CN109306005B

CN109306005B - 一种eb病毒特异性t细胞抗原受体及其应用

Info

Publication number: CN109306005B
Application number: CN201811155550.5A
Authority: CN
Inventors: 贾乐梅; 陈花; 赵学强; 林欣
Original assignee: Huaxia Yingtai (beijing) Biotechnology Co Ltd; Sino-American iCELL (Shanghai) Biotechnology Co Ltd; Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University; Bristar Immunotech Ltd
Priority date: 2018-09-30
Filing date: 2018-09-30
Publication date: 2019-11-15
Anticipated expiration: 2038-09-30
Also published as: CN109306005A

Abstract

一种EB病毒特异性T细胞抗原受体及其应用。本发明提供了一种特异性结合人类疱疹病毒(HHV‑4)即EB病毒(Epstein‑Barr Virus，EBV)潜伏期膜蛋白LMP2肽(包含序列TYGPVFMCL和/或TYGPVFMSL)的T细胞抗原受体(TCR)及其在制备治疗与EBV相关疾病的药物中的应用或在制备杀伤小鼠肿瘤细胞、提高小鼠存活率的产品中的应用。本发明所述的TCR能够特异性地被病毒抗原肽提呈细胞激活，提高胞外细胞因子IFNγ、IL2的释放水平及乳酸脱氢酶释放量，且显著地杀伤靶细胞。

Description

一种EB病毒特异性T细胞抗原受体及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种针对EBV LMP2表位的高亲和力T细胞抗原特异性受体及其制备方法，以及其在制备治疗与EBV相关的疾病的药物中的应用或在制备杀伤小鼠肿瘤细胞、提高小鼠存活率的产品中的应用。

背景技术

T细胞抗原受体(T cell receptor，TCR)对免疫系统的细胞免疫功能是至关重要的，TCR是呈递在主要组织相容性复合体(MHC)上的特异性抗原肽的唯一受体，通过抗原特异性TCR与pMHC复合物结合引发T细胞与抗原呈递细胞直接的物理接触，相互作用，导致一系列后续细胞信号传递和其他生理反应，从而使得不同抗原特异性的T细胞对其靶细胞发挥免疫效应。

EB病毒(Epstein-Barr Virus，EBV)也称人类疱疹病毒4型，属于γ疱疹病毒，是最常见的引起人类疾病的病毒之一，主要感染B细胞和鼻咽上皮细胞。EBV感染分为增殖型感染和潜伏型感染。潜伏型表达的蛋白主要包括6个核蛋白EBNA1、2、3A、3B和3C，EBNA-LP以及3个潜伏期膜蛋白LMP1、LMP2A、LMP2B，其中LMP2B是LMP2A的截短异形体。根据不同疾病表达的潜伏蛋白谱的差异，将潜伏型分为I、II、III期。

专利CN108289950A公开了一种特异于人HLA呈递的EBV LMP2的T细胞受体样抗体药剂，其中所述的T细胞受体识别的抗原肽表位为CLGGLLTMV。专利CN1526072A公开了EBV肿瘤相关潜伏膜蛋白的胞外结构域的鉴定方法和与之反应的抗体试剂的选择方法，其中EBVLMP2胞外域的氨基酸序列为4-9中的任一个。及CN1269804A中公开的众多EBV的T细胞CTL表位。但是均非公开本发明所述的TCR特异性识别及结合的表位。

因此，本发明提供了一种T细胞抗原受体，能够特异性地被病毒抗原肽提呈细胞激活，提高胞外细胞因子IFNγ、IL2的释放水平及乳酸脱氢酶释放量，且显著地杀伤靶细胞。

发明内容

本发明提供了一种T细胞抗原受体(TCR)，其特异性结合EBV潜伏期膜蛋白LMP2，所述的EBV潜伏期膜蛋白LMP2包含SEQ ID NO：8和/或SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列。

优选的，所述的T细胞抗原受体特异性结合EBV潜伏期膜蛋白LMP2肽，所述的EBV潜伏期膜蛋白LMP2肽包含SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列。

本发明所述的SEQ ID NO：1具体序列为：TYGPVFMCL。

本发明所述的SEQ ID NO：21具体序列为：TYGPVFMSL。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的EBV潜伏期膜蛋白LMP2肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，或与SEQ ID NO：8所示序列具有至少80％同源性并具有抗原活性的序列。

MGSLEMVPMGAGPPSPGGDPDGYDGGNNSQYPSASGSSGNTPTPPNDEERESNEEPPPPYEDPYWGNGDRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEAGRGSMNPVCLPVIVAPYLFWLAAIAASCFTASVSTVVTATGLALSLLLLAAVASSYAAAQRKLLTPVTVLTAVVTFFAICLTWRIEDPPFNSLLFALLAAAGGLQGIYVLVMLVLLILAYRRRWRRLTVCGGIMFLACVLVLIVDAVLQLSPLLGAVTVVSMTLLLLAFVLWLSSPGGLGTLGAALLTLAAALALLASLILGTLNLTTMFLLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLASALIAGGSILQTNFKSLSSTEFIPNLFCMLLLIVAGILFILAILTEWGSGNRTYGPVFMCLGGLLTMVAGAVWLTVMSNTLLSAWILTAGFLIFLIGFALFGVIRCCRYCCYYCLTLESEERPPTPYRNTV*(SEQ ID NO：8)

其中，SEQ ID NO：8中下滑线标注的序列为被本发明所述的TCR识别的EBV潜伏期膜蛋白LMP2肽的氨基酸序列。

在本发明的另一个具体实施方式中，所述的EBV潜伏期膜蛋白LMP2肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示，或与SEQ ID NO：20所示序列具有至少80％同源性并具有抗原活性的序列。

MGSLEMVPMGAGPPSPGGDPDGYDGGNNSQYPSASGSSGNTPTPPNDEERESNEEPPPPYEDPYWGNGDRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEAGRGSMNPVCLPVIVAPYLFWLAAIAASCFTASVSTVVTATGLALSLLLLAAVASSYAAAQRKLLTPVTVLTAVVTFFAICLTWRIEDPPFNSLLFALLAAAGGLQGIYVLVMLVLLILAYRRRWRRLTVCGGIMFLACVLVLIVDAVLQLSPLLGAVTVVSMTLLLLAFVLWLSSPGGLGTLGAALLTLAAALALLASLILGTLNLTTMFLLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLASALIAGGSILQTNFKSLSSTEFIPNLFCMLLLIVAGILFILAILTEWGSGNRTYGPVFMSLGGLLTMVAGAVWLTVMSNTLLSAWILTAGFLIFLIGFALFGVIRCCRYCCYYCLTLESEERPPTPYRNTV*(SEQ ID NO：20)

