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CN109276560B - 一种含乳铁蛋白的pH响应型微囊及其制备方法和应用 - Google Patents

一种含乳铁蛋白的pH响应型微囊及其制备方法和应用 Download PDF

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CN109276560B CN201811119834.9A CN201811119834A CN109276560B CN 109276560 B CN109276560 B CN 109276560B CN 201811119834 A CN201811119834 A CN 201811119834A CN 109276560 B CN109276560 B CN 109276560B
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Abstract

本发明属于活性蛋白缓释技术领域，公开了一种含乳铁蛋白的pH响应型微囊及其制备方法和应用。将PSS和PLGA通过溶剂置换法制备得到PLGA/PSS纳米粒子分散液，加入Lf溶液混合孵育，得到Lf‑PLGA/PSS纳米粒子，然后滴加到果胶溶液中包覆处理，将果胶包覆的Lf‑PLGA/PSS纳米粒子分散液加入到聚丙烯酸树脂溶液中，搅拌混合，再加入到HCl溶液中，搅拌混合，得到含乳铁蛋白的pH响应型微囊。本发明通过溶剂置换法和层层自组装技术制备pH响应型的微囊，具有粒径分布窄、吸附效率和稳定性高及小肠靶向缓释效果优异的特点。

Description

一种含乳铁蛋白的pH响应型微囊及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于活性蛋白缓释技术领域，具体涉及一种含乳铁蛋白的pH响应型微囊及其制备方法和应用。
背景技术
乳铁蛋白是一种相对分子量约为80kDa的铁结合性糖蛋白，主要存在于哺乳动物的乳汁中。它具有调节铁代谢、促进细胞生长、增强免疫、抗微生物、抗氧化及抗肿瘤等功能。美国食品药品管理局(FDA)允许乳铁蛋白作为食品添加剂用于运动、功能性食品。在我国，乳铁蛋白主要作为营养强化剂添加至婴幼儿配方奶粉或复合营养粉中制成口服冲剂。研究表明，口服乳铁蛋白与小肠黏膜上受体的相互作用是其发挥多种生物功能的基础。但是，由于乳铁蛋白相对分子质量大、水溶性强、对胃中的高酸及蛋白酶环境敏感、膜透过性差等，其口服生物利用度低于1％。因此，开发乳铁蛋白的小肠靶向缓释体系对于提高其口服生物利用度具有重要的意义。
目前，提高乳铁蛋白口服生物利用度的方法包括对其进行化学改性(如聚乙二醇化)、应用吸收促进剂、采用新型给药载体与递送系统(如脂质体、固体脂质颗粒、微粒)等。随着纳米技术研究的不断深入，纳米级口服传递系统以其独特的纳米效应和界面效应使得所负载活性物质在胃肠道中的稳定性和靶向缓释性能都得到提高。在纳米负载体系中，蛋白类活性物质被包埋于聚合物或脂质核心中，特别地，采用离子交联法制备负载蛋白质的壳聚糖纳米粒子及利用蛋白质亲水性将其包埋于两亲性脂质的亲水性核心中；或者通过静电作用吸附于具有一定电荷强度的纳米粒子表面。相对而言，通过包埋可以实现较高的活性物质负载效率。但是，该类纳米粒子在制备过程往往需要使用表面活性剂及较高的剪切力。另外，应用于蛋白质类活性物质口服传递的纳米负载体系还存在两个主要缺陷：其一，生物活性物质的负载效率低；其二，纳米负载体系在胃环境中稳定性差且存在明显的突释现象。因此，需要选择合适的纳米粒子制备方法及综合其它技术以提高纳米粒子的负载效率及其在胃肠道中的稳定性和靶向缓释性能。
发明内容
