脱剂，通过硅胶色谱纯化得到3.7g中间体4，橙黄色固体(收率为39％)。
(3)步骤三：制备6-[5-氯-2-(1,3-苯并噻唑-6-基磺酰基氨基)苯基]-己-5-炔酸甲酯(中间体5)
中间体4(2.4g，10mmol)的30mL吡啶溶液，加入2.8g(12mmol)1,3-苯并噻唑-6-基磺酰氯。混合物在室温下搅拌1.5小时，然后减压浓缩。使用环己烷/乙酸乙酯混合物(8/2，v/v)作为洗脱剂，通过硅胶色谱纯化残余油，得到4.3g中间体5，浅褐色固体(收率96％)。
(4)步骤四：制备4-[5-氯-1-(1,3-苯并噻唑-6-基磺酰基)-1H-吲哚-2-基]丁酸甲酯(中间体6)
中间体5(200mg，0.45mmol)的35mL1,2-二氯乙烷溶液，加入10mg(0.05mmol)醋酸铜，混合物搅拌下回流24小时。然后减压除去溶剂，使用甲苯/乙酸乙酯混合物(9/1，v/v)作为洗脱剂，通过硅胶色谱纯化残余粘稠固体，得到160mg中间体6，为黄色固体(收率79％)。
(5)步骤五：制备4-[1-(1,3-苯并噻唑-6-基磺酰基)-5-氯-1H-吲哚-2-基]丁酸(IVA337)
将90mg(0.2mmol)中间体6与8mL THF和2mL水混合，加入10mg(0.24mmol)氢氧化锂。混合物在室温下搅拌4小时，然后加压浓缩。在12mL水中处理蒸发残余物，用1N盐酸溶液酸化溶液。用乙酸乙酯萃取白色沉淀，分离有机相，用硫酸镁干燥，减压浓缩，得到83mg目标产物，黄色固体(收率95％)。
实施例4 2-[2-(4-氟苯甲酰基)苯基)氨基]-3-(4-(2-卡巴唑基乙氧基)苯基)-丙酸钠的制备(CS-038)
(1)步骤一：2-[(2-(4-氟苯甲酰基)苯基)氨基]-3-(4-羧基苯基)-丙酸甲酯(CHIG-003)的制备
于反应瓶中加入39.0g(0.2mol)L-酪氨酸甲脂、49.5g(0.23mol)2-(4-氟苯甲酰基)环己酮、13.0g 5％钯/碳催化剂及800mL苯甲醚，回流反应2小时，同时用分水器除去反应过程中生成的水。将反应混合物冷却至80℃，过滤除去钯/碳催化剂。然后再将反应混合物冷却至80℃，过滤除去钯/碳催化剂。然后再将反应混合物冷却至40℃，加入800mL正己烷，于-20℃静置48小时，过滤，正己烷(200mL×5)洗涤得粗产品。将粗产品加入200mL甲醇中，回流30分钟，过滤，甲醇洗涤(50mL×2)，干燥得40.1g(收率51％)目标化合物。
(2)步骤二：2-[(2-(4-氟苯甲酰基)苯基)氨基]-3-(4-(2-溴乙氧基)苯基)-丙酸甲酯(CHIG-005)的制备
于反应瓶中加入0.1g(1.74mmol)氢氧化钾、0.68g(1.74mmol)2-[(2-(4-氟苯甲酰基)苯基)氨基]-3-(4-羟基苯基)-丙酸甲酯、3.26g(17.4mmol)1,2-二溴乙烷及15mL乙醇，回流反应8小时，过滤去除固体不溶物，将滤液真空浓缩得粗产品，层析分离(展开剂：正己烷：乙酸乙酯＝4:1)得0.37g(收率42％)目标化合物。
(3)步骤三：2-[2-(4-氟苯甲酰基)苯基)氨基]-3-(4-(2-(9H-咔唑-9-基)乙氧基)苯基)-丙酸(Chiglitazar)的制备
于反应瓶中加入0.084g咔唑(0.50mmol)、0.25g(0.50mmol)2-[(2-(4-氟苯甲酰基)苯基)氨基]-3-(4-(2-溴乙氧基)苯基)-丙酸甲酯、0.085g(2.13mmol)50％NaOH、0.08g四丁基溴化铵及10mL苯，回流反应12小时，在加入30mL苯，水洗(30mL×3)，干燥，真空浓缩得粗产品，层析分离(展开剂：甲醇：氯仿＝4：1)得0.11g(收率37％)目标产物。HRMS(C36H29FN2O4)计算值(％)：572.6357；实测值(％)：572.6354。元素分析(C36H29FN2O4)计算值(％)：C，75.51％；H，5.11％；N，4.89％；实测值(％)：C，75.83％；H，5.10％；N，4.90％。