其中，SEQ ID NO：20中下滑线标注的序列为被本发明所述的TCR识别的EBV潜伏期膜蛋白LMP2肽的氨基酸序列。

本发明所述的T细胞抗原受体通过主要组织相容性复合物分子(MHC)的呈递，与来自EBV潜伏期膜蛋白LMP2肽特异性结合。

本发明所述的TCR至少含有一个α链可变区和/或β链可变区。

优选的，所述TCR是αβ二聚体。

本发明所述的T细胞抗原受体包含α链和β链；

所述的α链的可变区氨基酸序列包含SEQ ID NO：11所示序列，或包含与SEQ IDNO：11所示序列具有至少80％同源性的序列。

所述的β链的可变区氨基酸序列包含SEQ ID NO：12所示序列，或包含与SEQ IDNO：12所示序列具有至少80％同源性的序列。

所述α链包含互补决定区CDR3α的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示序列，或与SEQID NO：2所示序列具有至少80％同源性并具有与EBV潜伏期膜蛋白LMP2肽表位：MHC复合物结合功能的序列，或与SEQ ID NO：2的差异包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的序列或至少一个N-/C-末端延伸并具有与EBV潜伏期膜蛋白LMP2肽表位：MHC复合物结合功能的序列；

所述β链包含互补决定区CDR3β的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示序列，或与SEQID NO：3所示序列具有至少80％同源性并具有与EBV潜伏期膜蛋白LMP2肽表位：MHC复合物结合功能的序列，或与SEQ ID NO：3的差异包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的序列或至少一个N-/C-末端延伸并具有与EBV潜伏期膜蛋白LMP2肽表位：MHC复合物结合功能的序列。

本发明所述的SEQ ID NO：2具体序列为：AGERGSTLGRLY。

本发明所述的SEQ ID NO：3具体序列为：ASSPLNRGQNEQF。

优选的，所述的取代为保守取代。

优选的，所述的α链包含三个互补决定区，其中，CDR1α的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示序列，或与SEQ ID NO：4所示序列具有至少80％同源性并具有与EBV潜伏期膜蛋白LMP2肽表位：MHC复合物结合功能的序列；CDR2α的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示序列，或与SEQ ID NO：5所示序列具有至少80％同源性并具有与EBV潜伏期膜蛋白LMP2肽表位：MHC复合物结合功能的序列；CDR3α的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示序列，或与SEQ ID NO：2所示序列具有至少80％同源性并具有与EBV潜伏期膜蛋白LMP2肽表位：MHC复合物结合功能的序列；或者，

所述的β链包含三个互补决定区，其中CDR1β的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示序列，或与SEQ ID NO：6所示序列具有至少80％同源性并具有与EBV潜伏期膜蛋白LMP2肽表位：MHC复合物结合功能的序列；CDR2β的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示序列，或与SEQ IDNO：7所示序列具有至少80％同源性并具有与EBV潜伏期膜蛋白LMP2肽表位：MHC复合物结合功能的序列；CDR3β的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示序列，或与SEQ ID NO：3所示序列具有至少80％同源性并具有与EBV潜伏期膜蛋白LMP2肽表位：MHC复合物结合功能的序列。

进一步优选的，所述的α链包含三个互补决定区，其中：

CDR1α：TTLSN(SEQ ID NO：4)

CDR2α：LVKSGEV(SEQ ID NO：5)

CDR3α：AGERGSTLGRLY(SEQ ID NO：2)

进一步优选的，所述的β链包含三个互补决定区，其中：

CDR1β：SEHNR(SEQ ID NO：6)

CDR2β：FQNEAQ(SEQ ID NO：7)

CDR3β：ASSPLNRGQNEQF(SEQ ID NO：3)

在本发明的一个具体实施方式中，所述的α链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示，或与SEQ ID NO：11所示序列具有至少80％同源性并具有与EBV潜伏期膜蛋白LMP2肽表位：MHC复合物结合功能的序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的β链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示，或与SEQ ID NO：12所示序列具有至少80％同源性并具有与EBV潜伏期膜蛋白LMP2肽表位：MHC复合物结合功能的序列。

本发明所述的T细胞抗原受体的氨基酸序列中，所述的β链与α链通过linker序列连接。优选的，所述linker序列为furin-SGSG-p2A序列(以下简写为fp2A)，所述的fp2A氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示。所述的fp2A核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示。

在本发明的具体实施方式中，所述T细胞抗原受体的氨基酸序列中，连接顺序依次为启动子、β链、fp2A、α链。优选的，为助于转染与表达检测，在α链后连接IRES和RFP序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的T细胞抗原受体包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列至少80％同源性并具有与EBV潜伏期膜蛋白LMP2肽表位：MHC复合物结合功能的序列。

MGTSLLCWMALCLLGADHADTGVSQDPRHKITKRGQNVTFRCDPISEHNRLYWYRQTLGQGPEFLTYFQNEAQLEKSRLLSDRFSAERPKGSFSTLEIQRTEQGDSAMYLCASSPLNRGQNEQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDFRRKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMLLITSMLVLWMQLSQVNGQQVMQIPQYQHVQEGEDFTTYCNSSTTLSNIQWYKQRPGGHPVFLIQLVKSGEVKKQKRLTFQFGEAKKNSSLHITATQTTDVGTYFCAGERGSTLGRLYFGRGTQLTVWPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*(SEQIDNO：9)

其中，SEQ ID NO：9所示氨基酸序列中，下划线标注的序列为fp2A的氨基酸序列，其上游的氨基酸序列为β链，其下游的氨基酸序列为α链。

在本发明的一个具体实施方式中，涉及一种编码上述的T细胞抗原受体的核苷酸序列，所述的T细胞抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，或与SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列至少80％同源性的序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的每个MHC与一个生物素分子偶联，所述的生物素分子与链霉亲和素分子结合形成四聚体，所述四聚体呈递所述的EBV潜伏期膜蛋白LMP2抗原肽，与本发明所述的T细胞抗原受体特异性结合。

本发明的第二方面，涉及一种编码上述的T细胞抗原受体的α链的核苷酸序列。

优选的，所述的α链的核苷酸序列包含SEQ ID NO：14所示序列，或包含与SEQ IDNO：14所示序列具有至少80％同源性的序列。

本发明的第三方面，涉及一种编码上述的T细胞抗原受体的β链的核苷酸序列。

优选的，所述的β链的核苷酸序列包含SEQ ID NO：15所示序列，或包含与SEQ IDNO：15所示序列具有至少80％同源性的序列。

本发明所述的核苷酸序列可以是经密码子优化的。优选的，所述的密码子优化包括将病毒等使用的大量稀有密码子变为对应的哺乳动物密码子和/或移除mRNA不稳定基序和/或隐藏的剪接位点。