针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种含乳铁蛋白的pH响应型微囊的制备方法。
本发明的另一目的在于提供一种通过上述方法制备得到的含乳铁蛋白的pH响应型微囊。
本发明的再一目的在于提供上述含乳铁蛋白的pH响应型微囊在活性蛋白缓释材料中的应用。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种含乳铁蛋白的pH响应型微囊的制备方法，包括如下制备步骤：
(1)将聚苯乙烯磺酸钠(PSS)和聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)溶于有机溶剂中得到有机相，然后滴加到去离子水中搅拌混合均匀，蒸发去除体系中的有机溶剂，得到PLGA/PSS纳米粒子分散液；
(2)往步骤(1)所得PLGA/PSS纳米粒子分散液中加入乳铁蛋白(Lf)溶液，混合孵育，得到负载Lf的PLGA/PSS纳米粒子(Lf-PLGA/PSS纳米粒子)；
(3)将步骤(2)所得Lf-PLGA/PSS纳米粒子滴加到果胶溶液中，搅拌混合，离心去除上清液，再加入去离子水重新分散，得到果胶包覆的Lf-PLGA/PSS纳米粒子分散液；
(4)将步骤(3)所得果胶包覆的Lf-PLGA/PSS纳米粒子分散液加入到聚丙烯酸树脂溶液中，搅拌混合，得到混合溶液；
(5)将步骤(4)的混合溶液加入到HCl溶液中，搅拌混合，得到含乳铁蛋白的pH响应型微囊。
优选地，步骤(1)中所述PSS和PLGA加入的质量比为1:9。
优选地，步骤(1)中所述有机溶剂是指丙酮。
优选地，步骤(2)中所述混合孵育是指在5℃下孵育5h。
优选地，步骤(4)中所述聚丙烯酸树脂溶液通过如下方法制备得到：将聚丙烯酸树脂加入去离子水中，加入碱溶液调节pH，搅拌溶解，然后加酸中和至中性，得到聚丙烯酸树脂溶液。
优选地，所述聚丙烯酸树脂溶液的浓度为5～20mg/mL。
优选地，步骤(5)中所述HCl溶液是指pH为1.0的HCl溶液。
一种含乳铁蛋白的pH响应型微囊，通过上述方法制备得到。
上述含乳铁蛋白的pH响应型微囊在活性蛋白缓释材料中的应用。
本发明的制备方法及所得到的产物具有如下优点及有益效果：
(1)本发明通过溶剂置换法制备得到的纳米粒子具有较窄的粒径分布，且制备过程避免了高剪切力和表面活性剂的使用。
(2)本发明通过溶剂置换法制备带有一定负电荷强度的聚合物纳米粒子，可以提高阳离子型乳铁蛋白的吸附效率和稳定性。
(3)本发明利用层层自组装技术制备pH响应型的微囊用于乳铁蛋白的小肠靶向释放，该靶向体系可以降低乳铁蛋白在胃环境中的突释量，提高乳铁蛋白的稳定性，实现乳铁蛋白的小肠靶向缓释，进而提高乳铁蛋白的生物利用度，为乳铁蛋白口服新剂型的开发提供新的思路，拓展了层层自组装技术在活性蛋白缓释领域的应用空间。
附图说明
图1为实施例1～4所得含乳铁蛋白的pH响应型微囊的粒径图。
图2为实施例1～4所得含乳铁蛋白的pH响应型微囊的SEM图。
图3和图4及图5分别为实施例1所得含乳铁蛋白的pH响应型微囊经过不同的热处理后(M:蛋白质分子量标准；a:25℃，30min；b:60℃，30min；c:70℃，10min；d:70℃，20min；e:70℃，30min；f:80℃，10min；g:90℃，10min；C:对照组，pH 7.0的乳铁蛋白的水溶液)，微囊中乳铁蛋白的凝胶电泳图和圆二色谱图及其二级结构定量分析图。
图6为实施例1所得pH响应型微囊和对比例1所得非微囊化的果胶包覆的聚合物纳米粒子中的乳铁蛋白在体外模拟胃液和模拟小肠液中的连续释放曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
