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CN109276717A - 用于癌症疗法的连带基因失活生物标志和靶标 - Google Patents

用于癌症疗法的连带基因失活生物标志和靶标 Download PDF

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CN109276717A
CN109276717A CN201810965939.XA CN201810965939A CN109276717A CN 109276717 A CN109276717 A CN 109276717A CN 201810965939 A CN201810965939 A CN 201810965939A CN 109276717 A CN109276717 A CN 109276717A
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艾略特·弗莱彻-沙那尼空
西蒙娜·科拉
埃莉莎·阿奎兰蒂
罗纳德·德潘霍
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Dana Farber Cancer Institute Inc
University of Texas System
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Dana Farber Cancer Institute Inc
University of Texas System
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Abstract

本发明提供了通过用基因的抑制剂治疗所述受试者来治疗确定患有包含管家基因的杂合失活(或功能上冗余的管家基因的纯合缺失)的癌症的受试者的方法。举例来说，患有具有ENO基因缺失的癌症的受试者可以用糖酵解抑制剂，如烯醇酶抑制剂来治疗。在一些方面，患有具有ARS基因缺失的癌症的受试者可以用ARS抑制剂来治疗。

Description

用于癌症疗法的连带基因失活生物标志和靶标
本申请是国际申请日为2012年12月14日，中国国家申请号为201280069681.6，发明名称为“用于癌症疗法的连带基因失活生物标志和靶标”的发明专利申请的分案申请。
本申请要求2011年12月14日提交的美国临时专利申请号61/570,366和2012年5月29日提交的美国临时专利申请号61/652,738的权益，这两个申请都以引用的方式整体并入本文中。
本发明是通过政府支持在国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的批准号P01CA95616下进行的。政府对本发明具有一定权利。
名称为“UTFCP1138WO_ST25.txt”并且为2KB(如在Microsoft 中测量)并在2012年12月14日创建的文档中所含的序列表通过电子呈交而被一同提交并且以引用的方式并入本文中。
发明背景
1.发明领域
本发明整体上涉及分子生物学和肿瘤学领域。更具体地说，其涉及鉴别并治疗癌症的方法，这些癌症具有功能上失活(例如，通过基因编码序列的全部或一部分的缺失或突变、基因座的表观遗传沉默以及其它机理)的必需基因的一个拷贝。
2.相关领域的描述
癌症的成功治疗近年来在领域中保持着难以捉摸而快速的进展。在有效治疗中的一个主要的复杂因素在于用于肿瘤表征(例如，通过病理检查)的常规诊断分析提供了关于什么类型的抗癌疗法可以成功地用于治疗任何给定的癌症的有限指导。事实上，癌细胞对各种抗癌疗法展现出大范围的抗性/敏感性，因此，难以预测特定癌症是否将对给定的疗法具有抗性或敏感性。为了解决这一问题，肿瘤细胞的基因分析最近已经被用来进一步表征患者中的特定癌细胞。然而，这些分析的结果典型地显示了癌症中过多的基因变化并且常常不会提供关于治疗干预的实用指南。举例来说，基因组的大区域的杂合缺失是癌症中的原型体细胞事件。在许多情况下，癌细胞所展现的基因不稳定性通过消除关键肿瘤抑制基因的功能而驱动肿瘤发生。然而，缺失常常是很大的并且可以涵盖在癌症发病机理中没有已知作用的邻近基因。迄今为止，还没有关于可以如何驾驭肿瘤细胞中的这些突变来改善癌症诊断或疗法的指导。
发明概述
本发明的实施方案是基于以下发现：一些癌症具有冗余的管家基因的纯合缺失，并且这可以通过靶向未缺失的冗余的同源物而在治疗上被利用。同样地，已经认识到，包含管家基因的杂合缺失的癌症也被促使对靶向管家基因的未缺失拷贝的治疗性治疗具敏感性。在又另一个实施方案中，预期包含两个(或更多个)管家基因的杂合缺失的癌细胞被促使对靶向包含杂合缺失的管家基因中的每一者的未缺失拷贝的治疗性治疗具敏感性，并且可以用这种治疗性治疗来治疗。
在一个方面，本发明的实施方案提供了治疗受试者的癌症的方法。这种癌症具有管家基因的纯合缺失并且管家基因具有功能上冗余的同源物。受试者是通过使细胞与冗余的同源物的抑制剂接触来治疗，这种抑制剂的量足以抑制冗余的同源物的活性。
在另一个方面，本发明的实施方案提供了削弱细胞的细胞增殖和或诱导细胞的细胞死亡的方法。这种细胞具有管家基因的纯合缺失并且管家基因具有功能上冗余的同源物。细胞增殖和/或细胞死亡是通过使细胞与冗余的同源物的抑制剂接触来诱导，这种抑制剂的量足以抑制冗余的同源物的活性。
任选地，使细胞进一步与化学治疗剂接触。在一些实施方案中，化学治疗剂干扰DNA动态平衡。
抑制剂可以是例如抑制冗余的同源物的表达或活性的核酸、特异性地结合冗余的同源物的抗体，或小分子。抑制剂包括例如膦酰基乙酰羟肟酸盐、脱氢表雄酮、Np2AD、Np4AD、Nap4AD、氟柠檬酸盐或胡绊酸盐或其衍生物。
在一些方面，管家基因是烯醇酶1(ENO1)并且冗余的同源物是烯醇酶2(ENO2)；管家基因是己糖-6-磷酸脱氢酶(H6PD)并且冗余的同源物是葡萄糖-6脱氢酶(G6PD)；管家基因是驱动蛋白家族成员1B(KIF1B)并且冗余的同源物是驱动蛋白家族成员1A(KIF1A)或驱动蛋白家族成员1C(KIF1A)；管家基因是烟酰胺核苷酸腺苷酰转移酶1(NMNAT1)并且冗余的同源物是烟酰胺核苷酸腺苷酰转移酶2(NMNAT2)或烟酰胺核苷酸腺苷酰转移酶3(NMNAT3)；管家基因是泛素化因子E4B(UBE4B)并且冗余的同源物是泛素化因子4A(UBE4A)；管家基因是顺乌头酸酶1(ACO1)并且冗余的同源物是顺乌头酸酶2(ACO2)或顺乌头酸酶3(ACO3)；管家基因是kelch样9(KLHL9)并且冗余的同源物是kelch样13(KLHL13)；管家基因是泛酸激酶1(PANK1)并且冗余的同源物是泛酸激酶3(PANK3)；或管家基因是激酶家族成员20B(KIF20B)并且冗余的同源物是激酶家族成员20A(KIF20A)。
本发明的实施方案还提供了评价在通过根据本发明的方法治疗的受试者中治疗方案的有效性的方法，该方法是通过测量来自受试者的样品中的管家基因的代谢路径的一个或多个代谢物的水平来实现。代谢物的积聚指示出治疗是有效的。举例来说，当管家基因是烯醇酶并且代谢物是甘油酸盐时。
除非另有规定，否则本文中所用的所有技术和科学术语具有与本发明所述领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。尽管在本发明的实践中可以使用类似于或等同于本文所描述者的方法和材料，但下文描述了适合的方法和材料。本文中所提及的所有出版物、专利申请、专利以及其它参考文献都以引用的方式明确地整体并入。在相矛盾的情况下，将以本说明书(包括定义)为准。另外，本文所描述的材料、方法和实施例仅仅是说明性的并不是旨在限制。
在另一个实施方案中，提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括将至少第一糖酵解抑制剂施用给该受试者，其中已确定癌症的细胞包含使烯醇酶1(ENO1)基因的一个拷贝失活的杂合突变。因此，在一些方面，提供了一种治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括(a)选择经确定包含具有使ENO1基因的一个拷贝失活的杂合突变的癌细胞的受试者；以及(b)将至少第一糖酵解抑制剂施用给该受试者。
在另一个实施方案中，提供了一种选择患有癌症的受试者用于糖酵解抑制剂疗法(即，使用第一糖酵解抑制剂的疗法)的方法，该方法包括确定受试者的癌细胞是否包含使ENO1基因的一个拷贝失活的杂合突变，其中如果癌细胞包含杂合突变，那么受试者被选择用于糖酵解抑制剂疗法。在另一个方面，提供了一种选择患有癌症的受试者用于糖酵解抑制剂疗法的方法，该方法包括(a)确定受试者的癌细胞是否包含使ENO1基因的一个拷贝失活的杂合突变；以及(b)如果受试者的癌细胞包含杂合突变，那么选择该受试者用于糖酵解抑制剂疗法。
在又另一个实施方案中，提供了一种预测在患有癌症的受试者中对糖酵解抑制剂疗法的反应的方法，该方法包括确定受试者的癌细胞是否包含使ENO1基因的一个拷贝失活的杂合突变，其中如果癌细胞包含杂合突变，那么这个受试者被预测到对糖酵解抑制剂疗法具有良好的反应。在另一个方面，提供了一种预测在患有癌症的受试者中对糖酵解抑制剂疗法的反应的方法，该方法包括(a)确定受试者的癌细胞是否包含使ENO1基因的一个拷贝失活的杂合突变；以及(b)如果来自受试者的癌细胞包含杂合突变，那么将该受试者鉴别为预测到对糖酵解抑制剂疗法具有良好的反应；或如果来自受试者的癌细胞不包含杂合突变，那么将该受试者鉴别为未预测到对糖酵解抑制剂疗法具有良好的反应。
在又另一个实施方案中，提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括将至少t-RNA合成酶(ARS)抑制剂施用给该受试者，其中已确定癌症的细胞包含使ARS基因的一个拷贝失活的杂合突变。因此，在一些方面，提供了一种治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括(a)选择经确定包含具有使ARS基因的一个拷贝失活的杂合突变的癌细胞的受试者；以及(b)将至少第一ARS抑制剂施用给该受试者。
在另一个实施方案中，提供了一种选择患有癌症的受试者用于ARS抑制剂疗法(即，使用第一ARS抑制剂的疗法)的方法，该方法包括确定受试者的癌细胞是否包含使ARS基因的一个拷贝失活的杂合突变，其中如果癌细胞包含杂合突变，那么该受试者被选择用于ARS抑制剂疗法。在另一个方面，提供了一种选择患有癌症的受试者用于ARS抑制剂疗法的方法，该方法包含(a)确定受试者的癌细胞是否包含使ARS基因(或两个或更多个ARS基因)的一个拷贝失活的杂合突变；以及(b)如果受试者的癌细胞包含杂合突变，那么选择该受试者用于ARS抑制剂疗法。
在又另一个实施方案中，提供了一种预测在患有癌症的受试者中对ARS抑制剂疗法的反应的方法，该方法包括确定受试者的癌细胞是否包含使ARS基因的一个拷贝失活的杂合突变，其中如果癌细胞包含杂合突变，那么该受试者被预测到对ARS抑制剂疗法具有良好的反应。在另一个方面，提供了一种预测在患有癌症的受试者中对ARS抑制剂疗法的反应的方法，该方法包括(a)确定受试者的癌细胞是否包含使ARS基因的一个拷贝失活的杂合突变；以及(b)如果来自受试者的癌细胞包含杂合突变，那么将该受试者鉴别为预测到对ARS抑制剂疗法具有良好的反应；或如果来自受试者的癌细胞不包含杂合突变，那么将该受试者鉴别为未预测到对ARS抑制剂疗法具有良好的反应。
在另一个实施方案中，提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括将至少第一磷酸葡萄糖酸脱氢酶抑制剂施用给该受试者，其中已确定癌症的细胞包含使磷酸葡萄糖酸脱氢酶(PGD)基因的一个拷贝失活的杂合突变。因此，在一些方面，提供了一种治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括(a)选择经确定包含具有使PGD基因的一个拷贝失活的杂合突变的癌细胞的受试者；以及(b)将至少第一磷酸葡萄糖酸脱氢酶抑制剂(例如，6-氨基烟酰胺)施用给该受试者。
在另一个实施方案中，提供了一种选择患有癌症的受试者用于磷酸葡萄糖酸脱氢酶抑制剂疗法(即，使用第一磷酸葡萄糖酸脱氢酶抑制剂的疗法)的方法，该方法包括确定受试者的癌细胞是否包含使PGD基因的一个拷贝失活的杂合突变，其中如果癌细胞包含杂合突变，那么该受试者被选择用于磷酸葡萄糖酸脱氢酶抑制剂疗法。在另一个方面，提供了一种选择患有癌症的受试者用于磷酸葡萄糖酸脱氢酶抑制剂疗法的方法，该方法包括(a)确定受试者的癌细胞是否包含使PGD基因的一个拷贝失活的杂合突变；以及(b)如果受试者的癌细胞包含杂合突变，那么选择该受试者用于磷酸葡萄糖酸脱氢酶抑制剂疗法。
在又另一个实施方案中，提供了一种预测在患有癌症的受试者中对磷酸葡萄糖酸脱氢酶抑制剂疗法的反应的方法，该方法包括确定受试者的癌细胞是否包含使PGD基因的一个拷贝失活的杂合突变，其中如果癌细胞包含杂合突变，那么该受试者被预测到对磷酸葡萄糖酸脱氢酶抑制剂疗法具有良好的反应。在另一个方面，提供了一种预测在患有癌症的受试者中对磷酸葡萄糖酸脱氢酶抑制剂疗法的反应的方法，该方法包括(a)确定受试者的癌细胞是否包含使PGD基因的一个拷贝失活的杂合突变；以及(b)如果来自受试者的癌细胞包含杂合突变，那么将该受试者鉴别为预测到对磷酸葡萄糖酸脱氢酶抑制剂疗法具有良好的反应；或如果来自受试者的癌细胞不包含杂合突变，那么将该受试者鉴别为未预测到对磷酸葡萄糖酸脱氢酶抑制剂疗法具有良好的反应。
在另一个实施方案中，提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括将至少第一糖酵解抑制剂施用给该受试者，其中已确定癌症的细胞包含使GAPDH、ENO2和/或TPI基因(各自位于12p13处)的一个拷贝失活的杂合突变。因此，在一些方面，提供了一种治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括(a)选择经确定包含具有使GAPDH、ENO2和/或TPI基因的一个拷贝失活的杂合突变的癌细胞的受试者；以及(b)将至少第一糖酵解抑制剂施用给该受试者。
在另一个实施方案中，提供了一种选择患有癌症的受试者用于糖酵解抑制剂疗法(即，使用第一糖酵解抑制剂的疗法)的方法，该方法包括确定受试者的癌细胞是否包含使GAPDH、ENO2和/或TPI基因的一个拷贝失活的杂合突变，其中如果癌细胞包含杂合突变，那么该受试者被选择用于糖酵解抑制剂疗法。在另一个方面，提供了一种选择患有癌症的受试者用于糖酵解抑制剂疗法的方法，该方法包括(a)确定受试者的癌细胞是否包含使GAPDH、ENO2和/或TPI基因的一个拷贝失活的杂合突变；以及(b)如果受试者的癌细胞包含杂合突变，那么选择该受试者用于糖酵解抑制剂疗法。
在又另一个实施方案中，提供了一种预测在患有癌症的受试者中对糖酵解抑制剂疗法的反应的方法，该方法包括确定受试者的癌细胞是否包含使GAPDH、ENO2和/或TPI基因的一个拷贝失活的杂合突变，其中如果癌细胞包含杂合突变，那么该受试者被预测到对糖酵解抑制剂疗法具有良好的反应。在另一个方面，提供了一种预测在患有癌症的受试者中对糖酵解抑制剂疗法的反应的方法，该方法包括(a)确定受试者的癌细胞是否包含使GAPDH、ENO2和/或TPI基因的一个拷贝失活的杂合突变；以及(b)如果来自受试者的癌细胞包含杂合突变，那么将该受试者鉴别为预测到对糖酵解抑制剂疗法具有良好的反应；或如果来自受试者的癌细胞不包含杂合突变之一，那么将该受试者鉴别为未预测到对糖酵解抑制剂疗法具有良好的反应。
实施方案的某些方面涉及包含使必需基因的一个拷贝失活的杂合突变，例如ENO1、ARS基因、PGD基因、GAPDH基因、ENO2基因和/或TPI基因的一个拷贝。如本文中所用的“杂合突变”指的是基因的两个拷贝中仅一者的突变(在二倍体细胞中，或在三倍体细胞中的一者的损失，或更广泛地说，在多倍体细胞中除了一个拷贝以外的所有拷贝的损失)。
举例来说，杂合突变可以是使ENO1的一个拷贝功能上失活的缺失、取代、倒位、重排或插入。在一些方面，突变是缺失，例如在染色体1p36处杂合性的损失。因此，在某些方面，杂合缺失可以涵盖超过ENO1基因，例如使ENO1以及RERE、CA6和/或SLC2A7失活的缺失。举例来说，在一些方面，实施方案的方法可以涉及确定ENO1的5'和3'的缺失并且从而确定使ENO1间接地失活(缺失)。位于ENO1的位置5'的基因的实例包括(但不限于)NPHP4、KCNAB2、CHD5、RPL22、RNF207、C1orf211、GPR153、ICMT、HES3、ACOT7、TNFRSF25、PLEKHG5、DNAJC11、HES2、ESPN、MIR4252、NOL9、TAS1R1、ZBTB48、KLHL21、PHF13、THAP3、CAMTA1、VAMP3、PER3、UTS2、TNFRSF9、TRNA_Pseudo、PARK7、AX747125、ERRFI1、SLC45A1、RERE和BC113958。位于ENO1的位置3'的基因的非限制性实例包括CA6、SLC2A7、SLC2A5、GPR157、mir-34、MIR34A、H6PD、SPSB1、5S rRNA、SLC25A33、TMEM201、PIK3CD、C1orf200、BC038541、CLSTN1、CTNNBIP1、LZIC、NMNAT1、RBP7、UBE4B、KIF1B、APITD1-CORT、PEX14、CASZ1、Mir_584、PGD、APITD1、CORT、DFFA、C1orf127、TARDBP、MASP2、SRM、MTOR、ANGPTL7、EXOSC10、UBIAD1、PTCHD2、FBXO2、FBXO44、FBXO6、MAD2L2、C1orf187、AK125437、AGTRAP、C1orf167、MTHFR、CLCN6、NPPA-AS1、NPPA、NPPB、KIAA2013、PLOD1和MFN2。在某些方面，癌症包含染色体1的整个臂都损失的杂合突变。在某些情况下，ENO1的杂合缺失可以通过细胞发生染色体铺展或在ENO1基因上游和下游的随机DNA片段的拷贝数分析来确定。
在一些方面，杂合突变可以是使GAPDH、ENO2和/或TPI基因的一个拷贝功能上失活的缺失、取代、倒位、重排或插入。在一些方面，突变是缺失，例如在染色体12p13处杂合性的损失。因此，在某些方面，杂合缺失可以涵盖超过GAPDH、ENO2和/或TPI基因，例如使这些基因中的两者或全部三者失活的缺失。
在另一个实例中，杂合突变可以是使ARS基因的一个拷贝功能上失活的缺失、取代、倒位、重排或插入，例如EPARS(又称为EPRS)、VARS、IARS、CARS、SARS、YARS、AARS、KARS、LARS、HARS、RARS或TARS基因的一个拷贝。在一些方面，突变是缺失，例如在包含基因的染色体基因座处杂合性的损失。举例来说，癌细胞可以包含在5q13、1q41、6p21、9q24、11p15、1p13、1p35、16q13、16q24、5q31、5q32或5q35处杂合性的损失。因此，在某些方面，杂合缺失可以涵盖超过一个ARS基因，例如使SARS以及YARS、AARS和KARS、LARS和HARS或LARS HARS和RARS失活的缺失。
在又另一个实例中，杂合突变可以是使PGD基因的一个拷贝功能上失活的缺失、取代、倒位、重排或插入。在一些方面，突变是缺失，例如在包含基因，例如包含1p36.22的染色体基因座处杂合性的损失。在某些方面，缺失可以涵盖染色体1p的额外部分。举例来说，癌细胞可以包含了包含ENO1和PGD的缺失。因此，在一些方面，被鉴别为包含ENO1和PGD两者的一个拷贝的失活的癌症可以用至少第一糖酵解抑制剂联合PGD抑制剂(如6-氨基烟酰胺)来治疗。
实施方案的一些方面涉及将至少第一糖酵解抑制剂施用给受试者(例如，具有ENO1基因的一个拷贝的突变的受试者)。糖酵解抑制剂的实例包括(但不限于)丙酮酸激酶(例如，PKLR1或PKM2)、烯醇酶(例如，ENO1、ENO2或ENO3)、磷酸甘油酸变位酶(例如，PGM1、PGM2、PGM2L1、PGM3或PGM5)、磷酸甘油酸激酶(例如，PGK1或PGK2)、磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、磷酸丙糖异构酶(TPI)、双磷酸果糖醛缩酶(例如，Aldoa、Aldob或Aldoc)、磷酸果糖激酶(PFKL、PFKM或PFKP)、磷酸葡萄糖异构酶(GPI)和己糖激酶(例如，HK1、HK2或HK3)的抑制剂。在其它方面，抑制剂是线粒体电子传递链的抑制剂。在一些方面，糖酵解抑制剂是抑制性多核苷酸(例如，siRNA、shRNA或miRNA)，例如与编码丙酮酸激酶、烯醇酶(例如，ENO1)、磷酸甘油酸变位酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油醛脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、双磷酸果糖醛缩酶、磷酸果糖激酶、磷酸葡萄糖异构酶和己糖激酶的基因的全部或一部分互补的抑制性多核苷酸。在又其它方面，糖酵解抑制剂是小分子抑制剂或其前药。用于根据实施方案使用的糖酵解抑制剂的实例包括(但不限于)2-脱氧葡萄糖、6-氨基烟酰胺、二磷酸丁糖、康宁吉克酸(koningic acid)和MJE3。
在某些优选的方面，用作治疗剂的糖酵解抑制剂是基于在癌症中鉴别的杂合基因失活来选择。举例来说，如果癌细胞包含ENO1的杂合失活，那么糖酵解抑制剂疗法可以包含烯醇酶抑制剂。同样地，在癌症具有GAPDH、ENO2或TPI基因的杂合失活的情况下，糖酵解抑制剂疗法可以分别包含GAPDH、烯醇酶或TPI抑制剂。在某些方面，癌细胞包含糖酵解路径中的两个或更多个基因的杂合失活并且糖酵解抑制剂疗法包含经受杂合缺失的基因中的每一者的抑制剂。