本发明的第四方面，涉及一种包含上述的T细胞抗原受体的核苷酸序列、α链的核苷酸序列或β链核苷酸序列的载体。

本发明的第五方面，涉及一种包含上述的载体和/或上述的T细胞抗原受体的核苷酸序列、α链的核苷酸序列或β链核苷酸序列的细胞。

优选的，所述的核苷酸序列整合到细胞的染色体中。

优选的，所述的细胞选自造血干细胞或外周血淋巴细胞(PBL)源T细胞。

本发明的第六方面，涉及一种表达上述的T细胞抗原受体的分离的细胞。

本发明所述的MHC分子可以是I类MHC分子。该复合物可在几乎所有有核细胞的表面表达，或其可通过重组表达纯化后包被在珠或板上而被固定。

本发明所述的HLA为人的MHC的名称，包括I类HLA抗原(A、B或C)或II类HLA抗原(DP、DQ或DR)。

本发明所述的TCR可以是HLA-A*01、A*02、A*03、A*11或A*24限制性的。优选的，所述的TCR为HLA-A*2402。

本发明的第七方面，涉及一种重组T细胞的制备方法，包括如下步骤：

1)从阳性T细胞克隆得到编码本发明所述的T细胞抗原受体的α链和/或β链的核苷酸序列；

2)分离、培养原代T细胞；

3)将步骤1)所述的α链和/或β链的核苷酸序列递送至步骤2)所述的原代T细胞，获得所述包含本发明所述的T细胞抗原受体的重组T细胞。

优选的，表达T细胞抗原受体的细胞的制备方法，包括如下步骤：

1)分离上述的细胞，反转录获得cDNA；

2)克隆步骤1)所述的α链和/或β链的核苷酸序列；

3)将步骤2)所述的α链和β链的核苷酸序列通过同源重组，构建成表达质粒；

4)将步骤3)所述的α链和/或β链的表达质粒递送至细胞，获得所述表达T细胞抗原受体的细胞。

本发明的第八方面，涉及一种上述的T细胞抗原受体、T细胞抗原受体的核苷酸序列、α链的核苷酸序列或β链核苷酸序列、上述的载体或上述的细胞或分离的细胞在制备治疗与EBV相关的疾病的药物中的应用。

优选的，所述EBV相关的疾病选自传染性单核细胞增多症、连锁淋巴细胞增生综合征，病毒性嗜血细胞综合征，口腔毛状黏膜白斑病，慢性活动性EB病毒感染，病毒性脑膜炎、周围神经炎、病毒性肺炎病毒性心肌炎、鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、胃癌、肝细胞癌、淋巴上皮样肉瘤、唾液腺肿瘤、乳腺癌、胸腺瘤、原发性渗出性淋巴瘤或B/T/NK细胞淋巴瘤。

优选的，所述的药物包含本发明所述的TCR或多价TCR复合物、本发明所述的核苷酸序列、含有本发明所述的核苷酸序列的载体或本发明所述的细胞及分离的细胞，以及药学上可接受的载体。

本发明的第九方面，涉及一种上述的T细胞抗原受体、T细胞抗原受体的核苷酸序列、α链的核苷酸序列或β链核苷酸序列、上述的载体或上述的细胞或分离的细胞在制备诊断或治疗肿瘤的产品中的应用或在疫苗递送方面的应用。

本发明的第十方面，涉及一种诊断或治疗肿瘤的方法，所述的方法包括给予患者有效量的上述TCR或多价TCR复合物或上述细胞。

本发明所述的肿瘤的治疗或诊断，包括将本发明所的TCR定位在肿瘤或转移性肿瘤的附近，以提高毒素或免疫刺激剂的效力。

本发明所述的疫苗递送，包括将疫苗抗原定位在抗原呈递细胞附近，以提高该抗原的效力。

本发明所述的多价复合物为将本发明所述的TCR偶联于生物素或链霉生物素上。

本发明所述的T细胞抗原受体能够特异性地被EBV LMP2抗原肽提呈细胞激活，提高胞外细胞因子IFNγ、IL2的释放水平及乳酸脱氢酶释放量，且显著地杀伤靶细胞；在模型小鼠体内的功能检测显示，本发明制备T细胞抗原受体可以明显杀伤肿瘤细胞、提高小鼠存活率。

本发明所述的“T细胞受体”为能够识别当由MHC分子递呈时的肽的分子，所述的MHC分子优选的是I类MHC分子。

本发明所述的“载体”包括表达载体，即能够在体内或在体外/离体表达的构建体；优选的，所述的载体在体内细胞中持续高水平表达。

本发明所述的“和/或”包括择一列出的项目以及任何数量的项目组合。

本发明所述的“包括”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。

本发明所述的“保守取代”包括但不限于：丙氨酸与丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸、缬氨酸、脯氨酸或谷氨酸之间的替换；和/或，天冬氨酸与甘氨酸、天冬酰胺或谷氨酸之间的替换；和/或，丝氨酸与甘氨酸、天冬酰胺或苏氨酸之间的替换；和/或，亮氨酸与异亮氨酸或缬氨酸之间的替换；和/或，缬氨酸与亮氨酸、异亮氨酸之间的替换；和/或，酪氨酸与苯丙氨酸之间的替换；和/或，赖氨酸与精氨酸之间的替换。上述所述的取代基本不会改变本发明所述的氨基酸序列的活性。

本发明所述的“预防”表示避免、延缓、阻抗或阻碍疾病的感染；优选的，预防和/或降低EBV感染和/或再活化的可能性。

本发明所述“治疗”表示在疾病已开始发展后减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。

本发明所述“同源性”，是指在使用蛋白序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同源性。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1：TCRβ链和α链在pHAGE载体中连接示意图，其中连接顺序依次为启动子、β链、fp2A、α链、IRES和RFP序列；

图2：通过overlap PCR扩增获得E9片段；

图3：EBV抗原特异性TCR-E9在Jurkat clone 5(TCRα链和β链敲除的Jurkat细胞系)中的表达和在细胞膜外展示的情况；

图4：实施例2制备的EBV抗原特异性TCR-E9的Jurkat clone 5与EBV LMP2HLA-A*2402四聚体探针结合的亲和力检测；

图5：实施例2制备的EBV抗原特异性TCR-E9的Jurkat clone5能识别EBVLMP2TYGPVFMCL及其变异体TYGPVFMSL；

图6：TCR-T胞外细胞因子IL2的释放水平的检测结果图，其中，E9代表实施例2制备的TCR-E9，1G4代表能够识别抗原EY-ESO-1的对照TCR，Targets only代表只有靶细胞的空白对照；

图7：TCR-T胞外细胞因子IFNγ的释放水平的检测结果图，其中，E9代表实施例2制备的TCR-E9，1G4代表能够识别抗原EY-ESO-1的对照TCR，Targets only代表只有靶细胞的空白对照；

图8：乳酸脱氢酶法测定TCR-T细胞对靶细胞的杀伤，其中，E9代表实施例2制备的TCR-E9，1G4代表能够识别抗原EY-ESO-1的对照TCR，Targets only代表只有靶细胞的空白对照；