本实施例的一种含乳铁蛋白的pH响应型微囊的制备，具体步骤如下：
(1)将10mg质量比为1:9的PSS和PLGA混合物溶于1mL丙酮，得到的聚合物溶液作为有机相并逐滴加入到5mL去离子水中，于室温下搅拌8h。通过真空蒸发的方式去除体系中的有机溶剂，即得到PLGA/PSS纳米粒子分散液。
(2)往3mL步骤(1)所得到的PLGA/PSS纳米粒子分散液中加入1mL浓度为8.0mg/mL的Lf溶液，该混合体系于5℃下孵育5h，即得到Lf-PLGA/PSS纳米粒子分散液。
(3)将步骤(2)中得到的Lf-PLGA/PSS纳米粒子分散液逐滴加入到果胶溶液中，室温条件下搅拌2h得到果胶包覆的Lf-PLGA/PSS纳米粒子，然后在20000rpm条件下离心15min，去除上清液并加入等体积的去离子水重新分散，得到果胶包覆的Lf-PLGA/PSS纳米粒子分散液。
(4)取40mg聚丙烯酸树脂(ES-100)溶于8mL去离子水中，首先采用1mol/L的NaOH溶液调节体系pH至11.0，于25℃搅拌溶解，然后采用1％冰醋酸调节体系pH至7.0，得到浓度为5mg/mL的聚丙烯酸树脂溶液。往所得聚丙烯酸树脂溶液中加入体积为8mL步骤(3)所得到的果胶包覆的Lf-PLGA/PSS纳米粒子分散液，室温搅拌1h，得到混合溶液。
(5)将步骤(4)的混合溶液以2mL/min加入到4mL pH 1.0HCl溶液中，于25℃下快速搅拌2h，得到含乳铁蛋白的pH响应型微囊。
实施例2
本实施例的一种含乳铁蛋白的pH响应型微囊的制备，具体步骤如下：
(1)将10mg质量比为1:9的PSS和PLGA混合物溶于1mL丙酮，得到的聚合物溶液作为有机相并逐滴加入到5mL去离子水中，于室温下搅拌8h。通过真空蒸发的方式去除体系中的有机溶剂，即得到PLGA/PSS纳米粒子分散液。
(2)往3mL步骤(1)所得到的PLGA/PSS纳米粒子分散液中加入1mL浓度为8.0mg/mL的Lf溶液，该混合体系于5℃下孵育5h，即得到Lf-PLGA/PSS纳米粒子分散液。
(3)将步骤(2)中得到的Lf-PLGA/PSS纳米粒子分散液逐滴加入到果胶溶液中，室温条件下搅拌2h得到果胶包覆的Lf-PLGA/PSS纳米粒子，然后在20000rpm条件下离心15min，去除上清液并加入等体积的去离子水重新分散，得到果胶包覆的Lf-PLGA/PSS纳米粒子分散液。
(4)取80mg聚丙烯酸树脂(ES-100)溶于8mL去离子水中，首先采用1mol/L的NaOH溶液调节体系pH至11.0，于25℃搅拌溶解，然后采用1％冰醋酸调节体系pH至7.0，得到浓度为10mg/mL的聚丙烯酸树脂溶液。往所得聚丙烯酸树脂溶液中加入体积为8mL步骤(3)所得到的果胶包覆的Lf-PLGA/PSS纳米粒子分散液，室温搅拌1h，得到混合溶液。
(5)将步骤(4)的混合溶液以2mL/min加入到4mL pH 1.0HCl溶液中，于25℃下快速搅拌2h，得到含乳铁蛋白的pH响应型微囊。
实施例3
本实施例的一种含乳铁蛋白的pH响应型微囊的制备，具体步骤如下：
(1)将10mg质量比为1:9的PSS和PLGA混合物溶于1mL丙酮，得到的聚合物溶液作为有机相并逐滴加入到5mL去离子水中，于室温下搅拌8h。通过真空蒸发的方式去除体系中的有机溶剂，即得到PLGA/PSS纳米粒子分散液。
(2)往3mL步骤(1)所得到的PLGA/PSS纳米粒子分散液中加入1mL浓度为8.0mg/mL的Lf溶液，该混合体系于5℃下孵育5h，即得到Lf-PLGA/PSS纳米粒子分散液。
(3)将步骤(2)中得到的Lf-PLGA/PSS纳米粒子分散液逐滴加入到果胶溶液中，室温条件下搅拌2h得到果胶包覆的Lf-PLGA/PSS纳米粒子，然后在20000rpm条件下离心15min，去除上清液并加入等体积的去离子水重新分散，得到果胶包覆的Lf-PLGA/PSS纳米粒子分散液。