(4)步骤四：2-[2-(4-氟苯甲酰基)苯基)氨基]-3-(4-(2-(9H-咔唑-9-基)乙氧基)苯基)-丙酸钠(CS-038)的制备
在30L塑料桶中加入243.7g(6.09mol)NaOH和6L无水甲醇，室温搅拌溶解。再在不锈钢反应釜(内衬聚四氟乙烯)中加入150L四氢呋喃和3.45kg(6.03mol)2-(2-(4-氟苯甲酰基)苯基氨基)-3-(4-(2-(9H-咔唑-9-基)乙氧基)苯基)丙酸，室温搅拌溶解，向反应釜中加入上述溶有氢氧化钠的甲醇溶液，加完后继续搅拌30min。真空浓缩，除去四氢呋喃和甲醇，得浓缩物。将浓缩物溶于10L二氯甲烷，在室温和搅拌下滴加到65L异丙醚中，离心分离，收集固体，于105℃真空干燥3h，得2-(2-(4-氟苯甲酰基)苯基氨基)-3-(4-(2-(9H-咔唑-9-基)乙氧基)苯基)丙酸钠，重量3.50kg，收率97％。
1H NMR(DMSO-d6)：δ2.88(dd,1H,CH2),3.03(dd,1H,CH2),3.86(m,1H,CH),4.25(t,2H,CH2),4.73(t,2H,CH2),6.36(t,1H,Ar-H),6.59(d,2H,Ar-H),6.65(d,1H,Ar-H),7.00(d,2H,Ar-H),7.18(m,2H,Ar-H),7.21(m,2H,Ar-H),7.31(m,2H,Ar-H),7.43(m,2H,Ar-H),7.55(m,2H,Ar-H),7.64(d,2H,Ar-H),8.13(d,2H,Ar-H),8.73(d,1H,NH)。
元素分析(C36H28FN2NaO4·0.5H2O)计算值：C 71.63，H 4.83，N 4.64；实测值：C71.62，H 4.89，N4.56。
药效实验：
采用下表所示方案进行实验设计。
表1：药效实施例方案
其中，各组代号释义为：MCS：正常蛋氨酸-胆碱补充饲料对照组；MCD：蛋氨酸-胆碱缺乏饲料模型组；GS：MCD+5mg/kg GS-4997；GFT：MCD+3mg/kg GFT505；GG：MCD+2.5mg/kgGS-4997+1.5mg/kg GFT505；IVA：MCD+10mg/kg IVA337；GI：MCD+2.5mg/kg GS-4997+5mg/kgIVA337；CS：MCD+10mg/kg CS-038；GC：MCD+2.5mg/kg GS-4997+5mg/kg CS-038。
实施例5 GS-4997与GFT505联合用药及单独用药对NASH的影响
本实施例采用蛋氨酸-胆碱缺乏(methionine-choline-deficient，MCD)饮食喂养构建NASH模型，此模型是国际上被广泛认可的动物模型，操作简便，成模率高，且引起的脂肪性肝炎病变与人类NASH极为类似，因此成为研究NASH发病机制及防治药物的最主要动物模型之一。本实施例中所采用的GS-4997的剂量为前期背景实验成果，发现5mg/kg的GS-4997可以在一定程度上减少此动物模型中纤维化标志物Col1a1、α-SMA的水平，并发挥调节脂肪酸合成、脂质代谢的作用。而GFT505作为PPARα/δ双重激动剂，以3mg/kg的剂量浓度，在此模型上可发挥脂质合成、代谢调节作用，并改善肝纤维化程度。
实验过程：本实施例用蛋氨酸-胆碱缺乏饲料喂养C57BL/6J小鼠(南京大学—南京生物医药研究院)，饮食诱导8周建立非酒精性脂肪肝模型。研究开始前至少7天给予正常饲料使小鼠适应，随后将小鼠按重量随机分为5组，每组10只小鼠，分别为蛋氨酸-胆碱补充饲料对照组(MCS，Researchdiets，A02082003B)，蛋氨酸-胆碱缺乏饲料模型组(MCD，Researchdiets，A02082002B)，蛋氨酸-胆碱缺乏饲料+GS-4997组(GS，5mg/kg，p.o.qd)，蛋氨酸-胆碱缺乏饲料+GFT505组(GFT，3mg/kg，p.o.qd)，和蛋氨酸-胆碱缺乏饲料+GS-4997(2.5mg/kg)+GFT505(1.5mg/kg)组(GG，p.o.qd)(表1)。化合物干预和MCD饲料诱导同时开展，根据上述分组每日对小鼠口服给药。在连续干预8周后，用乙醚麻醉小鼠，收集其血清，随后将动物安乐死，收获其肝脏，以供形态学、组织学和生化分析研究。所有用于生化分析的组织均以液氮快速冷冻，并-80℃保存；用于组织学分析的组织以4％中性缓冲多聚甲醛固定。