图9：靶细胞死活的检测，其中，E9代表实施例2制备的TCR-E9，1G4代表能够识别抗原EY-ESO-1的对照TCR，Targets only代表只有靶细胞的空白对照；

图10：动物模型构建的实验方案；

图11：无T细胞注射组(PBS)、对照TCR-T细胞注射组(TCR-1G4)、及EBV TCR-T注射组(TCR-E9)的NSG小鼠体内肿瘤生长情况；

图12：TCR-T细胞在对照TCR-T细胞注射组(TCR-1G4)、及EBV TCR-T注射组(TCR-E9)的NSG小鼠体内的扩增情况；

图13：无T细胞注射组(PBS)、对照TCR-T细胞注射组(TCR-1G4)、及EBV TCR-T注射组(TCR-E9)的NSG小鼠存活率统计结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1 pHAGE-TCR-RFP载体的构建

一、获取EBV HLA-A*2402-TYGPVFMCL表位特异的TCR的β和α基因片段

1)从MBL公司购买获得商业化HLA-A*2402TYGPVFMCL(SEQ ID NO：1)的四聚体，根据产品说明书与外周血染色，将四聚体染色阳性的T细胞进行流式单细胞分选，反转录获得cDNA(IV Reverse Transcriptase,Invitrogen)。根据cDNA末端快速扩增(RACE)原理，通过两轮PCR(KOD-Plus-Neo，TOYOBO)扩增出TCRβ基因的可变区(SEQ ID NO：15)片段。

反转录引物为：TCAGGCAGTATCTGGAGTCATTG(SEQ ID NO：16)

锚定引物为：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G(SEQ ID NO：17)

其中rG代表核糖核苷酸，+G代表O2’和C4’脱水自连成环的锁定核苷酸

PCR扩增引物为：

上游引物1：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT(SEQ ID NO：19)

上游引物2：GTGGTATCAACGCAGAGTACATGG(SEQ ID NO：22)

下游引物1：GCACCTCCTTCCCATTCACC(SEQ ID NO：23)

下游引物2：GCTTCTGATGGCTCAAACACAG(SEQ ID NO：24)

具体的，根据PCR聚合酶KOD-Plus-Neo产品说明书，一轮PCR体系为50μL，退火温度为60℃，反应30个循环。取第一轮PCR反应的产物1μL，作为二轮PCR的模板，二轮PCR体系为50μL，退火温度为60℃，反应30个循环。然后将第二轮PCR产物跑琼脂糖胶，将对应大小的条带进行切胶回收(天根胶回收试剂盒)，送测序，测序引物为下游引物2。

得到TCRβ基因序列如SEQ ID NO：15所示。

2)如上，对HLA-A*2402-TYGPVFMCL四聚体染色阳性T细胞的进行反转录获得cDNA(IV Reverse Transcriptase,Invitrogen)。根据产品说明书通过两轮PCR(KOD-Plus-Neo,TOYOBO)扩增出TCRα基因(SEQ ID NO：14)片段，

反转录引物为：CGACCAGCTTGACATCACAG(SEQ ID NO：25)

锚定引物为：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G(SEQ ID NO：17)

PCR扩增引物为：

上游引物1：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT(SEQ ID NO：19)

上游引物2：GTGGTATCAACGCAGAGTACATGG(SEQ ID NO：22)

下游引物3：GTTGCTCTTGAAGTCCATAGACCTC(SEQ ID NO：29)

下游引物4：AATCGGTGAATAGGCAGACAGAC(SEQ ID NO：30)

具体的，根据PCR聚合酶KOD-Plus-Neo产品说明书，一轮PCR体系为50μL，退火温度为60℃，反应30个循环。取第一轮PCR反应的产物1μL，作为二轮PCR的模板，二轮PCR体系为50μL，退火温度为60℃，反应30个循环。然后将第二轮PCR产物跑琼脂糖胶，将对应大小的条带进行切胶回收(天根胶回收试剂盒)，送测序，测序引物为下游引物4。

得到TCRα基因序列如SEQ ID NO：14所示。

二、pHAGE-TCR-E9载体的构建

将TCRβ，fp2A，TCRα经长引物(包含fp2A序列)overlap-PCR扩增(KOD-Plus-Neo,TOYOBO)得到TCRβ-fp2A-TCRα片段，命名为E9(见图1)。

扩增的引物为：

上游引物5：atttcaggtgtcgtgaagcggccgcgccaccATGGGCACCAGCCTCCT(SEQ ID NO：31)下游引物5：

TCTCCAGCCTGCTTCAGCAGGCTGAAGTTAGTAGCTCCGCTTCCGCTccgtttccgccgGAAATCCTTTCTCTTGACCATG(SEQ ID NO：26)

上游引物6:

TCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTATGCTACTCATCACATCAATGTTG(SEQ ID NO：27)

下游引物6：agggatcctctagactcgagctagcTCAGCTGGACCACAGCCGCA(SEQ ID NO：28)

具体的，先用引物5和引物6分别将TCRβ和TCRα扩增出来，PCR体系为50μL，退火温度为60℃，反应30个循环。将PCR产物跑胶回收(天根胶回收试剂盒)，分别取回收产物1μL作为模板，用上游引物5和下游引物6进行overlap PCR，PCR体系为50μL，退火温度为60℃，反应30个循环。跑琼脂糖胶得到约1800bp的条带(如图2)，进行切胶回收。

将慢病毒载体pHAGE-IRES-RFP用NotI和NheI进行双酶切。酶切体系为40μL，其中含NotI和NheI分别1.5μL，质粒2-3μg，37℃酶切6小时，然后再体系里加入1μL碱性磷酸酶(NEB)，处理一小时以减少质粒自连，将酶切后的质粒跑胶回收，用nanodrop测浓度，作为骨架用于构建质粒。

根据Clone Express II One Step Cloning kit产品说明书，将E9通过overlap与酶切后线性化的pHAGE-IRES-RFP载体进行连接，转化Stbl3菌株，在含氨苄的LB平板上培养12-16小时，挑取单克隆隆菌进行测序，测序引物选用pHAGE载体上的引物seq-pHAGE-F和seq-pHAGE-R，以及下游引物4。

实施例2 EBV TCR-E9的膜表达及亲和力的检测

1.慢病毒包装

将无菌抽提的pHAGE-TCR-E9质粒与包装质粒psPAX2与pMD2.G按照一定的比例用转染试剂PEI转染293T细胞，收取48小时和72小时的细胞培养上清，将上清与PEG8000混合，4℃静置过夜后3500rpm离心30min，弃上清，用小体积的培养基重悬，得到浓缩后的慢病毒。

2.慢病毒感染人类T细胞系

将携带TCR-E9的慢病毒感染对数生长期的Jurkat clone 5细胞。将浓缩后的慢病毒和助感剂Polybrene一起加入到T细胞培养基中，在32℃下1500rpm离心感染2小时。感染3天后，可观察荧光报告基因，并可以检测目标蛋白表达。

