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CN109303920B - 降低lc-3b的表达或活性的试剂在制备增强石蒜碱的抗肝癌活性药物中的应用 - Google Patents

降低lc-3b的表达或活性的试剂在制备增强石蒜碱的抗肝癌活性药物中的应用 Download PDF

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CN109303920B
CN109303920B CN201710619928.1A CN201710619928A CN109303920B CN 109303920 B CN109303920 B CN 109303920B CN 201710619928 A CN201710619928 A CN 201710619928A CN 109303920 B CN109303920 B CN 109303920B
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lycorine
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高秀梅
陈璐
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Tianjin University of Traditional Chinese Medicine
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Abstract

本发明公开了降低LC‑3B的表达或活性的试剂在制备增强石蒜碱的抗肝癌活性药物中的应用。本发明具体提供了降低LC‑3B的表达或活性的试剂在制备增强石蒜碱抗肝癌活性或抗肝癌细胞活性产品中的应用。实验证明，降低LC‑3B的表达或活性的试剂和石蒜碱联合用药的肝癌细胞凋亡率比降低LC‑3B表达或活性的试剂单独用药的肝癌细胞凋亡率与石蒜碱单独用药的肝癌细胞凋亡率之和还要高。说明降低LC‑3B的表达或活性的试剂和石蒜碱在抗肝癌方面产生了协同作用，降低LC‑3B的表达或活性的试剂增强了石蒜碱的抗肝癌活性。

Description

降低LC-3B的表达或活性的试剂在制备增强石蒜碱的抗肝癌 活性药物中的应用
技术领域
本发明涉及降低LC-3B的表达或活性的试剂的用途，特别涉及降低LC-3B的表达或活性的试剂在制备增强石蒜碱的抗肝癌活性药物中的应用。
背景技术
肝细胞癌(HCC)是全球最常见的侵袭性肿瘤之一。肝癌是一种高度致命的肿瘤，其中位生存率在诊断后仍保持在1年以下。肝癌是源于慢性肝脏疾病如慢性炎症和肝硬化的异质性疾病。迄今为止，针对肝癌的治疗策略主要包括切除术，移植术，局部消融术和化疗。由于肝癌的早期症状不明显，大多数肝癌患者被诊断为晚期阶段，失去手术机会，及时接受过手术的患者多数仍会发生复发和转移。在化学治疗剂中，索拉非尼是一种小分子多激酶抑制剂，被认为是一种积极的治疗方法，是延长晚期肝癌患者生存期延长的唯一批准的全身药物。然而，索拉非尼治疗晚期肝癌患者的预期寿命仅为8-11个月。在过去几十年中，尽管肝癌患者常规治疗方案取得了显着进展，但由于治疗有限，预后差，复发率高，仍然是全球最致命的恶性肿瘤之一。新的有效和有希望的治疗策略仍然需要在全球范围内进行深入的探索。
具有多种生物活性和机制的天然产物通常作为癌症预防和抗癌药物发现的优良药物。已经探索了石蒜碱(结构如图1中a)，一种普通民间药物的活性生物碱，其中包括抗癌，抗病毒，抗疟疾，抗菌和抗炎活性等多种生物活性。尽管石蒜碱的靶点或机制尚未定义，但是石蒜碱的主要生物学活性和低细胞毒性使其成为潜在的临床药物或潜在的潜在药物。例如，它作为有前途的抗癌剂被宫颈癌，白血病，前列腺癌和多发性骨髓瘤所广泛关注。然而，其明确的分子机制目前仍不清楚。
微管相关蛋白1轻链3β(microtubule associated protein 1light chain3beta，MAP1LC3B，简称LC-3B)，是MAP1LC3B基因编码蛋白，是自噬途径中的一种中枢蛋白，在自噬底物选择和自噬体发生过程中起着重要作用。LC3是最广泛使用的自噬体标志物。
舌癌耐药相关蛋白1(Tongue cancer resistance-associated protein1，TCRP1)据报道能够通过选择性活化PI3K/Akt和NF-KB通路在抗辐射性口腔鳞状细胞癌中促进肿瘤发生。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何增强石蒜碱的抗肝癌活性或抗肝癌细胞活性。
为了解决以上技术问题，本发明提供了降低LC-3B的表达或活性的试剂在制备增强石蒜碱的抗肝癌活性产品(如药物、疫苗、保健品和/或食品)中的应用。
上述应用中，所述降低LC-3B的表达或活性的试剂包括抑制或减弱LC-3B的表达或活性的分子，例如小分子或多肽。所述降低LC-3B的表达或活性的试剂可以包含抑制和/或降低LC-3B的表达和/或活性的抗体或其抗原结合片段。所述降低LC-3B的表达或活性的试剂可以包含靶向LC-3B基因的多核苷酸，例如下述1)、2)或3)：
1)靶向LC-3B基因的siRNA、shRNA、miRNA或反义RNA；
2)产生靶向LC-3B基因的siRNA的表达载体、产生靶向LC-3B基因的shRNA的表达载体、产生靶向LC-3B基因的miRNA的表达载体或产生靶向LC-3B基因的miRNA的表达载体；
3)产生靶向LC-3B基因的siRNA的DNA分子、产生靶向LC-3B基因的shRNA的DNA分子、产生靶向LC-3B基因的miRNA的DNA分子或产生靶向LC-3B基因的DNA分子。
上述应用中，所述靶向LC-3B基因的siRNA具体可为LC-3B-1或LC-3B-2，LC-3B-1的一条链的从5’端至3’端的核苷酸序列为序列表中序列1或序列1的第1-19位，LC-3B-1的另一条链的从3’端至5’端的核苷酸序列为序列表中序列2或序列2的第3-21位。LC-3B-2的一条链的从5’端至3’端的核苷酸序列为序列表中序列3或序列3的第1-19位，LC-3B-2的另一条链的从3’端至5’端的核苷酸序列为序列表中序列4或序列4的第3-21位。
上述应用中，所述降低LC-3B的表达或活性的试剂的活性成分可为所述抑制或减弱LC-3B表达或活性的分子，所述降低LC-3B的表达或活性的试剂的活性成分还可含有其它成分，其它活性成分本领域技术人员可根据抗肝癌效果确定。
上述降低LC-3B的表达或活性的试剂和石蒜碱在制备抗肝癌或抗肝癌细胞产品(药物、疫苗或保健品)中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了抗肝癌或抗肝癌细胞的产品。
