CN109303759A - 一种脐带血富血小板血浆的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞因子化妆品领域，具体而言，涉及一种脐带血富血小板血浆的制备方法及其应用。一种脐带血富血小板血浆的制备方法，包括以下步骤：脐带血180‑200g离心，得到的全血分为3层，上层为淡黄色血浆层，最下层为红细胞层，二者中间有一层白色黄衣层；取上层、白色黄衣层和白色黄衣层附近的红细胞，800±50g离心，管底部白色沉淀即为浓缩血小板，吸走上层血浆，剩余液体充分混匀，即为富血小板血浆。该方法具有明显的富集血小板的作用，得到的富血小板血浆主要含有血小板、TGF‑β1、PDGF、VEGF等，使用后皮肤水合度提高，经皮失水减少，弹性明显增强，对皮肤状态改善明显。

Description

一种脐带血富血小板血浆的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及脐带血富血小板血浆化妆品领域，具体而言，涉及一种脐带血富血小板血浆的制备方法及其应用。

背景技术

富血小板血浆(PRP)是通过血液离心得到的富含大量生长因子的血小板浓缩物，每个血小板含有近50-80个α-颗粒，α-颗粒直径虽只有200-500nm，却包含着近300种生物活性蛋白，这些成分使组织损伤局部的生长因子增高，通过生长因子对组织的修复来达到治疗的目的，因此在组织损伤修复中起重要作用。

血小板激活后能释放大量活性分子，以及少量的白细胞和红细胞，只有通过脱颗粒才能使生长因子(如血小板源性生长因子(PDGF)，转化生长因子β1、β2(TGF-β1、β2)，成纤维细胞生长因子(FGF)，血管内皮生长因子(VEGF)，类胰岛素生长因子(IGF)以及表皮生长因子(EGF)等)大量释放。血小板源性生长因子(PDGF)可以刺激成纤维细胞的生成、趋化、刺激转化生长因子β1、合成胶原等。这些生长因子可帮助皮肤减缓衰老，提高胶原含量和组织内新生血管含量，使皮肤呈现活力与光泽。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种脐带血富血小板血浆的制备方法，该方法具有明显的富集血小板的作用，得到的富血小板血浆主要含有血小板、TGF-β1、PDGF、VEGF等。

本发明的第二目的在于提供富血小板血浆在改善皮肤状态中的应用，使用后皮肤水合度提高，经皮失水减少，弹性明显增强。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种脐带血富血小板血浆的制备方法，包括以下步骤：脐带血180-200g离心，得到的全血分为3层，上层为淡黄色血浆层，最下层为红细胞层，二者中间有一层白色黄衣层；

取上层、白色黄衣层和白色黄衣层附近的红细胞，800±50g离心，管底部白色沉淀即为浓缩血小板，吸走上层血浆，剩余液体充分混匀，即为富血小板血浆。

本发明提供的脐带血富血小板血浆的制备方法，具有明显的富集血小板的作用，得到的富血小板血浆主要含有血小板、TGF-β1、PDGF、VEGF等。

进一步地，所述180-200g离心的时间为8-15min。如在不同的实施例中，可以为：180g离心的时间为15min、190g离心的时间为10min、200g离心的时间为10min、200g离心的时间为8min、180g离心的时间为10min等等。

进一步地，所述800±50g离心的时间为8-15min。如在不同的实施例中，可以为：800g离心的时间为10min、800g离心的时间为8min、800g离心的时间为15min、750g离心的时间为15min、850g离心的时间为8min等等。