3.TCR-E9上膜情况及亲和力检测

取感染72小时后的T细胞，用Brilliant Violet 421^TM anti-human TCRα/β(Biolegend)以及EBV LMP2HLA-A*2402四聚体-APC(Tetramer-APC)的染色，之后进行流式检测。实验结果见图3、4，由图3显示，E9可以被TCRα/β的抗体染色，这一结果表明TCR-E9其α链和β链可以正确表达并且展示在细胞膜外。图4显示TCRα/β的抗体阳性的细胞都可以被Tetramer-APC染色，表明实施例1制备的TCR-E9其α链和β链能正确形成配对，并且与EBVLMP2HLA-A*2402四聚体探针具有一定的亲和力。

实施例3 EBV TCR-E9识别突变表位

TCR-E9能特异识别EBV LMP2表位序列TYGPVFMCL，据文献报道，该表位的一个变异体TYGPVFMSL病毒株在我国东南沿海人群中占主要分布。故从MBL公司购买获得商业化HLA-A*2402TYGPVFMSL的四聚体，检测TCR-E9对其识别作用。如图5，结果显示TCR-E9既能识别TYGPVFMCL，也能识别TYGPVFMSL。

实施例4 EBV TCR-E9T细胞的构建及体外功能检测

1.人类原代T细胞的分离、培养和慢病毒感染

为了验证所筛选到的TCR-E9对EBV LMP2抗原的识别和杀伤功能，根据EasySepHuman T cell isolation kit(stem cell technologies)产品说明书，从人外周血中通过阴选的方法获得T细胞，然后将T细胞培养在用抗CD3/CD28抗体包被的培养皿中，激活48小时后，用慢病毒体系将装载有TCR-E9的病毒颗粒感染T细胞，感染方法为32℃下1500rpm离心感染2小时。构建出了稳定表达TCR-E9基因的T细胞，并在含20％血清和100U/mL IL-2的RPMI 1640培养基中培养至足够数量，用流式细胞仪将荧光标签RFP阳性的细胞分选出来。

2.靶细胞的构建

用慢病毒体系将分别装载有LMP2-RFP、HLA-A*2402-BSD以及Luciferase-GFP的病毒颗粒感染对数生长期的Raji细胞。通过药物筛选及流式分选，得到同时稳定表达LMP2、HLA-A*2402分子以及Luciferas-GFP的Raji细胞，命名为Raji_HLA matched。

3.E9在人原代T细胞中的体外功能验证

将Raji_HLA matched以及未转LMP2的Raji细胞(命名为Raji_Ctrl)与TCR-E9T细胞1G4T细胞按照1：3的数量比例进行共培养后，共培养24小时后，分别收集细胞和上清，初步检测了TCR-E9T细胞的激活和靶细胞的死亡情况。从胞外细胞因子IL2(见图6)和IFNγ(见图7)的释放水平来看，TCR-E9T同靶细胞共孵育后，与对照组1G4T相比，可以显著地引起T细胞的激活。且从细胞上清中乳酸脱氢酶量及流式分析效靶比可反映出靶细胞死亡情况(见图8，图9)。实验结果证明，本发明实施例构建的TCR-E9T细胞可以特异性地被EBV LMP2抗原肽提呈细胞激活，且能够显著地杀伤靶细胞。

实施例5动物模型构建及EBV TCR-T体内功能检测

Raji_HLA matched肿瘤细胞系在NSG小鼠中构建动物模型(见图10)，进一步评价EBV TCR-E9T细胞体内杀伤肿瘤细胞功能。在第0天时，给每只NSG小鼠尾静脉注射3e5个Raji_HLA matched细胞；3天后将小鼠分为三个小组，分别为A：无T细胞注射组(注射等体积PBS)；B：对照TCR-T细胞注射组(TCR-1G4T细胞)；C：EBV TCR-T注射组(TCR-E9T细胞)；B/C组小鼠尾静脉注射5e6T细胞，A组注射等体积200μL PBS。在接下来的几周监测不同组别小鼠体内肿瘤细胞生长情况，T细胞体内增殖情况以及小鼠存活情况。如图11、图12、图13所示，与对照组比较，本发明实施例构建的EBV特异性TCR-E9T细胞能够显著地杀伤小鼠体内肿瘤细胞，提高小鼠的存活率。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

序列表

<110> 清华大学、华夏英泰（北京）生物技术有限公司、上海赛傲生物技术有限公司

<120> 一种EB病毒特异性T细胞抗原受体及其应用

<130> 1

<160> 31

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> EB病毒潜伏期膜蛋白LMP2（Epstein-Barr Virus）

<400> 1

Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met Cys Leu

1 5

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ala Gly Glu Arg Gly Ser Thr Leu Gly Arg Leu Tyr

1 5 10

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ala Ser Ser Pro Leu Asn Arg Gly Gln Asn Glu Gln Phe

1 5 10

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Thr Thr Leu Ser Asn

1 5

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Leu Val Lys Ser Gly Glu Val

1 5

<210> 6

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Ser Glu His Asn Arg

1 5

<210> 7

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Phe Gln Asn Glu Ala Gln

1 5

<210> 8

<211> 497

<212> PRT

<213> EB病毒潜伏期膜蛋白LMP2（Epstein-Barr Virus）

<400> 8

Met Gly Ser Leu Glu Met Val Pro Met Gly Ala Gly Pro Pro Ser Pro

1 5 10 15

Gly Gly Asp Pro Asp Gly Tyr Asp Gly Gly Asn Asn Ser Gln Tyr Pro

20 25 30

Ser Ala Ser Gly Ser Ser Gly Asn Thr Pro Thr Pro Pro Asn Asp Glu

35 40 45

Glu Arg Glu Ser Asn Glu Glu Pro Pro Pro Pro Tyr Glu Asp Pro Tyr

50 55 60

Trp Gly Asn Gly Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln

65 70 75 80

Asp Gln Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu

85 90 95

Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Pro Arg Asp Asp Ser Ser Gln His Ile Tyr

100 105 110

Glu Glu Ala Gly Arg Gly Ser Met Asn Pro Val Cys Leu Pro Val Ile

115 120 125

Val Ala Pro Tyr Leu Phe Trp Leu Ala Ala Ile Ala Ala Ser Cys Phe

130 135 140

Thr Ala Ser Val Ser Thr Val Val Thr Ala Thr Gly Leu Ala Leu Ser

145 150 155 160

Leu Leu Leu Leu Ala Ala Val Ala Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Gln Arg