实验结果：MCD模型组小鼠血清中AST、ALT水平均显著升高，而血清TC和TG水平与MCS组无显著性差异，但MCD模型组小鼠的肝脏TG和TC水平则显著高于MCS组。单独给予GS-4997和GFT505分别能够减少21％(n.s.)和27％(P<0.05)的血清AST水平(图1)，24％(n.s.)和33％(P<0.05)的血清ALT水平(图2)，24％(n.s.)和41％(P<0.05)的肝脏TG水平(图3)，28％(n.s.)和33％(P<0.05)的肝脏TC水平(图4)，而GS-4997和GFT505联合用药后对以上指标的抑制率分别是63％(p<0.001)(图1)，57％(p<0.001)(图2)，61％(p<0.01)(图3)和58％(p<0.01)(图4)。
利用HE染色对肝组织切片进行病理观察，可以发现MCD组小鼠肝小叶边缘模糊，肝窦变窄，肝细胞肿胀，细胞内可见大小不一的油滴蓄积，呈气球样变，大量炎症细胞浸润，形成炎症灶。利用NAS组织学病理评分结果显示：MCD模型组的评分为7.3±0.7，而正常对照MCS组小鼠的平均分仅为1.3±0.5。在给予化合物干预后，单独给予GS-4997和GFT505的小鼠的NAS得分分别为5.9±0.7和6.2±1.0，与MCD组相比分别降低了19.2％(p<0.001)和15.7％(p<0.05)。而GS-4997和GFT505联合给药组的NAS得分为4.6±1.0，与MCD组相比降低了36.3％(p<0.001)。进一步，将GS-4997和GFT505联合给药组的NAS得分与GS-4997和GFT505单独给药组相比，分别降低了22％(P<0.01)和26％(P<0.01)(表2和图5)。
利用天狼星红染色对小鼠肝脏纤维化进行评价，发现MCD造模小鼠染色面积明显增加，并伴随有纤维化标志物α-SMA水平和Col1a1表达的显著增加。单独给予GS-4997和GFT505分别能够减少23％(n.s.)和18％(n.s.)的染色面积(图6)，分别减少43％(p<0.05)和16％(n.s.)模型诱导引起的α-SMA水平升高(图7)，分别减少55％(p<0.05)和22％(n.s.)模型诱导引起Col1a1表达增加(图8)。而GS-4997、GFT505联合用药对以上3个指标的抑制率分别可达到53％(p<0.01)(图6)，65％(p<0.01)(图7)和83％(p<0.001)(图8)。进一步，将GS-4997和GFT505联合给药组的纤维化染色面积与GS-4997和GFT505单独给药组的相比，纤维化染色面积分别降低了38.9％(P<0.001)和42.8％(P<0.001)(图6)。
结论：从以上实验结果可以看出，GS-4997和GFT505联合给药对NASH的肝脂质蓄积、肝功能指标、NAS打分以及肝纤维化等方面的疗效均显著的优于单独给予GS-4997或GFT505。具体表现为：联合给药组在NASH病理指标中最具代表性的NAS打分和纤维化程度这两方面的治疗效果均优于单独给药组，且有统计学意义的显著差异(NAS打分：GS:GG＝5.9:4.6，P<0.01；GFT:GG＝6.2:4.6，P<0.01；纤维化染色面积：GS:GG＝23％:53％，P<0.001；GFT:GG＝18％:53％，P<0.001)。而对其他各项指标如AST(GS:GFT:GG＝21％:27％:63％)、ALT(GS:GFT:GG＝24％:33％:57％)、TG(GS:GFT:GG＝24％:41％:61％)、TC(GS:GFT:GG＝28％:33％:58％)、α-SMA(GS:GFT:GG＝43％:16％:65％)、Col1a1(GS:GFT:GG＝55％:22％:83％)的治疗强度也均大于单独给药组。综合可知，与单药治疗相比，GS-4997与GFT505联合用药显示了更优越的抗NASH疗效。