本发明所提供的抗肝癌或抗肝癌细胞的产品(如药物、疫苗、保健品和/或食品)含有所述降低LC-3B的表达或活性的试剂和石蒜碱。
上述抗肝癌或抗肝癌细胞的产品中，所述降低LC-3B的表达或活性的试剂和所述石蒜碱均可单独包装。
上述应用和上述抗肝癌或抗肝癌细胞的产品中，所述降低LC-3B的表达或活性的试剂和所述石蒜碱的配比本领域技术人员可根据抗肝癌或抗肝癌细胞的效果确定。当所述降低LC-3B的表达或活性的试剂的活性成分为所述靶向LC-3B基因的siRNA时，所述降低LC-3B的表达或活性的试剂和所述石蒜碱的配比具体可为30nM所述靶向LC-3B基因的siRNA：40μmol石蒜碱。
上述应用和上述抗肝癌或抗肝癌细胞的产品中，所述LC-3B可为任何哺乳动物的LC-3B，如人的LC-3B。
上述应用中或上述抗肝癌或抗肝癌细胞的产品中，所述肝癌可为肝细胞肝癌。
本发明还提供了降低TCRP1的表达或活性的试剂在制备增强石蒜碱抗肝癌活性或抗肝癌细胞活性产品中的应用。
本发明还提供了抗肝癌或抗肝癌细胞的产品。
本发明所提供的抗肝癌或抗肝癌细胞的产品(如药物、疫苗、保健品和/或食品)含有降低TCRP1的表达或活性的试剂和石蒜碱。
本发明还提供了降低TCRP1的表达或活性的试剂和石蒜碱在制备抗肝癌或抗肝癌细胞产品(如药物、疫苗、保健品和/或食品)中的应用。
上述应用和上述抗肝癌或抗肝癌细胞的产品中，所述降低TCRP1的表达或活性的试剂包括抑制或减弱TCRP1的表达或活性的分子，例如小分子或多肽。所述降低TCRP1的表达或活性的试剂可以包含抑制和/或降低TCRP1的表达和/或活性的抗体或其抗原结合片段。所述降低TCRP1的表达或活性的试剂可以包含靶向TCRP1基因的多核苷酸，例如下述1)、2)或3)：
1)靶向TCRP1基因的siRNA、shRNA、miRNA或反义RNA；
2)产生靶向TCRP1基因的siRNA的表达载体、产生靶向TCRP1基因的shRNA的表达载体、产生靶向TCRP1基因的miRNA的表达载体或产生靶向TCRP1基因的miRNA的表达载体；
3)产生靶向TCRP1基因的siRNA的DNA分子、产生靶向TCRP1基因的shRNA的DNA分子、产生靶向TCRP1基因的miRNA的DNA分子或产生靶向TCRP1基因的DNA分子。
上述应用和上述抗肝癌或抗肝癌细胞的产品中，所述靶向TCRP1基因的siRNA具体可为siRNATCRP1,siRNATCRP1的一条链的从5’端至3’端的核苷酸序列为5’-uagucccaguuaugcuccagaguuuTT-3’或其第1-19位，siRNATCRP1的另一条链的从3’端至5’端的核苷酸序列为3’-TTaucagggucaauacgaggucucaaa-5’或其第3-21位。
上述抗肝癌或抗肝癌细胞的产品中，所述降低TCRP1的表达或活性的试剂和所述石蒜碱均可单独包装。
上述应用和上述抗肝癌或抗肝癌细胞的产品中，所述降低TCRP1的表达或活性的试剂的活性成分可为所述抑制或减弱TCRP1的表达或活性的分子，所述降低TCRP1的表达或活性的试剂的活性成分还可含有其它成分，其它活性成分本领域技术人员可根据抗肝癌效果确定。
上述应用和上述抗肝癌或抗肝癌细胞的产品中，所述降低TCRP1的表达或活性的试剂和所述石蒜碱的配比本领域技术人员可根据抗肝癌或抗肝癌细胞的效果确定。当所述降低TCRP1的表达或活性的试剂的活性成分为所述靶向TCRP1基因的siRNA时，所述降低TCRP1的表达或活性的试剂和所述石蒜碱的配比具体可为30nM所述靶向TCRP1基因的siRNA：40μmol石蒜碱。
上述抗肝癌或抗肝癌细胞的产品中，所述产品还可含有载体或赋形剂。所述载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)、肠溶性载体材料(如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲基纤维素等)。
本发明还提供了石蒜碱在制备降低肝癌细胞中TCRP1蛋白水平(含量)的产品(如降低肝癌细胞TCRP1蛋白水平的试剂)中的应用。
上述应用中，所述降低肝癌细胞这TCRP1蛋白水平的产品不改变所述肝癌细胞中TCRP1的mRNA水平。
上述应用和上述抗肝癌或抗肝癌细胞的产品中，所述TCRP1可为任何哺乳动物的TCRP1，如人的TCRP1。
上述应用中或上述抗肝癌或抗肝癌细胞的产品中，所述肝癌可为肝细胞肝癌。
本申请中，抗肝癌、抗肝癌细胞、抗肝癌活性或抗肝癌细胞活性具体可为促进肝癌细胞凋亡和/或促进肝癌细胞自噬和/或降低肝癌细胞活力。
实验证明，降低LC-3B的表达或活性的试剂和石蒜碱联合用药的肝癌细胞凋亡率比降低LC-3B的表达或活性的试剂单独用药的肝癌细胞凋亡率与石蒜碱单独用药的肝癌细胞凋亡率之和还要高，降低LC-3B的表达或活性的试剂和石蒜碱在抗肝癌方面产生了协同作用，降低LC-3B的表达或活性的试剂增强了石蒜碱的抗肝癌活性。降低TCRP1的表达或活性的试剂和石蒜碱联合用药的肝癌细胞凋亡率比降低TCRP1的表达或活性的试剂单独用药的肝癌细胞凋亡率与石蒜碱单独用药的肝癌细胞凋亡率之和还要高，降低TCRP1的表达或活性的试剂和石蒜碱在抗肝癌方面产生了协同作用，降低TCRP1的表达或活性的试剂增强了石蒜碱的抗肝癌活性。
附图说明
图1为石蒜碱抑制了肝细胞肝癌的生长。
图1中，a为石蒜碱的结构式；b为细胞活力测定结果；c为单细胞克隆形成测定结果；d-f为异种移植瘤致瘤性检测结果，g为通过Ki67染色进行免疫组化检测肿瘤生长中增殖的相对变化，h为心、肝、脾、肺和肾的HE染色免疫组化检测结果。
图2为石蒜碱促进了肝细胞肝癌的自噬。
图2中，a为蛋白质印迹分析HepG2和SMMC-7721中p62和LC-3B的表达量；b蛋白质印迹分析HepG2和SMMC-7721中Atg5、Atg7和Atg12的表达量；c为透射电子显微镜分析，d和e为自噬通量分析；f为蛋白质印迹分析肝细胞肝癌中p62和LC-3B的表达量；g为免疫组化检测肝细胞肝癌中LC-3B的表达量。
图3为抑制自噬可以进一步促进石蒜碱诱导的肝癌细胞凋亡。
图3中，a、c和f为蛋白质印迹分析各处理细胞中p62、LC-3B、Cleaved Caspase-3、PARP1/2和Actin表达量。b、d和e为各处理细胞的细胞活力和细胞凋亡率。
图3中，a和b的各图片中，从左至右分别为对照处理细胞、石蒜碱单独处理细胞、3-MA单独处理细胞和石蒜碱和3-MA联合处理细胞。c和d的各图片中，从左至右分别为对照siRNA单独处理1细胞、石蒜碱和对照siRNA联合处理1细胞、LC-3B-1单独处理细胞、石蒜碱和LC-3B-1联合处理细胞。e和f的各图片中，从左至右分别为对照siRNA单独处理2细胞、石蒜碱和对照siRNA联合处理2细胞、LC-3B-2单独处理细胞、石蒜碱和LC-3B-2联合处理细胞。