(4)取120mg聚丙烯酸树脂(ES-100)溶于8mL去离子水中，首先采用1mol/L的NaOH溶液调节体系pH至11.0，于25℃搅拌溶解，然后采用1％冰醋酸调节体系pH至7.0，得到浓度为15mg/mL的聚丙烯酸树脂溶液。往所得聚丙烯酸树脂溶液中加入体积为8mL步骤(3)所得到的果胶包覆的Lf-PLGA/PSS纳米粒子分散液，室温搅拌1h，得到混合溶液。
(5)将步骤(4)的混合溶液以2mL/min加入到4mL pH 1.0HCl溶液中，于25℃下快速搅拌2h，得到含乳铁蛋白的pH响应型微囊。
实施例4
本实施例的一种含乳铁蛋白的pH响应型微囊的制备，具体步骤如下：
(1)将10mg质量比为1:9的PSS和PLGA混合物溶于1mL丙酮，得到的聚合物溶液作为有机相并逐滴加入到5mL去离子水中，于室温下搅拌8h。通过真空蒸发的方式去除体系中的有机溶剂，即得到PLGA/PSS纳米粒子分散液。
(2)往3mL步骤(1)所得到的PLGA/PSS纳米粒子分散液中加入1mL浓度为8.0mg/mL的Lf溶液，该混合体系于5℃下孵育5h，即得到Lf-PLGA/PSS纳米粒子分散液。
(3)将步骤(2)中得到的Lf-PLGA/PSS纳米粒子分散液逐滴加入到果胶溶液中，室温条件下搅拌2h得到果胶包覆的Lf-PLGA/PSS纳米粒子，然后在20000rpm条件下离心15min，去除上清液并加入等体积的去离子水重新分散，得到果胶包覆的Lf-PLGA/PSS纳米粒子分散液。
(4)取160mg聚丙烯酸树脂(ES-100)溶于8mL去离子水中，首先采用1mol/L的NaOH溶液调节体系pH至11.0，于25℃搅拌溶解，然后采用1％冰醋酸调节体系pH至7.0，得到浓度为20mg/mL的聚丙烯酸树脂溶液。往所得聚丙烯酸树脂溶液中加入体积为8mL步骤(3)所得到的果胶包覆的Lf-PLGA/PSS纳米粒子分散液，室温搅拌1h，得到混合溶液。
(5)将步骤(4)的混合溶液以2mL/min加入到4mL pH 1.0HCl溶液中，于25℃下快速搅拌2h，得到含乳铁蛋白的pH响应型微囊。
对比例1
(1)将10mg质量比为1:9的PSS和PLGA混合物溶于1mL丙酮，得到的聚合物溶液作为有机相并逐滴加入到5mL去离子水中，于室温下搅拌8h。通过真空蒸发的方式去除体系中的有机溶剂，即得到PLGA/PSS纳米粒子分散液。
(2)往3mL步骤(1)所得到的PLGA/PSS纳米粒子分散液中加入1mL浓度为8.0mg/mL的Lf溶液，该混合体系于5℃下孵育5h，即得到Lf-PLGA/PSS纳米粒子分散液。
(3)将步骤(2)中得到的Lf-PLGA/PSS纳米粒子分散液逐滴加入到果胶溶液中，室温条件下搅拌2h得到果胶包覆的Lf-PLGA/PSS纳米粒子，然后在20000rpm条件下离心15min，去除上清液并加入等体积的去离子水重新分散，得到果胶包覆的Lf-PLGA/PSS纳米粒子分散液。
(4)取8mL去离子水中，首先采用1mol/L的NaOH溶液调节体系pH至11.0，然后采用1％冰醋酸调节体系pH至7.0，得到pH 7.0的水溶液。往所得水溶液中加入体积为8mL步骤(3)所得到的果胶包覆的Lf-PLGA/PSS纳米粒子分散液，室温搅拌1h，得到混合溶液。
(5)将步骤(4)的混合溶液以2mL/min加入到4mL pH 1.0HCl溶液中，于25℃下快速搅拌2h，得到含乳铁蛋白的非微囊化的果胶包覆的聚合物纳米粒子。
以上实施例1～4所得含乳铁蛋白的pH响应型微囊的粒径图如图1所示；所得含乳铁蛋白的pH响应型微囊的SEM图如图2所示。