在一些优选的方面，用于根据实施方案使用的糖酵解抑制剂是烯醇酶抑制剂，例如烯醇酶1抑制剂。举例来说，烯醇酶1抑制剂可以是抑制性多核苷酸，例如与ENO1基因的全部或一部分互补(例如，与编码烯醇酶1的mRNA的全部或一部分互补，参见例如NCBI登记号NM_001201483.1或NM_001428.3)的siRNA、shRNA或miRNA。在又其它方面，烯醇酶抑制剂是小分子烯醇酶抑制剂或其前药。小分子烯醇酶抑制剂的实例包括(但不限于)D-丙醇二酸半醛磷酸盐；3-氨基烯醇丙酮酸-2-磷酸盐；膦酰基乙酰羟肟酸盐(PhAH)；2-氟-2-膦酰基乙酰羟肟酸盐；(3-羟基-2-硝基丙基)膦酸盐；(硝基乙基)膦酸盐；d-(膦酰基乙基)硝酸盐；氟化物以及前述任一者的前药。
用于根据实施方案使用的ARS抑制剂的实例包括(但不限于)疏螺体素(Borrelidin)或其前药。在又其它方面，ARS抑制剂是常山碱(febrifugine)衍生物，例如卤夫酮(halofuginone)(参见例如Sundrud等人,2009和Keller等人,2012，以引用的方式并入本文中)。在一些方面，ARS抑制剂是抗微生物ARS抑制剂。在又其它方面，ARS抑制剂可以是抑制性多核苷酸，例如与ARS基因的全部或一部分互补的siRNA、shRNA或miRNA。在某些方面，ARS抑制剂是与蛋白质合成的另一抑制剂或氨基酸饥饿反应的活化剂联合施用。
用于根据实施方案使用的PGD抑制剂的实例包括例如6-氨基烟酰胺或其前药。在一些方面，PGD抑制剂可以是抑制性多核苷酸，例如与PGD基因的全部或一部分互补的siRNA、shRNA或miRNA(参见例如NCBI登记号NM_002631.2)。
用于根据实施方案施用的靶向抑制剂疗法(例如，糖酵解PGD或ARS抑制剂)典型地是在药学上可接受的载剂中配制的。这种疗法可以例如静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部地(topically)、瘤内、肌肉内、腹膜内、皮下、结膜下、囊内、经粘膜、心包内、脐带内、眼内、经口、局部地、区域性地(locally)、经由吸入(例如，气雾剂吸入)、通过注射或通过输注来递送。递送途径可以取决于例如待治疗的癌症的类型和所使用的抑制剂的类型。在其它方面，如糖酵解、PDG或ARS抑制剂等抑制剂可以被施用两次或更多次(例如，3、4、5、6、7、8、9或10次)。这种疗法的给药之间的时间可以变化并且可以包括(但不限于)在给药之间约1、2或3天、约1、2或3周或1个月或更长时间。
在再另一个实施方案中，提供一种治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括将靶向抑制剂疗法(例如，糖酵解、PDG或ARS抑制剂疗法)与至少第二疗法联合施用给受试者。举例来说，第二疗法可以在靶向抑制剂疗法之前、之后或期间被施用。靶向抑制剂疗法与第二疗法之间的时间可以变化并且可以包括(但不限于)在疗法之间约1、2或3天、约1、2或3周或1个月或更长时间。第二抗癌疗法可以是(但不限于)手术疗法、化学疗法、靶向癌细胞的疗法、放射疗法、冷冻疗法、过热治疗、光线疗法、射频消融疗法、激素疗法、免疫疗法、小分子疗法、受体激酶抑制剂疗法、抗血管生成疗法、细胞因子疗法或生物疗法，例如使用单克隆抗体、siRNA、反义寡核苷酸、核酶或基因疗法治疗。在又其它方面，第二疗法可以包含施用另一种不同的糖酵解抑制剂，例如相对于第一糖酵解抑制剂靶向不同糖酵解路径组分的抑制剂。在其它方面，第二疗法包含施用线粒体电子传递链抑制剂(例如，木利替尼(mubritinib)或寡霉素(oligomycin))或转录因子Hif1α的抑制剂。
实施方案的一些方面涉及受试者，例如患有癌症的受试者。如本文中所用的受试者可以是人或非人动物受试者(例如，狗、猫、小鼠、马等)。在某些方面，受试者患有癌症，例如口腔癌、口咽癌、鼻咽癌、呼吸道癌、泌尿生殖器癌、胃肠癌、中枢或周围神经系统组织癌、内分泌或神经内分泌癌或造血癌症、神经胶质瘤、肉瘤、癌瘤、淋巴瘤、黑素瘤、纤维瘤、脑膜瘤、脑癌、口咽癌、鼻咽癌、肾癌、胆管癌、嗜铬细胞瘤、胰岛细胞癌、李-法美尼肿瘤(Li-Fraumeni tumor)、甲状腺癌、甲状旁腺癌、垂体肿瘤、肾上腺肿瘤、骨原性肉瘤肿瘤、神经内分泌肿瘤、乳癌、肺癌、头颈癌、前列腺癌、食道癌、气管癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰脏癌、卵巢癌、子宫癌、子宫颈癌、睾丸癌、结肠癌、直肠癌或皮肤癌。在一些方面，癌症是神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、少突神经胶质瘤或大细胞神经内分泌肺肿瘤。在其它方面，癌症可以是黑素瘤，例如眼部/葡萄膜黑素瘤。在又其它方面，癌症是转移癌或对至少第一化学疗法具有抗性的癌症。
实施方案的一些方面涉及确定受试者的癌细胞是否包含使ENO1基因的一个拷贝失活的杂合突变。可以被用来确定受试者的癌细胞是否包含杂合突变的方法的实例包括(但不限于)DNA测序、聚合酶链反应(PCR)、核酸杂交(例如，Southern印迹或原位杂交)或DNA限制性分析以检测失活突变(例如，缺失、重排、取代、插入或倒位)。在其它方面，实施方案的方法可以包括测量烯醇酶表达或烯醇酶活性。举例来说，可以测量烯醇酶1mRNA或蛋白质的表达，并且将其与参考表达水平相比较以确定受试者的癌细胞是否包含使ENO1基因的一个拷贝失活的杂合突变。测量RNA表达的方法包括(但不限于)核酸杂交(例如，Northern印迹、原位杂交或阵列杂交)和定量逆转录PCR。测量烯醇酶1蛋白质表达的方法的非限制性实例包括进行ELISA、免疫分析法、放射免疫分析法(RIA)、免疫组织化学、免疫放射测定分析法、荧光免疫分析法、化学发光分析法、生物发光分析法、凝胶电泳、Western印迹分析、流式细胞测量术、正电子发射断层摄影(PET)或单光子发射计算机断层摄影(SPECT)成像。同样地，在一些方面，可以测量烯醇酶1活性(例如，通过测量底物催化)，并且将其与参考表达水平相比较以确定受试者的癌细胞是否包含使ENO1基因的一个拷贝失活的杂合突变。
在一些方面，生物样品(例如，包含癌细胞或代谢物或来自其的核酸的样品)从患者获得以供根据实施方案进行分析。举例来说，生物样品可以是(但不限于)血液、组织(例如，活体组织切片)、尿液、粪便或唾液样品。在一些方面，样品是肿瘤活体组织切片样品。
在一些方面，实施方案的方法进一步包括报告受试者的癌细胞是否包含使ENO1基因或ARS基因的一个拷贝失活的杂合突变。在又其它方面，方法可以包括报告受试者是否被鉴别为预测到或未预测到对糖酵解抑制剂疗法(例如，烯醇酶抑制剂疗法)或ARS抑制剂疗法具有良好的反应。举例来说，这种报告可以通过提供书面、电子或口头报告。在一些方面，报告被提供给受试者。在又其它方面，报告被提供给第三方，例如保险公司或卫生保健提供者(例如，医生或医院)。
实施方案的某些方面涉及预测受试者是否将对糖酵解抑制剂疗法或ARS抑制剂疗法具有良好的反应。举例来说，良好的反应可以是肿瘤尺寸或负荷减小、肿瘤生长受阻断、肿瘤相关疼痛减少、癌症相关病状减少、癌症相关症状减少、癌症无进展、无病间隔期增加、进展时间增加、诱导缓解、转移减少、患者存活期增加或肿瘤对抗癌疗法的敏感度增加。
在再另一个实施方案中，提供了一种试剂盒，其包含至少第一糖酵解抑制剂(例如，烯醇酶抑制剂)和用于针对使ENO1基因的一个拷贝失活的杂合突变来测试细胞的至少第一试剂。举例来说，糖酵解抑制剂可以是本领域中已知或本文中详述的那些抑制剂中的任一者。在一些方面，糖酵解抑制剂是烯醇酶抑制剂。用于在测试细胞中使用的试剂的实例包括(但不限于)内部或邻近结合到ENO1基因的核酸分子(例如，寡核苷酸引物)、抗烯醇酶1抗体和烯醇酶酶底物(例如，经标记的底物)。
同样地，在另一个实施方案中，提供了一种试剂盒，其包含ARS抑制剂和用于针对使ARS基因的一个拷贝失活的杂合突变来测试细胞的试剂。用于在测试细胞中使用的试剂的实例包括(但不限于)内部或邻近结合到ARS基因的核酸分子(例如，寡核苷酸引物)、抗ARS抗体和ARS酶底物(例如，经标记的底物)。
在再另一个实施方案中，提供了一种监测烯醇酶抑制剂疗法的有效性的方法，该方法包括测定来自经烯醇酶抑制剂治疗的受试者的样品中的甘油酸盐和/或1,3二羟基丙酮的水平，其中如果甘油酸盐或1,3二羟基丙酮的水平与参考水平相比没有升高，那么该受试者需要额外的烯醇酶抑制剂疗法，并且如果甘油酸盐或1,3二羟基丙酮的水平与参考水平相比升高，那么该受试者不需要额外的烯醇酶抑制剂疗法。在一些方面，提供了一种监测烯醇酶抑制剂疗法的有效性的方法，该方法包括(a)测定来自经烯醇酶抑制剂治疗的受试者的样品中的甘油酸盐或1,3二羟基丙酮的水平；以及(b)如果甘油酸盐或1,3二羟基丙酮的水平与参考水平相比没有升高，那么将该受试者鉴别为需要额外的烯醇酶抑制剂疗法；或如果甘油酸盐或1,3二羟基丙酮的水平与参考水平相比升高，那么将该受试者鉴别为不需要额外的烯醇酶抑制剂疗法。在一些方面，实施方案的方法进一步包括基于甘油酸盐或1,3二羟基丙酮的水平将额外的烯醇酶抑制剂疗法施用给受试者。在一些其它方面，额外的烯醇酶抑制剂疗法是额外施用烯醇酶抑制剂疗法或施用更高剂量的烯醇酶抑制剂。在再其它方面，实施方案的方法进一步包括报告受试者的甘油酸盐或1,3二羟基丙酮水平或报告受试者是否需要额外的烯醇酶抑制剂疗法。
如本文的说明书中所用，“一个(a/an)”可以意指一个或多个。如本文的权利要求书中所用，当联合词语“包含”使用时，词语“一个”可以意指一个或多于一个。
除非明确地指示出指的是唯一替代方案或替代方案互相排斥，否则在权利要求书中术语“或”的使用被用来意指“和/或”，不过本公开支持指的是唯一替代方案以及“和/或”的定义。如本文中所用的“另一个”可以意指至少第二个或更多个。
在本申请通篇，术语“约”被用来指示出某个值包括装置的误差、被用来测定这个值的方法的固有变化或在研究受试者之间存在的变化。
本发明的其它目的、特征和优点从以下详细描述将变得显而易见。然而，应了解，详细描述和特定实施例虽然指示出本发明的优选实施方案，但仅仅作为说明而给出，这是因为在本发明的精神和范围内的各种变化和修改从这个详细描述对本领域技术人员来说将显而易见。
附图简述
以下的图构成本说明书的一部分并且被包括在内以进一步展示本发明的某些方面。本发明可以通过参考这些图中的一者或多者结合本文中所呈现的特定实施方案的详细描述来更好地理解。
图1：GBM中1p36基因座的纯合缺失导致原发性肿瘤和细胞系中ENO1表达的损失。a，TCGA的Affymetrix aCGH数据显示了log2拷贝数<-1(呈白色的实际值)的四个原发性GBM，指示出1p36基因座的纯合缺失。b，DNA拷贝数与跨越原发性GBM的mRNA表达强烈相关；表达在n＝ENO1的2个拷贝(WT，灰色)的肿瘤中最高并且在n＝ENO1的0个拷贝(裸)的肿瘤中最低。c，D423-MG细胞系被鉴别为通过使用来自Wellcome Trust Sanger Institute的数据集的SNP阵列而纯合缺失。d，D423-MG和Gli56细胞中烯醇酶1蛋白质的完全缺乏是通过western印迹分析来确认。e，D423-MG ENO1裸细胞中ENO2的shRNA敲低在体内消除了颅内肿瘤发生。
图2：ENO2的shRNA消融影响ENO1裸细胞而非ENO1-WT GBM细胞。a，通过针对ENO2的两个独立的强力霉素(doxycycline，Dox)诱导性TRIPZ发夹(shENO2-3、shENO2-4)而引起的shRNA消融使得ENO1WT(A1207、U87、LN319)和ENO1裸(D423-MG)细胞系这两者中的烯醇酶2蛋白质水平降低>70％。b，ENO2的消融显著抑制ENO1裸细胞而非ENO1WT细胞的生长，而针对荧光素酶的非靶向shRNA(shLuc)在任何细胞系中都没有影响。经shLuc、shENO2-3或shENO2-4(在存在或不存在Dox诱导的情况下)感染的细胞生长的最后时间点的代表板与每个细胞系的生长曲线并排地示出。
图3：ENO1裸细胞对泛烯醇酶抑制剂PhAH的极度敏感度。a，在用不同浓度的PhAH治疗之后细胞系的结晶紫染色板显示出对D423-MG和Gli56ENO1裸细胞的急性毒性，而对ENO1WT细胞系和正常星形细胞都没有显示出急性毒性。b，GBM细胞系对PhAH治疗的敏感度与其总烯醇酶活性广泛相关。裂解物与1μM PhAH一起预先孵育使烯醇酶的酶活性抑制>95％。c，除了高于50μM的浓度之外，PhAH治疗对ENO1WT GBM细胞和正常星形细胞的生长具有极小影响。相比之下，甚至低浓度的PhAH仍足以使ENO1裸细胞的生长停止。ENO1杂合细胞(D502-MG和U343)显示出对PhAH治疗的中等敏感度。d，示出了在培养物中15天之后在不存在(左边)或存在PhAH(25μM，右边)的情况下额外的GBM细胞系和正常星形细胞的结晶紫染色板的代表性视图。
图4：在ENO1纯合缺失的原发性肿瘤中尽管ENO1mRNA表达显著降低，但糖酵解相关的转录物总体上没有减少。a，来自TCGA GBM数据集的Affymetrix U133微阵列数据(在y轴上绘制的log2绝对mRNA表达)显示了在ENO1纯合缺失的原发性肿瘤中的最低ENO1表达(红色圆圈)以及在杂合缺失的肿瘤中的中等表达(绿色正方形)。b，主要糖酵解基因GAPDH的表达(y轴)对比ENO1表达(x轴)。c、d，ENO3和ENO2的表达对比ENO1表达；ENO3表达是极低的(注意y轴上标度的差异)。从这些数据得出的主要结论是在ENO1缺失的肿瘤中ENO2或ENO3没有显著的补偿性上调，GAPDH也没有重大改变。这个发现表明，在ENO1裸肿瘤中没有发生重大的生物能量学重塑。
图5：ENO2的敲低使ENO1裸GBM细胞的生长停止，但不影响ENO1WT GBM细胞的生长。a，在ENO1裸GBM细胞系D423-MG中经由pLKO.1载体慢病毒递送的两个独立的发夹与非靶向发夹(shNT)相比使烯醇酶2蛋白质水平有效降低>80％。b，在ENO1WT GBM细胞系D502-MG中使用相同的两个发夹实现了类似水平的ENO2敲低。两个发夹选择性地靶向烯醇酶2并且不会降低烯醇酶1蛋白质水平。c，使用发光生存力分析法历时100小时获得的细胞增殖数据指示，使用两个独立的发夹敲低ENO2与shNT相比显著减缓ENO1裸细胞的生长。d，经相同发夹处理并且在相同条件下培养的ENO1WT细胞在存在和不存在ENO2敲低的情况下以类似的速率增殖。
图6：ENO2的敲低使ENO1裸GBM细胞的生长停止并且降低体外和体内肿瘤发生潜力。a，在细胞系D423-MG(ENO1裸)和D502-MG(ENO1WT)中经由pGIPZ载体慢病毒递送的发夹(shENO2-3)与非靶向发夹(shNT)相比使ENO2的表达降低>70％。b，细胞增殖仅在ENO1基因组缺失的情形中显著减缓。c，软琼脂集落形成(c)和体内肿瘤发生特性(图2e)在D423-MGENO1裸细胞中通过shENO2-3与shNT相比亦显著降低。在D502-MG细胞中对于ENO2消融来说无法收集到软琼脂集落形成或体内肿瘤发生特性，因为母细胞系不能形成软琼脂集落或颅内肿瘤。
图7：发夹抗性ENO2cDNA构建体的表达恢复烯醇酶活性并且防止ENO1裸细胞中的shENO2和PhAH的有害作用。a、b，表达发夹抗性ENO2(或GFP作为对照)的构建体被用来感染已经用pTRIPZ shENO2-4转导的D423-MG细胞，引起烯醇酶2蛋白质的强烈表达而与强力霉素活化发夹无关(a)以及总烯醇酶活性的强烈增加(b)。c、d，发夹抗性ENO2而非GFP的重新表达防止强力霉素诱导shENO2-4的有害作用。注意，在对照GFP实验中shENO2-4对生长的抑制程度略低于在先前的实验中在pCMV GFP感染之前由相同的细胞克隆体得到的结果(图3)。这归因于在连续培养期间ENO2敲低的损失(比较(a)与图3中ENO2敲低的水平)。ENO2的重新表达还赋予了对烯醇酶抑制剂PhAH的完全抗性(通过使总烯醇酶活性恢复到甚至高于WT细胞中的水平的水平)。
图8：ENO1裸细胞系D423-MG中烯醇酶1的异位表达防止烯醇酶2敲低的毒性作用。a，表达ENO1或GFP的pCMV慢病毒构建体被用来感染已经表达靶向烯醇酶2的两个pTRIPZ强力霉素诱导性shRNA(shENO2-3+4)的D423-MG细胞。shENO2-3+4的强力霉素诱导使得烯醇酶2蛋白质水平降低约80％。b、c，ENO1而非GFP的异位表达防止强力霉素介导的shRNA诱导的毒性作用。b，一式四份的每个治疗组的饱和板的结晶紫染色。c，显示平均汇合度的IncuCyte活生长曲线(一式四份+/-S.E.M.)。
图9：通过ENO1裸细胞系中ENO1和ENO2的异位表达对PhAH毒性的剂量依赖性补救。a，Gli56ENO1裸细胞经含有GFP、ENO1或ENO2的pCMV慢病毒构建体感染，得到与GBM细胞系(U87)中所示的水平相当的ENO1表达以及ENO2的强的过表达。b，烯醇酶1的表达和烯醇酶2的过表达显著保护Gli56细胞免受PhAH的有害作用。c，在D423-MG ENO1裸细胞系中以不同水平的病毒滴度进行相同实验。pCMV ENO1的六个不同滴度和pCMV ENO2的两个不同滴度得到分级水平的烯醇酶表达和活性。d，烯醇酶1的引入保护这些细胞免受PhAH的毒性作用，并且实现致死性(在14天孵育之后)所需的抑制剂浓度与烯醇酶1表达和酶活性的水平成正比地增加。对于2种水平的烯醇酶2过表达来说获得相同的模式。
图10：1p36纯合缺失的ENO1裸细胞对受体酪氨酸激酶抑制剂不敏感。与PhAH实验平行地分析在不同浓度的受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂索拉非尼(sorafenib)、拉帕替尼(lapatinib)和PHA665752的组合存在下每个细胞系的相对生长(图4)。ENO1裸D423-MG细胞(红线和标志)相比ENO1WT GBM细胞系对RTK抑制剂的组合没有更加敏感。
图11：ENO1杂合细胞对泛烯醇酶抑制剂PhAH的敏感度。在用渐增浓度的PhAH治疗之后WT(LN319)或ENO1杂合(502或U343)细胞系的结晶紫染色板。甚至低浓度的PhAH仍足以抑制ENO1杂合细胞(D502-MG和U343)的生长。
图12：U343细胞对PhAH的敏感度是由于降低的ENO1表达。a，ENO1杂合细胞(U343)对PhAH的敏感度通过异位ENO1或ENO2表达是部分可逆的。b，ENO1杂合细胞(U343)对PhAH的敏感度在ATP合酶抑制剂寡霉素(10nM)存在下增强。虽然寡霉素本身具有最小作用，但与PhAH组合对U343细胞具有高毒性。此外，这个作用通过用异位ENO1或ENO2表达补充而在很大程度上逆转。
图13a-b：在存在或不存在寡霉素的情况下U343细胞与正常人星形细胞相比对PhAH的敏感度增加。U343ENO1杂合细胞需要约低8倍剂量的PhAH来实现与正常人星形细胞相比类似的生长抑制，(a)正常人星形细胞和U343细胞响应于渐增剂量的PhAH的生长曲线，(b)与线粒体电子传递链抑制寡霉素(2.5nM)组合。
图14：当用烯醇酶2抑制剂治疗ENO1缺失的肿瘤时，各种代谢物是用来监测治疗有效性的潜在生物标志。细胞裂解物的代谢组学分析揭示，在用烯醇酶抑制剂PhAH治疗后，甘油酸盐和乙醇胺水平在ENO1裸细胞D423MG中增加，而其水平在ENO1野生型的U87细胞中没有变化(图a和图b)。这些代谢分析物在治疗期间可能积聚在患者的血清中，并且可以被用作评价疾病消退的非侵入性方式。当使用两个独立的发夹敲低ENO1裸细胞(D423MG)中的烯醇酶2时，乳酸盐水平下降(图c)。乳酸盐是用来监测治疗反应的另一个潜在的生物标志。肿瘤中的乳酸盐水平可以使用MR光谱学成像来检测，并且乳酸盐峰值的下降可能与肿瘤细胞死亡相关。
图15：烯醇酶抑制剂PhAH与如寡霉素、抗霉素A(antimycin A)和鱼藤酮(rotenone)等线粒体代谢抑制剂对ENO1裸细胞死亡发挥协同作用。ENO1裸细胞相比人星形细胞对PhAH和线粒体抑制剂的治疗更敏感。如通过荧光素酶分析法测量的D423MG细胞系的细胞生存力在线粒体抑制剂与PhAH组合使用时相比其单独使用时显著更低。这个作用是通过ENO1裸细胞中烯醇酶2的过表达来补救。这个作用在人星形细胞中也没有观察到。这个发现提高了使用烯醇酶抑制剂与线粒体抑制剂的组合来治疗具有ENO1纯合缺失的肿瘤的令人关注的可能性。在每个治疗中测试的细胞是423pCMV GFP(ENO1裸))；423pCMV ENO2(ENO1裸细胞，其中烯醇酶活性通过ENO2的高过表达而恢复)；以及星形细胞(从左到右)。
图16：必需的代谢基因/管家基因的纯合缺失使肿瘤对冗余的同源物的分子靶向敏感。许多必需的代谢过程是通过冗余的基因来执行，以使得在肿瘤发展期间一个成员的伴随纯合缺失对系统造成最小破坏(图a)。尽管如此，如果第二个冗余的同源物是通过特定抑制剂靶向的，那么必需的代谢过程在具有缺失的肿瘤中受损害，但基因完整的正常组织不受影响，因为肿瘤特异性缺失的同源物仍有功能(图b)。这个一般概念的特定实例是成胶质细胞瘤中的ENO1纯合缺失的情况。ENO1纯合缺失因为仍然表达ENO2而对肿瘤具耐受性(图c)，然而，ENO2的特定抑制剂应完全消除ENO1裸肿瘤细胞中的烯醇酶活性(因此阻断糖酵解和ATP合成)，但留下基因组完整的正常组织不受影响(图d)。