图4为石蒜碱通过TCRP1/Akt/mTOR信号通路促进肝癌细胞凋亡和自噬。
图4中，a为蛋白质印迹分析HepG2和SMMC-7721中TCRP1蛋白水平；b为实时定量PCR分析HepG2和SMMC-7721中的TCRP1的mRNA水平和蛋白质印迹分析HepG2和SMMC-7721中的TCRP1蛋白水平；c为蛋白质印迹分析结果表明过表达TCRP1显著阻止了石蒜碱对Akt/mTOR通路的抑制作用；d蛋白质印迹分析结果表明过表达TCRP1阻断了石蒜碱诱导的凋亡和自噬相关蛋白表达；e为细胞活力检测结果；f为自噬通量分析；g为TCRP1过表达强烈地阻断了石蒜碱对集落形成的抑制作用；h为石蒜碱处理减少HepG2异种移植肿瘤中TCRP1，Akt，4-EBP1和p70S6K的蛋白水平。
图5为免疫组化检测磷酸化的Akt和TCRP1水平。
a和b为在石蒜碱(10mg/kg)处理的异种移植肿瘤中，磷酸化的Akt和TCRP1的阳性染色强得多；c和d为免疫组化检测两个肝癌患者的磷酸化的Akt和TCRP1水平。
图6为Akt抑制剂增强石蒜碱的抗肝癌活性。两个图片中，从左至右均为对照处理细胞、石蒜碱单独处理细胞、LY294002单独处理细胞和石蒜碱和LY294002联合处理细胞。
图7为靶向TCRP1的siRNA增强石蒜碱的抗肝癌活性。两个图片中，从左至右均为对照siRNA单独处理细胞、石蒜碱和对照siRNA联合处理细胞、siRNATCRP1单独处理细胞、石蒜碱和siRNATCRP1联合处理细胞。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的材料和方法如下：
细胞培养和细胞处理：人类HCC细胞系HepG2，SMMC-7721，HuH-7和Chang肝细胞于2015年4月从ATCC获得。用过的细胞在1个月内复苏。通过PCR扩增的短串联重复分析鉴定细胞系。在含有5％CO2的加湿气氛中，在补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM或RPMI-1640中将细胞保持在37℃。人类TCRP1和Akt的表达载体设计并购自ServicebioTechnologies(中国武汉)。石蒜碱(Lycorine)(纯度>98％)购自上海源叶生物科技(中国上海)。石蒜碱用二甲基亚砜(DMSO)溶解制备为20mM储备溶液，并以等分试样储存在-20℃，处理细胞时，培养基稀释后即用；给小鼠注射时，用PBS稀释至相应的浓度。3-MA，MG-132和LY294002购自Selleck(London，ON，Canada)。MTT(3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2-H-四唑溴化物)试剂购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)。3-MA用二甲基亚砜(DMSO)溶解制备为20mM储备溶液，处理细胞时，培养基稀释后即用。LY294002用二甲基亚砜(DMSO)溶解制备为20mM储备溶液，处理细胞时，培养基稀释后即用。
组织样品：45对人肝癌及其匹配的相邻非肿瘤组织阵列均购自上海生物芯片有限公司(中国上海市)。所有这些样本都被取消识别，并且该队列具有临床结果信息。
通过MTT法测定细胞活力：向待测细胞中加入MTT溶液并在37℃下孵育4小时。然后取出培养基。加入100ul DMSO，用酶标仪测定570nm处的吸光度。
细胞凋亡测定：通过使用Muse TM Annexin V和死细胞测定试剂盒(Millipore，Billerica，MA，USA)染色细胞来测量细胞凋亡，并且在台式Muse Cell Analyzer(Millipore，Billerica，MA，USA)中根据制造商的说明书进行细胞计数、细胞周期及细胞凋亡分析。
单克隆形成实验(集落形成测定)：将肿瘤细胞接种到6孔板中并培养过夜。然后用指定浓度的药剂处理细胞48小时。用新鲜培养基冲洗后，形成集落，用4％多聚甲醛固定，用0.1％结晶紫染色，然后在指定时间内计数。
免疫荧光测定：用4％多聚甲醛固定细胞30分钟，并与0.5％Triton X-100在PBS中孵育，用5％BSA封闭30分钟。将载玻片在4℃下用抗LC-3B抗体染色过夜，随后在室温下用Alexa-Fluor 488缀合的山羊抗兔IgG抗体染色1小时。用2.5μg/mL DAPI(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)对核进行染色，并通过倒置荧光显微镜(Carl Zeiss，Oberkochen，Germany)显色。
免疫组化检测：切除组织切片，福尔马林固定，石蜡包埋，然后与抗Ki67，抗切割的半胱天冬酶3，抗PARP，抗LC-3B和抗-TCRP1抗体在4℃过夜，随后是生物素化的二抗。使用Vectastain Elite ABC试剂盒(Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA)可视化免疫反应性。在每个实验中包括已知的阳性对照，通过省略第一抗体获得阴性对照。
蛋白质印迹分析：使用的抗体如下：SQSTM1/p62(D5E2)抗体，Atg5(D5F5U)抗体，Atg7(D12B11)抗体，Atg12(D88H11)抗体，抗LC-3B(D11)抗体，磷酸-p70S6激酶(Thr-389)抗体，总p70S6K抗体，磷酸-Akt(Ser-473)抗体，总Akt抗体，磷酸4-EBP1(Thr-37/46)抗体，总4-EBP1抗体和Cleaved Caspase 3(D175)抗体为CST公司(Danvers，MA，USA)的产品。抗PARP1/2(H250)和TCRP1(E-13)抗体为Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA，USA)产品。抗β-肌动蛋白(A5441)抗体为Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)产品。
实施例1、自噬抑制剂增强石蒜碱的抗肝癌活性(自噬抑制剂和石蒜碱联用增强肝癌细胞的凋亡)
1、石蒜碱抑制了肝细胞肝癌的生长