以上实施例1所得含乳铁蛋白的pH响应型微囊经过不同的热处理后(M:蛋白质分子量标准；a:25℃，30min；b:60℃，30min；c:70℃，10min；d:70℃，20min；e:70℃，30min；f:80℃，10min；g:90℃，10min；C:对照组，pH 7.0的乳铁蛋白的水溶液)，微囊中乳铁蛋白的凝胶电泳图和圆二色谱图及二级结构定量图分别如图3和图4及图5所示。
将实施例1所得pH响应型微囊和对比例1所得非微囊化的果胶包覆的聚合物纳米粒子先置于模拟胃液2h，然后转移至模拟小肠液24h，进行体外释放实验，结果如图6所示。由图可见，实施例所得载乳铁蛋白的微囊在模拟胃液中的释放量少于1％，主要是因为聚丙烯酸树脂(ES-100)在强酸环境中不溶解，微囊结构未被破坏；在模拟小肠液中，体系pH升高至7.0，聚丙烯酸树脂(ES-100)逐渐溶解，包埋于微囊体系中游离的乳铁蛋白及载乳铁蛋白的果胶包覆的聚合物纳米粒子逐渐释放到体系中。同时，在pH 7.0条件下，乳铁蛋白分子负载的电荷量降低，加之模拟小肠液中的离子强度对聚合物纳米粒子表面电荷具有屏蔽效应。因此，乳铁蛋白与聚合物纳米粒子之间的静电作用减弱并使之逐渐解吸而释放到体系中。最终pH响应型微囊在模拟小肠液中20h的释放量大约为82％。而对比例所得非微囊化的果胶包覆的聚合物纳米粒子的乳铁蛋白在模拟胃液释放量明显大于实施例；在模拟小肠液中，对比例所得非微囊化的果胶包覆的聚合物纳米粒子中乳铁蛋白的释放量明显低于实施例。由此可见：本发明实施例制备的载乳铁蛋白的pH响应型微囊具有更优异的小肠靶向缓释效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种含乳铁蛋白的pH响应型微囊的制备方法，其特征在于包括如下制备步骤：
（1）将PSS和PLGA溶于有机溶剂中得到有机相，然后滴加到去离子水中搅拌混合均匀，蒸发去除体系中的有机溶剂，得到PLGA/PSS纳米粒子分散液；
（2）往步骤（1）所得PLGA/PSS纳米粒子分散液中加入Lf溶液，混合孵育，得到Lf-PLGA/PSS纳米粒子；
（3）将步骤（2）所得Lf-PLGA/PSS纳米粒子滴加到果胶溶液中，搅拌混合，离心去除上清液，再加入去离子水重新分散，得到果胶包覆的Lf-PLGA/PSS纳米粒子分散液；
（4）将步骤（3）所得果胶包覆的Lf-PLGA/PSS纳米粒子分散液加入到聚丙烯酸树脂溶液中，搅拌混合，得到混合溶液；
（5）将步骤（4）的混合溶液加入到HCl溶液中，搅拌混合，得到含乳铁蛋白的pH响应型微囊；
步骤（4）中所述聚丙烯酸树脂溶液通过如下方法制备得到：将聚丙烯酸树脂加入去离子水中，加入碱溶液调节pH，搅拌溶解，然后加酸中和至中性，得到聚丙烯酸树脂溶液；所述聚丙烯酸树脂溶液的浓度为5~20 mg/mL；
步骤（5）中所述HCl溶液是指pH为1.0 的HCl溶液。
2.根据权利要求1所述的一种含乳铁蛋白的pH响应型微囊的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述PSS和PLGA加入的质量比为1:9。
3.根据权利要求1所述的一种含乳铁蛋白的pH响应型微囊的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述有机溶剂是指丙酮。
4.根据权利要求1所述的一种含乳铁蛋白的pH响应型微囊的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述混合孵育是指在5℃下孵育5 h。
5.一种含乳铁蛋白的pH响应型微囊，其特征在于：通过权利要求1~4任一项所述的方法制备得到。
6.权利要求5所述的一种含乳铁蛋白的pH响应型微囊在制备活性蛋白缓释材料中的应用。
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