165 170 175

Lys Leu Leu Thr Pro Val Thr Val Leu Thr Ala Val Val Thr Phe Phe

180 185 190

Ala Ile Cys Leu Thr Trp Arg Ile Glu Asp Pro Pro Phe Asn Ser Leu

195 200 205

Leu Phe Ala Leu Leu Ala Ala Ala Gly Gly Leu Gln Gly Ile Tyr Val

210 215 220

Leu Val Met Leu Val Leu Leu Ile Leu Ala Tyr Arg Arg Arg Trp Arg

225 230 235 240

Arg Leu Thr Val Cys Gly Gly Ile Met Phe Leu Ala Cys Val Leu Val

245 250 255

Leu Ile Val Asp Ala Val Leu Gln Leu Ser Pro Leu Leu Gly Ala Val

260 265 270

Thr Val Val Ser Met Thr Leu Leu Leu Leu Ala Phe Val Leu Trp Leu

275 280 285

Ser Ser Pro Gly Gly Leu Gly Thr Leu Gly Ala Ala Leu Leu Thr Leu

290 295 300

Ala Ala Ala Leu Ala Leu Leu Ala Ser Leu Ile Leu Gly Thr Leu Asn

305 310 315 320

Leu Thr Thr Met Phe Leu Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu

325 330 335

Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu

340 345 350

Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ala

355 360 365

Leu Ile Ala Gly Gly Ser Ile Leu Gln Thr Asn Phe Lys Ser Leu Ser

370 375 380

Ser Thr Glu Phe Ile Pro Asn Leu Phe Cys Met Leu Leu Leu Ile Val

385 390 395 400

Ala Gly Ile Leu Phe Ile Leu Ala Ile Leu Thr Glu Trp Gly Ser Gly

405 410 415

Asn Arg Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met Cys Leu Gly Gly Leu Leu Thr

420 425 430

Met Val Ala Gly Ala Val Trp Leu Thr Val Met Ser Asn Thr Leu Leu

435 440 445

Ser Ala Trp Ile Leu Thr Ala Gly Phe Leu Ile Phe Leu Ile Gly Phe

450 455 460

Ala Leu Phe Gly Val Ile Arg Cys Cys Arg Tyr Cys Cys Tyr Tyr Cys

465 470 475 480

Leu Thr Leu Glu Ser Glu Glu Arg Pro Pro Thr Pro Tyr Arg Asn Thr

485 490 495

Val

<210> 9

<211> 609

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala

1 5 10 15

Asp His Ala Asp Thr Gly Val Ser Gln Asp Pro Arg His Lys Ile Thr

20 25 30

Lys Arg Gly Gln Asn Val Thr Phe Arg Cys Asp Pro Ile Ser Glu His

35 40 45

Asn Arg Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Thr Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe

50 55 60

Leu Thr Tyr Phe Gln Asn Glu Ala Gln Leu Glu Lys Ser Arg Leu Leu

65 70 75 80

Ser Asp Arg Phe Ser Ala Glu Arg Pro Lys Gly Ser Phe Ser Thr Leu

85 90 95

Glu Ile Gln Arg Thr Glu Gln Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala

100 105 110

Ser Ser Pro Leu Asn Arg Gly Gln Asn Glu Gln Phe Phe Gly Pro Gly

115 120 125

Thr Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu

130 135 140

Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys

145 150 155 160

Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu

165 170 175

Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr

180 185 190

Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr

195 200 205

Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro

210 215 220

Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn

225 230 235 240

Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser

245 250 255

Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr

260 265 270

Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly

275 280 285

Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala

290 295 300

Met Val Lys Arg Lys Asp Phe Arg Arg Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ala

305 310 315 320

Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro

325 330 335

Gly Pro Met Leu Leu Ile Thr Ser Met Leu Val Leu Trp Met Gln Leu

340 345 350

Ser Gln Val Asn Gly Gln Gln Val Met Gln Ile Pro Gln Tyr Gln His

355 360 365

Val Gln Glu Gly Glu Asp Phe Thr Thr Tyr Cys Asn Ser Ser Thr Thr

370 375 380

Leu Ser Asn Ile Gln Trp Tyr Lys Gln Arg Pro Gly Gly His Pro Val

385 390 395 400

Phe Leu Ile Gln Leu Val Lys Ser Gly Glu Val Lys Lys Gln Lys Arg

405 410 415

Leu Thr Phe Gln Phe Gly Glu Ala Lys Lys Asn Ser Ser Leu His Ile

420 425 430

Thr Ala Thr Gln Thr Thr Asp Val Gly Thr Tyr Phe Cys Ala Gly Glu

435 440 445

Arg Gly Ser Thr Leu Gly Arg Leu Tyr Phe Gly Arg Gly Thr Gln Leu

450 455 460

Thr Val Trp Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu

465 470 475 480

Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe

485 490 495

Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile

500 505 510

Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn

515 520 525

Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala

530 535 540

Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu

545 550 555 560

Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr

565 570 575

Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu

580 585 590

Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser

595 600 605

Ser

<210> 10

<211> 1830

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atgggcacca gcctcctatg ctggatggcc ctgtgtctcc tgggggcaga tcacgcagat 60