实施例6 GS-4997与IVA337联合用药及单独用药对NASH的影响
本实施例中IVA337的剂量由前期背景实验决定，实验结果显示10mg/kg的IVA337可以有效地抑制此动物模型中脂质代谢基因如SCD1、CPT1、CPT2等表达水平，降低小鼠肝脏脂质变性打分，抑制炎症相关基因如IL-1β，IL-6，MCP-1等的表达水平，降低组织纤维化打分。
实验过程：本实施例用蛋氨酸-胆碱缺乏饲料喂养C57BL/6J小鼠(南京大学—南京生物医药研究院)，饮食诱导8周建立非酒精性脂肪肝模型。研究开始前至少7天给予正常饲料使小鼠适应，随后将小鼠按重量随机分为5组，每组10只小鼠，分别为蛋氨酸-胆碱补充饲料对照组(MCS，Researchdiets，A02082003B)，蛋氨酸-胆碱缺乏饲料模型组(MCD，Researchdiets，A02082002B)，蛋氨酸-胆碱缺乏饲料+GS-4997组(GS，5mg/kg，p.o.qd)，蛋氨酸-胆碱缺乏饲料+IVA337组(IVA，10mg/kg，p.o.qd)和蛋氨酸-胆碱缺乏饲料+GS-4997(2.5mg/kg)+IVA337(5mg/kg)组(GI，p.o.qd)(表1)。化合物干预和MCD饲料诱导同时开展，根据上述分组每日对小鼠口服给药。在连续干预8周后，用乙醚麻醉小鼠，收集其血清，随后将动物安乐死，收获其肝脏，以供形态学、组织学和生化分析研究。所有用于生化分析的组织均以液氮快速冷冻，并-80℃保存；用于组织学分析的组织以4％中性缓冲多聚甲醛固定。
实验结果：MCD模型组小鼠血清中AST、ALT水平均显著升高，而血清TC和TG水平与MCS组无显著性差异，但MCD模型组小鼠的肝脏TG和TC水平则明显高于MCS组。单独给予GS-4997和IVA337分别能够减少21％(n.s.)和36％(P<0.05)的血清AST水平(图1)，24％(n.s.)和43％(P<0.05)的血清ALT水平(图2)，24％(n.s.)和48％(P<0.05)的肝脏TG水平(图3)，28％(n.s.)和34％(P<0.05)的肝脏TC水平(图4)，而GS-4997和IVA337联合用药后对以上指标的抑制率分别是65％(p<0.001)(图1)，61％(p<0.001)(图2)，73％(p<0.01)(图3)和59％(p<0.001)(图4)。
利用HE染色对肝组织切片进行病理观察，可以发现MCD组小鼠肝小叶边缘模糊，肝窦变窄，肝细胞肿胀，细胞内可见大小不一的油滴蓄积，呈气球样变，大量炎症细胞浸润，成炎症灶，利用NAS组织学病理评分结果显示：MCD模型组的评分为7.3±0.7，而正常对照MCS组小鼠的平均分仅为1.3±0.5。在给予化合物干预后，单独给予GS-4997和IVA337的小鼠的NAS得分分别为5.9±0.7和5.1±0.9，与MCD组相比分别降低了19.2％(p<0.001)和30.0％(p<0.001)。而GS-4997和IVA337联合给药组的NAS得分为3.9±1.2，与MCD组相比降低了46.7％(p<0.001)。进一步，将GS-4997和IVA337联合给药组的NAS得分与GS-4997和IVA337单独给药组相比，分别降低了33.9％(P<0.001)和23.5％(P<0.05)(表2和图5)。
利用天狼星红染色对小鼠肝脏纤维化进行评价，发现MCD造模小鼠染色面积明显增加，并伴随有α-SMA水平和Col1a1表达增加。单独给予GS-4997和IVA337分别能够减少23％(n.s.)和17％(n.s.)的染色面积(图6)，分别减少43％(p<0.05)和37％(p<0.05)的α-SMA水平升高(图7)，分别减少55％(p<0.05)和44％(p<0.05)的Col1a1表达增加(图8)。而GS-4997、IVA337联合用药对以上3个指标的抑制率分别是52％(p<0.01)(图6)，76％(p<0.001)(图7)和94％(p<0.001)(图8)。进一步，将GS-4997和IVA337联合给药组的纤维化染色面积与GS-4997和IVA337单独给药组相比，纤维化染色面积分别降低了37.3％(P<0.01)和42.7％(P<0.001)(图6)。