本发明中，脐带血分离后为了防止凝聚，需要加入抗凝剂。抗凝剂选用现有的试剂以及含量添加即可。

本发明中所用的所述脐带血为含有枸橼酸葡萄糖抗凝溶液A的脐带血。

皮肤由构造致密的多层组织与细胞相叠而成，主要分为表皮、真皮和皮下组织。皮肤的老化是生理因素和外在因素共同作用的结果，生理因素如年龄、内分泌及免疫功能等，外在因素如紫外线、风吹等。真皮层的老化是皮肤老化的主要原因，真皮层直接与含有透明质酸、复合蛋白糖等多种物质的基质相连，这些基质是各种水溶性物质、电解质等代谢转化的场所，与皮肤老化有最直接的关系。延缓真皮层基质的老化，延缓基质微血管量的降低，能够有效缓解衰老过程。日光紫外线长期反复照射是环境中影响皮肤衰老最重要的因素，能够导致皮肤粗糙、皱纹加深、色素沉着、血管扩张、真皮弹性纤维变性等。

护肤品的发展历程中，第一代是单纯物理保护的油脂类化妆品，如绵羊油等，第二代则是合成的脂肪族化合物，如硬脂酸钠等，第三代的主要成分是天然植物的提取物。第四代生物技术护肤品，采用生物技术提取制造与人体自身结构相仿且具有高亲和力的生物精华物质，富血小板血浆就是其中一类，干细胞富含的各种因子能够将皮肤护理转向细胞水平，从根本上实现皮肤状态的年轻化。

本发明提供的富血小板血浆主要含有血小板、TGF-β1、PDGF、VEGF等。

1)血小板源生长因子(PDGF)

PDGF是一种促有丝分裂因子，能够刺激细胞群分裂增殖，促进纤维母细胞的生成，从而使皱纹自然长平。还可以刺激成纤维细胞的生成、趋化、刺激转化生长因子β1、合成胶原1，促进皮下血管形成，修复皮下血液微循环系统，为皮肤提供充足营养，更有效地延缓皮肤衰老。

2)转化生长因子β1(TGF-β1)

TGF-β1是成纤维细胞的主要趋化因子，能够刺激成纤维细胞分裂增殖。TGF-β1对成纤维细胞的诱导趋化有利于组织修复过程的进行。TGF-β1还能够诱导巨噬细胞分泌血管发生因子，加速血管形成，还可以促进纤维连接蛋白、透明质酸等的合成，因此皮肤可以得到很好的修复，变得光滑红润。

3)血管内皮生长因子(VEGF)

VEGF是目前发现的作用最强、特异性最高的促血管生成因子。皮肤表皮组织无血管结构，主要通过真皮微血管提供营养物质并排出代谢废弃物。老年人皮肤的血管数急剧减少，从而导致皮肤的营养供给不足，阻碍了细胞的新陈代谢。VEGF可有效提高局部血管通透性，为成纤维细胞的增殖及胶原合成提供充足的营养物质和生长因子，促进细胞分裂，改善皮肤微循环，是皮肤代谢产物易于排出，不容易形成暗疮、黑斑和黄褐斑等。

本发明提供的上述方法制得的富血小板血浆在改善皮肤状态中的应用。

各组分协同配合，使用后皮肤水合度提高，经皮失水减少，弹性明显增强，改善皮肤状态效果明显。

本发明还提供了一种生物制剂，含有上述的制备方法制得的富血小板血浆。

本发明提供的富血小板血浆可根据使用需求制成不同剂型或包装的生物制剂。

进一步地，所述富血小板血浆保存在凝血酶-氯化钙激活剂中；

所述凝血酶-氯化钙激活剂为凝血酶与氯化钙的混合液，其中，所述氯化钙以氯化钙溶液的形式添加，所述氯化钙溶液的质量百分比浓度为10％±2％，以氯化钙溶液的体积计，所述凝血酶的添加量为1000±200U/mL。