通过MTT法测定细胞活力，分析石蒜碱对三种典型的人类肝细胞肝癌细胞系(HepG2，SMMC-7721，HuH-7)的生长抑制作用，以及非致瘤性的人类肝细胞系(ChangLiver)。用分别含有0、10、20、30、40、50μM的石蒜碱的培养基分别培养HepG2，SMMC-7721，HuH-7和Chang Liver 48小时，用MTT法测定细胞活力，结果表明10、20、30、40、50μM的石蒜碱处理48小时，肝癌细胞存活能力显著下降，与此同时，石蒜碱并没有影响到相同剂量的正常肝细胞Chang Liver的细胞存活能力(图1中b)。取其中的0、10、20μM的石蒜碱处理48小时的HepG2，SMMC-7721，HuH-7进行单克隆形成实验检测，结果表明10和20μM石蒜碱处理HepG2，SMMC-7721，HuH-7 48小时，显著抑制HepG2，SMMC-7721，HuH-7的细胞增殖(图1中C)。异种移植瘤致瘤性检测结果表明，如图1中d所示，与对照组相比，用石蒜碱治疗后肿瘤的大小明显降低。与此相一致，正常组肿瘤的重量比用石蒜碱处理的肿瘤要大得多(图1中e)。与对照组相比，石蒜碱治疗的异种移植肿瘤的生长率明显下降(图1中f)。为了进一步评估肿瘤生长中增殖的相对变化，通过Ki67(标记细胞增殖状态的抗原)染色进行免疫组化检测，结果表明与正常组的肿瘤相比，Lycorine(10mg/kg)组和Lycorine(20mg/kg)组的肿瘤有明显的下降百分比(图1中g)。然而，主要目标器官(图1中h)的细胞形态和体重并没有明显的差异。总的来说，这些结果表明，石蒜碱在体外和体内抑制了肝癌的增殖。
其中，异种移植瘤致瘤性检测方法如下：
将HepG2细胞(0.2mL PBS中的5×106)(通过皮下注射)接种到7周龄的BALB/c雌性无胸腺裸鼠(Taconic)中。当肿瘤体积达到100mm3时，将小鼠随机分为3组：正常组，Lycorine(10mg/kg)组(Lycorine 10mg/kg)和Lycorine(20mg/kg)组(Lycorine 20mg/kg)，每组8只。并且每隔一天连续33天腹腔注射溶液，Lycorine(10mg/kg)组每只注射120μL的石蒜碱溶液，使石蒜碱的注射剂量为10mg/kg体重/天；Lycorine(20mg/kg)组每只注射120μL的石蒜碱溶液，使石蒜碱的注射剂量为20mg/kg体重/天；正常组注射等体积的PBS。每3天监测肿瘤体积和体重。从第一次给药起33天处死小鼠后，将其肿瘤称重，拍照并在4％多聚甲醛中固定，用于免疫组织化学测定。
2、石蒜碱促进了肝细胞肝癌的自噬
除了细胞凋亡外，自噬是细胞应激反应的程序性细胞死亡的另一种模式。首先通过评价LC-3B和p62(两种经典的自噬标记物)来研究石蒜碱对自噬体形成的影响，用分别含有0、10、20、30和40μM的石蒜碱的培养基分别培养HepG2，SMMC-7721，48小时，取细胞分别用SQSTM1/p62(D5E2)抗体、LC-3B(D11)抗体、Atg5(D5F5U)抗体，Atg7(D12B11)抗体，Atg12(D88H11)抗体和抗β-肌动蛋白(A5441)抗体进行蛋白质印迹分析p62、LC-3B、Atg5、Atg7、Atg12和Actin(作为内参)表达量，结果表明石蒜碱可以上调LC-3B的表达并呈一定的剂量依赖型，而p62的表达显着降低(图2中a)。石蒜碱可以显著上调Atg5，Atg7和Atg12的蛋白表达(图2中b)。为了进一步验证石蒜碱诱导的自噬，通过透射电子显微镜研究了肝癌的细胞内形态学变化。方法如下：用分别含有0和40μM的石蒜碱的培养基分别培养HepG2，SMMC-772148小时，用4％戊二醛固定细胞。在超薄切片机中切割超薄(50nm)切片，并用1％乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色。最后，通过电子显微镜Hitachi H-7650(Hitachi，Tokyo，Japan)测定切片。结果表明与正常组细胞(0μM石蒜碱处理的细胞)相比，40μM石蒜碱处理的细胞(图2中c用Lycorine表示的细胞)双膜囊泡有着显著的积累(含有亚细胞物质)(图2中c)。
为了确定自噬通量，根据制造商(上海吉凯基因化学技术)的说明书用自噬双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3)转染细胞HepG2，SMMC-7721。然后将转染的细胞分别用含有0和40μM的石蒜碱的培养基分别培养48小时。随后，将这些细胞用4％多聚甲醛固定10分钟，并用PBS洗涤。最后，用激光扫描共焦显微镜(Olympus FV1000，Tokyo，Japan)对GFP/mRFP图像进行显像。其中，mRFP用于标记及追踪LC3，GFP的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，红绿荧光Merge后出现的黄色斑点即是自噬体，红色的斑点指示自噬溶酶体,通过不同颜色斑点的计数可以清晰的看出自噬流的强弱。另外，用分别含有0和40μM的石蒜碱的培养基分别培养HepG2，SMMC-772148小时，用DAPI对细胞进行细胞核染色，10分钟后，用抗LC-3B(D11)抗体对细胞进行免疫组化检测。结果表明使用串联mRFP-GFP标记的LC-3，石蒜碱处理后，导致LC-3-II转化增加，促进LC-3脂化和斑点，以及积累的黄色点状自噬体(图2中d和e)。图2中d和e，正常组和Control为0μM石蒜碱处理的细胞，Lycorine为40μM石蒜碱处理的细胞。
此外，通过蛋白质印迹测定和免疫组化染色评估了石蒜碱对体内肝癌自噬的影响。将HepG2细胞(0.2mL PBS中的5×106)(通过皮下注射)接种到7周龄的BALB/c雌性无胸腺裸鼠(Taconic)中。当肿瘤体积达到100mm3时，将小鼠随机分为3组：正常组，Lycorine(10mg/kg)组和Lycorine(20mg/kg)组，每组8只。并且每隔一天连续33天腹腔注射溶液，Lycorine(10mg/kg)组每只注射120μL的石蒜碱溶液，使石蒜碱的注射剂量为10mg/kg体重/天；Lycorine(20mg/kg)组每只注射120μL的石蒜碱溶液，使石蒜碱的注射剂量为20mg/kg体重/天；正常组注射等体积的PBS。每3天监测肿瘤体积和体重。从第一次给药起33天处死小鼠后，在4％多聚甲醛中固定肿瘤，用抗LC-3B(D11)抗体对肿瘤细胞进行免疫组化检测，并对肿瘤细胞分别用SQSTM1/p62(D5E2)抗体、LC-3B(D11)抗体和抗β-肌动蛋白(A5441)抗体进行蛋白质印迹分析p62、LC-3B和Actin(作为内参)表达量。结果表明与正常组相比，石蒜碱处理后明显增加了HepG2肿瘤中LC-3B-II水平，同时，p62的水平显着降低(图2中f)。图2中f中，Lycorine(mg/kg)行中的0列为正常组，Lycorine(mg/kg)行中的10列为Lycorine(10mg/kg)组，Lycorine(mg/kg)行中的20列为Lycorine(20mg/kg)组。