结论：从以上实验结果可以看出，GS-4997和IVA337联合给药对NASH的肝脂质蓄积、肝功能指标、NAS打分以及肝纤维化等方面的疗效均显著的优于单独给予GS-4997或IVA337。具体表现为：联合给药组在NASH病理指标中最具代表性的NAS打分和纤维化程度这两方面的治疗效果均优于单独给药组，且有统计学意义的显著差异(NAS打分：GS:GI＝5.9:3.9，P<0.001；IVA:GI＝5.1:3.9，P<0.05；纤维化染色面积：GS:GI＝23％:52％，P<0.01；IVA:GI＝17％:52％，P<0.001)。而对其他各项指标如AST(GS:IVA:GI＝21％:36％:65％)、ALT(GS:IVA:GI＝24％:43％:61％)、TG(GS:IVA:GI＝24％:48％:73％)、TC(GS:IVA:GI＝28％:34％:59％)、α-SMA(GS:IVA:GI＝43％:37％:76％)、Col1a1(GS:IVA:GI＝55％:44％:94％)的治疗强度也均大于单独给药组。综合可知，与单药治疗相比，GS-4997与IVA337联合用药显示了更优越的抗NASH疗效。
实施例7 GS-4997与CS-038联合用药及单独用药对NASH的影响
本实施例中CS-038为针对2型糖尿病的PPARα/δ/γ全激动剂，目前尚无其在NASH治疗领域的相关研究数据披露。但鉴于PPAR在NASH治疗中的潜在价值，我们在前期剂量摸索实验中发现10mg/kg的CS-038能够有效的降低肝脏和血清中的TG、TC、LDL-C水平，调节小鼠脂质代谢，同时对炎症相关基因的表达也具有抑制作用，在组织病理分析中也可有效的减少炎症灶的数量。
实验过程：本实施例用蛋氨酸-胆碱缺乏饲料喂养C57BL/6J小鼠(南京大学—南京生物医药研究院)，饮食诱导8周建立非酒精性脂肪肝模型。研究开始前至少7天给予正常饲料使小鼠适应，随后将小鼠按重量随机分为5组，每组10只小鼠，分别为蛋氨酸-胆碱补充饲料对照组(MCS，Researchdiets，A02082003B)，蛋氨酸-胆碱缺乏饲料模型组(MCD，Researchdiets，A02082002B)，蛋氨酸-胆碱缺乏饲料+GS-4997组(GS，5mg/kg，p.o.qd)，蛋氨酸-胆碱缺乏饲料+CS-038组(CS，10mg/kg，p.o.qd)和蛋氨酸-胆碱缺乏饲料+GS-4997(2.5mg/kg)+CS-038(5mg/kg)组(GC，p.o.qd)(表1)。化合物干预和MCD饲料诱导同时开展，根据上述分组每日对小鼠口服给药。在连续干预8周后，用乙醚麻醉小鼠，收集其血清，随后将动物安乐死，收获其肝脏，以供形态学、组织学和生化分析研究。所有用于生化分析的组织均以液氮快速冷冻，并-80℃保存；用于组织学分析的组织以4％中性缓冲多聚甲醛固定。
实验结果：MCD模型组小鼠血清中AST、ALT水平均显著升高，而血清TC和TG水平与MCS组无显著性差异，但MCD模型组小鼠的肝脏TG和TC水平则明显高于MCS组。单独给予GS-4997和CS-038分别能够减少21％(n.s.)和18％(n.s.)的血清AST水平(图1)，24％(n.s.)和28％(n.s.)的血清ALT水平(图2)，24％(n.s.)和33％(n.s.)的肝脏TG水平(图3)，28％(n.s.)和38％(n.s.)的肝脏TC水平(图4)，而GS-4997和CS-038联合用药后对以上指标的抑制率分别是55％(p<0.001)(图1)，48％(p<0.001)(图2)，57％(p<0.01)(图3)和53％(p<0.01)(图4)。