图17：靶向主要肿瘤抑制因子的纯合缺失可以包括必需的代谢基因/管家基因。众所周知的是，若干基因座，包括10q23(PTEN)和9p21(Ink/arf)，在许多不同癌症中展现出频繁并循环的纯合缺失。这个图示出了多发性原发性肿瘤中围绕10q23基因座的SNP阵列(拷贝数)变化。缺失具有广泛范围的尺寸和边界，但全部被锚定在PTEN上。这种类型的模式“最小共用区”已经作为缺失所靶向的关键肿瘤抑制基因的标记而被广泛研究(Maser等人,2007)。受到大大减少的关注的是，这些缺失中的一些可能相当大并且去除了许多非靶标的非肿瘤抑制基因(“乘客”)，这些非肿瘤抑制基因可能在细胞中起重要(如果冗余的话)作用。虽然这些乘客缺失的基因中的大多数在肿瘤组织中不相关并且不表达(例如，干扰素、防御素)，但许多广泛表达的代谢基因与PTEN共同缺失，随着与PTEN的距离增大而频率下降。这些包括ATAD1(具有未知功能的高度保守的线粒体AAA ATP酶)、MINPP1(在糖酵解、核黄素和碳水化合物代谢中起作用的多磷酸肌醇磷酸酶；Cho等人,2008)以及PANK1(泛酸激酶，辅酶A生物合成中的第一步，用于乙酰基转移反应、脂肪酸氧化和脂质生物合成的必需辅因子；参见例如Leonardi等人,2010a和Leonardi等人,2010b，以引用的方式并入本文中)。
图18：与主要肿瘤抑制因子一起缺失的必需的冗余的管家基因的另一个实例。这个图示出了围绕INK/ARF基因座(主要肿瘤抑制因子)的染色体9上的拷贝数变化。在这种情况下，编码TCA循环酶顺乌头酸酶1的基因ACO1与INK4a/ARF一起缺失。图a显示，在两个独立的黑素瘤数据集中，ACO1在两个患者样品中是纯合缺失的。图b显示，这种纯合缺失也在2/356成胶质细胞瘤患者中发生。顺乌头酸酶1是另一个重要的管家基因，它是我们的治疗策略的有前景的靶标。
图19：基因组拷贝数与TARS的表达相关。c，基因组拷贝数数据从Sanger COSMIC网站上检索(a)并且通过实验研究来确认(c)，显示了SK-MEL-2细胞系中TARS的杂合缺失。(a)中的数目指示DNA拷贝数。b，DNA拷贝数与TARS的mRNA表达相关。黑色框指示SK-MEL-2细胞系。
图20：在TARS缺乏的黑素瘤细胞中对TARS抑制剂疏螺体素的敏感度增加。a，SK-MEL-2细胞系被鉴别为具有TARS的杂合缺失；451Lu细胞系被鉴别为缺乏TARS；并且SK-MEL-5和HMEL细胞系被鉴别为对于TARS基因来说是野生型的(数据从CCLE-Broad网站上检索)。b，低浓度的疏螺体素治疗对HMEL和SK-MEL-5细胞的生长具有极小影响。相比之下，低浓度的疏螺体素使SK-MEL-2细胞的生长停止。451Lu细胞显示出对疏螺体素治疗的中等敏感度。c，TARS的表达水平是通过western印迹分析来确认，这显示了与对疏螺体素的敏感度的强相关性。
图21：活生长曲线(SK-MEL-2的低初始细胞密度)显示了在TARS缺乏的黑素瘤细胞中对TARS抑制剂疏螺体素的敏感度增加。SK-MEL-2(TARS Het)；SK-MEL-5(TARS WT)；451Lu(TARS缺乏)；HMEL(TARS WT)。
图22：活生长曲线(SK-MEL-2的高初始细胞密度)显示了在TARS缺乏的黑素瘤细胞中疏螺体素的细胞毒性增加。SK-MEL-2(TARS Het)；SK-MEL-5(TARS WT)；451Lu(TARS缺乏)；HMEL(TARS WT)。
图23：对疏螺体素的敏感度增加是通过TARS缺乏的黑素瘤细胞中TARS的异位过表达来逆转。a、b，TARS而非GFP或CHEK1的异位表达防止SK-MEL-2细胞中由疏螺体素引起的毒性作用。a，表达GFP的pCMV慢病毒构建体被用来感染SK-MEL-2细胞。b，表达TARS的pCMV慢病毒构建体被用来感染SK-MEL-2细胞。c，SK-MEL-2细胞对疏螺体素的敏感度是通过TARS而非GFP或CHEK1的异位表达来逆转。d，Western印迹法显示，用含有TARS的pCMV慢病毒构建体感染在SK-MEL-2细胞中得到高水平的TARS表达。
图24：TARS拷贝数/mRNA表达与对疏螺体素的敏感度之间的强相关性。一组癌细胞系对疏螺体素的敏感度(IC50，以log10M表示，y轴)是从NCI-60数据库中获取的并且被绘制成随着从CCLE-Broad数据集获得的TARS基因组拷贝数(A，x轴)或mRNA表达(B，x轴)而变化的图。SK-MEL-2细胞系(浓阴影)具有最低拷贝数和第二低的TARS mRNA表达，并且相应地对疏螺体素的IC50最低(敏感度最高)。基于产生addymetrix aCGH数据的实验研究的拷贝数确认了SK-MEL-2中TARS的拷贝数损失(C)。
图25：基因组拷贝数与广泛范围的ARS基因的表达水平相关。这些图显示，DNA拷贝数与AARS(a)、KARS(b)、HARS(c)和LARS(d)的mRNA表达相关。
图26：CHEK1蛋白质表达与基因组拷贝数不相关，并且CHEK1的过表达不会赋予对CHEK1抑制剂AZD7762的抗性。A，来自COMIC(Sanger Center)的基因组拷贝数显示，染色体11上的CHEK1(框式)在细胞系SK-MEL-2中仅具有一个拷贝。B，微阵列表达和阵列CGH拷贝数数据显示了约900个细胞系中mRNA水平与CHEK1的基因组拷贝之间的良好相关性(SK-MEL-2用框来指示)。C，然而，通过western印迹分析，SK-MEL-2细胞不会表达较低水平的CHEK1蛋白质。D，SK-MEL-2细胞中CHEK1的过表达不会赋予对CHEK1抑制剂AZD7762的抗性。
具体实施方案
I.本发明
基因组的大区域的缺失(例如，杂合缺失)是癌症中的原型体细胞事件，这个事件通过消除关键肿瘤抑制基因的功能而驱动肿瘤发生。这些缺失常常涵盖在癌症发病机理中没有已知作用的邻近基因，在许多情况下，这些基因包括编码必需代谢酶的必需基因。然而，肿瘤细胞中一部分酶活性的损失(例如，损失50％)典型地甚至在必需管家基因的情况下仍被耐受。关于这点的一个原因是因为大多数代谢酶大量过量地存在并且毒性取决于低于临界阈值的表达的损失。典型地，需要远远大于50％的活性损失以对癌细胞具有任何影响。
在这里所呈现的研究展示，ENO1基因的一个拷贝的杂合失活促使癌细胞对糖酵解路径抑制剂极其敏感。相反地，在保留ENO1的两个拷贝的癌细胞中，需要极高水平的糖酵解抑制剂以对癌细胞生长具有任何影响。因此，具有杂合ENO1失活的癌细胞可以用相比其它情况所需的浓度低得多的浓度的糖酵解抑制剂来有效地治疗。举例来说，显示ENO1杂合缺失的成胶质细胞瘤细胞(U343和D502-MG)与ENO1-WT成胶质细胞瘤细胞系和正常人星形细胞相比对烯醇酶抑制剂磷酸基乙酰羟肟酸盐(PhAH)的敏感度高2-8倍(参见图3b-c和图11)。这个作用通过使用用于表达ENO1或ENO2的载体补充细胞而至少部分可逆，展示了这个作用是归因于癌细胞中烯醇酶表达的水平降低。重要的是，细胞对PhAH的敏感度可以通过用寡霉素共同治疗来进一步增强(图12)。
鉴于这些研究，如ARS、PDG或ENO1等管家基因的杂合失活可以充当用于指导抗癌疗法的生物标志。举例来说，经确定具有ENO1的这种杂合缺失的癌症患者可以用糖酵解抑制剂(例如，烯醇酶抑制剂)或这种抑制剂的前药来治疗。同样地，经确定具有ARS基因的这种杂合缺失的患者可以用ARS抑制剂来治疗。优选地，这些患者是联合第二疗法(例如，在ENO1的情况下是第二糖酵解抑制剂或线粒体转运抑制剂，或在ARS的情况下是蛋白质合成抑制剂)来治疗，从而进一步增强特定抑制剂对癌细胞的功效。同样地，可以针对ENO1或ARS的杂合失活来分析来自患者的癌细胞以预测患者是否可能响应特定抑制剂疗法或甚至估计应被施用的疗法的剂量。这些方法允许抗癌疗法针对特定患者和那个患者的特定癌症来作调整。因此，疗法应不仅证实更加有效，而且通过鉴别将有效的疗法而不是仅仅施用具有许多副作用和未经测试的功效的“标准”治疗来显著降低副作用。
本发明的实施方案利用了正常组织与癌组织之间由基因决定的代谢差异以产生癌细胞特异性治疗。具体地说，本发明的方面是部分基于以下令人惊讶的发现：冗余的必需管家基因的纯合缺失建立了癌症特异性弱点。由这些基因编码的蛋白质的活性的完全损失和细胞死亡是通过以在缺失的组织与未缺失的组织之间相区分的剂量施用针对未缺失的同系物的选择性抑制剂或靶向两个同系物的化合物来获得。使用这种方法，两种基因都是完整的并且被表达的正常细胞的健康状况不受影响。
癌症基因组的特征为分别靶向驱动癌基因和肿瘤抑制基因的众多扩增和缺失。靶向癌症基因的这些拷贝数变化几乎总是涉及在致癌过程中没有直接作用的邻近基因的拷贝数的变化。在这里，这些连带事件在经设计以评价癌细胞中潜在的独特弱点的策略中被利用，这些癌细胞已经遭受必需管家基因的纯合缺失。在无脊椎动物以及小鼠中的很多基因相互作用研究指示，许多必需的细胞管家功能是由编码重叠功能的多个同源基因执行的，这种重叠功能在面临一个同源物的损失时使细胞能够生存，但在多个同源物损失时完全致死(参见例如图16，以及Deutscher等人,2006；DeLuna等人,2008；Costanzo等人,2010；Vavouri等人,2008；和Brookfield等人,1997，其各自均以引用的方式并入本文中)。在这个概念框架下，预想冗余的必需管家基因的纯合缺失可以建立癌症特异性弱点，借此，第二个未缺失的同源物的药理学失活将使得携带这种缺失的肿瘤细胞的活性完全损失，但不会损害两种基因都是完整的并且被表达的正常细胞的健康状况(图16a)。为了研究这些基因，检查GBM的高分辨率综合TCGA数据集(表1和The Cancer Genome Atlas Research Network2008)。
“连带弱点”法的概念的基因学和药理学证据在本文中与位于1p36基因座处的ENO1基因一起呈现，1p36基因座是经受具有包括CHD5和CAMTA1的若干个候选肿瘤抑制基因的GBMa中的频繁缺失的区域(图1a；Henrich等人,2011和Bagchi等人,2008)。1p36基因座在1-5％的GBM(以及少突神经胶质瘤和大细胞神经内分泌肺肿瘤，参见例如The CancerGenome Atlas Research Network 2008；Yin等人,2009；Duncan等人,2010；Kotliarov等人,2006；和Peng等人,2005)中是纯合缺失的，并且常常涉及ENO1基因的纯合缺失。由三个同源基因编码的烯醇酶是催化糖酵解的第二步到最后一步的必需酶，从而将2-磷酸甘油酸转化成磷酸烯醇丙酮酸盐(Poyner等人,1992)。在哺乳动物中，烯醇酶活性由以下三个基因编码：广泛表达的ENO1，只有在神经组织中表达的ENO2，以及在肌肉组织中表达的ENO3(表2)。因此，考虑到糖酵解对正常细胞并且尤其是肿瘤细胞中的能量产生的至关重要性(Wise等人,2010)，对于ENO1来说纯合裸的GBM肿瘤将被预测到对烯醇酶2的抑制高度敏感，而正常神经元组织将通过烯醇酶1的功能冗余来补救(图16b)。相应地，Eno2敲除小鼠是能生存并且能繁殖的，表明烯醇酶2的药理学抑制可能耐受良好(表2)。此外，具有若干个烯醇酶同源物的酿酒酵母(S.cerevisiae)显示了具有单个突变体的弱表型并且仅在所有同源物都缺失时才导致细胞致死(Deutscher等人,2006；DeLuna等人,2008；和Costanzo等人,2010)。秀丽隐杆线虫(C.elegans)和果蝇(Drosophila)仅具有一个编码烯醇酶活性的基因并且这个基因的缺失是致死的(Buszczak等人,2007和Sonnichsen等人,2005)。
本文所描述的基因学和药理学结果展示，烯醇酶2抑制在具有1p36纯合缺失并连带损失ENO1的细胞中是致死的，而ENO1完整细胞可以依赖于烯醇酶1来经历糖酵解并支持存活。考虑到若干个纯合缺失的管家基因可以在1p36上以相同的“缺失”出现(例如H6PD，表1)，通过组合ENO2的抑制与同时缺失的管家基因的另一个同源物的抑制而可能进一步增加有效性和癌细胞特异性杀死。
当然，连带弱点可以被扩展到除ENO1之外的其它乘客纯合缺失的管家基因。GBM中的主要纯合缺失的基因座9p21(CDKN2A)和10q23(PTEN)涵盖大量缺失的乘客基因，这些乘客基因是功能上冗余的管家基因家族的成员(表1，图17)。重要的是，许多这些化合物关于癌症治疗是完全新颖的分子实体。据估计，人基因组中11％的所有蛋白质编码基因在人癌症中是缺失的(Bignell等人,2010)。因此，考虑到大量纯合缺失跨越在好几百个基因跨度上的许多不同癌症类型(Bignell等人,2010；Taylor等人,2010；Cox等人,2005；和Tonon等人,2005)，在这里针对GBM所描述的范例应适用于开发许多额外的癌症类型的个性化治疗。
未缺失的同系物的特定抑制剂可以通过对已经可用的泛酶抑制剂进行化学修饰(表3)或通过使用可用的小分子库进行高通量筛选来发现。抑制可以使用针对每种酶的特定活性分析法来检测。举例来说，对于烯醇酶，这涉及在NADH氧化之后使用丙酮酸激酶和LDH偶合分析法。对于H6PD，这可以通过测量NADPH的产生来完成(Clarke等人,2003，以引用的方式并入本文中)。顺乌头酸酶活性可以通过在异柠檬酸脱氢酶偶合反应中监测NAPD+的减少来测量(Bulteau等人,2005，以引用的方式并入本文中)。泛酸激酶活性可以通过将这种酶与14C标记的泛酸盐一起孵育并且通过闪烁计数定量放射性产物来测量(Zheng等人,2008，以引用的方式并入本文中)。KIF活性可以使用ATP酶分析法来测量。
具有必需的代谢管家基因的纯合缺失的肿瘤可以在手术后或活体组织切片后使用肿瘤组织的拷贝数分析或酶分析法来诊断。在烯醇酶的情况下，举例来说，可能在肿瘤组织和正常组织上操作烯醇酶1和烯醇酶2活性分析法(Poyner等人,1992)。作为适当治疗靶标的肿瘤将被鉴别为具有几乎检测不到的烯醇酶1活性和正常烯醇酶2活性。这可以被延伸到其它代谢酶。对于不具有这些现成的酶分析法的蛋白质来说，肿瘤样品的拷贝数分析可以被用作诊断方法。在目前的研究中，我们示出了，对于烯醇酶1来说，这是用来检测真正的纯合缺失的一种有效方式，因为基于拷贝数显示出纯合缺失的样品也具有几乎检测不到的烯醇酶1表达水平。
在治疗期间，可以通过非侵入性成像或通过代谢型态分析来监测反应。在成胶质细胞瘤中的烯醇酶抑制的情况下，举例来说，MR光谱学成像(MRSI)可以是一种有效的使用工具。这种技术已经被用来区分脑肿瘤类型，并且其还具有分期和预测性预后的潜在应用(Nelson等人)。这种技术组合了MRI与NMR光谱学以通过检测各种代谢物的水平和空间分布来提供关于组织代谢型态的信息，这些代谢物有胆碱、肌酸、N-乙酰天冬氨酸盐、乳酸盐和脂质(Nelson等人)。乳酸盐峰值对应于无氧代谢的区域，并且在多个研究中已经发现其在成胶质细胞瘤中明显突出(Moller-Hartmann等人；Law)。在这里所呈现的数据显示，乳酸盐水平在体外在ENO1缺失的细胞中烯醇酶2抑制之后显著降低(图14c)。这可以指示，对治疗展现出成功的反应的患者与基线相比将具有降低的肿瘤乳酸盐水平。或者，可能在治疗之前和之后分析血清代谢物。先前的研究已经显示，可以基于血清或尿液的代谢型态来区分癌症患者与具有良性状况的健康患者。这适用于从卵巢癌到肝细胞癌的多种癌症(Chen等人；Odunsi；Spratlin等人)。治疗后的肿瘤代谢变化可以被检测为血清代谢物的变化，特别是那些处于靶蛋白上游或下游的血清代谢物。通过这种方式，可以发现特定生物标志并且将其用来监测治疗有效性。经PhAH治疗的D423MG ENO1裸细胞的初始代谢表征指示出甘油酸盐的明显上调(图14a)。甘油酸盐可能是由于2-磷酸甘油酸盐和3-磷酸甘油酸盐(预期这些中间物紧邻烯醇酶区块的上游积聚)的自发水解的结果而产生(图14c)。甘油酸盐在正常血清和脑脊髓液中是稳定的并具有低丰度，并且因此可以作为抑制剂有效性的潜在标志。
此外，纯合缺失的管家基因的抑制剂可以与其它的化学治疗剂治疗组合使用。可能使用作用于类似的路径，从而对细胞死亡产生协同作用的两种化合物。数据显示，举例来说，在ENO1裸细胞中，烯醇酶抑制剂与如寡霉素、抗霉素A和鱼藤酮等线粒体代谢抑制剂具有协同作用(图15)。这个作用在ENO1野生型的细胞中没有观察到，并且其通过ENO1裸细胞中烯醇酶2的过表达来补救。表3中示出了假定的协同相互作用的额外列表。
因此，本发明提供了治疗癌症或诱导细胞的细胞死亡的方法，这种癌症或细胞具有管家基因的纯合缺失，这种管家基因具有功能上冗余的同源物，该方法是通过向受试者施用或使细胞接触适当剂量的冗余的同源物的抑制剂或两个同系物的抑制剂来实现，借此，缺乏两个同源物之一的细胞需要较低水平的抑制剂(相比健康的、基因组完整的)来达到治疗上相关的路径抑制水平。
II.定义
“管家基因”意指维持基本细胞功能所需的基因。
如本文中所用的“纯合缺失”意指基因的两个等位基因都缺失。
如本文中所用的“杂合缺失”意指基因的等位基因之一缺失。
如本文中所用的给定基因的“功能上冗余的同源物”或“功能上冗余的同系物”指的是可以执行与给定基因基本上相同的功能的基因。举例来说，在编码酶的基因的情况下，功能上冗余的同源物将编码在代谢路径的相同步骤中作用于相同底物的酶(例如，具有相同EC编号的酶)。
“治疗”是为了防止病症发展或改变病症的病状或症状的目的而进行的干预。因此，“治疗”指的是治疗性治疗和预防措施。需要治疗的人包括已经患有病症的人以及有待预防病症的人。在肿瘤(例如，癌症)治疗中，治疗剂可以直接减少肿瘤细胞的病状，或促使肿瘤细胞对其它治疗剂(例如，放射线和/或化学疗法)的治疗更敏感。如本文中所用的“改善”或“治疗”指的是接近归一化值(例如，在健康患者或个体中获得的值)的症状，例如，与归一化值的差异小于50％，优选地，与归一化值的差异小于约25％，更优选地，与归一化值的差异小于10％，并且甚至更优选地，与归一化值没有显著差异(如使用常规统计检验所测定)。
因此，治疗可以包括遏制、抑制、预防、治疗或其组合。治疗尤其指的是增加持续进展的时间、加快缓解、诱导缓解、增强缓解、加速恢复、增加替代治疗剂的功效或减小对替代治疗剂的抗性，或其组合。“遏制”或“抑制”尤其指的是延缓症状的发作、防止疾病复发、减小复发事件的数目或频率、增加有症状事件之间的潜伏期、降低症状的严重程度、降低急性事件的严重程度、减小症状的数目、减小疾病相关症状的发生率、减小症状的潜伏期、改善症状、减少继发性症状、减少继发性感染、延长患者存活期，或其组合。症状是原发性的，而在另一个实施方案中，症状是继发性的。“原发性”指的是作为增生性病症的直接结果的症状，而继发性指的是来源于原发性原因或因原发性原因而起的症状。症状可以是疾病或病理状况的任何表现。
“癌症或肿瘤细胞的治疗”指的是在本说明书通篇所描述的一定量的小分子或核酸，其能够产生以下作用中的一者或多者：(1)抑制肿瘤生长，包括(i)减缓和(ii)完全生长停滞；(2)减小肿瘤细胞的数目；(3)维持肿瘤尺寸；(4)减小肿瘤尺寸；(5)抑制，包括(i)减少、(ii)减缓或(iii)完全防止肿瘤细胞渗入周围器官中；(6)抑制，包括(i)减少、(ii)减缓或(iii)完全防止转移；(7)增强抗肿瘤免疫反应，其可以使得(i)维持肿瘤尺寸、(ii)减小肿瘤尺寸、(iii)减缓肿瘤生长、(iv)减少、减缓或防止侵入；和/或(8)在某种程度上减低一个或多个与病症相关的症状的严重程度或数目。
如本文中所用的“经改善的症状”或“经治疗的症状”指的是接近归一化值的症状，例如，与归一化值的差异小于50％，优选地，与归一化值的差异小于约25％，更优选地，与归一化值的差异小于10％，并且甚至更优选地，与归一化值没有显著差异(如使用常规统计检验所测定)。
如本文中所用的“药学上可接受的组分”是适合人和/或动物使用而没有过度的不良副作用(如毒性、刺激性和过敏反应)并且与合理的效益/风险比相匹配的组分。
如本文中所用的术语“安全并有效的量”或“治疗量”指的是当以本发明的方式使用时足以得到所要治疗反应而没有过度的不良副作用(如毒性、刺激性或过敏反应)并且与合理的效益/风险比相匹配的组分的数量。“治疗有效量”意指有效得到所想要的治疗反应的本发明化合物的量。举例来说，有效延缓癌症生长或引起癌症缩减或防止转移的量。特定的安全并有效的量或治疗有效量将随以下因素而变化：如所治疗的特定病状、患者的身体状况、所治疗的哺乳动物或动物的类型、治疗的持续时间、同步疗法(如果有的话)的性质，以及所采用的特定配制品和化合物或其衍生物的结构。
如本文中所用的“癌症”指的是在哺乳动物中发现的所有类型的癌症或赘生物或恶性肿瘤，包括(但不限于)：白血病、淋巴瘤、黑素瘤、癌瘤和肉瘤。癌症的实例是脑癌、乳癌、胰脏癌、子宫颈癌、结肠癌、头颈癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、间皮瘤、卵巢癌、肉瘤、胃癌、子宫癌和成神经管细胞瘤。额外的癌症包括例如霍奇金氏病(Hodgkin'sDisease)、非霍奇金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin's Lymphoma)、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、乳癌、卵巢癌、肺癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、小细胞肺肿瘤、原发性脑肿瘤、胃癌、结肠癌、恶性胰脏胰岛素瘤、恶性类癌、膀胱癌、恶化前皮肤病变、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、神经胶质瘤、成神经细胞瘤、食道癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、子宫颈癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌和前列腺癌。
“增生性病症”是由比正常细胞生长更快速的细胞(即，肿瘤细胞)引起的疾病或病状。增生性病症包括良性肿瘤和恶性肿瘤。当按肿瘤的结构分类时，增生性病症包括实体肿瘤和造血肿瘤。