与此一致地，通过LC-3B的免疫组化染色观察到类似的趋势。在石蒜碱治疗的肿瘤中，LC-3B阳性染色的自噬细胞数量明显高于正常组(图2中g)。总之，这些结果表明，石蒜碱促进了肝细胞肝癌的自噬。
3、抑制自噬可以进一步促进石蒜碱诱导的肝癌细胞凋亡
3.1自噬抑制剂3-MA增强石蒜碱的抗肝癌活性，3-MA和石蒜碱在抗肝癌方面产生了协同作用
虽然细胞凋亡和自噬是程序性细胞死亡的两种不同模式，但它们具有复杂的互连，以维持细胞内环境平衡。为了研究石蒜碱对肝癌细胞细胞自噬和凋亡的影响，选择了3-甲基腺嘌呤(3-MA)，一种自噬抑制剂(阻断自噬)，分别用和不用3-MA处理的石蒜碱诱导的肝癌细胞。
实验设4个处理，分别为对照处理、石蒜碱单独处理、3-MA单独处理、石蒜碱和3-MA联合处理。具体实验方法如下：
对照处理：将HepG2，SMMC-7721用含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基在37℃分别培养50小时，收集细胞，得到对照处理细胞。
石蒜碱单独处理：将HepG2，SMMC-7721用含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基在37℃分别培养2小时后，再向培养基中加入石蒜碱至石蒜碱的含量为40μM在37℃分别继续培养48小时，收集细胞，得到石蒜碱单独处理细胞。
3-MA单独处理：将HepG2，SMMC-7721用含有3-MA培养基(向含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基中加入3-MA至3-MA的含量为3mM得到的培养基)在37℃分别培养50小时，收集细胞，得到3-MA单独处理细胞。
石蒜碱和3-MA联合处理：将HepG2，SMMC-7721用含有3-MA培养基(向含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基中加入3-MA至3-MA的含量为3mM得到的培养基)在37℃分别培养2小时后，再向培养基中加入石蒜碱至石蒜碱的含量为40μM在37℃分别继续培养48小时，收集细胞，得到石蒜碱和3-MA联合处理细胞。
用SQSTM1/p62(D5E2)抗体、LC-3B(D11)抗体、Cleaved Caspase 3(D175)抗体、抗PARP1/2(H250)抗体和抗β-肌动蛋白(A5441)抗体进行蛋白质印迹分析对照处理细胞、石蒜碱单独处理细胞、3-MA单独处理细胞和石蒜碱和3-MA联合处理细胞中的p62、LC-3B、Cleaved Caspase-3、PARP和Actin(作为内参)表达量，结果表明3-MA显着减弱肝癌细胞(HepG2和SMMC-7721)中的石蒜碱诱导的自噬(图3中a)。有趣的是，3-MA通过激活CleavedCaspase 3和PARP进一步增加了石蒜碱诱导的细胞凋亡(图3中a)。
PARP(poly ADP-ribose polymerase)是细胞凋亡核心成员胱天蛋白酶(caspase)的切割底物。
将对照处理细胞、石蒜碱单独处理细胞、3-MA单独处理细胞和石蒜碱和3-MA联合处理细胞通过MTT法测定细胞活力，通过使用Muse TM Annexin V和死细胞测定试剂盒(Millipore，Billerica，MA，USA)染色细胞来测量细胞凋亡，结果如图3中b所示，石蒜碱和3-MA联合处理的HepG2细胞的凋亡率(60.18％±1.02％)高于石蒜碱单独处理的HepG2细胞的凋亡率(40.85％±1.13％)和3-MA单独处理的HepG2细胞的凋亡率(7.53％±0.13％)之和；石蒜碱和3-MA联合处理的SMMC-7721细胞的凋亡率(63.52％±2.22％)高于石蒜碱单独处理的SMMC-7721细胞的凋亡率(46.33％±2.35％)和3-MA单独处理的SMMC-7721细胞的凋亡率(7.21％±0.11％)之和。说明3-MA增强石蒜碱的抗肝癌活性，3-MA和石蒜碱在抗肝癌方面产生了协同作用。
实施例2、靶向LC-3B的siRNA增强石蒜碱的抗肝癌活性，靶向LC-3B的siRNA和石蒜碱在抗肝癌方面产生了协同作用
人微管相关蛋白1轻链3β(Homo sapiens microtubule associated protein1light chain 3beta，MAP1LC3B，简称LC-3B)基因的NCBI Reference Sequence:NM_022818.4(Update Date：10-JUL-2017)。
本实验选择随机双链RNA作为阴性对照siRNA，该随机双链RNA的名称为siNC，siNC的一条链的从5’端至3’端的核苷酸序列为(5’-uucuccgaacgugucacguTT-3’)，siNC的另一条链的从3’端至5’端的核苷酸序列为(3’-TTaagaggcuugcacagugca-5’)。
本实验选择两个靶向人LC-3B的siRNA，分别命名为LC-3B-1和LC-3B-2，LC-3B-1的一条链的从5’端至3’端的核苷酸序列为(5’-gcucuucuagaauuguuuaTT-3’(序列表中序列1))，LC-3B-1的另一条链的从3’端至5’端的核苷酸序列为(3’-TTcgagaagaucuuaacaaau-5’(序列表中序列2))。LC-3B-2的一条链的从5’端至3’端的核苷酸序列为(5’-guagaagauguccgacuuaTT-3’(序列表中序列3))，LC-3B-2的另一条链的从3’端至5’端的核苷酸序列为(3’-TTcaucuucuacaggcugaau-5’(序列表中序列4))。
上述三个siRNA的序列中，u、c、g、a和T分别为尿嘧啶核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、腺嘌呤核糖核苷酸和胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸。
实验设8个处理，分别为对照siRNA单独处理1、对照siRNA单独处理2、石蒜碱和对照siRNA联合处理1、石蒜碱和对照siRNA联合处理2、LC-3B-1单独处理、石蒜碱和LC-3B-1联合处理、LC-3B-2单独处理、石蒜碱和LC-3B-2联合处理。具体实验方法如下：
对照siRNA单独处理1和对照siRNA单独处理2的实验方法相同，石蒜碱和对照siRNA联合处理1与石蒜碱和对照siRNA联合处理2的实验方法相同，对照siRNA单独处理1与石蒜碱和对照siRNA联合处理1作为LC-3B-1的对照，对照siRNA单独处理2与石蒜碱和对照siRNA联合处理2作为LC-3B-2的对照。