利用HE染色对肝组织切片进行病理观察，可以发现MCD组小鼠肝小叶边缘模糊，肝窦变窄，肝细胞肿胀，细胞内可见大小不一的油滴蓄积，呈气球样变，大量炎症细胞浸润，成炎症灶，利用NAS组织学病理评分结果显示：MCD模型组的评分为7.3±0.7，而正常对照MCS组小鼠的平均分仅为1.3±0.5。在给予化合物干预后，单独给予GS-4997和CS-038的小鼠的NAS得分分别为5.9±0.7和6.0±1.2，与MCD组相比分别降低了19.2％(p<0.001)和17.7％(p<0.01)。而GS-4997和CS-038联合给药组的NAS得分为4.4±0.8，与MCD组相比降低了39.0％(p<0.001)。进一步，将GS-4997和CS-038联合给药组的NAS得分与GS-4997和CS-038单独给药组相比，分别降低了25.4％(P<0.001)和26.7％(P<0.01)(表2和图5)。
利用天狼星红染色对小鼠肝脏纤维化进行评价，发现MCD造模小鼠染色面积明显增加，并伴随有α-SMA水平和Col1a1表达增加。单独给予GS-4997和CS-038分别能够减少23％(n.s.)和15％(n.s.)的染色面积(图6)，分别减少43％(p<0.05)和21％(n.s.)的α-SMA水平升高(图7)，分别减少55％(p<0.05)和24％(n.s.)的Col1a1表达增加(图8)。而GS-4997、CS-038联合用药对以上3个指标的抑制率分别是49％(p<0.01)(图6)，67％(p<0.01)(图7)和79％(p<0.01)(图8)。进一步，将GS-4997和CS-038联合给药组的纤维化染色面积与GS-4997和CS-038单独给药组相比，纤维化染色面积分别降低了33.5％(P<0.01)和38.0％(P<0.001)(图6)。
结论：从以上实验结果可以看出，GS-4997和CS-038联合给药对NASH的肝脂质蓄积、肝功能指标、NAS打分以及肝纤维化等方面的疗效均显著的优于单独给予GS-4997或CS-038。具体表现为：联合给药组在NASH病理指标中最具代表性的NAS打分和纤维化程度这两方面的治疗效果均优于单独给药组，且有统计学意义的显著差异(NAS打分：GS:GC＝5.9:4.4，P<0.001；CS:GC＝6.0:4.4，P<0.01；纤维化染色面积：GS:GC＝23％:49％，P<0.01；CS:GC＝15％:49％，P<0.001)。而对其他各项指标如AST(GS:CS:GC＝21％:18％:55％)、ALT(GS:CS:GC＝24％:28％:48％)、TG(GS:CS:GC＝24％:33％:57％)、TC(GS:CS:GC＝28％:38％:53％)、α-SMA(GS:CS:GC＝43％:21％:67％)、Col1a1(GS:CS:GC＝55％:24％:79％)的治疗强度也均大于单独给药组。综合可得，与单药治疗相比，GS-4997与CS-038联合用药显示了更优越的抗NASH疗效。
表2：各组小鼠NAS打分
在本说明书的描述中，参考术语“实施例”、“实例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种药物组合物，其特征在于，包括第一组分、第二组分，其中，
第一组分为选自ASK1抑制剂及其前体、活性代谢产物、立体异构体、药学上可接受的盐、酯类和溶剂合物中的至少一种；
第二组分为选自PPAR调节剂及其前体、活性代谢产物、立体异构体、药学上可接受的盐、酯类和溶剂合物中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述第一组分为选自5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-N-[6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-2-基]-4-甲基苯甲酰胺、4-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-N-[3-(4-环丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)苯基]吡啶-2-甲酰胺和6-氨基-9-[(3R)-1-(丁-2-炔酰基)吡咯烷-3-基]-7-(4-苯氧基苯基)-7,9-二氢-8H-嘌呤中的至少一种；