进一步地，所述凝血酶为牛凝血酶。

进一步地，所述富血小板血浆与所述凝血酶-氯化钙激活剂按体积比为8-15:1混匀。

进一步地，所述混匀后，静置25-30s，所述富血小板血浆与凝血酶-氯化钙激活剂的混合液成凝胶状。

得到的凝胶状物质可进行分装以及保存的步骤，如放置在4℃保存。

制得的凝胶状物质可直接用于使用。

具体使用步骤如下：

1)面部用清洁洗面奶洗干净，自然晾干。

2)涂抹面部专用麻药一层，涂抹均匀后，覆盖保鲜膜一层以防麻药流动导致厚度不均匀，露出眼、鼻、嘴等部位，等待60-70min。

3)清水洗净麻药，操作人员戴上无菌手套，打开无菌纱布，蘸取适量皮肤消毒用新洁尔灭，擦拭面部两次，进行面部消毒。

4)用无菌干纱布擦拭掉剩余新洁尔灭，至面部无水分残留。

5)调整电动微针长度为1mm，在面颊部位次序进行微针针刺，保证每块肌肤都涉及，有微量出血属正常现象。

6)同时涂抹已准备好的凝胶状物质，用手涂抹均匀，使富血小板血浆慢慢被吸收。

7)眼睑、额头、鼻梁、上嘴唇几个敏感部位适当减少微针长度至0.7-0.9mm。

8)次序针刺至覆盖全脸，同时涂抹凝胶状物质，不断涂抹至吸收。

9)敷以提前4℃低温保存的保湿面膜20分钟，让皮肤镇定。

与传统护肤品相比，富血小板血浆能由内而外激活皮肤细胞，从真皮层改善皮肤功能，由本及面，改善效果能够更加持久。微针能够有效将富血小板血浆送到表皮以下，更有利于因子的吸收，能由内而外激发皮肤再生，因而能更加持久地改善皮肤状态。

本发明还提供了一种化妆品，含有上述的制备方法制得的富血小板血浆或上述的生物制剂。

进一步地，所述化妆品包括化妆水、乳液、面霜、眼霜。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供的富血小板血浆的制备方法，方法简便，得到的细胞因子种类丰富，含量高。

(2)本发明提供的富血小板血浆制成的生物制剂，使用后皮肤水合度提高，经皮失水减少，弹性明显增强，对皮肤状态改善效果明显。

(3)本发明还提供含有富血小板血浆的化妆品，为皮肤的护理提供更大的发展空间。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实验例1中状态变化对比照片；

图2为本发明实验例1中状态变化的另一组对比照片；

图3为本发明实验例1中状态变化的另一组对比照片。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

含有脐带血富血小板血浆的生物制剂，制备步骤如下：

1)将含有枸橼酸葡萄糖抗凝溶液A的15mL脐带血置于15mL离心管中，200×g离心10min。

2)全血分为3层，最下面1/2层为红细胞层，上层为淡黄色血浆层，二者中间有一层薄的白色黄衣层。

3)取全部上清及黄衣层和黄衣层附近的红细胞，800×g离心10min，离心管底部白色沉淀即为浓缩血小板，吸走上层3/4血浆，剩余液体充分混匀，即为富血小板血浆(PRP)。

4)无菌条件下，取1mL 10％氯化钙溶液，与1000U牛凝血酶溶解，混匀，即为凝血酶-氯化钙激活剂，使用前1h配置好，4℃保存。

5)制备的PRP与凝血酶-氯化钙激活剂按10:1混匀，静置30s，成凝胶状。

经检测，脐带血中血小板计数为(223.99±44.70)×10⁹/L，本实施例制备的凝胶状PRP中血小板计数为(1446.60±353.95)×10⁹/L，约为全血血小板计数的6.45倍，具有明显的富集作用。

检测凝胶状PRP中的组分，结果如下：TGF-β1浓度221.34±19.78ng/mL，PDGF浓度为125.32±33.5ng/mL，VEGF浓度为23.85±4.2ng/mL。