术语“患者”、“受试者”或“个体”在本文中可互换地使用，并且指的是有待治疗的哺乳动物受试者，其中人患者是优选的。在一些情况下，本发明的方法可应用于实验动物、兽医学应用，以及开发疾病的动物模型，包括(但不限于)啮齿动物，包括小鼠、大鼠和仓鼠；以及灵长类动物。
如本文中所用的术语“施用到细胞”(例如，表达载体、核酸、递送媒介、作用物(agent)等等)指的是用分子转导、转染、显微注射、电穿孔或射击细胞。在一些方面，通过使靶细胞与递送细胞接触(例如，通过细胞融合或通过使递送细胞裂解(当其接近于靶细胞时))，将分子引入到靶细胞中。
III.其它管家基因
在本发明的背景下，管家基因是维持基本细胞功能所需的任何基因。在无脊椎动物以及小鼠中的很多基因相互作用研究指示，许多必需的细胞管家功能是由编码重叠功能的多个同源基因(即，冗余的同源物)执行的，这种重叠功能在面临一个同源物的损失时使细胞能够生存，但在多个同源物损失时完全致死。(Deutscher等人2006；Costanzo等人2010；Vavouri等人2008；Brookfield等人1997)
适用于本发明的方法中的示例性的管家基因和其冗余的同源物描述于表1中。管家基因包括例如(但不限于)烯醇酶1(ENO1)、己糖-6-磷酸脱氢酶(H6PD)、驱动蛋白家族成员1B(KIF1B)、烟酰胺核苷酸腺苷酰转移酶1(NMNAT1)、泛素化因子E4B(UBE4B)、顺乌头酸酶1(ACO1)、kelch样9(KLHL9)、泛酸激酶1(PANK1)和激酶家族成员20B(KIF20B)。
表1示出了在成胶质细胞瘤中纯合缺失的代谢基因/管家基因的精细列表，对此，针对必需性以及冗余性存在基于无脊椎动物的证据。以GBM-TCGA数据集(log2拷贝数<-1)中纯合缺失的基因的完整列表开始，我们应用了若干个过滤器来确定这种缺失的基因是否是必需的冗余的管家基因，即，最终确定同源物的药理学抑制是否将导致肿瘤特异性细胞受损的功能。为了确定缺失的基因是否起到管家功能，我们首先查询了肿瘤和正常组织中的表达强度和模式以及基因的一般功能。第二，我们询问了基因跨越种系保守的程度，以及敲除数据是否可用于无脊椎动物模型(酵母基因组数据库(Saccharomyces GenomeDatabase；SGD)、线虫数据库(Wormbase；WB)、果蝇数据库(Flybase；FB))。第三，我们询问了导致细胞不能生存的已知基因相互作用是否已经在无脊椎动物或小鼠中有记载(使用数据库SGD、线虫数据库、果蝇数据库、MGI)。第四，我们询问了小分子抑制剂是否可用，这种小分子抑制剂可能经过修饰以选择性地击中一个同源物胜于另一个同源物。第五，我们研究了具有缺失的基因的可用细胞系以测试冗余性假设。最后，我们研究了MGI以确定药物靶标同源物的敲除是否是有害的，从而有了关于潜在的药物被患者良好耐受的程度的一些理念。从这种分析中显露出来的最强候选物按递减次序是ENO1/ENO2、PANK1/PANK3、ACO1/ACO3以及在较小程度上的KIF20B/KIF20A对。
泛酸激酶是辅酶A生物合成中的第一步，其为用于乙酰基转移反应、脂肪酸氧化和脂质生物合成的必需辅因子。辅酶A无法被输入并且必须以细胞自主方式合成。在酵母、苍蝇和蠕虫中，仅存在酶的一种同工型，并且敲除是致死的(Zhou等人2001)，指示出其为必需基因。在小鼠和人中，存在三个编码PANK活性的基因，最广泛表达的是PANK1和PANK3(Leonardi等人2010a；Leonardi等人2010b)。PANK1或PANK3的敲除使小鼠能生存，而PANK1/3双重敲除的小鼠在很早的胚胎发育期间是致死的(S.Jackowski,St Jude Children'sResearch Hospital,Memphis,TN,personal communications)。对PANK3显示出一些偏好的PANK抑制剂胡绊酸盐已经存在，并且已经在临床上用于人中(Zhang 2007)。因此，在PANK1裸肿瘤中PANK3的抑制(使用胡绊酸盐的衍生物)应严重地损害肿瘤细胞生长，但留下正常组织未被触及(考虑到PANK3裸小鼠能生存并且差不多是正常的)。
顺乌头酸酶1(ACO1)是双功能酶，其经由从柠檬酸盐产生异柠檬酸盐而在铁代谢和供给线粒体呼吸这两者中起到必需而冗余的作用。ACO2是线粒体同工型，其不会控制铁代谢，但在克雷布斯循环(Krebs cycle)中负责将柠檬酸盐转化成异柠檬酸盐。在酵母中，ACO1和ACO2单无效突变体是能生存的，其中只有双无效突变体才是致死的(Deutscher等人2006)。Aco2-/-小鼠尚未有报道，但Aco1-/-和Aco3-/-小鼠是能生存并且能繁殖的。ACO3是酶失活的，但如同ACO1一样，经由结合mRNA中的IRE来调控铁代谢。Aco1-/-Aco3-/-裸小鼠由于大量铁缺乏的结果而无法存活超过E6.5(Smith等人2006)。因此，ACO1纯合缺失展现了肿瘤的两个弱点：a)ACO2的特异性抑制，其将使得不能进行柠檬酸盐/异柠檬酸盐转化并牵连生物能量学和脂肪酸产生(Deutscher等人2006)；以及b)ACO3/IREB2的特异性抑制，其将引起铁饥饿(Smith等人2006)。
KIF20B(又称为M期磷蛋白1)是最初被认为是完成胞质分裂所需的驱动蛋白马达酶(Abaza等人2003)。在哺乳动物中存在两个KIF20家族成员(KIF20A和KIF20B)，但在酵母中没有直接的1:1同源物。在秀丽隐杆线虫和果蝇中，KIF20的一个直接的1:1同源物与基因缺失一起存在，从而导致早期幼虫致死(Moore等人1994)并有大量细胞死亡的证据，表明哺乳动物同源物KIF20A和KIF20B可以冗余地起作用。当然，正如KIF20B一样，KIF20A也已经被认为是胞质分裂所必需的(Hill等人2000)，并且两者都在有丝分裂期间高度上调。驱动蛋白是ATP依赖性酶，其据知是“可药化的”，并且已经在癌症治疗方面进行探索(Parrish等人2007)。最近描述了KIF20A的特定抑制剂帕普曲因(Paprotrain)(Tcherniuk等人2010)。此外，KIF20A已经作为胰脏癌中siRNA的“一般”癌症药物靶标来进行探索(Taniuchi等人2005)。
ARS基因是必需并且(在人中)非冗余的基因，其为蛋白质合成所需。具体地说，这些基因是氨基酸负载的t-RNA的产生所需的，这些t-RNA可以被核糖体利用以供多肽链延伸。可以在癌细胞中杂合失活的ARS基因的实例包括(但不限于)TARS(5q13)；EPARS(1q41)；VARS(6p21)；IARS(9q24)；CARS(11p15)；SARS(1p13)；YARS(1p35)；AARS(16q23)；KARS(16q24)；LARS(5q31)；HARS(5q32)；和RARS(5q35)(括号中的符号指示了基因的染色体位置)。因此，在一些情况下，用于根据实施方案治疗的癌细胞可以包含两个或更多个ARS基因(例如，SARS和YARS；AARS和KARS；或LARS、HARS和RARS)的杂合缺失。
其它适合的管家基因和冗余的同源物可以由本领域技术人员容易地鉴别(参见例如Nijhawan等人,2012，以引用的方式并入本文中)。
IV.检测突变
某些实施方案涉及在体内或在样品中检测基因(如ENO1或ARS)的一个拷贝的杂合失活。举例来说，在一些实施方案中，失活可以通过检测或测量癌细胞的核酸序列的变化(突变)来检测。在再其它方面，基因失活通过检测与癌细胞相关的降低的表达或降低的烯醇酶活性来间接地检测。
A.核酸检测
在一些实施方案中，评价杂合突变的存在可以涉及检测或定量编码核酸，例如编码基因产物(例如，ARS或ENO1)的RNA或DNA。举例来说，在一些方面，对癌细胞基因组的全部或一部分进行测序以检测基因的一个拷贝中突变(例如，取代、缺失、倒位或插入)的存在。在一些方面，可以使用聚合酶链反应(PCR)来扩增ENO1或ARS序列的全部或一部分。
在其它实施方案中，基因编码序列中的突变可以通过测定编码RNA的全部或一部分的序列来检测。举例来说，可以采用逆转录PCR来测定ENO1或ARS编码序列的序列。在又其它方面，可以采用定量PCR或RT PCR来确定细胞是否包含减少量的烯醇酶1编码序列(例如，对应于基因的一个拷贝的失活)。
在一些实施方案中，可以使用标准序列分析技术对上文所描述的PCR产物进行序列分析以鉴别特定种类的变化。在某些方法中，通过使用经设计以供最佳测序的引物组的序列分析来进行基因的详尽分析。本发明的实施方案提供了可以使用这些类型的分析中的任一者或全部的方法。使用人基因组(或来源于其的cDNA)的已知序列，可以设计寡核苷酸引物以允许在整个ENO1基因(或ARS基因)上的序列和周围的序列扩增。同样地，在一些情况下，可以使用DNA测序来检测和/或定量烯醇酶1编码核酸。用于这种序列的方法包括(但不限于)可逆性末端终止法(例如，由和BioSciences所用)、焦磷酸测序(例如，来自Roche的454测序)以及通过接合测序(例如，Life TechnologiesTM SOLiDTM测序)。
在PCRTM中，经扩增的靶标DNA的分子数在每个反应循环中增加接近两倍直到一些试剂变得有限。因此，扩增速率变得渐渐减小直到在循环之间经扩增的靶标没有增加。如果绘制循环数在X轴上并且经扩增的靶标DNA的浓度的对数在Y轴上的图，那么特征形状的曲线是通过连接所绘制的点而形成。以第一个循环开始，线的斜率是正的并且是恒定的。这被认为是曲线的线性部分。在试剂变得有限之后，线的斜率开始减小并且最终变成零。在这个点处，经扩增的靶标DNA的浓度变得渐近于某个固定值。这被认为是曲线的平稳部分。
在PCRTM扩增的线性部分的靶标DNA的浓度与在反应开始之前靶标的起始浓度成正比。通过测定已经完成相同数目的循环并且处于线性范围内的PCRTM反应中靶标DNA的经扩增产物的浓度，可能测定原始DNA混合物中特定靶标序列的相对浓度。因此，可以采用这些方法来检测在细胞中杂合缺失的ENO1或ARS序列或检测烯醇酶1编码序列的降低的总体表达。
在一些实施方案中，在凝胶分离并用溴化乙锭(ethidium bromide)染色并且在UV光下观测之后，检测或定量核酸。在一些实施方案中，如果核酸是使用完整放射性标记或荧光标记的核苷酸合成或扩增(例如，通过PCR)得到，那么在分离之后，可以接着使产物暴露于x射线胶片或在适当激发光谱下观测。
在一些实施方案中，观测是间接实现的。在分离核酸之后，使经标记的核酸与靶标序列接触。使探针偶联到发色团或放射性标记。在另一个实施方案中，使探针偶联到结合伴侣，如抗体或生物素，并且结合对的另一个成员携带可检测部分。前述内容的一个实例描述于以引用的方式并入本文中的美国专利号5,279,721中，这个专利公开了用于核酸的自动电泳和转移的装置和方法。这个装置允许在没有外部操作凝胶的情况下进行电泳和印迹并且理想地适于进行根据本发明实施方案的方法。
基因的突变可以通过杂交技术来进一步评价。Northern印迹和Southern印迹技术例如为本领域技术人员所熟知。Northern印迹和Southern印迹涉及分别使用RNA或DNA作为靶标。简单地说，使用探针来靶向已经被固定在适合的基体(常常是硝化纤维素过滤器)上的RNA或DNA物质。不同的物质应在空间上被隔离以有助于分析。这常常是通过核酸物质的凝胶电泳，接下来“印迹”到过滤器上来实现。随后，将被印迹的靶标与探针(如经标记的探针)在促进变性和再次杂交的条件下一起孵育。因为探针经过设计以与靶标进行碱基配对，所以这个探针将在复性条件下结合靶标序列的一部分。然后去除未结合的探针，并且完成检测。类似地，经标记的探针可以被用于原位杂交以检测ENO1或ARS中杂合突变的存在(或ENO1或ARS的一个拷贝的不存在)。举例来说，可以采用荧光原位杂交(FISH)。
B.检测降低的烯醇酶1蛋白质表达或活性
在一些方面，实施方案的方法涉及检测烯醇酶1蛋白质的表达或活性。举例来说，可以采用免疫检测法用来结合、纯化、去除、定量和/或在其它方面一般性地检测烯醇酶1蛋白质。可以采用根据本发明实施方案制备的抗体来检测和/或定量受试者或样品(例如，肿瘤活体组织切片)中的烯醇酶1。一些免疫检测法包括酶联免疫吸附分析法(ELISA)、放射免疫分析法(RIA)、免疫放射测定分析法、荧光免疫分析法、化学发光分析法、生物发光分析法和Western印迹法，举不胜举。各种适用的免疫检测法的步骤已经描述于科学文献中，例如，Doolittle MH和Ben-Zeev O,1999；Gulbis B和Galand P,1993；De Jager R等人,1993；和Nakamura等人,1987，其各自均以引用的方式并入本文中。
1.ELISA
如上文详述的免疫分析法，以其最简单和/或最直接的意义表示，是结合分析法。某些优选的免疫分析法是本领域中已知的各种类型的酶联免疫吸附分析法(ELISA)和/或放射免疫分析法(RIA)。使用组织切片的免疫组织化学检测也是特别适用的。
在一些实施方案中，实施方案的抗烯醇酶1抗体被固定到展现蛋白质亲和力的所选表面上，例如聚苯乙烯微量滴定板中的孔。然后，将疑似含有蛋白质抗原的测试组合物(如临床样品)添加到孔中。在结合和/或洗涤去除非特异性结合的免疫复合物之后，可以检测经结合的蛋白质抗原。检测一般通过添加另一种连接到可检测标记的抗烯醇酶1抗体来实现。这种类型的ELISA是简单的“夹心ELISA”。检测和定量也可以通过添加第二抗烯醇酶1抗体，接下来添加对第二抗体具有结合亲和力的第三抗体来实现，其中第三抗体连接到可检测标记。
在一些实施方案中，疑似含有烯醇酶1蛋白质抗原的样品被固定到孔表面上和/或然后与实施方案的抗烯醇酶1抗体接触。在结合和/或洗涤去除非特异性结合的免疫复合物之后，检测和定量经结合的抗烯醇酶1抗体。在初始抗烯醇酶1抗体连接到可检测标记的情况下，可以直接检测免疫复合物。此外，可以使用对第一抗烯醇酶1抗体具有结合亲和力的第二抗体来检测免疫复合物，其中第二抗体连接到可检测标记。
在一些实施方案中，烯醇酶1蛋白质、多肽和/或肽被固定。在一些实施方案中，ELISA涉及在检测中使用抗体竞争。在这个ELISA中，将针对烯醇酶1抗原的经标记的抗体添加到孔中，使其结合，和/或借助于其标记进行检测。未知样品中野生型或突变型烯醇酶1抗原的量然后是通过在与经涂布的孔一起孵育之前和/或期间将这个样品与针对抗原的经标记的抗体混合来测定。样品中烯醇酶1抗原的存在用以降低针对可用于结合到孔的野生型或突变型蛋白质的抗体的量并且因此减小最终信号。这也适用于检测未知样品中针对烯醇酶1抗原的抗体，其中未标记的抗体结合到经抗原涂布的孔并且也降低了可用于结合经标记的抗体的抗原的量。
与所采用的形式无关，ELISA具有某些共同特征，例如涂布、孵育和结合、洗涤去除非特异性结合的物质，以及检测经结合的免疫复合物。这些步骤为熟练的技术人员所熟知。
2.免疫组织化学
本发明实施方案的抗烯醇酶1抗体也可以与新鲜冷冻和/或福尔马林(formalin)固定、石蜡包埋的组织块联合使用，所述组织块经过制备以供免疫组织化学(IHC)研究。从这些颗粒样本制备组织块的方法已经被成功地用于各种预后因子的先前IHC研究中和/或为本领域技术人员所熟知(Brown等人,1990；Abbondanzo等人,1990；Allred等人,1990)。
简单地说，冷冻切片(例如，血管组织切片)可以通过以下方式制备：在小的塑料封壳中使50ng冷冻的“粉碎化”组织在室温下于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中再水合；通过离心使粒子沉淀；使其再悬浮于粘性包埋介质(OCT)中；将封壳倒置和/或再次通过离心沉淀；在70℃异戊烷中速冻；切割塑料封壳和/或移出冷冻的组织圆柱体；将组织圆柱体紧固在冷冻恒温的切片机夹盘上；和/或切割25-50个连续切片。
永久切片可以通过类似的方法制备，该方法涉及在塑料微量离心管中使50mg样品再水合；沉淀；再悬浮于10％福尔马林中以用于固定4小时；洗涤/沉淀；再悬浮于温热的2.5％琼脂中；沉淀；在冰水中冷却以硬化琼脂；从管中移出组织/琼脂块；将这个块浸透和/或包埋于石蜡中；和/或切割多达50个连续永久切片。
3.免疫电子显微镜检法
本发明实施方案的抗体也可以与电子显微镜检法联合使用以鉴别细胞内组织组分。简单地说，电子高密度标记直接或间接地偶联到抗烯醇酶1抗体。根据实施方案的电子高密度标记的实例是铁蛋白和金。电子高密度标记吸收电子并且可以用电子显微镜来观测。
4.免疫检测试剂盒
在一些方面，本发明的实施方案涉及免疫检测试剂盒，其与上文所描述的免疫检测法一起使用。由于抗烯醇酶1抗体一般被用来检测这些抗原，因此抗体将优选地包括在试剂盒中。然而，可以提供包括这两种组分的试剂盒。免疫检测试剂盒将因此在适合的容器构件中包含结合到蛋白质、多肽和/或肽的第一抗体(例如，抗烯醇酶1抗体)，和/或任选的免疫检测试剂，和/或其它任选的经纯化或重组蛋白质、多肽和/或肽。
在一些实施方案中，将使用单克隆抗体。在某些实施方案中，结合到抗原蛋白质、多肽和/或肽的第一抗体可以预先结合到固体支撑物，如柱状基体和/或微量滴定板的孔。
试剂盒的免疫检测试剂可以采用多种形式中的任一种，包括那些与给定抗体缔合和/或连接到给定抗体的可检测标记。还涵盖了与二级结合配体缔合和/或附着到二级结合配体的可检测标记。示例性的二级配体是那些对第一抗体具有结合亲和力的二级抗体。
用于本发明试剂盒中的其它适合的免疫检测试剂包括双组分试剂，其包含对第一抗体具有结合亲和力的二级抗体，连同对第二抗体具有结合亲和力的第三抗体，第三抗体连接到可检测标记。如上文所述，许多示例性的标记在本领域中是已知的和/或所有这些标记都可以结合本发明的实施方案而采用。
根据本发明实施方案的试剂盒可以进一步包含烯醇酶1抗原的经适当等分的组合物，其经标记和/或未经标记，同样可以被用来制备检测分析法的标准曲线。所提供的试剂盒可以含有抗体-标记偶联物，其呈完全偶联的形式、呈中间物的形式，和/或作为有待通过试剂盒的使用者进行偶联的独立部分。试剂盒的组分可以被封装在水介质中和/或呈冻干的形式。
试剂盒的容器构件将一般包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器和/或其它的容器构件，抗体可以被放到里面和/或优选地被适当等分。本发明实施方案的试剂盒也将典型地包括用于容纳抗体、抗原和/或任何其它试剂容器的构件，这个构件处于封闭限制状态以供商业销售。这些容器可以包括注射和/或吹塑成型的塑料容器，所想要的小瓶被保留在里面。
V.抑制剂
抑制剂是降低必需管家基因的冗余的同源物的表达或活性的化合物。表达或活性的降低是用必需管家基因的冗余的同源物的生物功能的降低来定义的。抑制剂在本领域中是已知的或使用本文所描述的方法来鉴别。管家基因的活性是通过本领域中已知的方法来测量。
适用于本发明的方法中的示例性的抑制剂描述于表1中。其它适合的抑制剂可以由本领域技术人员通过已知方法来容易地鉴别。
举例来说，当管家基因是烯醇酶时，抑制剂是膦酰基乙酰羟肟酸盐。当管家基因是己糖-6-磷酸脱氢酶(H6PD)并且冗余的同源物是葡萄糖-6脱氢酶(G6PD)时，抑制剂可以包含例如脱氢表雄酮。
当管家基因是烟酰胺核苷酸腺苷酰转移酶1(NMNAT1)并且冗余的同源物是烟酰胺核苷酸腺苷酰转移酶2(NMNAT2)或烟酰胺核苷酸腺苷酰转移酶3(NMNAT3)时，抑制剂是例如Np3AD、Np4As和Nap4AD。当管家基因是顺乌头酸酶1(ACO1)并且冗余的同源物是顺乌头酸酶2(ACO2)或顺乌头酸酶3(ACO3)时，抑制剂是例如氟柠檬酸盐。当管家基因是泛酸激酶1(PANK1)并且冗余的同源物是泛酸激酶3(PANK3)时，抑制剂是例如胡绊酸盐。
A.糖酵解抑制剂
本发明的实施方案涉及组合物和方法，其目的在于用糖酵解的抑制剂有效地治疗癌细胞。举例来说，糖酵解抑制剂可以是丙酮酸激酶(例如，PKLR1或PKM2)、烯醇酶(例如，ENO1、ENO2或ENO3)、磷酸甘油酸变位酶(例如，PGM1、PGM2、PGM2L1、PGM3或PGM5)、磷酸甘油酸激酶(例如，PGK1或PGK2)、磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、磷酸丙糖异构酶(TPI)、双磷酸果糖醛缩酶(例如，Aldoa、Aldob或Aldoc)、磷酸果糖激酶(PFK1)、磷酸葡萄糖异构酶(GPI)或己糖激酶(例如，HK1、HK2或HK3)的抑制剂。
在一些方面，糖酵解抑制剂是核酸或多肽抑制剂。举例来说，抑制剂可以是结合到糖酵解酶的抗体或其片段，该糖酵解酶如丙酮酸激酶、烯醇酶、磷酸甘油酸变位酶、磷酸甘油酸激酶、GAPDH、TPI、双磷酸果糖醛缩酶、磷酸果糖激酶、GPI或己糖激酶。在其它方面，抑制剂可以是结合到编码糖酵解酶的核酸分子的全部或一部分的抑制性核酸。举例来说，抑制性核酸可以是与编码PKLR1、PKM2、ENO1、ENO2、ENO3、PGM1、PGM2、PGM2L1、PGM3、PGM5、PGK1、PGK2、GAPDH、TPI、Aldoa、Aldob、Aldoc、PFK1、GPI、HK1、HK2或HK3的mRNA的全部或一部分互补的RNA。
在又其它方面，糖酵解抑制剂是小分子抑制剂或其前药。举例来说，小分子抑制剂可以是丙酮酸激酶、烯醇酶、磷酸甘油酸变位酶、磷酸甘油酸激酶、GAPDH、TPI、双磷酸果糖醛缩酶、磷酸果糖激酶、GPI或己糖激酶的抑制剂。示例性的糖酵解抑制剂化合物包括(但不限于)2-脱氧葡萄糖、6-氨基烟酰胺、二磷酸丁糖、康宁吉克酸和MJE3。其它示例性的糖酵解抑制剂包括与丙酮酸盐有关的组合物。举例来说，丙酮酸盐衍生物描述于美国专利申请公开US 2003/0013656、US 2003/0013847、US 2003/0013657和US 2003/0013846中。