actggagtct cccaggaccc cagacacaag atcacaaaga ggggacagaa tgtaactttc 120

aggtgtgatc caatttctga acacaaccgc ctttattggt accgacagac cctggggcag 180

ggcccagagt ttctgactta cttccagaat gaagctcaac tagaaaaatc aaggctgctc 240

agtgatcggt tctctgcaga gaggcctaag ggatctttct ccaccttgga gatccagcgc 300

acagagcagg gggactcggc catgtatctc tgtgccagca gccctttaaa cagggggcag 360

aatgagcagt tcttcgggcc agggacacgg ctcaccgtgc tagaggacct gaaaaacgtg 420

ttcccacccg aggtcgctgt gtttgagcca tcagaagcag agatctccca cacccaaaag 480

gccacactgg tgtgcctggc cacaggcttc ttccccgacc acgtggagct gagctggtgg 540

gtgaatggga aggaggtgca cagtggggtc agcacagacc cgcagcccct caaggagcag 600

cccgccctca atgactccag atactgcctg agcagccgcc tgagggtctc ggccaccttc 660

tggcagaacc cccgcaacca cttccgctgt caagtccagt tctacgggct ctcggagaat 720

gacgagtgga cccaggatag ggccaaaccc gtcacccaga tcgtcagcgc cgaggcctgg 780

ggtagagcag actgtggctt tacctcggtg tcctaccagc aaggggtcct gtctgccacc 840

atcctctatg agatcctgct agggaaggcc accctgtatg ctgtgctggt cagcgccctt 900

gtgttgatgg ccatggtcaa gagaaaggat ttccggcgga aacggagcgg aagcggagct 960

actaacttca gcctgctgaa gcaggctgga gacgtggagg agaaccctgg acctatgcta 1020

ctcatcacat caatgttggt cttatggatg caattgtcac aggtgaatgg acaacaggta 1080

atgcaaattc ctcagtacca gcatgtacaa gaaggagagg acttcaccac gtactgcaat 1140

tcctcaacta ctttaagcaa tatacagtgg tataagcaaa ggcctggtgg acatcccgtt 1200

tttttgatac agttagtgaa gagtggagaa gtgaagaagc agaaaagact gacatttcag 1260

tttggagaag caaaaaagaa cagctccctg cacatcacag ccacccagac tacagatgta 1320

ggaacctact tctgtgcagg agagagaggc tcaaccctgg ggaggctata ctttggaaga 1380

ggaactcagt tgactgtctg gcctgatatc cagaaccctg accctgccgt gtaccagctg 1440

agagactcta aatccagtga caagtctgtc tgcctattca ccgattttga ttctcaaaca 1500

aatgtgtcac aaagtaagga ttctgatgtg tatatcacag acaaaactgt gctagacatg 1560

aggtctatgg acttcaagag caacagtgct gtggcctgga gcaacaaatc tgactttgca 1620

tgtgcaaacg ccttcaacaa cagcattatt ccagaagaca ccttcttccc cagcccagaa 1680

agttcctgtg atgtcaagct ggtcgagaaa agctttgaaa cagatacgaa cctaaacttt 1740

caaaacctgt cagtgattgg gttccgaatc ctcctcctga aagtggccgg gtttaatctg 1800

ctcatgacgc tgcggctgtg gtccagctga 1830

<210> 11

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Gly Gln Gln Val Met Gln Ile Pro Gln Tyr Gln His Val Gln Glu Gly

1 5 10 15

Glu Asp Phe Thr Thr Tyr Cys Asn Ser Ser Thr Thr Leu Ser Asn Ile

20 25 30

Gln Trp Tyr Lys Gln Arg Pro Gly Gly His Pro Val Phe Leu Ile Gln

35 40 45

Leu Val Lys Ser Gly Glu Val Lys Lys Gln Lys Arg Leu Thr Phe Gln

50 55 60

Phe Gly Glu Ala Lys Lys Asn Ser Ser Leu His Ile Thr Ala Thr Gln

65 70 75 80

Thr Thr Asp Val Gly Thr Tyr Phe Cys Ala Gly Glu Arg Gly Ser Thr

85 90 95

Leu Gly Arg Leu Tyr Phe Gly Arg Gly Thr Gln Leu Thr Val Trp Pro

100 105 110

<210> 12

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Asp Thr Gly Val Ser Gln Asp Pro Arg His Lys Ile Thr Lys Arg Gly

1 5 10 15

Gln Asn Val Thr Phe Arg Cys Asp Pro Ile Ser Glu His Asn Arg Leu

20 25 30

Tyr Trp Tyr Arg Gln Thr Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe Leu Thr Tyr

35 40 45

Phe Gln Asn Glu Ala Gln Leu Glu Lys Ser Arg Leu Leu Ser Asp Arg

50 55 60

Phe Ser Ala Glu Arg Pro Lys Gly Ser Phe Ser Thr Leu Glu Ile Gln

65 70 75 80

Arg Thr Glu Gln Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Pro

85 90 95

Leu Asn Arg Gly Gln Asn Glu Gln Phe Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu

100 105 110

Thr Val Leu

115

<210> 13

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Arg Arg Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys

1 5 10 15

Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro

20 25

<210> 14

<211> 816

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atgctactca tcacatcaat gttggtctta tggatgcaat tgtcacaggt gaatggacaa 60

caggtaatgc aaattcctca gtaccagcat gtacaagaag gagaggactt caccacgtac 120

tgcaattcct caactacttt aagcaatata cagtggtata agcaaaggcc tggtggacat 180

cccgtttttt tgatacagtt agtgaagagt ggagaagtga agaagcagaa aagactgaca 240

tttcagtttg gagaagcaaa aaagaacagc tccctgcaca tcacagccac ccagactaca 300

gatgtaggaa cctacttctg tgcaggagag agaggctcaa ccctggggag gctatacttt 360

ggaagaggaa ctcagttgac tgtctggcct gatatccaga accctgaccc tgccgtgtac 420

cagctgagag actctaaatc cagtgacaag tctgtctgcc tattcaccga ttttgattct 480

caaacaaatg tgtcacaaag taaggattct gatgtgtata tcacagacaa aactgtgcta 540

gacatgaggt ctatggactt caagagcaac agtgctgtgg cctggagcaa caaatctgac 600

tttgcatgtg caaacgcctt caacaacagc attattccag aagacacctt cttccccagc 660

ccagaaagtt cctgtgatgt caagctggtc gagaaaagct ttgaaacaga tacgaaccta 720

aactttcaaa acctgtcagt gattgggttc cgaatcctcc tcctgaaagt ggccgggttt 780

aatctgctca tgacgctgcg gctgtggtcc agctga 816

<210> 15

<211> 933

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atgggcacca gcctcctatg ctggatggcc ctgtgtctcc tgggggcaga tcacgcagat 60

actggagtct cccaggaccc cagacacaag atcacaaaga ggggacagaa tgtaactttc 120

aggtgtgatc caatttctga acacaaccgc ctttattggt accgacagac cctggggcag 180

ggcccagagt ttctgactta cttccagaat gaagctcaac tagaaaaatc aaggctgctc 240

agtgatcggt tctctgcaga gaggcctaag ggatctttct ccaccttgga gatccagcgc 300

acagagcagg gggactcggc catgtatctc tgtgccagca gccctttaaa cagggggcag 360

aatgagcagt tcttcgggcc agggacacgg ctcaccgtgc tagaggacct gaaaaacgtg 420

ttcccacccg aggtcgctgt gtttgagcca tcagaagcag agatctccca cacccaaaag 480

gccacactgg tgtgcctggc cacaggcttc ttccccgacc acgtggagct gagctggtgg 540

gtgaatggga aggaggtgca cagtggggtc agcacagacc cgcagcccct caaggagcag 600

cccgccctca atgactccag atactgcctg agcagccgcc tgagggtctc ggccaccttc 660

tggcagaacc cccgcaacca cttccgctgt caagtccagt tctacgggct ctcggagaat 720

gacgagtgga cccaggatag ggccaaaccc gtcacccaga tcgtcagcgc cgaggcctgg 780

ggtagagcag actgtggctt tacctcggtg tcctaccagc aaggggtcct gtctgccacc 840

atcctctatg agatcctgct agggaaggcc accctgtatg ctgtgctggt cagcgccctt 900

gtgttgatgg ccatggtcaa gagaaaggat ttc 933

<210> 16

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tcaggcagta tctggagtca ttg 23