实施例2

含有脐带血富血小板血浆的生物制剂，制备步骤如下：

1)将含有枸橼酸葡萄糖抗凝溶液A的15mL脐带血置于15mL离心管中，180×g离心15min。

2)全血分为3层，最下面1/2层为红细胞层，上层为淡黄色血浆层，二者中间有一层薄的白色黄衣层。

3)取全部上清及黄衣层和黄衣层附近的红细胞，850×g离心8min，离心管底部白色沉淀即为浓缩血小板，吸走上层3/4血浆，剩余液体充分混匀，即为富血小板血浆。

4)无菌条件下，取1mL10％氯化钙溶液，与1000U牛凝血酶溶解，混匀，即为凝血酶-氯化钙激活剂，使用前1h配置好，4℃保存。

5)制备的PRP与凝血酶-氯化钙激活剂按10:1混匀，静置30s，成凝胶状。

经检测，本实施例制备的凝胶状PRP中血小板约为全血血小板计数的6.4倍以上，具有明显的富集作用。

检测凝胶状PRP中的组分，组分种类及含量与实施例1基本一致。

实施例3

含有脐带血富血小板血浆的生物制剂，制备步骤如下：

1)将含有枸橼酸葡萄糖抗凝溶液A的15mL脐带血置于15mL离心管中，200×g离心10min。

2)全血分为3层，最下面1/2层为红细胞层，上层为淡黄色血浆层，二者中间有一层薄的白色黄衣层。

3)取全部上清及黄衣层和黄衣层附近的红细胞，750×g离心15min，离心管底部白色沉淀即为浓缩血小板，吸走上层3/4血浆，剩余液体充分混匀，即为富血小板血浆。

4)无菌条件下，取1mL10％氯化钙溶液，与1000U牛凝血酶溶解，混匀，即为凝血酶-氯化钙激活剂，使用前1h配置好，4℃保存。

5)制备的PRP与凝血酶-氯化钙激活剂按10:1混匀，静置30s，成凝胶状。

经检测，本实施例制备的凝胶状PRP中血小板约为全血血小板计数的6.4倍以上，具有明显的富集作用。

检测凝胶状PRP中的组分，组分种类及含量与实施例1基本一致。

对比例1

申请号为201410538067.0公开的一种用于皮肤美容的血小板生长因子制备方法，用采集自人体的血液来获得血小板生长因子，血小板生长因子包含生长因子PDGF、TGF-β，包括如下制备步骤：

1)将人体血液置入采血试管，在离心机中以rpm：2000r/min转速，RCF：2000g离心力，旋转5分钟，分离出血浆、血小板、血球；

2)将所得血浆、血小板分别采用采血试管分离存放；

3)在血浆、血小板采血试管内分别加入医疗专用氯化钙，作为血小板中生长因子或血浆中胶原蛋白的激活剂，医疗专用氯化钙置入量为血浆或血小板重量的10％，使二者维持在7.0的pH值及在25℃温度下共同培养2小时的时间；

4)将血浆、血小板采血试管置入离心机中以rpm：8000r/min转速，RCF：8000g离心力，旋转5分钟，做二次分离；

5)取出血浆、血小板采血试管，在25℃的温度下共同培养不超过5小时。

对比例2

通过市售产品配置实施例1中凝胶状PRP的各组分，其中，血小板含量1450×10⁹/L，TGF-β1浓度230ng/mL，PDGF浓度为130ng/mL，VEGF浓度为25ng/mL。