在一些优选的方面，糖酵解抑制剂是烯醇酶抑制剂。这些烯醇酶抑制剂的实例包括(但不限于)D-丙醇二酸半醛磷酸盐；3-氨基烯醇丙酮酸-2-磷酸盐；膦酰基乙酰羟肟酸盐(PhAH)；2-氟-2-膦酰基乙酰羟肟酸盐；(3-羟基-2-硝基丙基)膦酸盐；(硝基乙基)膦酸盐；d-(膦酰基乙基)硝酸盐、氟化物以及其前药和衍生物。
B.ARS抑制剂
在某些实施方案中，本发明涉及ARS抑制剂和其施用，以供治疗具有一个或多个ARS基因的杂合失活的癌症。在一些方面，ARS抑制剂优先抑制真核的氨酰基tRNA。举例来说，ARS抑制剂可以是抑制脯氨酰基tRNA合成酶、半胱氨酰基tRNA合成酶、甘氨酰基tRNA合成酶、丙氨酰基tRNA合成酶、天冬氨酰基tRNA合成酶、谷氨酰基tRNA合成酶、天冬酰胺酰基tRNA合成酶、谷氨酰胺酰基tRNA合成酶、丝氨酰基tRNA合成酶、精氨酰基tRNA合成酶、组氨酰基tRNA合成酶、酪氨酰基tRNA合成酶或谷氨酰基-脯氨酰基-tRNA合成酶的药剂(例如，卤夫酮)。ARS抑制剂的实例包括(但不限于)TARS抑制剂疏螺体素，以及抗微生物ARS抑制剂(和其衍生物)，例如莫匹罗星(Mupirocin)；SB-234764；吲哚霉素(Indolmycin)；AN-2690；CB-432；艾芬净喷(Icofungipen)；REP8839；顺戊霉素(Cispentacin)；创新霉素(Chuangxinmycin)；小菌素C(Microcin C)(或经过处理的小菌素C)；普米多辛(Phosmidosin)；阿斯卡霉素(Ascamycin)；土壤杆菌素(Agrocin)；SB-217452；或白霉素(Albomycin)。可以根据本发明实施方案的方法使用的额外的抑制剂提供于以引用的方式并入本文中的美国专利公开20120058133中。
C.前药
本发明的化合物也可以依前药的形式存在。因为已知前药增强医药品的众多想要的品质(例如，溶解度、生物利用度、制造等)，所以在本发明的一些方法中所采用的化合物可能在必要时以前药的形式递送。一般来说，这些前药将是实施方案的糖酵解抑制剂的功能衍生物，其可以在体内容易地转化成活性糖酵解抑制剂。用于选择和制备适合的前药衍生物的常规程序描述于例如"Design of Prodrugs",H.Bundgaard编,Elsevier,1985；Huttunen等人,2011；和Hsieh等人,2009中，其各自均以引用的方式整体并入本文中。
前药可以是生物活性的糖酵解抑制剂(“母药”或“母分子”)的药理学上无活性的衍生物，其需要在体内转化以释放活性药物，并且具有优于母药分子的改进的递送特性。体内转化可以是例如某种代谢过程的结果，例如羧酸酯、磷酸酯或硫酸酯的化学水解或酶水解，或易受影响的官能团的还原或氧化。因此，实施方案中所采用的化合物的前药可以通过以一定方式对化合物中所存在的官能团进行修饰来制备，这种方式使得在常规操作中或在体内使这些修饰裂解成母化合物。前药包括例如羟基、氨基或羧基键结到任何基团的本文所描述的化合物，当将前药施用给受试者时，这个任何基团分别裂解形成羟基、氨基或羧酸。因此，本发明涵盖本发明的化合物的前药以及递送前药的方法。
VI.组合疗法
为了增加本发明实施方案的糖酵解抑制剂的有效性，可能需要将这些组合物与有效治疗癌症的其它药剂组合。作为非限制性实例，癌症的治疗可以用糖酵解抑制剂连同其它抗癌剂一起来实施。“抗癌”剂能够负面地影响受试者的癌症，例如，通过杀死癌细胞、诱导癌细胞凋亡、减小癌细胞的生长速率、降低转移的发生率或数目、减小肿瘤尺寸、抑制肿瘤生长、减少向肿瘤或癌细胞的血液供应、促进对抗癌细胞或肿瘤的免疫反应、防止或抑制癌症的进展，或增加患有癌症的受试者的寿命。更一般来说，这些其它组合物将以有效杀死细胞或抑制细胞增殖的组合量提供。这可以通过使细胞接触(或向受试者施用)包括两种药剂的单一组合物或药理学配制品来实现，或通过使细胞同时接触两种不同的组合物或配制品来实现，其中一种组合物包括糖酵解抑制剂并且另一种组合物包括第二药剂。
使用糖酵解抑制剂的治疗可以在另一种药剂或治疗之前或之后，间隔时间在几分钟到几周的范围内。在另一种药剂和糖酵解抑制剂被独立地施用于细胞的实施方案中，将一般要确保相当长的时间段在每次递送的时间之间不会终止，以使得这种药剂和糖酵解抑制剂将仍然能够对细胞发挥有利组合的作用。在这些情况下，预期可以使细胞与两种模态在彼此的约12-24小时内并且更优选地在彼此的约6-12小时内接触。在一些情况下，可能需要显著延长治疗的时间段，其中在各自的施用之间流逝了几天(例如，2、3、4、5、6或7天)到几周(例如，1、2、3、4、5、6、7或8周)。
可以采用各种组合，其中糖酵解抑制剂疗法是“A”，并且二级药剂或治疗，如放射疗法、化学疗法或线粒体电子转运抑制剂，是“B”：
在某些实施方案中，向患者施用本发明实施方案的糖酵解抑制剂疗法将遵循用于施用化学治疗剂的一般方案，将抑制剂的毒性(如果有的话)考虑在内。预期治疗周期将在必要时重复进行。也预期各种标准疗法以及手术干预可以与所描述的过度增殖细胞疗法组合施用。
A.化学疗法
癌症疗法还包括多种组合疗法。在一些方面，实施方案的糖酵解抑制剂与化学治疗剂联合施用(或配制)。组合化学疗法包括例如烷化剂，如噻替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclosphosphamide)；烷基磺酸酯，如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类，如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙撑亚胺类(ethylenimine)和甲基蜜胺类(methylamelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物拓扑替康(topotecan))；苔藓抑素(bryostatin)；卡莱抑素(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；隐藻素类(cryptophycin)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他丁(dolastatin)；度卡霉素(duocarmycin)(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类，如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼氮芥(prednimustine)、曲洛磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；硝基脲类，如卡莫司汀(carmustine)、氯脲霉素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素类，如烯二炔抗生素(例如，加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；双膦酸盐类，如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authrarnycin)、氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星(morpholino-doxorubicin)、氰基吗啉代多柔比星(cyanomorpholino-doxorubicin)、2-吡咯代多柔比星(2-pyrrolino-doxorubicin)和脱氧多柔比星(deoxydoxorubicin))、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、依达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalarnycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培来霉素(peplomycin)、甲基丝裂霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，如甲氨喋呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸(denopterin)、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮杂尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、多西氟尿啶(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，如卡鲁睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolonepropionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，如米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；阿莫司汀(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elformithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；类美登素(maytansinoid)，如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；苯来美特(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinicacid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多糖复合物；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐糖(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(richothecene)(尤其是T-2毒素、维拉菌素A(verracurinA)、杆孢菌素A(roridin A)和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托辛(gacytosine)；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺；类紫杉醇(taxoid)，例如紫杉醇(paclitaxel)和多西紫杉醇吉西他滨(docetaxel gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；铂配位络合物，如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱(vincristine)；长春瑞宾(vinorelbine)；诺安托(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基喋呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(例如，CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维A酸(retinoid)，如视黄酸(retinoicacid)；卡培他滨(capecitabine)；卡铂、丙卡巴肼、普卡霉素(plicomycin)、吉西他滨(gemcitabien)、诺维本(navelbine)、法尼基蛋白转移酶抑制剂、反铂(transplatinum)，以及上述任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在某些实施方案中，本文所提供的组合物可以与吉非替尼(gefitinib)组合使用。在其它实施方案中，本发明的实施方案可以与格列卫(Gleevac)组合实施(例如，可以向患者每天施用约400到约800毫克的格列卫)。在某些实施方案中，一种或多种化学治疗剂可以与本文所提供的组合物组合使用。
B.放射疗法
对于癌症疗法有效并且已经得到广泛使用的其它因子包括通常被称为γ射线、X射线和/或放射性同位素向肿瘤细胞的定向递送的因子。还涵盖其它形式的DNA损伤因子，如微波和UV照射。最有可能的是，所有这些因子都实现了对DNA、对DNA前体、对DNA的复制和修复以及对染色体的组装和维护的大范围损伤。X射线的剂量范围在50到200伦琴的日剂量(对于较长的时间段，3到4周)到2000到6000伦琴的单次剂量的范围内。放射性同位素的剂量范围广泛变化，并且取决于同位素的半衰期、所发出的放射线的强度和类型以及由赘生性细胞的吸收。
术语“接触”和“暴露”当应用于细胞时，在本文中被用来描述将治疗性组合物和化学治疗剂或放射治疗剂递送到靶细胞或放在直接毗邻靶细胞的过程。为了实现细胞杀死或停滞，将两种药剂以有效杀死细胞或防止其分裂的组合量递送到细胞。
C.免疫疗法
免疫治疗剂一般依赖于使用免疫效应细胞和分子来靶向和破坏癌细胞。免疫效应子可以是例如特异性地针对肿瘤细胞表面上的某种标志的抗体。单独的抗体可以充当疗法的效应子，或其可以募集其它细胞以实际上实现细胞杀死。抗体还可以偶联到药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒素A链(ricin A chain)、霍乱毒素、百日咳毒素等)并且仅仅充当靶向剂。或者，效应子可以是携带与肿瘤细胞靶标直接或间接地相互作用的表面分子的淋巴细胞。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。
因此，免疫疗法可以用作组合疗法的一部分，与本发明实施方案的糖酵解抑制剂疗法联合。下文论述了用于组合疗法的一般方法。一般来说，肿瘤细胞必须带有适于靶向作用，即，不存在于大多数其它细胞上的某种标志。存在许多肿瘤标志，并且在本发明实施方案的情形中这些肿瘤标志中的任一者可以适合于靶向。常见的肿瘤标志包括癌胚抗原、前列腺特异性抗原、泌尿系统肿瘤相关的抗原、胚胎抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸化的路易斯抗原(Sialyl Lewis Antigen)、MucA、MucB、PLAP、雌激素受体、层粘连蛋白受体(laminin receptor)、erb B和p155。
D.基因疗法
在再另一个实施方案中，二级治疗是基因疗法，其中在治疗性组合物之前、之后或同时施用治疗性多核苷酸。用于表达基因产物的病毒载体在本领域中是熟知的，并且包括真核表达系统，如腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、慢病毒、痘病毒(包括牛痘病毒)和乳头瘤病毒(包括SV40)。或者，表达构建体的施用可以用基于脂质的载体，如脂质体或DOTAP:胆固醇囊泡来实现。所有这些方法在本领域中是熟知的(参见例如Sambrook等人,1989；Ausubel等人,1998；Ausubel,1996)。
编码以下基因产物之一的载体的递送将对靶组织具有组合的抗过度增殖作用。多种蛋白质涵盖于本发明的实施方案内，下文描述了其中一些蛋白质。
1.细胞增殖的抑制剂
如上文所述，肿瘤抑癌基因发挥功能以抑制过度细胞增殖。这些基因的失活破坏了其抑制活性，从而使得增殖上调。
可以根据本发明实施方案用作二级治疗的基因包括p53、p16、Rb、APC、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、zac1、p73、VHL、MMAC1/PTEN、DBCCR-1、FCC、rsk-3、p27、p27/p16融合体、p21/p27融合体、抗血栓形成基因(例如，COX-1、TFPI)、PGS、Dp、E2F、ras、myc、neu、raf、erb、fms、trk、ret、gsp、hst、abl、E1A、p300、血管生成中所涉及的基因(例如，VEGF、FGF、血小板反应蛋白(thrombospondin)、BAI-1、GDAIF或其受体)、MCC以及表IV中所列的其它基因。
2.程序性细胞死亡的调控子
细胞凋亡或程序性细胞死亡是正常胚胎发育的基本过程，从而维持成体组织中的动态平衡并且抑制癌发生(Kerr等人,1972)。已经展示，Bcl-2蛋白质家族和ICE样蛋白酶是其它系统中的细胞凋亡的重要调控子和效应子。所发现的与滤泡性淋巴瘤相关联的Bcl-2蛋白质在响应于不同的细胞凋亡刺激物来控制细胞凋亡和增强细胞存活方面起突出作用(Bakhshi等人,1985；Cleary和Sklar,1985；Cleary等人,1986；Tsujimoto等人,1985；Tsujimoto和Croce,1986)。进化上保守的Bcl-2蛋白质现在被识别为相关蛋白质家族的成员，其可以被归类为死亡促效剂或死亡拮抗剂。
继Bcl-2的发现之后，已经显示，Bcl-2用以抑制由多种刺激物触发的细胞死亡。而且，现在显而易见，存在Bcl-2细胞死亡调控蛋白质的家族，这些蛋白质共享有共同的结构和序列同源性。已经显示，这些不同的家族成员具有与Bcl-2类似的功能(例如，BclXL、BclW、BclS、Mcl-1、A1、Bfl-1)或抵消Bcl-2功能并且促进细胞死亡(例如，Bax、Bak、Bik、Bim、Bid、Bad、Harakiri)。
E.手术
约60％的患有癌症的人将经历某种类型的手术，其包括预防性、诊断性或分期的、治愈性和姑息性手术。治愈性手术是可以与其它疗法联合使用的癌症治疗，这些疗法如本文所提供的治疗、化学疗法、放射疗法、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或替代疗法。
治愈性手术包括切除术，其中实体上去除、切除和/或破坏癌组织的全部或一部分。肿瘤切除术指的是实体上去除肿瘤的至少一部分。除了肿瘤切除术之外，手术治疗还包括激光手术、冷冻手术、电手术和显微镜控制的手术(莫氏手术(Mohs'surgery))。进一步预期，本发明的实施方案可以与去除浅表癌、初癌或附带量的正常组织联合使用。
在切除癌细胞、组织或肿瘤的一部分或全部之后，在体内可能形成空腔。治疗可以通过灌注、直接注射或向区域局部施用额外的抗癌疗法来实现。这种治疗可以例如每隔1、2、3、4、5、6或7天，或每隔1、2、3、4和5周，或每隔1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月重复进行。这些治疗也可以具有不同的剂量。
F.其它药剂
预期其它药剂可以与本文所提供的组合物组合使用以改进治疗的治疗性功效。这些额外的药剂包括免疫调节剂、影响细胞表面受体的上调和GAP连接的药剂、细胞抑制剂和分化剂、细胞粘着抑制剂，或增加过度增殖细胞对细胞凋亡诱导剂的敏感度的药剂。免疫调节剂包括肿瘤坏死因子；干扰素α、β和γ；IL-2和其它细胞因子；F42K和其它细胞因子类似物；或MIP-1、MIP-1β、MCP-1、RANTES和其它趋化因子。进一步预期，细胞表面受体或其配体，如Fas/Fas配体、DR4或DR5/TRAIL的上调将通过确立对过度增殖细胞的自分泌或旁分泌作用来加强本文所提供的组合物的细胞凋亡诱导能力。通过提高GAP连接数增加细胞间信号传导将会增加对邻近的过度增殖细胞群体的抗过度增殖作用。在其它实施方案中，细胞抑制剂或分化剂可以与本文所提供的组合物组合使用以改进治疗的抗过度增殖功效。预期细胞粘着抑制剂改进本发明的功效。细胞粘着抑制剂的实例是粘着斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐他汀(Lovastatin)。进一步预期，增加过度增殖细胞对细胞凋亡的敏感度的其它药剂，如抗体c225，可以与本文所提供的组合物组合使用以改进治疗功效。
在某些实施方案中，激素疗法也可以与本发明的实施方案联合使用或与先前所描述的任何其它癌症疗法组合使用。激素的使用可以用于治疗某些癌症，如乳癌、前列腺癌、卵巢癌或子宫颈癌，以降低某些激素(如睾酮或雌激素)的水平或阻断其作用。这种治疗常常与至少一种其它癌症疗法组合使用，作为治疗选项或用来降低转移的风险。
VII.治疗方法
通过使细胞与含有抑制剂的组合物接触来抑制(例如减少)细胞生长或诱导细胞死亡。抑制细胞生长意指细胞与没有暴露于组合物的细胞相比以更低的速率增殖或具有降低的生存力。细胞生长是通过本领域中已知的方法来测量，如结晶紫、锥虫蓝，或测量ATP、NADH、Capase、LDH或MTT。
使细胞与抑制剂直接接触。或者，全身施用抑制剂。抑制剂以足以减少(例如，抑制)细胞增殖或诱导细胞死亡的量施用。
任选地，细胞与化学治疗性化合物接触。具体地说，化学治疗性化合物靶向管家基因的代谢路径。举例来说，化学治疗性化合物靶向DNA动态平衡。示例性的化学治疗性化合物包括吉西他滨。
细胞是肿瘤细胞，如癌瘤、腺癌、胚细胞瘤、白血病、骨髓瘤或肉瘤。具体地说，癌症是成胶质细胞瘤。
在多个方面，细胞具有一个或多个管家基因的纯合缺失，这一个或多个管家基因具有冗余的同源物。纯合缺失是通过本领域中已知的方法来鉴别。
方法适用于减轻多种癌症的症状。含有具有冗余的同源物的管家基因的纯合缺失的任何癌症都可以经受本发明方法的治疗。在一些方面，受试者罹患成胶质细胞瘤。
如果治疗产生临床效益，例如，受试者中肿瘤的尺寸、盛行率或转移潜力减小，那么治疗是有效的。当预防性地施用治疗时，“有效”意指治疗延迟或防止肿瘤形成，或预防或减轻肿瘤的临床症状的症状。有效性是与诊断或治疗特定肿瘤类型的任何已知方法相结合来测定。