<210> 17

<211> 32

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

aagcagtggt atcaacgcag agtacatrgr gg 32

<210> 18

<211> 81

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cggcggaaac ggagcggaag cggagctact aacttcagcc tgctgaagca ggctggagac 60

gtggaggaga accctggacc t 81

<210> 19

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

aagcagtggt atcaacgcag agt 23

<210> 20

<211> 497

<212> PRT

<213> EB病毒潜伏期膜蛋白LMP2（Epstein-Barr Virus）

<400> 20

Met Gly Ser Leu Glu Met Val Pro Met Gly Ala Gly Pro Pro Ser Pro

1 5 10 15

Gly Gly Asp Pro Asp Gly Tyr Asp Gly Gly Asn Asn Ser Gln Tyr Pro

20 25 30

Ser Ala Ser Gly Ser Ser Gly Asn Thr Pro Thr Pro Pro Asn Asp Glu

35 40 45

Glu Arg Glu Ser Asn Glu Glu Pro Pro Pro Pro Tyr Glu Asp Pro Tyr

50 55 60

Trp Gly Asn Gly Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln

65 70 75 80

Asp Gln Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu

85 90 95

Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Pro Arg Asp Asp Ser Ser Gln His Ile Tyr

100 105 110

Glu Glu Ala Gly Arg Gly Ser Met Asn Pro Val Cys Leu Pro Val Ile

115 120 125

Val Ala Pro Tyr Leu Phe Trp Leu Ala Ala Ile Ala Ala Ser Cys Phe

130 135 140

Thr Ala Ser Val Ser Thr Val Val Thr Ala Thr Gly Leu Ala Leu Ser

145 150 155 160

Leu Leu Leu Leu Ala Ala Val Ala Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Gln Arg

165 170 175

Lys Leu Leu Thr Pro Val Thr Val Leu Thr Ala Val Val Thr Phe Phe

180 185 190

Ala Ile Cys Leu Thr Trp Arg Ile Glu Asp Pro Pro Phe Asn Ser Leu

195 200 205

Leu Phe Ala Leu Leu Ala Ala Ala Gly Gly Leu Gln Gly Ile Tyr Val

210 215 220

Leu Val Met Leu Val Leu Leu Ile Leu Ala Tyr Arg Arg Arg Trp Arg

225 230 235 240

Arg Leu Thr Val Cys Gly Gly Ile Met Phe Leu Ala Cys Val Leu Val

245 250 255

Leu Ile Val Asp Ala Val Leu Gln Leu Ser Pro Leu Leu Gly Ala Val

260 265 270

Thr Val Val Ser Met Thr Leu Leu Leu Leu Ala Phe Val Leu Trp Leu

275 280 285

Ser Ser Pro Gly Gly Leu Gly Thr Leu Gly Ala Ala Leu Leu Thr Leu

290 295 300

Ala Ala Ala Leu Ala Leu Leu Ala Ser Leu Ile Leu Gly Thr Leu Asn

305 310 315 320

Leu Thr Thr Met Phe Leu Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu

325 330 335

Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu

340 345 350

Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ala

355 360 365

Leu Ile Ala Gly Gly Ser Ile Leu Gln Thr Asn Phe Lys Ser Leu Ser

370 375 380

Ser Thr Glu Phe Ile Pro Asn Leu Phe Cys Met Leu Leu Leu Ile Val

385 390 395 400

Ala Gly Ile Leu Phe Ile Leu Ala Ile Leu Thr Glu Trp Gly Ser Gly

405 410 415

Asn Arg Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met Ser Leu Gly Gly Leu Leu Thr

420 425 430

Met Val Ala Gly Ala Val Trp Leu Thr Val Met Ser Asn Thr Leu Leu

435 440 445

Ser Ala Trp Ile Leu Thr Ala Gly Phe Leu Ile Phe Leu Ile Gly Phe

450 455 460

Ala Leu Phe Gly Val Ile Arg Cys Cys Arg Tyr Cys Cys Tyr Tyr Cys

465 470 475 480

Leu Thr Leu Glu Ser Glu Glu Arg Pro Pro Thr Pro Tyr Arg Asn Thr

485 490 495

Val

<210> 21

<211> 9

<212> PRT

<213> EB病毒潜伏期膜蛋白LMP2（Epstein-Barr Virus）

<400> 21

Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met Ser Leu

1 5

<210> 22

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gtggtatcaa cgcagagtac atgg 24

<210> 23

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gcacctcctt cccattcacc 20

<210> 24

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gcttctgatg gctcaaacac ag 22

<210> 25

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

cgaccagctt gacatcacag 20

<210> 26

<211> 81

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

tctccagcct gcttcagcag gctgaagtta gtagctccgc ttccgctccg tttccgccgg 60

aaatcctttc tcttgaccat g 81

<210> 27

<211> 71

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

tcagcctgct gaagcaggct ggagacgtgg aggagaaccc tggacctatg ctactcatca 60

catcaatgtt g 71

<210> 28

<211> 45

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

agggatcctc tagactcgag ctagctcagc tggaccacag ccgca 45

<210> 29

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

gttgctcttg aagtccatag acctc 25

<210> 30

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

aatcggtgaa taggcagaca gac 23

<210> 31

<211> 48

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

atttcaggtg tcgtgaagcg gccgcgccac catgggcacc agcctcct 48

Claims

1.一种T细胞抗原受体，其特征在于，其包含α链和β链，所述的α链包含三个互补决定区，其中，CDR1α的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示序列；CDR2α的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示序列，CDR3α的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示序列；和，所述的β链包含三个互补决定区，其中，CDR1β的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示序列，CDR2β的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示序列，CDR3β的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示序列。

2.一种核酸，其特征在于，其编码权利要求1所述的T细胞抗原受体、所述T细胞抗原受体的α链或β链。

3.一种包含权利要求2所述的核酸的载体。

4.一种表达权利要求1所述的T细胞抗原受体、包含权利要求2所述的核酸和/或包含权利要求3所述的载体的细胞。

5.一种重组T细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)从阳性T细胞克隆得到编码权利要求1所述的T细胞抗原受体的α链和/或β链的核酸；

2)分离、培养原代T细胞；

3)将步骤1)所述的α链和/或β链的核酸递送至步骤2)所述的原代T细胞，获得包含权利要求1所述的T细胞抗原受体的重组T细胞。

6.一种权利要求1所述的T细胞抗原受体、权利要求2所述的核酸、权利要求3所述的载体或权利要求4所述的细胞在制备治疗与EBV相关疾病的药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述EBV相关的疾病选自传染性单核细胞增多症、连锁淋巴细胞增生综合症、病毒性嗜血细胞综合症、口腔毛状黏膜白斑病、病毒性脑膜炎、周围神经炎、病毒性肺炎病毒性心肌炎、鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、胃癌、肝细胞癌、淋巴上皮样肉瘤、唾液腺肿瘤、乳腺癌、胸腺瘤、原发性渗出性淋巴瘤或B/T/NK细胞淋巴瘤。

8.一种权利要求1所述的T细胞抗原受体、权利要求2所述的核酸、权利要求3所述的载体或权利要求4所述的细胞在制备诊断或治疗EBV相关的疾病的产品中的应用。