对照siRNA单独处理1、对照siRNA单独处理2：将HepG2和SMMC-7721细胞分别接种于6孔板中，每孔接种4×105个细胞，用含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基37℃培养12h后使用Lipofectamine RNAi Max转染siNC，12h后进行二次转染，二次转染siNC24h后换新鲜的含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基在37℃分别继续培养48小时，收集细胞，得到对照siRNA单独处理1细胞和对照siRNA单独处理2细胞。其中，每次转染的siNC浓度均为30nM。
石蒜碱和对照siRNA联合处理1、石蒜碱和对照siRNA联合处理2：将HepG2和SMMC-7721细胞分别接种于6孔板中，每孔接种4×105个细胞，用含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基培养37℃12h后使用Lipofectamine RNAi Max转染siNC，12h后进行二次转染，二次转染siNC 24h后换含有40μM的石蒜碱的培养基(向含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基中加入石蒜碱至石蒜碱的含量为40μM)在37℃分别继续培养48小时，收集细胞，得到石蒜碱和对照siRNA联合处理1细胞、石蒜碱和对照siRNA联合处理2细胞。其中，每次转染的siNC浓度均为30nM。
LC-3B-1单独处理：将HepG2和SMMC-7721细胞分别接种于6孔板中，每孔接种4×105个细胞，用含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基37℃培养12h后使用Lipofectamine RNAi Max转染LC-3B-1，12h后进行二次转染，二次转染LC-3B-124h后换新鲜的含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基在37℃分别继续培养48小时，收集细胞，得到LC-3B-1单独处理细胞。其中，每次转染的LC-3B-1浓度均为30nM。
石蒜碱和LC-3B-1联合处理：将HepG2和SMMC-7721细胞分别接种于6孔板中，每孔接种4×105个细胞，用含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基37℃培养12h后使用Lipofectamine RNAi Max转染LC-3B-1，12h后进行二次转染，二次转染LC-3B-1 24h后换含有40μM的石蒜碱的培养基(向含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基中加入石蒜碱至石蒜碱的含量为40μM)在37℃分别继续培养48小时，收集细胞，得到石蒜碱和LC-3B-1联合处理细胞。其中，每次转染的LC-3B-1浓度均为30nM。
LC-3B-2单独处理：将HepG2和SMMC-7721细胞分别接种于6孔板中，每孔接种4×105个细胞，用含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基37℃培养12h后使用Lipofectamine RNAi Max转染LC-3B-2，12h后进行二次转染，二次转染LC-3B-224h后换新鲜的含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基在37℃分别继续培养48小时，收集细胞，得到LC-3B-2单独处理细胞。其中，每次转染的LC-3B-2浓度均为30nM。
石蒜碱和LC-3B-2联合处理：将HepG2和SMMC-7721细胞分别接种于6孔板中，每孔接种4×105个细胞，用含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基37℃培养12h后使用Lipofectamine RNAi Max转染LC-3B-2，12h后进行二次转染，二次转染LC-3B-2 24h后换含有40μM的石蒜碱的培养基(向含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基中加入石蒜碱至石蒜碱的含量为40μM)在37℃分别继续培养48小时，收集细胞，得到石蒜碱和LC-3B-2联合处理细胞。其中，每次转染的LC-3B-2浓度均为30nM。
用SQSTM1/p62(D5E2)抗体、LC-3B(D11)抗体、Cleaved Caspase 3(D175)、抗PARP1/2(H250)抗体和抗β-肌动蛋白(A5441)抗体进行蛋白质印迹分析对照siRNA单独处理1细胞、对照siRNA单独处理2细胞、石蒜碱和对照siRNA联合处理1细胞、石蒜碱和对照siRNA联合处理2细胞、LC-3B-1单独处理细胞、石蒜碱和LC-3B-1联合处理细胞、LC-3B-2单独处理细胞、石蒜碱和LC-3B-2联合处理细胞中的p62、LC-3B、Cleaved Caspase-3、PARP和Actin(作为内参)表达量，结果表明LC-3B-1和LC-3B-2这两个靶向LC-3B的siRNA显着减弱肝癌细胞(HepG2和SMMC-7721)中的石蒜碱诱导的自噬(图3中c和f)。LC-3B-1和LC-3B-2这两个靶向LC-3B的siRNA均降低了石蒜碱诱导的HepG2和SMMC-7721细胞中的LC-3B的含量。说明siRNA敲低内源性LC-3B显著降低了石蒜碱诱导的自噬。
将对照siRNA单独处理1细胞、对照siRNA单独处理2细胞、石蒜碱和对照siRNA联合处理1细胞、石蒜碱和对照siRNA联合处理2细胞、LC-3B-1单独处理细胞、石蒜碱和LC-3B-1联合处理细胞、LC-3B-2单独处理细胞、石蒜碱和LC-3B-2联合处理细胞通过MTT法测定细胞活力，通过使用Muse TM Annexin V和死细胞测定试剂盒(Millipore，Billerica，MA，USA)染色细胞来测量细胞凋亡，结果如图3中d和e所示，石蒜碱和LC-3B-1联合处理的HepG2细胞的凋亡率(68.32％±1.53％)高于石蒜碱和对照siRNA联合处理1的HepG2细胞的凋亡率(47.73％±1.81％)和LC-3B-1单独处理的HepG2细胞的凋亡率(3.12％±0.38％)之和；石蒜碱和LC-3B-2联合处理的HepG2细胞的凋亡率(57.62％±4.28％)高于石蒜碱和对照siRNA联合处理2的HepG2细胞的凋亡率(34.25％±2.92％)和LC-3B-2单独处理的HepG2细胞的凋亡率(6.23％±2.35％)之和。石蒜碱和LC-3B-1联合处理的SMMC-7721细胞的凋亡率(64.39％±1.62％)高于石蒜碱和对照siRNA联合处理1的SMMC-7721细胞的凋亡率(42.33％±3.85％)和LC-3B-1单独处理的SMMC-7721细胞的凋亡率(4.04％±0.29％)之和；石蒜碱和LC-3B-2联合处理的SMMC-7721细胞的凋亡率(58.98％±0.33％)高于石蒜碱和对照siRNA联合处理2的SMMC-7721细胞的凋亡率(38.66％±4.30％)和LC-3B-2单独处理的SMMC-7721细胞的凋亡率(3.14％±0.32％)之和。说明LC-3B-1和LC-3B-2这两个靶向LC-3B的siRNA增强石蒜碱的抗肝癌活性，靶向LC-3B的siRNA和石蒜碱在抗肝癌方面产生了协同作用。这些结果强烈地表明，抑制自噬可以进一步促进石蒜碱诱导的肝癌细胞凋亡。