本发明中还包括了测定通过本发明的治疗方法治疗的功效的方法。治疗的有效性是通过测量来自受试者的样品中管家基因的代谢路径的一个或多个代谢物的水平来测定。使细胞中的路径停止将使得在管家基因产生之前的代谢物积聚。代谢物的这种积聚指示出治疗是有效的。
举例来说，在抑制烯醇酶2之后，细胞中的糖酵解路径停止将使得在烯醇酶产物之前的代谢物(最紧邻的是2-磷酸甘油酸盐)积聚。预期经有效治疗的肿瘤以一定速率在血流中释放这些代谢物，这种速率与烯醇酶抑制有效性的速率相关。测量这些代谢物的血清水平将允许我们监测肿瘤靶向有效性。我们还将进行经特定抑制剂治疗的细胞系的代谢型态分析，以确定哪些额外的代谢物积累并且可能最适用于血清型态分析或进一步精制处理。
VIII.治疗性施用
本发明包括向受试者施用包含抑制剂的组合物。
治疗性化合物的有效量优选地为约0.1mg/kg到约150mg/kg。如本领域技术人员所识别，有效剂量视施用途径、赋形剂的使用以及与其它治疗性治疗的共同施用而变化，这些治疗性治疗包括使用其它抗增殖剂或治疗剂用于治疗、预防或减轻癌症的症状。治疗方案是通过使用标准方法鉴别罹患癌症的哺乳动物(例如人患者)来进行，这种癌症具有必需管家基因的纯合缺失。
使用本领域中已知的方法将药物化合物施用给这类个体。化合物优选地经口、经直肠、经鼻、局部地或肠道外施用，肠道外如皮下、腹膜内、肌肉内和静脉内。抑制剂任选地作为治疗性药物的混合物的组分来配制以治疗癌症。适合于肠道外施用的配制品的实例包括等渗盐水溶液、5％葡萄糖溶液或另一种标准的药学上可接受的赋形剂中的活性剂的水溶液。如PVP或环糊精等标准增溶剂也被用作医药赋形剂用于递送治疗性化合物。
利用常规的方法将本文所描述的治疗性化合物配制成用于其它施用途径的组合物。举例来说，在胶囊或片剂中配制治疗性化合物以供经口施用。胶囊可以含有任何标准的药学上可接受的材料，如明胶或纤维素。片剂可以根据常规的程序通过压制治疗性化合物与固体载剂和润滑剂的混合物来配制。固体载剂的实例包括淀粉和糖膨润土。化合物以硬壳片剂或胶囊的形式施用，这种片剂或胶囊含有粘合剂，例如乳糖或甘露糖醇，常规的填充剂，以及制片剂。其它配制品包括软膏、栓剂、糊剂、喷雾、贴片、乳膏、凝胶、可再吸收海绵，或泡沫。这些配制品是使用本领域中熟知的方法来产生。
治疗性化合物在这种化合物与受影响的组织直接接触后即有效。因此，局部地施用化合物。或者，全身施用治疗性化合物。举例来说，通过吸入施用化合物。化合物以气雾剂喷雾的形式从含有适合的推进剂(例如气体，如二氧化碳)的加压容器或分配器或从喷雾器递送。
另外，化合物可以通过植入固体或可再吸收的基体(直接植入到器官中或皮下植入)来施用，这种基体缓慢地释放化合物到受试者的邻近和周围的组织中。
IX.实施例
包括以下实施例以展示本发明的优选实施方案。本领域技术人员应了解，后续的实施例中所公开的技术代表本发明者所发现的在实施本发明中发挥功能良好的技术，并且因此可以被视为构成实施本发明的优选模式。然而，本领域技术人员鉴于本公开应了解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下许多变化可以在所公开的特定实施方案中作出并且仍然获得同样或类似的结果。
实施例1-靶向具有纯合缺失的癌细胞中的管家基因引起癌细胞死亡
在癌症具有管家基因的纯合缺失并且管家基因具有功能上冗余的同源物的情况下，通过向受试者施用或使细胞接触冗余的同源物的抑制剂来诱导癌细胞增殖和或死亡，这种抑制剂的量足以抑制冗余的同源物的活性。
一般方法
细胞培养
使用已知的方法培养具有纯合缺失的细胞系。(1p36出于比较目的，使细胞系U87、LN319、SW1088、U343、U373和A1207在相同条件下生长。
管家基因表达的shRNA敲低
制备靶向管家基因的发夹，并且针对其降低管家基因的蛋白质水平的能力进行筛选。
使用制造商所提供的方案将GIPZ载体中的发夹克隆到TRIPZ载体中。TRIPZ载体是具有红色荧光蛋白报道体的强力霉素诱导性系统，这种报道体只有在强力霉素诱导后才表达。通过遵循标准方案瞬时转染293T细胞来产生重组慢病毒。简单地说，使用(Roche,Indianapolis,IN)将72μg shRNA质粒、54μg Delta 8.9和18μg VSVG质粒转染到涂于245mm2培养皿中的293T细胞中。转染后72小时收集病毒上清液，通过以23,000rpm离心来浓缩，并且再悬浮于细胞生长培养基中。为了转导，将病毒溶液添加到含有4μg/mL聚凝胺(polybrene)的细胞培养基中；感染后48小时，使用2μg/mL嘌呤霉素选择细胞，并且通过western印迹法针对管家基因敲低进行测试。
产生shRNA抗性管家基因构建体
通过过表达shRNA抗性形式的管家基因来进行敲低细胞中的管家基因的表型效应的补救。简单地说，根据QuickChange试剂盒(Stratagene,La Jolla,CA,USA)使用定点诱变，将6个沉默突变引入到shRNA所靶向的管家基因编码区中。将shRNA抗性管家基因编码区克隆到pHAGE-CMV慢病毒载体中，并且在存在或不存在强力霉素的情况下在携带shRNA的细胞系中过表达。作为对照，用携带GFP基因的慢病毒载体感染相同的细胞系。
增殖分析法
经由结晶紫染色或使用Promega Cell Titer增殖试剂盒(Roche,Indianapolis,IN)来分析经shRNA或PhAH处理的细胞系的细胞生长。对于结晶紫分析法来说，在每个时间点将10,000个细胞接种于6孔板中。在指定的时间点，将细胞用10％福尔马林固定并且用结晶紫溶液染色1小时。使用10％乙酸溶液进行染料萃取，并且在590nm下读取吸光度。如制造商所指示来进行Cell Titer实验。在每个时间点将1000个细胞/孔涂于96孔板中，并且每隔24小时获取发光读数。所有实验都一式三份进行。
管家基因活性分析
使用本领域中已知的方法来测量管家基因的活性。
Western印迹法
在2次PBS洗涤之后，在缓缓振荡下将细胞于RIPA缓冲液中孵育15分钟。然后收集裂解物，进行声波处理，并且在4℃下以14000RPM离心10分钟。如先前(Maser等人,2007)一样进行SDS-PAGE和Western印迹法。
实施例2-ENO2活性的抑制诱导具有ENO1纯合缺失的细胞系的细胞死亡
一般方法
细胞培养
获得细胞系D423-MG(1p36纯合缺失，包括ENO1)和D502-MG(1p36纯合缺失，但不包括ENO1)，并且在含20％FBS的DMEM培养基中培养(Duncan等人,2010；D423和D502在Duncan等人中被称作H423和H502，但在Sanger数据库中被称作D423-MG和D502-MG，这里采用这种命名)。出于比较目的，使细胞系U87、LN319、SW1088、U343、U373和A1207在相同条件下生长。使获自ScienCell(Carlsbad,CA)的正常胚胎人星形细胞在制造商所提供的培养基中生长。
ENO2表达的shRNA敲低
筛选靶向烯醇酶2的22个发夹，并且4个独立的发夹发现到引起蛋白质水平降低>50％。这些发夹中的两者在pLKO.1载体(ShENO2-1和shENO2-2)中，并且其余两者在Expression Arrest GIPZ(shENO2-3)和TRIPZ(shENO2-4)shRNAmir载体(OpenBiosystems,Huntsville,AL)中。使用制造商所提供的方案将GIPZ载体中的发夹克隆到TRIPZ载体中。TRIPZ载体是具有红色荧光蛋白报道体的强力霉素诱导性系统，这种报道体只有在强力霉素诱导后才表达。通过遵循标准方案瞬时转染293T细胞来产生重组慢病毒。简单地说，使用(Roche,Indianapolis,IN)将72μg shRNA质粒、54μg Delta8.9和18μg VSVG质粒转染到涂于245mm2培养皿中的293T细胞中。转染后72小时收集病毒上清液，通过以23,000rpm离心来浓缩，并且再悬浮于细胞生长培养基中。为了转导，将病毒溶液添加到含有4μg/mL聚凝胺的细胞培养基中；感染后48小时，使用2μg/mL嘌呤霉素选择细胞，并且通过western印迹法针对ENO2敲低进行测试。
产生shRNA抗性ENO2构建体
通过过表达shRNA抗性形式的ENO2来进行敲低细胞系D423-MG中的ENO2的表型效应的补救。简单地说，根据QuickChange试剂盒(Stratagene,La Jolla,CA,USA)使用定点诱变，将6个沉默突变引入到shENO2-4所靶向的ENO2编码区中。将shRNA抗性ENO2编码区克隆到pHAGE-CMV慢病毒载体中，并且在存在或不存在强力霉素的情况下在携带shENO2-4的D423-MG细胞系中过表达。作为对照，用携带GFP基因的慢病毒载体感染相同的细胞系。
增殖分析法
经由结晶紫染色或使用Promega Cell Titer增殖试剂盒(Roche,Indianapolis,IN)来分析经shRNA或PhAH处理的细胞系的细胞生长。对于结晶紫分析法来说，在每个时间点将10,000个细胞接种于6孔板中。在指定的时间点，将细胞用10％福尔马林固定并且用结晶紫溶液染色1小时。使用10％乙酸溶液进行染料萃取，并且在590nm下读取吸光度。如制造商所指示来进行Cell Tite实验。在每个时间点将1000个细胞/孔涂于96孔板中，并且每隔24小时获取发光读数。所有实验都一式三份进行。
软琼脂集落形成分析法
在6孔板中一式两份或一式三份进行锚定非依赖性生长分析法。将每孔104个指定细胞接种于含有0.4％低熔点琼脂糖的DMEM+10％FBS中，在底层琼脂的顶部含有1％低熔点琼脂糖DMEM+10％FBS。14-21天后，将集落用碘硝基氯化四氮唑(iodonitrotetrazoliumchloride)(Sigma-Aldrich)染色并且进行计数。
正位肿瘤发生分析法
如先前所描述(Zheng等人,2008中)，进行D423-MG细胞的注射。将6-12周龄的SCID小鼠(Charles River)放到配备有Z轴(Stoelting)的立体定位装置中。使用牙钻在位于前囱前面0.5mm和侧面3.0mm处在颅骨中钻孔。使用具有未斜切的30号针的10-μl汉密尔顿注射器(Hamilton syringe)将汉克斯缓冲盐溶液(Hanks Buffered Salt Solution)中的十万个细胞注射到位于大脑表面下方3mm处的右尾状核中。使用9-mm自动缝合夹镊(AutoclipApplier)将头皮闭合。每日追踪动物的神经缺陷的发展。
每日追踪动物的神经缺陷的发展。所有小鼠实验都是在哈佛大学和达纳-法伯癌症研究所的机构动物照护和使用委员会(Harvard and Dana-Farber Cancer InstituteInstitutional Animal Care and Use Committee)的批准下进行。
烯醇酶活性分析法
如先前Joseph等人,1996中所描述，在丙酮酸激酶-乳酸脱氢酶偶合分析法中在NADH氧化之后测量烯醇酶活性。简单地说，使细胞在20mM Tris HCL、1mM EDTA和1mMβ-巯基乙醇(pH 7.4)中裂解，并且使用polytron均化器均化三次历时10秒的时段，接下来进行声波处理。通过分光光度法用340nm下的吸光度或通过荧光法用340nm下的激发和460nm下的发射测量NADH的氧化来记录烯醇酶活性。
Western印迹法
在2次PBS洗涤之后，在缓缓振荡下将细胞于RIPA缓冲液中孵育15分钟。然后收集裂解物，进行声波处理，并且在4℃下以14,000RPM离心10分钟。如先前Maser等人,2007一样进行SDS-PAGE和Western印迹法。使用以下抗体：烯醇酶1CST#3810；烯醇酶2#9536；来自Cell signaling Technologies(Danvers,MA)的GAPDH CST#3683；以及来自Sigma-Aldrich(St Louis,MO)的粘着斑蛋白(Vinculin)。
抑制剂研究
遵循Anderson等人,1984的方案，通过TCRS LLC(Bristol,PA)定制合成膦酰基乙酰羟肟酸锂盐(PhAH)。通过NMR验证结构和纯度。将PhAH以50mM储备液形式溶解于PBS中，并且在-80℃下冷冻储存直到使用为止。考虑到化合物的不稳定性，每隔5天更换培养基，并且与新鲜的培养基一起添加新鲜的抑制剂。雷帕霉素(rapamycin)、索拉非尼、拉帕替尼和PHA665752分别获自LC Labs(Woburn,MA)和Tocris(Ellisville,MO)。
结果
TCGA Agilent SNP阵列数据和Affymetrix阵列CGH数据的数据库分析(TheCancer Genome Atlas Research Network,2008)揭示了具有ENO1纯合缺失的5/359GBM样品；其它的基因组数据集显示了ENO1纯合缺失的频率高达5％16、19、20。基因表达分析显示了这些样品中几乎完全缺乏烯醇酶1表达(图1b、图18)。GBM细胞系D423-MG20被鉴别出具有跨越CAMTA1、VAMP3、PER3、UTS2、TNFRSF9、PARK7、ERRFI1、SLC45A1、RERE、ENO1、CA6、SLC2A5、GPR157、MIR34A、H6PD、SPSB1和SLC25A33基因的1p36.23纯合缺失。第二个GBM细胞系D502-MG也发生这个基因座的纯合缺失，但留下贯穿SLC25A33基因的完整ENO1(图1c)。这些细胞系的Western印迹分析显示了D423-MG中烯醇酶1蛋白质的损失和烯醇酶2的正常表达以及D502-MG和所测试的所有其它神经胶质/神经胶质瘤细胞系中两种蛋白质的存在(图1d)。
这两个细胞系连同其它ENO1完整对照(U87、A1207、LN319)一起被用来评价在野生型或裸ENO1情形中shRNA介导的烯醇酶2敲低的影响。使用强力霉素诱导性系统，两个独立的shRNA有效引起烯醇酶2蛋白质减少>70％(图2a)并且显示对烯醇酶1水平没有影响。ENO2的这种消融使得只有在ENO1裸D423-MG中细胞增殖才受明显抑制(图2b)。在非诱导性系统中使用两个额外独立的烯醇酶2shRNA获得相同结果(图5)。进一步显示，发夹抗性ENO2构建体的表达完全逆转了shENO2发夹的有害作用(图7)，指示出发夹的作用确实特定针对ENO2表达的下调。
紧接着，我们评价了在ENO1野生型和裸细胞中烯醇酶活性抑制的药理学影响。先前的研究已经集中于烯醇酶的药理学抑制，特别是为了达成抗细菌和抗寄生虫的目的(Guha-Chowdhury等人,1997；de,
A.S.N.M.V.等人,2007)，并且已经表征了许多化合物，其中大多数充当反应中间物类似物(表4)。最有效的烯醇酶抑制剂是化合物膦酰基乙酰羟肟酸盐(PhAH；Anderson等人,1984)，其被认为充当具有15pM的抑制常数的过渡态类似物。虽然还没有针对人烯醇酶来测试PhAH，但先前的工作展示了对来自远缘相关的生物体的烯醇酶的抑制作用(Anderson等人,1984；de,A.S.N.M.V.等人,2007)，表明其在大的种系发生距离上的潜在用途。PhAH有效地抑制体外神经胶质瘤细胞系的天然裂解物中的烯醇酶(图3b)。采用浓度在0.625到50μM范围内的PhAH，我们观察到ENO1裸细胞中的显著毒性(图3a、c、d)以及对ENO1完整对照的最小影响，这显示了烯醇酶活性相对于ENO1裸细胞至少高10倍(图3B；ENO1是GBM中的主要烯醇酶同工型，占细胞烯醇酶活性的75％到90％；Joseph等人,1996)。显著的是，ENO1裸细胞没有显示出对其它分子靶向疗法的任何更大的敏感度，这些疗法如受体酪氨酸激酶抑制剂(Stommel等人,2007)(拉帕替尼、索拉非尼、PHA665752)(图10)。这些数据指示，D423-MG细胞并不广泛地对其它抗癌剂敏感，并且PhAH选择性地靶向ENO1裸GBM细胞。值得注意的是，具有1p36纯合缺失但仍保留ENO1基因的D502-MG细胞对PhAH的抗性比ENO1裸D423-MG细胞大得多。另外，显示中等水平的烯醇酶活性的U343和D502细胞显示出对PhAH的中等水平的敏感度，这表明了对烯醇酶抑制的相对敏感度。最后，通过重新表达发夹抗性ENO2提高ENO2活性完全逆转了ENO1裸D423-MG细胞的PhAH敏感度(图7)。
实施例3-ENO1的缺失促使细胞对糖酵解抑制剂敏感
癌症基因组的特征为分别靶向驱动癌基因和肿瘤抑制基因的众多拷贝数扩增和缺失。常常，这些基因组变化是影响除了预定靶标之外的许多其它基因的大区域事件。这些广泛的基因组变化并不是针对癌细胞负向选择的事实暗示，这些邻近乘客的拷贝数变化本身必须不携带任何有害的生物结果。就是说，可以想象这些乘客基因组事件可以建立那些细胞所独有的非预定(连带)的弱点；例如当共同缺失的乘客是起到必需管家功能的冗余的多基因家族的成员时。在无脊椎动物以及小鼠中的很多基因相互作用研究指示，许多必需的细胞管家功能是由编码重叠功能的多个同源基因执行的；这种冗余性在一个同源物损失时使细胞能够生存，但在多个同源物损失时导致致死(Vavouri等人,2008；Costanzo等人,2008；Deutscher等人,2006)。在这个概念框架中，假定冗余的必需管家基因的纯合缺失可以建立癌症特异性弱点，借此，第二个未缺失的同源物的药理学失活将使得携带这种缺失的肿瘤细胞的活性完全损失，但不会损害两种基因都是完整的并且被表达的正常细胞的健康状况。
通过针对靶向必需的细胞活性中所涉及的基因的纯合缺失来检查Cancer GenomeAtlas(TCGA)GBM数据集(Cancer Genome Atlas Research Network,2008)，ENO1基因被鉴别为候选物，其位于1p36肿瘤抑制因子基因座处。由三个同源基因编码的烯醇酶是催化糖酵解的第二步到最后一步的必需酶，从而将2-磷酸甘油酸转化成磷酸烯醇丙酮酸盐。在哺乳动物中，烯醇酶活性由以下三个基因编码：广泛表达的ENO1(Joseph等人,1996；Stefanini,1972)；只有在神经组织中表达的ENO2(Joseph等人,1996；Kobayakawa等人,2007)；以及在肌肉组织中表达的ENO3(Comi等人,2001)。ENO1是GBM中的主要烯醇酶同工型，占细胞烯醇酶活性的75％到90％(Joseph等人,1996)。考虑到糖酵解对正常细胞并且尤其是肿瘤细胞中的能量产生和合成代谢过程的至关重要性(Wise和Thompson,2010)，对于ENO1来说纯合裸的GBM肿瘤将被预测到对烯醇酶2的抑制高度敏感，而正常神经组织由于烯醇酶1的功能冗余而应不受影响。相应地，ENO2敲除小鼠是能生存并且能繁殖的，表明烯醇酶2的药理学抑制可能在生物体层面上耐受良好。此外，具有若干个烯醇酶同源物的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)显示了具有单个突变体的弱表型并且仅在所有同源物都缺失时才导致细胞致死(Costanzo等人,2008；Deutscher等人,2006)；而秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)和果蝇仅具有一个编码烯醇酶活性的基因并且这个基因的缺失是致死的(Sonnichsen等人,2005)。
含有若干个候选肿瘤抑制基因的1p36基因座(Bagchi和Mills,2008)保持在GBM中频繁缺失(图1a)(Joseph等人,1996)。1p36基因座在1-5％的GBM(Cancer Genome AtlasResearch Network,2008；Duncan等人,2010)(以及少突神经胶质瘤(Kotliarov等人,2006)和大细胞神经内分泌肺肿瘤(Peng等人,2005))中是纯合缺失的，并且ENO1常常被包括在这种缺失中。通过检查TCGA拷贝数异常(单核苷酸多态性[SNP]和阵列比较基因组杂交[aCGH]数据)(Cancer Genome Atlas Research Network,2008)和表达型态，5/359GBM样品被鉴别出具有ENO1的纯合缺失以及相关的其表达几乎完全缺乏(图1b和图4)。两个GBM细胞系D423-MG(Duncan等人,2010)和Gli56(Mueller等人,2007)被鉴别出在跨越ENO1的1p36基因座处具有纯合缺失。第三个GBM细胞系D502-MG(Duncan等人,2010)在这个基因座中也发生许多基因的纯合缺失，但留下完整的ENO1并且因此充当极好的对照(图1c)。Western印迹分析确认了D423-MG和Gli56中烯醇酶1的损失和烯醇酶2蛋白质的保留，而两种蛋白质都存在于D502-MG中以及所测试的所有其它神经胶质瘤和正常神经胶质细胞系中(图1d)。
D502-MG(ENO1野生型[WT])和D423-MG(ENO1裸)细胞系被用来评价在ENO1WT或裸的情形中shRNA介导的ENO2敲低的影响。两个独立的ENO2shRNA(pLKO.1载体)引起稳固的蛋白质减少并且使得只有在ENO1基因组缺失的情形中细胞生长才受明显抑制(图5)。使用额外独立的ENO2shRNA(pGIPZ载体)获得相同结果(图6a、b)。此外，ENO1裸细胞中ENO2的shRNA消融也使得软琼脂集落形成减少并且阻断颅内注射的细胞的体内肿瘤发生潜力(图1e和图6c)。最后，在等基因情形中使用强力霉素诱导性TRIPZ载体展示了ENO2消融对ENO1裸细胞的选择性毒性。当在ENO1WT细胞系(U87、A1207、LN319)中使用这个强力霉素诱导性系统时，两个独立的shRNA使烯醇酶2蛋白质水平降低>70％(图2a)而对烯醇酶1水平没有影响(数据未示出)。ENO2的这种消融使得只有在ENO1裸D423-MG细胞系中细胞增殖才受明显抑制(图2b)。此外，发夹抗性ENO2cDNA的强制表达完全逆转了shENO2发夹的有害作用(图7)，显示了发夹的抑制作用确实特定针对降低的ENO2表达并且不是脱靶效应。最后，当在D423-MG(ENO1裸)细胞系中以与ENO1-WT GBM细胞系中所观察到的水平类似的水平异位重新表达ENO1时，完全消除了ENO2的shRNA消融的有害作用(图8)。