任选地，所述第二组分为PPARα/δ双重激动剂和/或PPARα/δ/γ泛激动剂；
优选的，所述第二组分为2-[2,6-二甲基-4-[3-[4-(甲硫基)苯基]-3-氧-1-丙烯基]苯氧基]-2-甲基丙酸、4-[1-(1,3-苯并噻唑-6-基磺酰基)-5-氯-1H-吲哚-2-基]丁酸和2-[2-(4-氟苯甲酰基)苯基)氨基]-3-(4-(2-卡巴唑基乙氧基)苯基)-丙酸钠中的至少一种。
3.根据权利要求1～2中任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述第一组分与所述第二组分的重量比为1：(0.1～400)，优选为1：(0.5～200)；
优选所述药物组合物中GS-4997和GFT505的重量比为1：(0.5～40)，优选为1：(1.5～20)；
优选所述药物组合物中GS-4997和IVA337的重量比为＝1：(10～400)，优选为1：(20～200)；
优选所述药物组合物中GS-4997和CS038的重量比为＝1：(2～40)，优选为1：(4～20)。
4.一种药物制剂，其包括权利要求1～3任一项所述的药物组合物作为活性成分，
任选地，所述药物制剂进一步包含药学可接受的载体。
5.根据权利要求4所述的药物制剂，所述第一组分的含量为1mg～100mg，优选为5mg～50mg；第二组分的含量为1mg～1500mg，优选为5mg～1200mg；
优选所述药物制剂中GS-4997的含量为1mg～50mg，优选为2mg～20mg；
优选所述药物制剂中IVA337的含量为100mg～1500mg，优选为200mg～1200mg；
优选所述药物制剂中GFT505的含量为10mg～150mg，优选为40mg～120mg；
优选所述药物制剂中CS038的含量为10mg～150mg，优选为15mg～100mg。
6.权利要求1～3任一项所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于：降低总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、丙氨酸氨基转氨酶、天门冬氨酸氨基转移酶、和/或碱性磷酸酶水平，和/或降低肝系数，和/或降低纤维化标志物Col1a1表达水平和/或α-SMA表达水平，和/或升高高密度脂蛋白胆固醇，和/或改善NAS评分和/或纤维化评分。
7.权利要求1～3任一项所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于：预防和/或治疗NAFLD或NAFLD关联病症，
任选地，所述药物用于预防和或治疗：非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性肝纤维化、非酒精性肝硬化、胰岛素抗性、高血糖、代谢综合征、肥胖伴高脂血症、2型糖尿病、心血管疾病、肝衰竭、和/或肝癌。
8.权利要求1～3任一项所述的药物组合物在制备预防和/或治疗NASH药物中的用途。
9.权利要求1～3任一项所述的药物组合物在制备预防和/或治疗非酒精性脂肪肝药物中的用途。
10.根据权利要求6～9任一项所述的用途，其特征在于，所述药物组合物的给药方式采用口服的方式，或以混合物形式给药，或给予不同时间的先后次序形式给药，
任选地，所述药物组合物的用药剂量为1～1500mg/天。
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