实验例1

本发明还提供了上述的制备方法制得的生物制剂在改善皮肤状态中的应用。

具体使用步骤如下：

1)面部用清洁洗面奶洗干净，自然晾干。

2)涂抹面部专用麻药一层，涂抹均匀后，覆盖保鲜膜一层以防麻药流动导致厚度不均匀，露出眼、鼻、嘴等部位，等待60-70min。

3)清水洗净麻药，操作人员戴上无菌手套，打开无菌纱布，蘸取适量皮肤消毒用新洁尔灭，擦拭面部两次，进行面部消毒。

4)用无菌干纱布擦拭掉剩余新洁尔灭，至面部无水分残留。

5)调整电动微针长度为1mm，在面颊部位次序进行微针针刺，保证每块肌肤都涉及，有微量出血属正常现象。

6)同时涂抹已准备好的富血小板凝胶，用手涂抹均匀，使复合物慢慢被吸收。

7)眼睑、额头、鼻梁、上嘴唇几个敏感部位适当减少微针长度至0.7-0.9mm。

8)次序针刺至覆盖全脸，涂抹富血小板凝胶，不断涂抹至吸收。

9)敷以提前4℃低温保存的保湿面膜20分钟，让皮肤镇定。

实验组：共有13人，性别不限，年龄33-60岁。使用本发明实施例1提供的富血小板凝胶治疗5次后，进行效果比较，部分结果如表1所示。

表1治疗效果比较

统计全部检测数据发现，采用本发明实施例1提供的富血小板凝胶治疗5次后，水合度提升均在9.5％以上，最高可达26％，统计平均值在15％左右；经皮失水降低均在7％以上，最高可达27％，统计平均值在14％左右；弹性提升均在4.5％以上，最高可达10％，统计平均值在7.5％左右。

部分实例图片对照结果如图1-3所示，其中，A是治疗前图片，B是治疗后图片。

对比例1组：共有5人，性别不限，年龄33-60岁。使用对比例1提供的液体治疗5次后，进行效果比较，结果如表2所示。

表2治疗效果比较

采用本发明对比例1提供的液体治疗5次后，水合度提升均在6％以内，统计平均值在3％左右；经皮失水降低均在15％以内，统计平均值在10％左右；弹性提升，统计平均值在5％左右。

对比例2组：共有5人，性别不限，年龄33-60岁。使用对比例2提供的液体治疗5次后，进行效果比较，结果如表3所示。

表3治疗效果比较

采用本发明对比例2提供的液体治疗5次后，水合度提升均在5.1％以内，统计平均值在3％左右；经皮失水降低均在12.2％以内，统计平均值在10％左右；弹性提升，统计平均值在4％左右。

上述可知，本发明提供的脐带血富血小板血浆凝胶使用后皮肤水合度提高明显，经皮失水减少，弹性明显增强，对改善皮肤状态具有明显作用。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种脐带血富血小板血浆的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：脐带血180-200g离心，得到的全血分为3层，上层为淡黄色血浆层，最下层为红细胞层，二者中间有一层白色黄衣层；

取上层、白色黄衣层和白色黄衣层附近的红细胞，800±50g离心，管底部白色沉淀即为浓缩血小板，吸走上层血浆，剩余液体充分混匀，即为富血小板血浆。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述180-200g离心的时间为8-15min。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述800±50g离心的时间为8-15min。

4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述脐带血为含有枸橼酸葡萄糖抗凝溶液A的脐带血。

5.权利要求1-4任一项所述的制备方法制得的富血小板血浆在改善皮肤状态中的应用。

6.一种生物制剂，其特征在于，含有权利要求1-4任一项所述的制备方法制得的富血小板血浆。

7.根据权利要求6所述的生物制剂，其特征在于，所述富血小板血浆保存在凝血酶-氯化钙激活剂中；

所述凝血酶-氯化钙激活剂为凝血酶与氯化钙的混合液，其中，所述氯化钙以氯化钙溶液的形式添加，所述氯化钙溶液的质量百分比浓度为10％±2％，以氯化钙溶液的体积计，所述凝血酶的添加量为1000±200U/mL；

进一步地，所述凝血酶为牛凝血酶。

8.根据权利要求7所述的生物制剂，其特征在于，所述富血小板血浆与所述凝血酶-氯化钙激活剂按体积比为8-15:1混匀；

进一步地，所述混匀后，静置25-30s，所述富血小板血浆与凝血酶-氯化钙激活剂的混合液成凝胶状。

9.一种化妆品，其特征在于，含有权利要求1-4任一项所述的制备方法制得的富血小板血浆或权利要求6-8任一项所述的生物制剂。

10.根据权利要求9所述的化妆品，其特征在于，所述化妆品包括乳液、面霜、眼霜。