紧接着，在ENO1WT和裸细胞中评价烯醇酶活性的药理学抑制的影响。先前的研究已经集中于烯醇酶的药理学抑制，特别是为了达成抗寄生虫的目的(Navarro等人,2007)，并且已经表征了许多化合物，其中大多数充当反应中间物类似物(表5)。
表5：所公布的烯醇酶抑制剂的一般特性。过去已经合成了一大组泛烯醇酶抑制剂作为用来研究酶机理的工具，其中PhAH显示最有效力。大多数抑制剂被认为充当过渡态类似物，其显示了反应物(2-磷酸甘油酸盐)和产物(磷酸烯醇丙酮酸盐)的中间构型。应注意，这些抑制剂的有效IC50低于表中所列的那些，因为其为充当抑制剂并且pKa从8变到12的电离形式。对于PhAH来说，pKa是10.2，以使得在生理pH下，预期IC50为约15nM(Navarro等人,2007)。
最有效的烯醇酶抑制剂是PhAH(Anderson等人,1984)，其被认为充当对酵母烯醇酶具有15pM的抑制常数的过渡态类似物。尽管还没有针对人烯醇酶来测试PhAH，但先前的工作展示了对来自远缘相关的生物体的烯醇酶的抑制作用(Navarro等人2007；Anderson等人,1984；Duncan等人,2010)，表明其在大的种系发生距离上的潜在用途。PhAH确实能够以约20nM的IC50有效抑制体外人GBM细胞系的天然裂解物中的烯醇酶(图3b)。PhAH以在0.625μM到50μM范围内的浓度使用，并且观察到ENO1裸细胞中的显著毒性(图3a、c、d和图9)以及对ENO1-WT对照的最小影响，这显示了烯醇酶活性相对于ENO1裸细胞至少高10倍(因为ENO1占总细胞烯醇酶活性的90％(Joseph等人,1996)，图3b)。尽管PhAH的IC50在体外对于ENO1和ENO2来说是类似的(数据未示出)，但抑制剂对ENO1裸细胞(Gli56、D423-MG)的更大毒性来源于以下事实：在这些细胞中，烯醇酶活性与ENO1-WT细胞系相比已经低90％(实际上，90％“预先抑制”)，并且因此需要低得多的剂量来降低总烯醇酶活性低于毒性阈值。更多的数据指示了烯醇酶活性的水平与跨越不同细胞系以及在具有不同水平的强制烯醇酶表达的相同细胞系中对PhAH的敏感度之间的直接关系。首先，与其它细胞系相比具有中等水平的烯醇酶活性(和烯醇酶1蛋白质表达，图1d)的U343和D502-MG细胞具有对PhAH的中等水平的敏感度(图3)，在U343的情况下，这可以通过ENO1或ENO2的异位过表达来补救(数据未示出)。具有不同水平的强制ENO1或ENO2表达的D423-MG细胞系中PhAH的系统滴定显示了烯醇酶表达/活性的水平与对PhAH的后续抗性之间的直接关系(图9)。PhAH毒性也在Gli56ENO1裸细胞中通过生理水平的ENO1的异位表达或ENO2的过表达来消除(图9)。关于毒性机理，细胞周期和细胞凋亡分析展示，历时48小时的PhAH处理诱导S期显著减少，接下来D423-MG而非ENO1WT U373细胞的细胞凋亡显著增加。这种作用通过ENO2过表达来完全补救。这种生长抑制和后续细胞凋亡是归因于能量危机的事实通过磷酸化AMPK(Thr172)的强诱导来具体体现，这种强诱导在D423-MG而非ENO1WT细胞系中观察到(数据未示出)。不禁推测，这种能量应激反应发挥保护作用并且因此同时添加AMPK抑制剂与PhAH将产生更多毒性。最后，值得注意的是，ENO1裸细胞与ENO1WT细胞相比没有显示出对其它分子靶向疗法的任何更大的敏感度，这些疗法如受体酪氨酸激酶抑制剂(Stomme等人,2007)(拉帕替尼、索拉非尼和PHA665752)(图10)与雷帕霉素的组合。这些数据指示，D423-MG细胞并不广泛地对其它抗癌剂敏感，并且PhAH选择性地靶向ENO1裸GBM细胞。
总之，这些基因学和药理学结果展示，烯醇酶2抑制在具有1p36纯合缺失并连带损失ENO1的细胞中是致死的，而ENO1完整细胞可以依赖于烯醇酶1来经历糖酵解并支持存活。这些发现与来自无脊椎动物的基因数据一致(Costanzo等人,2008；Deutscher等人,2006)。考虑到若干个纯合缺失的管家基因可以在1p36上以相同的缺失出现(例如，H6PD)，通过组合ENO2的抑制与同时缺失的管家基因的另一个同源物的抑制而可能进一步增加有效性和癌细胞特异性杀死。
此外，研究显示，在ENO1基因座处杂合的细胞(如U343)比野生型成胶质细胞瘤细胞系和正常星形细胞对烯醇酶抑制剂(如膦酰基乙酰羟肟酸盐)的毒性更敏感。图1、3和11突出了这些数据。图1d示出，D502-MG和U343这两个细胞都显示了对应于ENO1的杂合缺失而降低烯醇酶1的表达。如图3和11中的剂量反应研究所示，这些细胞比野生型细胞系对PhAH的毒性作用显著更敏感。发现这种作用通过细胞中ENO1或ENO2的过表达是部分可逆的。有趣的是，通过用寡霉素处理，也进一步使杂合细胞对PhAH的作用敏感。因此，ENO1杂合癌细胞是基于糖酵解抑制剂的疗法的有前景的靶标。
实施例4-用于实施例3的材料和方法
使用标准技术在含20％胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基(DulbeccoModified Eagle's Medium)中培养细胞。通过瞬时转染293T细胞产生慢病毒来进行shRNA实验，接下来在含有4μg/mL聚凝胺的培养基中转导并且用2μg/mL嘌呤霉素进行选择。用1μg/mL强力霉素诱导shRNA表达，并且通过western印迹法测试敲低。通过使用来自Stratagene的QuickChange定点诱变试剂盒引入沉默突变来产生shRNA抗性ENO2克隆体，然后将其克隆到pHAGE-CMV慢病毒载体中。使用结晶紫染色、CellTiter-Glo分析法(Roche)并且通过使用IncuCyte(Essen Bioscience)测量汇合度来进行细胞增殖实验。如先前所描述(Zheng等人,2008)，在存在和不存在SCID小鼠中的ENO2敲低的情况下进行D-423MG细胞的正位颅内注射。使用标准技术通过将104个细胞接种到6孔板中对上述细胞进行软琼脂集落形成分析法。对于抑制剂研究来说，遵循Anderson等人(1984)的方案，通过TCRS定制合成PhAH锂盐。对于烯醇酶活性分析法来说，如先前所描述(Joseph等人,1996)，在丙酮酸激酶-乳酸脱氢酶偶合反应中测量NADH氧化。对于细胞周期研究来说，在存在或不存在PhAH的情况下孵育细胞48小时，用碘化丙啶(propidium iodide)染色，并且经由流式细胞测量分析进行分选。对于膜联蛋白(Annexin)V/7-AAD分析法来说，用或不用PhAH处理细胞96小时，用膜联蛋白V-PE和7-AAD染色，并且根据制造商的方案(Biovision)通过流式细胞测量术评估细胞凋亡。
细胞培养
细胞系D423-MG是1p36纯合缺失的，包括ENO1；并且D502-MG是1p36纯合缺失的，不包括ENO1(Duncan等人,2010)。细胞D423和D502在Duncan等人中被称作H423和H502，但在Wellcome Trust Sanger Institute数据库中被称作D423-MG和D502-MG，这里采用这种命名(在万维网sanger.ac.uk上)。Gli56描述于Mueller等人(2007)中。D423-MG中的缺失跨越CAMTA1、VAMP3、PER3、UTS2、TNFRSF9、PARK7、ERRFI1、SLC45A1、RERE、ENO1、CA6、SLC2A5、GPR157、MIR34A、H6PD、SPSB1和SLC25A33基因，而Gli56中的缺失跨越UTS2、TNFRSF9、PARK7、ERRFI1、SLC45A1、RERE、ENO1、CA6、SLC2A5、GPR157、MIR34A、H6PD、SPSB1、SLC25A33、TMEM201、C1orf200、PIK3CD、CLSTN1、CTNNBIP1、LZIC、NMNAT1、RBP7和UBE4B基因座。在含20％胎牛血清(FBS)的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)中培养细胞。为了比较，使细胞系U87、LN319、SW1088、U343、U373和A1207在相同条件下生长。正常人星形细胞获自ScienCell。
ENO2表达的shRNA敲低
筛选靶向ENO2的22个发夹，并且4个独立的发夹发现到引起蛋白质水平降低<50％。这些发夹中的两者在pLKO.1载体(shENO2-1和shENO2-2)中，并且其余两者在Expression Arrest GIPZ(shENO2-3)和TRIPZ(shENO2-4)shRNAmir载体(OpenBiosystems)中。ENO2shRNA序列如下：
使用制造商所提供的方案将GIPZ载体中的发夹克隆到TRIPZ载体中。TRIPZ载体是具有红色荧光蛋白报道体的强力霉素诱导性系统，这种报道体只有在强力霉素诱导后才表达。通过遵循标准方案瞬时转染293T细胞来产生重组慢病毒粒子。简单地说，使用FuGene(Roche)将72μg shRNA质粒、54μg delta 8.9质粒和18μg VSVG质粒转染到涂于245mm2培养皿中的293T细胞中。转染后72小时收集病毒上清液，通过以23,000rpm离心来浓缩，并且再悬浮于细胞生长培养基中。为了转导，将病毒溶液添加到含有4μg/mL聚凝胺的细胞培养基中；感染后48小时，使用2μg/mL嘌呤霉素选择细胞，并且通过western印迹法针对ENO2敲低进行测试。
ENO1、ENO2和shRNA抗性ENO2的异位表达
通过过表达shRNA抗性形式的ENO2来进行敲低细胞系D423-MG中的ENO2的表型效应的补救。简单地说，使用QuickChange定点诱变试剂盒(Stratagene)，将6个沉默突变引入到shENO2-4所靶向的ENO2编码区中。将shRNA抗性ENO2编码区克隆到pHAGE-CMV慢病毒载体(D.N.Kotton的慷慨馈赠)中，并且在存在或不存在强力霉素的情况下在携带shENO2-4的D423-MG细胞系中过表达。作为对照，用携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的慢病毒载体感染相同的细胞系。为了异位重新表达ENO1或ENO2，如上文所描述，将经过序列验证的cDNA克隆门控(gateway)克隆到pHAGE-CMV慢病毒载体中并且慢病毒转导到神经胶质瘤细胞系中。
增殖分析法和锚定非依赖性生长
经由结晶紫染色或使用Promega CellTiter-Glo增殖试剂盒(Roche)，或者在体内通过使用IncuCyte(Essen BioScience)测量汇合度来分析经shRNA或PhAH处理的细胞系的细胞生长。通过每隔2小时以一式四份的重复实验进行成像来使用IncuCyte产生生长曲线。对于结晶紫分析法来说，在每个时间点将104个细胞接种于6孔板中。在指定的时间点，将细胞用10％福尔马林固定并且用结晶紫溶液染色1小时。使用10％乙酸溶液进行染料萃取，并且在590nm下读取吸光度。根据制造商的说明书进行CellTiter-Glo实验；在每个时间点将103个细胞/孔涂于96孔板中，并且每隔24小时获取发光读数。所有实验都一式三份进行。在接种有指定基因型的104个细胞的6孔板中监测软琼脂(锚定非依赖性)生长。培养基含有含10％FBS的DMEM；顶层琼脂含有0.4％低熔点琼脂糖，而底层琼脂含有1％低熔点琼脂糖。通过荧光(GFP)监测生长，并且在28天后，将集落用碘硝基氯化四氮唑(Sigma-Aldrich)染色并且进行计数。
正位脑肿瘤形成
如先前所描述(Zheng等人,2008)，测定使用经由pGIPZ递送的非靶向发夹或shENO2-3转导的D423-MG细胞的体内肿瘤发生潜力。将处于深度麻醉下的SCID小鼠(Charles River)放到配备有z轴(Stoelting)的立体定位装置中。然后，使用10-μl汉密尔顿注射器将3×105个细胞颅内注射到位于大脑表面下方3mm处的右尾状核中。每日追踪动物的神经缺陷的发展。所有小鼠实验都是在哈佛大学癌症中心和达纳-法伯癌症研究所的机构动物照护和使用委员会的批准下进行。
烯醇酶活性分析法
如先前所描述(Joseph等人,1996)，在丙酮酸激酶-乳酸脱氢酶偶合分析法中在NADH氧化之后测量烯醇酶活性。简单地说，使细胞在20mM Tris HCl、1mM EDTA和1mMβ-巯基乙醇(pH 7.4)中裂解，并且使用Polytron均化器均化三次历时10秒的时段，接下来进行声波处理。通过分光光度法用340nm下的吸光度或通过荧光法用340nm下的激发和460nm下的发射测量NADH的氧化来记录烯醇酶活性。
Western印迹分析
在用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次之后，在缓缓振荡下将细胞于RIPA缓冲液中孵育15分钟。然后收集裂解物，进行声波处理，并且在4℃下以14,000rpm离心10分钟。如先前所描述(Taniuchi等人,2005)，进行SDS-PAGE和Western印迹分析。使用以下抗体：烯醇酶1,CST#3810；烯醇酶2,#9536；和GAPDH CST#3683；来自Cell Signaling Technologies的磷-AMPK Thr172CST#2535以及来自Sigma-Aldrich的粘着斑蛋白。
抑制剂研究
遵循Anderson等人(1984)的方案，通过TCRS定制合成PhAH锂盐。通过NMR验证结构和纯度。将PhAH以50mM储备液形式溶解于PBS中，并且在-80℃下冷冻储存直到使用为止。考虑到化合物的不稳定性，每隔5天更换培养基，并且与新鲜的培养基一起添加新鲜的抑制剂。雷帕霉素、索拉非尼、拉帕替尼和PHA665752分别获自LC Laboratories和TocrisBioscience。
细胞周期分析
在存在或不存在PhAH(25μM)的情况下处理D423-MG和U373细胞系48小时，并且在-20℃下固定于75％乙醇中过夜。第二天，用冷的PBS洗涤细胞，用100μg RNA酶A(Qiagen)处理，并且用50μg碘化丙啶(Roche)染色。使用三色FACScan流式细胞仪和CellQuest软件(Becton Dickinson)进行流式细胞采集。对于每个样品来说，门控104个事件。使用ModFitLT(Verity Software House)进行数据分析。
针对细胞凋亡的膜联蛋白V/7-AAD分析法
在存在或不存在PhAH(25μM)的情况下处理D423-MG和U373细胞系96小时。对于膜联蛋白V/7-AAD分析法来说，将细胞用膜联蛋白V-PE和7-AAD染色，并且根据制造商的方案(Biovision)通过流式细胞测量术针对细胞凋亡进行评估。使用Becton-DickinsonFACScan细胞仪测定凋亡细胞。早期凋亡细胞(膜联蛋白V阳性、7-AAD阴性)和晚期凋亡细胞(膜联蛋白V阳性和7-AAD阳性)这两者都被包括在细胞死亡测定中。
实施例5-苏氨酰基-tRNA合成酶(TARS)杂合缺失使细胞对TARS抑制剂敏感
本发明者着手进行了研究来确定TARS缺乏对于细胞对TARS抑制剂疏螺体素的敏感度的影响。首先，进行分析以定义基因组拷贝数与TARS的表达之间的相关性(图19)。在若干个细胞系中测定TARS基因拷贝数(图19a)，并且绘制这些数据相对于相同细胞系中TARS的mRNA表达水平的图(图19b)。在黑素瘤细胞系中，SK-MEL-2细胞被鉴别为具有TARS的杂合缺失，451Lu细胞被鉴别为TARS缺乏的，并且SK-MEL-5和HEML细胞被鉴别为TARS野生型的(图20a)。为了确认TARS蛋白质的表达水平与基于基因拷贝数和mRNA表达水平的预期水平相一致，进行western印迹分析(图20c)。
确定疏螺体素处理对SK-MEL-2、451Lu、SK-MEL-5和HMEL细胞生长的影响。在低浓度下，疏螺体素处理对TARS野生型的HMEL和SK-MEL-5细胞的生长具有极小乃至没有影响(图20b)。相比之下，等效低浓度的疏螺体素使SK-MEL-2细胞的生长停止。TARS缺乏的451Lu细胞系显示出对疏螺体素处理的中等敏感度。
还研究了随着时间的推移多种浓度的疏螺体素对四种黑素瘤细胞系生长的影响(图21)。发现HMEL细胞系在最高测试浓度62.5nM下对疏螺体素处理具有抗性。也是TARS野生型的SK-MEL-2细胞系对62.5nM疏螺体素部分敏感，但对小于31.25nM的浓度有很大抗性。TARS杂合SK-MEL-2细胞系的生长受31.25nM疏螺体素完全抑制，并且对低到3.9nM的浓度至少部分敏感。TARS缺乏的451Lu细胞系的生长受62.5nM疏螺体素差不多抑制，并且在所有测试浓度下始终介于TARS杂合SK-MEL-2细胞与TARS野生型细胞中间。
在生长分析法中所测试的疏螺体素的最高浓度完全抑制SK-MEL-2细胞系生长的观察结果促使本发明者测试疏螺体素对SK-MEL-2细胞的细胞毒性作用。为了这个目的，除了在时间零点以SK-MEL-2细胞的高汇合度开始以外，本发明者进行了相同的存活生长分析法。在这些条件下，变得显而易见的是，15nM或高于15nM的疏螺体素浓度对SK-MEL-2细胞具细胞毒性，而更低浓度是抑制生长的(图22)。
为了确认疏螺体素对四种黑素瘤细胞系的差异化影响实际上是归因于TARS的相对表达水平，本发明者在SK-MEL-2细胞中使用慢病毒pCMV载体异位表达TARS。还使用表达GFP和表达CHEK1的pCMV载体转导细胞作为对照，并且通过western印迹分析来确认经转导的细胞中的TARS蛋白质表达水平(图23d)。发现疏螺体素对SK-MEL-2细胞生长的影响通过SK-MEL-2细胞中外源TARS的表达而逆转(图23b、c)，而GFP或CHEK1的表达对于SK-MEL-2细胞对疏螺体素的反应没有影响(图23a、c)。图24中所示的研究进一步确立，TARS基因拷贝数和mRNA表达水平与细胞中的疏螺体素敏感度直接相关。
最后，研究额外的ARS基因以确定表达水平是否与DNA基因拷贝数相关。如图25中所示，在AARS、HARS、LARS和KARS表达的情况下注意到显著相关性，指示出ARS基因一般来说是抗癌疗法的极好靶标和生物标志。
实施例6-免疫组织化学可以被用来精确检测纯合ENO1失活
着手进行了研究以确认ENO1纯合失活(例如，缺失)是否可以使用抗体结合研究来检测。简单地说，将ENO1纯合缺失(D423-MG)或WT(U87)的人癌细胞系注射到裸小鼠的大脑中并且使其形成肿瘤。遵循标准组织病理学程序，将带瘤大脑固定，并且切出石蜡切片。经苏木精/曙红染色的D423-MG ENO1裸肿瘤细胞可以通过形态来容易地检测，这是通过用针对NUMA的抗体(来自Epitomics的S2825)染色来验证，这种抗体仅标记人细胞而非小鼠细胞。用针对ENO1的抗体(来自Protein Tech的11204-1-AP)染色在正常小鼠大脑中显示出强的免疫反应性，如从广泛表达的管家基因所预期。正如预期，在D423-MG ENO1裸肿瘤中没有观察到染色，而在U87ENO1WT肿瘤中观察到强染色。这些结果显示，通过针对ENO1蛋白质的免疫组织化学可能鉴别ENO1裸肿瘤，并且这种方法可以被用来筛选将受益于例如ENO2抑制剂的患者。
实施例7-CHEK1蛋白质表达与基因组拷贝数不相关并且CHEK1的过表达不会赋予对CHEK1抑制剂的抗性
与上文所示的ARS基因和烯醇酶基因的结果成对比，研究指示，CHEK1蛋白质表达与基因组拷贝数不相关。来自COMIC(Sanger Center)的基因组拷贝数显示，染色体11上的CHEK1在细胞系SK-MEL-2中仅具有一个拷贝(图26A)。当然，微阵列表达和阵列CGH拷贝数的数据显示出mRNA水平与CHEK1的基因组拷贝之间的良好相关性(图26B)。尽管如此，通过western印迹分析，SK-MEL-2细胞不会表达更低水平的CHEK1蛋白质(图26C)。同样地，SK-MEL-2细胞中CHEK1的过表达不会赋予对CHEK1抑制剂AZD7762的抗性(图26D)。这些结果可以指示，CHEK1的主要表达控制是转录后事件，并且在CHEK1基因座处杂合性的损失不足以显著降低CHEK1蛋白质的表达。
***
本文所公开和要求保护的所有方法都可以鉴于本公开在没有过度实验的情况下获得和执行。虽然本发明的组合物和方法已经根据优选的实施方案来描述，但本领域技术人员应了解，在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下可以将变化应用于本文所描述的方法以及方法的步骤或步骤顺序。更具体地说，将显而易见的是，在化学上和生理上都相关的某些药剂可以替代本文所描述的药剂，同时将实现相同或类似的结果。对于本领域技术人员来说显而易见的是所有这些类似替代和修改被视为处于如随附权利要求书所定义的本发明的精神、范围和概念内。
参考文献
以下参考文献，就其提供了为本文所阐述的内容作补充的示例性的程序或其它细节来说，以引用的方式特定地并入本文中。
U.S.Patent 5,279,721
U.S.Patent Publn.US 2003/0013656
U.S.Patent Publn.US 2003/0013657
U.S.Patent Publn.US 2003/0013846
U.S.Patent Publn.US 2003/0013847
Abaza et al.M phase phosphoprotein l is a human plus-end-directedkinesin-related protein required for cytokinesis.J.Biol.Chem.278，27844-27852，(2003).