实施例3、Akt抑制剂增强石蒜碱的抗肝癌活性(Akt抑制剂和石蒜碱联用增强肝癌细胞的凋亡)
1、石蒜碱通过TCRP1/Akt/mTOR信号通路促进肝癌细胞凋亡和自噬
参照实施例1中相应的实验方法进行实验。
据报道，舌癌耐药相关蛋白1(Tongue cancer resistance-associatedprotein1，TCRP1)能够通过选择性活化PI3K/Akt和NF-KB通路在抗辐射性口腔鳞状细胞癌中促进肿瘤发生。如图4中a所示，石蒜碱治疗显着降低了肝癌细胞TCRP1蛋白水平的表达。然而，石蒜碱治疗并没有明显改变TCRP1的mRNA水平(图4中b)，这表明TCRP1蛋白质通过蛋白酶体降解大部分被转移。随后，用MG-132(一种蛋白酶体抑制剂)治疗明显地消除了石蒜碱对肝癌细胞TCRP1蛋白水平的抑制作用(图4中b)。总之，这些结果表明，石蒜碱可能通过促进TCRP1蛋白降解途径降低TCRP1蛋白水平。
接下来，发现肝癌细胞中过表达TCRP1显著阻止了石蒜碱对Akt/mTOR通路的抑制作用(图4中c)。此外，TCRP1过表达也阻断了石蒜碱诱导的凋亡和自噬相关蛋白表达，细胞死亡(图4中d-f)。此外，TCRP1过表达强烈地阻断了石蒜碱对集落形成的抑制作用(图4中g)。与此相一致的，石蒜碱处理减少HepG2异种移植肿瘤中TCRP1，Akt，4-EBP1和p70S6K的蛋白水平(图4中h)。因此，免疫组化染色证明，与对照异种移植物肿瘤相比，在石蒜碱处理的异种移植肿瘤中，磷酸化的Akt和TCRP1的阳性染色强得多(图5中a和b)。接下来，评价了肝癌患者组织中Akt和TCRP1之间的临床相关性。如预期的那样，TCRP1表达与p-Akt呈正相关(图5中c和d)，其支持在培养的细胞和小鼠肿瘤模型中的结果。总之，该研究结果表明，石蒜碱通过TCRP1/Akt/mTOR信号通路促进肝癌细胞凋亡和自噬并起关键性的作用。
2、Akt抑制剂增强石蒜碱的抗肝癌活性(Akt抑制剂和石蒜碱联用增强肝癌细胞的凋亡)
本实验采用的Akt抑制剂是LY294002，其结构式如式1。
Figure BDA0001361447870000141
实验设4个处理，分别为对照处理、石蒜碱单独处理、LY294002单独处理、石蒜碱和LY294002联合处理。具体实验方法如下：
对照处理：将HepG2，SMMC-7721用含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基在37℃分别培养50小时，收集细胞，得到对照处理细胞。
石蒜碱单独处理：将HepG2，SMMC-7721用含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基在37℃分别培养2小时后，再向培养基中加入石蒜碱至石蒜碱的含量为40μM在37℃分别继续培养48小时，收集细胞，得到石蒜碱单独处理细胞。
LY294002单独处理：将HepG2，SMMC-7721用含有LY294002培养基(向含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基中加入LY294002至LY294002的含量为20μM得到的培养基)在37℃分别培养50小时，收集细胞，得到LY294002单独处理细胞。
石蒜碱和LY294002联合处理：将HepG2，SMMC-7721用含有LY294002培养基(向含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基中加入LY294002至LY294002的含量为20μM得到的培养基)在37℃分别培养2小时后，再向培养基中加入石蒜碱至石蒜碱的含量为40μM在37℃分别继续培养48小时，收集细胞，得到石蒜碱和LY294002联合处理细胞。
将对照处理细胞、石蒜碱单独处理细胞、LY294002单独处理细胞与石蒜碱和LY294002联合处理细胞通过使用Muse TM Annexin V和死细胞测定试剂盒(Millipore，Billerica，MA，USA)染色细胞来测量细胞凋亡，结果表明，石蒜碱和LY294002联合处理的HepG2细胞的凋亡率(62.82％±3.82％)高于石蒜碱单独处理的HepG2细胞的凋亡率(37.66％±3.35％)和LY294002单独处理的HepG2细胞的凋亡率(4.85％±0.34％)之和；石蒜碱和LY294002联合处理的SMMC-7721细胞的凋亡率(60.59％±4.68％)高于石蒜碱单独处理的SMMC-7721细胞的凋亡率(39.19％±4.16％)和LY294002单独处理的SMMC-7721细胞的凋亡率(3.99％±0.28％)之和(图6)。说明LY294002增强石蒜碱的抗肝癌活性，LY294002和石蒜碱在抗肝癌方面产生了协同作用。
实施例4、靶向TCRP1的siRNA增强石蒜碱的抗肝癌活性(抑制TCRP1表达的试剂和石蒜碱联用增强肝癌细胞的凋亡)
本实验选择随机双链RNA作为阴性对照siRNA，该随机双链RNA的名称为siNC，siNC的一条链的从5’端至3’端的核苷酸序列为(5’-uagaccuugguacucgacgaucuuuTT-3’)，siNC的另一条链的从3’端至5’端的核苷酸序列为(3’-TTaucuggaaccaugagcugcuagaaa-5’)。
本实验选择一个靶向TCRP1的siRNA，命名为siRNATCRP1的一条链的从5’端至3’端的核苷酸序列为(5’-uagucccaguuaugcuccagaguuuTT-3’)，siRNATCRP1的另一条链的从3’端至5’端的核苷酸序列为(3’-TTaucagggucaauacgaggucucaaa-5’。
上述两个siRNA的序列中，u、c、g、a和T分别为尿嘧啶核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、腺嘌呤核糖核苷酸和胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸。