Abbondanzo et al.，Breast Cancer Res.Treat.，16：182(151)，1990.
Allred et al.，Breast Cancer Res.Treat.，16：182(149)，1990.
Anderson et al.，Biochemistry.23：2779-2786，1984.
Anderson，V.E.，Weiss，P.M.&Cleland，W.W.Reaction intermediate analoguesfor enolase.Biochemistry 23，2779-2786(1984).
Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.，1996.
Ausubel et al.，In：Current Protocols in Molecular Biology，John，Wiley&Sons，Inc，New York，1998.
Bagchi，A.&Mills，A.A.The quest for the lp36 tumor suppressor.CancerRes.68，2551-2556，(2008).
Bakhshi et al.，Cell，41(3)：899-906，1985.
Bignell et al.，Nature，463：893-898，2010.
Brookfield，Genetic redundancy.Adv Genet 36，137-155(1997).
Brown et al.Immunol.Ser.，53：69-82.1990.
Bulteau et al.Reversible redox-dependent modulation of mitochondrialaconitase and proteolytic activity during in vivo cardiac ischemia/reperfusion Proc Natl Acad Sci USA.2005 April 26；102(17)：5987-5991.
Buszczak et al.The carnegie protein trap library：a versatile tool forDrosophila developmental studies.Genetics 175，1505-1531，(2007).
Cancer Genome Atlas Research Network，In：Comprehensive genomiccharacterization defines human glioblastoma genes and core pathways.Nature，455：1061-1068，2008.
Chen et al.Serum and urine metabolite profiling reveals potentialbiomarkers of human hepatocellular carcinoma.Molecular and cellularproteomics 10：M110.004945
Cho et al.，Dephosphorylation of 2，3-bisphosPhoglycerate by MIPPexpands the regulatory capacity of the Rapoport-Luebering glycolyticshunt.Proc Natl Acad Sci USA 105，5998-6003，(2008).
Clarke et al.，Arch.Biochem.Biophys.415：229-234，2003.
Cleary and Sklar，Proc.Natl.Acad.Sci.US4，82(21)：7439-7443，1985.
Cleary et al.，J.Exp.Med.，164(1)：315-320，1986.
Comi et al.，Ann.Neurol.，50：202-207，2001.
Costanzo et al.，The genetic landscape of a cell.Science，327：425-431，2008.
Cox et al.A survey of homozygous deletions in human cancergenomes.Proc Natl Acad Sci USA 102，4542-4547，(2005).
de，A.S.N.M.V.et al.Structural flexibility in Trypanosoma bruceienolase revealed by X-ray crystallography and molecular dynamics.FEBS J.274，5077-5089，(2007).
De Jager et al-，Semin.Nucl.Med.，23(2)：165-179，1993.
DeLuna et al.Exposing the fitness conntribution of duplicatedgenes.Nat.Genet.40，676-681，(2008).
De Soto et al.，PARP-1 inhibitors：are they the long-sought geneticallyspecific drugs for BRCA 1/2-associated breast cancers？Int J Med Sci 3，117-123(2006).
Deutscher et al.，Nat.Genet.，38：993-998，2006.
Design of Prodrugs(ed.H.Bundgaard)，Elsevier Science Publishers BV，Amsterdam，1985.
Doolittle and Ben-Zeev，Methos Mol.Biol，，109：215-237，1999.
Druker，Translation of the Philadelphia chromosome into therapy forCML.Blood 112，4808-4817，(2008).
Duncan，C.G.et al.Integrated genomic analyses identify ERRF11 andTACC3 as glioblastoma-targeted genes.Oncotarget 1，265-277(2010).
Guha PARP inhibitors stumble in breast cancer.Nat.Biotechnol.29，373-374，(2011).
Guha-Chowdhury et al.，Inhibition of purified enolases from oralbacteria by fluoride.Oral Microbiol.lmmunol.12，91-97(1997).
Gulbis and Galand，Hum.Pathol.24(12)，1271-1285，1993.
Henrich et al.CAMTA1，a 1p36 tumor suppressor candidate，inhibitsgrowth and activates differentiation programs in neuroblastoma cells.CancerRes.71，3142-3151，(2011).
Hill et al.，The Rab6-binding kinesin，Rab6-KIFL，is required forcytokinesis.EMBO J.19，5711-5719(2000).
Huttunen et al.，Pharmacol.Rev.，63(3)：750-71，2011.
Hsieh et al.，Curr.Pharm.Des.，15(19)：2236-50，2009.
Joseph et al.，Enolase activity and isoenzyme distribution in humanbrain regions and tumors.
J.Neurochem.66，2484-2490(1996).
Keller et al.，Halofuginone and other febrifugine derivatives inhibitprolyl-tRNA synthetase.
Nat.Chem.Biol.8(3)：311-7，2012.
Kerr et al.，Br.J.Cancer，26(4)：239-257，1972.
Kobayakawa et al.，Nature，450：503-508，2007.
Kotliarov，Y.et al.High-resolution global genomic survey of 178gliomas reveals novel regions of copy number alteration and allelicimbalances.Cancer Res 66，9428-9436，(2006).
Law Perfusion and MRS for brain tumor diagnosis.Clinical MR.Chapter43：1215-1243.
Leonardi et al.，Pantothenate kinase l is required to support themetabolic transition from the fed to the fasted state.PLoS One 5，el 1107，(2010a).
Leonardi et al.Modulation of pantothenate kinase 3 activity by smallmolecules that interact with thc substrate/allosteric regulatorydomain.Chem.Biol.17，892-902，(2010b).
Leonardi et al.Activation of human mitochondrial pantothenate kinase2 by palmitoylcarnitine PNAS 2007：1494-1499.
Maser et al.Chromosomally unstable mouse tumours have genomicalterations similar to diverse human cancers.Nature 447，966-971，(2007).
Moller-Hartmann et al.Clinical application of proton magneticresonance spectroscopy in the diagnosis of intracranial masslesions.Neuroradiology 44：371-381
Moore et al.，Double or nothing：a Drosophila mutation affectingmeiotic chromosome segregation in both females and males.Genetics 136，953-964(1994).
Mueller et al.，Oncogene，26：583-593，2007.
Nakamura et al.，In：Handbook of Experimental Immunology(4thEd.)，Weir etal.(Eds.)，1∶27，Blackwell Scientific Publ.，Oxford，1987.
Navarro et al.，FEBSJ.，274：5077-5089，2007.
Nelson Multivoxel Magnetic Resonance Spectrosopy of braintumors.Molecular Cancer Therapeutics 2，497-507
Nijhawan et al.，Cell，150：842-854，2012.
Odunsi Detection of epithelial ovarian cancer using 1H-NMR-basedmetabolomics.Int.J.of Cancer 2005：782-788.
Parrish et al.Novel ATP-competitive kines in spindle proteininhibitors，J.Med.Chem.50，4939-4952，(2007).
Peng et al.Array-based comparative genomic hybridization analysis ofhigh-grade neuroendocrine tumors of the lung.Cancer Sci.96，661-667，(2005).
Possemato et al.Functional genomics reveal that the serine synthesispathway is essential in breast cancer.Nature 476，346-350，(2011).
Poyner et al.，Structure of the bis divalent cation complex withphosphonoacetohydroxamate at the active site of enolase.Biochemistry 31，7166-7173(1992).
Raj et al.Selective killing of cancer cells by a small moleculetargeting the stress response to ROS，Nature 475，231-234，(2011).
Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd Edition，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.，1989.
Smith et al.，Complete loss of iron regulatory proteins 1 and 2prevents viability of murine zygotes beyond the blastocyst stage of embryonicdevelopment，Blood Cells Mol.Dis，36，283-287，(2006).
Sonnichsen et al.Full-genome RNAi profiling of early embryogenesis inCaenorhabditis elegans.Nature 434，462-469，(2005).
Spratlin et al.Clinical applications of metabolonics in oncology：areview.Clinical cancer research 15：431-440.
Stefanini，Am.J.Clin.Pathol.，58：408-414，1972.
Stommel et al.Coactivation of rereceptor tyrosine kinases affects theresponse of tumor cells to targeted therapies.Science 318，287-290，(2007).
Sundrud et al.，Halofuginone inhibits TH 17 cell differentiation byactivating the amino acid starvation response.Science，324(5932)：1334-8，2009.
Taniuchi et al.Down-regulation of RAB6KIFL/KIF20A，a kinesin involvedwith membrane trafficking of discs large homologue 5，can attenuate growth ofpancreatic cancer cell.Cancer Res.65，105-112，(2005).
Taylor et al.Integrative genomic profiling of human prostatecancer.Cancer Cell 18，11-22，(2010).
Tcherniuk et al.Relocation of Aurora B and survivin from centromeresto the central spindle impaired by a kinesin-specific MKLP-2 inhibitor.AngewChem Int Ed Engl 49，8228-8231，(2010).
Tonon et al.High-resolution genomic profiles of human lungcancer.Proc Natl Acad Sci USA 102，9625-9630，(2005).
Tsujimoto and Croce，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83(14)：5214-5218，1986.
Tsujimoto et al.，Nature，315：340-343，1985.
Vavouri et al.，Widespread conservation of genetic redundancy during abillion years of eukaryotic evolution.Trends Genet.24，485-488，(2008).
Wise et al.，Glutamine addiction：a new therapeutic target incancer.Trends Biochem.Sci.35，427-433，(2010).
Yin et al.High-resolution genomic copy number profiling ofglioblastoma multiforme by single nucleotide polymorphism DNAmicroarray.Mml.Cancer Res.7，665-677，(2009).
Zhang et al.Chemical knockout of pantothenate kinase reveals themetabolic and genetic program responsible for hepatic coenzyme Ahomeostasis.Chem.Biol.14，291-302，(2007).
Zheng et al.，Nature，4551129-1133，2008.
Zhou et al.A novel pantothenate kinase gene(PANK2)is defective inHallervorden-Spatz syndrome.Nat.Genet.28，345-349，(2001).
序列表
<110> 德克萨斯系统大学董事会；
达纳-法伯癌症研究公司
<120> 用于癌症疗法的连带基因失活生物标志和靶标
<130> UTFC.P1138WO
<140> 未知
<141> 2012-12-14
<150> 61/570,366
<151> 2011-12-14
<150> 61/652,738
<151> 2012-05-29
<160> 4
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 1
caagggagtc atcaaggaca a 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 2
cgcctggcta ataaggcttt a 21
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 3
cggccttcaa cgtgatcaa 19
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 4
gggactgaga acaaatcc 18

Claims (27)

1.糖酵解抑制剂在制备用于治疗癌症的药物中的用途，所述癌症包含使烯醇酶1(ENO1)基因的一个拷贝失活的杂合突变。
2.一种选择患有癌症的受试者用于糖酵解抑制剂疗法的体外方法，所述方法包括确定所述受试者的癌细胞是否包含使烯醇酶1(ENO1)基因的一个拷贝失活的杂合突变，其中如果所述癌细胞包含所述杂合突变，那么所述受试者被选择用于糖酵解抑制剂疗法。
3.一种选择患有癌症的受试者用于糖酵解抑制剂疗法的体外方法，所述方法包括：
(a)确定所述受试者的癌细胞是否包含使烯醇酶1(ENO1)基因的一个拷贝失活的杂合突变；以及
(b)如果受试者的癌细胞包含所述杂合突变，那么选择所述受试者用于糖酵解抑制剂疗法。
4.一种预测在患有癌症的受试者中对糖酵解抑制剂疗法的反应的体外方法，所述方法包括确定所述受试者的癌细胞是否包含使烯醇酶1(ENO1)基因的一个拷贝失活的杂合突变，其中如果所述癌细胞包含所述杂合突变，那么所述受试者被预测到对糖酵解抑制剂疗法具有良好的反应。
5.一种预测在患有癌症的受试者中对糖酵解抑制剂疗法的反应的体外方法，所述方法包括：
(a)确定所述受试者的癌细胞是否包含使烯醇酶1(ENO1)基因的一个拷贝失活的杂合突变；以及
(b)如果来自所述受试者的癌细胞包含所述杂合突变，那么将所述受试者鉴别为预测到对糖酵解抑制剂疗法具有良好的反应；或如果来自所述受试者的癌细胞不包含所述杂合突变，那么将所述受试者鉴别为未预测到对糖酵解抑制剂疗法具有良好的反应。
6.如权利要求2到5中任一项所述的方法，其中所述糖酵解抑制剂疗法是烯醇酶抑制剂疗法。
7.如权利要求2到5中任一项所述的方法，其中所述杂合突变是ENO1的一个拷贝的全部或一部分的缺失。
8.如权利要求2到5中任一项所述的方法，其进一步包括报告所述受试者的癌细胞是否包含使烯醇酶1(ENO1)基因的一个拷贝失活的杂合突变。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述报告包括提供书面或电子报告。
10.如权利要求5所述的方法，其进一步包括报告所述受试者是否被鉴别为预测到或未预测到对糖酵解抑制剂疗法具有良好的反应。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述报告包括提供书面或电子报告。
12.如权利要求2到5中任一项所述的方法，其中确定所述受试者的癌细胞是否包含所述杂合突变包括DNA测序、聚合酶链反应、核酸杂交或DNA限制性分析。
13.如权利要求2到5中任一项所述的方法，其中确定所述受试者的癌细胞是否包含所述杂合突变包括测量烯醇酶的表达或活性。
14.如权利要求4或5所述的方法，其中对糖酵解抑制剂疗法的良好的反应包括肿瘤尺寸或负荷减小、肿瘤生长受阻断、肿瘤相关疼痛减少、癌症相关病状减少、癌症相关症状减少、癌症无进展、无病间隔期增加、进展时间增加、诱导缓解、转移减少、患者存活期增加或肿瘤对抗癌疗法的敏感度增加。
15.tRNA合成酶(ARS)抑制剂或其前药在制备用于治疗患有癌症的受试者的药物中的用途，所述癌症包含使ARS基因的一个拷贝失活的杂合突变。
16.如权利要求15所述的用途，其中所述杂合突变是ARS基因的一个拷贝的全部或一部分的缺失。
17.如权利要求16所述的用途，其中所述缺失是在选自由以下组成的组的区域处的杂合性的损失：5q13、1q41、6p21、9q24、11p15、1p13、1p35、16q13、16q24、5q31、5q32或5q35。
18.如权利要求15所述的用途，其中所述杂合突变是使ARS基因的一个拷贝失活的取代或插入。
19.如权利要求15所述的用途，其中所述ARS基因是EPARS、VARS、IARS、CARS、SARS、YARS、AARS、KARS、LARS、HARS或RARS之一。
20.如权利要求15所述的用途，其中所述ARS基因是TARS。
21.如权利要求15所述的用途，其中所述ARS抑制剂是小分子抑制剂。
22.如权利要求16所述的用途，其中所述小分子抑制剂包含疏螺体素或其前药。
23.如权利要求15所述的用途，其进一步包含蛋白质合成抑制剂。
24.一种选择患有癌症的受试者用于ARS抑制剂疗法的体外方法，所述方法包括：
(a)确定所述受试者的癌细胞是否包含使ARS基因的一个拷贝失活的杂合突变；以及
(b)如果受试者的癌细胞包含所述杂合突变，那么选择所述受试者用于ARS抑制剂疗法。
25.一种预测在患有癌症的受试者中对ARS抑制剂疗法的反应的体外方法，所述方法包括确定所述受试者的癌细胞是否包含使ARS基因的一个拷贝失活的杂合突变，其中如果所述癌细胞包含所述杂合突变，那么所述受试者被预测到对ARS抑制剂疗法具有良好的反应。
26.一种预测在患有癌症的受试者中对糖酵解抑制剂疗法的反应的体外方法，所述方法包括：
(a)确定所述受试者的癌细胞是否包含使ARS基因的一个拷贝失活的杂合突变；以及
(b)如果来自所述受试者的癌细胞包含所述杂合突变，那么将所述受试者鉴别为预测到对ARS疗法具有良好的反应；或如果来自所述受试者的癌细胞不包含所述杂合突变，那么将所述受试者鉴别为未预测到对ARS抑制剂疗法具有良好的反应。
27.如权利要求25或26所述的方法，其中对ARS疗法的良好的反应包括肿瘤尺寸或负荷减小、肿瘤生长受阻断、肿瘤相关疼痛减少、癌症相关病状减少、癌症相关症状减少、癌症无进展、无病间隔期增加、进展时间增加、诱导缓解、转移减少、患者存活期增加或肿瘤对抗癌疗法的敏感度增加。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113766955A (zh) * 2019-03-29 2021-12-07 得克萨斯大学体系董事会 对携带her2外显子21插入的癌细胞具有抗肿瘤活性的化合物

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG11201605698XA (en) 2014-01-13 2016-08-30 Berg Llc Enolase 1 (eno1) compositions and uses thereof
CN104894229A (zh) * 2014-03-04 2015-09-09 中南大学 己糖激酶2作为鼻咽癌放疗预后预测的生物标志物
EP3240566B1 (en) * 2014-12-31 2020-07-22 Development Center for Biotechnology Humanized alpha-enolase specific antibodies and methods of uses in cancer therapy
WO2016145113A1 (en) 2015-03-09 2016-09-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Enolase inhibitors and methods of treatment therewith
WO2017074788A1 (en) * 2015-10-27 2017-05-04 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for targeting cancer-specific sequence variations
CA2937896A1 (en) * 2016-08-02 2018-02-02 Universite De Montreal Use of mubritinib for the treatment of poor prognosis acute myeloid leukemia
CN107217054B (zh) * 2017-04-25 2020-08-14 中山大学肿瘤防治中心 G6pd基因及其表达产物在治疗结直肠癌中的应用
CN107460250B (zh) * 2017-09-28 2020-07-28 郑州大学第一附属医院 基于kif14、kif15和kif20a基因的透明细胞肾癌诊断试剂盒及其使用方法
KR102847999B1 (ko) * 2019-02-26 2025-08-21 노보큐어 게엠베하 표적 암세포들의 전기적 특징에 기초한 종양처리장 요법의 주파수 결정
US20220244263A1 (en) * 2019-05-28 2022-08-04 The Regents Of The University Of California Methods for treating small cell neuroendocrine and related cancers
EP4093513A4 (en) * 2020-01-24 2024-05-08 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. USE OF BIOMARKERS TO IMPROVE IMMUNOTHERAPY
CN113567675B (zh) * 2020-04-28 2023-09-22 苏州浚惠生物科技有限公司 用于肿瘤的己糖激酶2抑制剂液体活检伴随诊断和试剂盒
WO2022074066A1 (en) * 2020-10-06 2022-04-14 European Molecular Biology Laboratory Screening method for the identification of novel therapeutic compounds
US20250019708A1 (en) * 2021-11-19 2025-01-16 Institut Curie Methods for the treatment of hrd cancer and brca-associated cancer
WO2023239958A1 (en) * 2022-06-10 2023-12-14 The Children's Hospital Of Philadelphia Alternatively spliced isoform in cancer and methods of use thereof
CN114751961B (zh) * 2022-06-14 2022-09-20 中山大学孙逸仙纪念医院 circ0005199-173aa蛋白及其在制备食管癌诊断产品中的应用
CN115074445B (zh) * 2022-08-09 2023-08-08 河北医科大学第二医院 Eno3在肾癌诊断及治疗中的应用
CN115825308B (zh) * 2022-11-30 2023-06-09 江西省肿瘤医院(江西省第二人民医院、江西省癌症中心) 鼻咽癌相关尿液标志物在制备用于鼻咽癌诊断/预后的产品中的应用
CN116286828B (zh) * 2023-05-12 2023-08-18 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种寡聚核酸siRNA及其在制备用于预防和治疗肝癌的药物中的应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998041648A2 (en) * 1997-03-20 1998-09-24 Variagenics, Inc. Target genes for allele-specific drugs
WO2007072219A2 (en) * 2005-09-21 2007-06-28 Aurelium Biopharma Inc. Alpha enolase-directed diagnostics and therapeutics for cancer and chemotherapeutic drug resistance
US20090324682A1 (en) * 2004-08-30 2009-12-31 Youri Popowski Medical stent provided with inhibitors of atp synthesis
CN102225201A (zh) * 2010-05-11 2011-10-26 中国医学科学院基础医学研究所 糖酵解抑制剂的新用途

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5279721A (en) 1993-04-22 1994-01-18 Peter Schmid Apparatus and method for an automated electrophoresis system
US6046002A (en) 1998-01-05 2000-04-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Highly parallel and sensitive method for identifying drugs and drug targets
US6200754B1 (en) * 1998-03-19 2001-03-13 Variagenics, Inc. Inhibitors of alternative alleles of genes encoding products that mediate cell response to environmental changes
EP1392639B1 (en) 2001-05-03 2008-09-17 Galileo Laboratories, Inc. Pyruvate derivatives
WO2003082187A2 (en) 2002-03-26 2003-10-09 Indiana University Purification and cloning of nmn adenylyltranserase and its therapeutic use
EP2011885B1 (en) 2005-02-10 2015-04-22 Oncotherapy Science, Inc. Method of diagnosing bladder cancer
US8193238B2 (en) * 2006-03-08 2012-06-05 University Of Maryland, Baltimore Inhibition of microtubule protrusion in cancer cells
EP2086999B1 (en) 2006-11-02 2013-01-09 Staidson (Beijing) Biopharmaceuticals Co., Ltd Inhibitors for disrupting the interaction of ubiquitination related enzymes and uses thereof
TWI596109B (zh) * 2007-02-21 2017-08-21 腫瘤療法 科學股份有限公司 表現腫瘤相關抗原之癌症的胜肽疫苗
WO2009002607A1 (en) 2007-05-01 2008-12-31 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for identifying transforming and tumor suppressor genes

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998041648A2 (en) * 1997-03-20 1998-09-24 Variagenics, Inc. Target genes for allele-specific drugs
US20090324682A1 (en) * 2004-08-30 2009-12-31 Youri Popowski Medical stent provided with inhibitors of atp synthesis
WO2007072219A2 (en) * 2005-09-21 2007-06-28 Aurelium Biopharma Inc. Alpha enolase-directed diagnostics and therapeutics for cancer and chemotherapeutic drug resistance
CN102225201A (zh) * 2010-05-11 2011-10-26 中国医学科学院基础医学研究所 糖酵解抑制剂的新用途

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113766955A (zh) * 2019-03-29 2021-12-07 得克萨斯大学体系董事会 对携带her2外显子21插入的癌细胞具有抗肿瘤活性的化合物

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