实验设4个处理，分别为对照siRNA单独处理、石蒜碱和对照siRNA联合处理、siRNATCRP1单独处理、石蒜碱和siRNATCRP1联合处理。具体实验方法如下：
对照siRNA单独处理：将HepG2和SMMC-7721细胞分别接种于6孔板中，每孔接种4×105个细胞，用含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基37℃培养12h后使用Lipofectamine RNAi Max转染siNC，12h后进行二次转染，二次转染siNC 24h后换新鲜的含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基在37℃分别继续培养48小时，收集细胞，得到对照siRNA单独处理细胞。其中，每次转染的siNC浓度均为30nM。
石蒜碱和对照siRNA联合处理：将HepG2和SMMC-7721细胞分别接种于6孔板中，每孔接种4×105个细胞，用含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基37℃培养12h后使用Lipofectamine RNAi Max转染siNC，12h后进行二次转染，二次转染siNC 24h后换含有40μM的石蒜碱的培养基(向含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基中加入石蒜碱至石蒜碱的含量为40μM)在37℃分别继续培养48小时，收集细胞，得到石蒜碱和对照siRNA联合处理细胞。其中，每次转染的siNC浓度均为30nM。
siRNATCRP1单独处理：将HepG2和SMMC-7721细胞分别接种于6孔板中，每孔接种4×105个细胞，用含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基37℃培养12h后使用Lipofectamine RNAi Max转染siRNATCRP1，12h后进行二次转染，二次转染siRNATCRP124h后换新鲜的含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基在37℃分别继续培养48小时，收集细胞，得到siRNATCRP1单独处理细胞。其中，每次转染的siRNATCRP1浓度均为30nM。
石蒜碱和siRNATCRP1联合处理：将HepG2和SMMC-7721细胞分别接种于6孔板中，每孔接种4×105个细胞，用含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基37℃培养12h后使用Lipofectamine RNAi Max转染siRNATCRP1，12h后进行二次转染，二次转染siRNATCRP1 24h后换含有40μM的石蒜碱的培养基(向含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基中加入石蒜碱至石蒜碱的含量为40μM)在37℃分别继续培养48小时，收集细胞，得到石蒜碱和siRNATCRP1联合处理细胞。其中，每次转染的siRNATCRP1浓度均为30nM。
将对照siRNA单独处理细胞、石蒜碱和对照siRNA联合处理细胞、siRNATCRP1单独处理细胞、石蒜碱和siRNATCRP1联合处理细胞通过使用Muse TM Annexin V和死细胞测定试剂盒(Millipore，Billerica，MA，USA)染色细胞来测量细胞凋亡，结果表明石蒜碱和siRNATCRP1联合处理的HepG2细胞的凋亡率(61.22％±1.49％)高于石蒜碱和对照siRNA联合处理的HepG2细胞的凋亡率(36.90％±3.88％)和siRNATCRP1单独处理的HepG2细胞的凋亡率(5.19％±0.31％)之和；石蒜碱和siRNATCRP1联合处理的SMMC-7721细胞的凋亡率(58.24％±4.37％)高于石蒜碱和对照siRNA联合处理的SMMC-7721细胞的凋亡率(35.55％±2.96％)和siRNATCRP1单独处理的SMMC-7721细胞的凋亡率(4.04％±0.35％)之和(图7)。说明靶向TCRP1的siRNA增强石蒜碱的抗肝癌活性，靶向TCRP1的siRNA和石蒜碱在抗肝癌方面产生了协同作用。
<110> 天津中医药大学
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 1
gcucuucuag aauuguuuat t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 2
ttcgagaaga ucuuaacaaa u 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 3
guagaagaug uccgacuuat t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<220>
<230>
<400> 4
ttcaucuucu acaggcugaa u 21

Claims (7)

1.降低LC-3B的表达或活性的试剂在制备增强石蒜碱抗肝癌活性产品中的应用；所述降低LC-3B的表达或活性的试剂选自1)、2)或其组合：
1)靶向LC-3B基因的siRNA、shRNA、miRNA或反义RNA；
2)产生靶向LC-3B基因的siRNA的表达载体、产生靶向LC-3B基因的shRNA的表达载体或产生靶向LC-3B基因的miRNA的表达载体。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：2)所述表达载体为产生靶向LC-3B基因的siRNA的DNA分子或产生靶向LC-3B基因的shRNA的DNA分子。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述抗肝癌活性产品为抗肝癌细胞活性产品。
4.权利要求1或2中所述的降低LC-3B的表达或活性的试剂和石蒜碱在制备抗肝癌产品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述抗肝癌产品为抗肝癌细胞产品。
6.抗肝癌的产品，其特征在于：所述产品含有权利要求1或2中所述的降低LC-3B的表达或活性的试剂和石蒜碱。
7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于：所述抗肝癌的产品为抗肝癌细胞的产品。
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