CN109232725A - 大豆c2h2型单锌指蛋白转录因子及编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种大豆C2H2型单锌指蛋白转录因子及编码基因与应用，属于植物基因工程领域。大豆C2H2型单锌指蛋白转录因子的氨基酸序列为SEQ ID N0.2，并在培育耐冷大豆品种中应用。C2H2型双锌指蛋白在国内外研究中被证实与逆境胁迫特别是耐冷方面起着重要作用，而单锌指蛋白则在植物生长发育中发挥着不可替代的作用，本发明成功挖掘了一个单锌指蛋白基因，在验证其具备调控生长发育相关功能之外，重点研究了其是否具备耐冷特性的功能，最终通过一系列的实验，发现了一个既参与生长发育的调控又具备独特耐冷性的双功能基因，这也为后期更深入功能的探究打下了坚实的基础，对改良培育新型多功能种质资源有着重要作用。

Description

大豆C2H2型单锌指蛋白转录因子及编码基因与应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种大豆C2H2型单锌指蛋白转录因子及其编码基因在转基因植物耐冷方面的应用。

背景技术

大豆是重要的经济作物，在世界范围内普遍种植，不仅是人类蛋白和脂类的主要来源，同时也是重要的家畜饲料和工业原料,在医学上也有很大价值。然而生物和非生物胁迫对大豆的生长和发育产生极为不利的影响，其中，低温严重影响着大豆的产量、品质和经济效益，造成严重的经济损失。因此，阐明大豆对逆境的响应机制，鉴定耐冷相关的重要基因并利用它们来提高大豆的耐盐性显得尤为重要。

植物转录因子在胁迫的刺激下可以不断合成并将信号传递和放大，调控下游多个基因的表达，从而引起植物生理生化的改变来适应外界的不利环境，近年来逐渐成为人们的研究热点。锌指蛋白是一种具有手指状结构域的转录因子，最初Milier于1983年在非洲爪蟾卵母细胞的转录因子TFⅢA中发现。按照锌指蛋白不同的功能和序列，Berg等将其分为9大类：C4,C6,C8,CCCH,C2HC,C2HC5,C2H2,C3HC4,C4HC3，目前研究最多的事C2H2类锌指蛋白。C2H2类锌指蛋白大约有30个氨基酸组成，锌指结构的保守序列为：C-X2-4-C-X3-P-X5-L-X2-H-X3-H(其中C为半胱氨酸，X为任何氨基酸，H为组氨酸，P为苯丙氨酸，L为亮氨酸)。这些序列能形成紧密的ββα结构，其中α螺旋和两条反向平行的β链将锌离子夹在其中，锌离子与α螺旋C端部分的两个组氨酸以及β链末端的两个半胱氨酸组成四面体结构。植物锌指蛋白不仅在形态建成，花粉、胚的发育等过程中参与调控，更是在非生物逆境中发挥着重要的作用。

迄今为止，锌指蛋白分为两类，一类是单锌指结构的蛋白，主要参与调控植物生殖器官的发育，种子发育生长等性状，而双锌指蛋白则主要参与到各种非生物胁迫中，许多与植物非生物胁迫相关的C2H2型锌指蛋白基因被国内外发现。其中，低温可以诱导植物体内某些锌指蛋白基因发挥作用从而使其耐低温胁迫。

Sakamoto等发现冷诱导下烟草转STZ基因的表达增强；Mukhopadhyay等将水稻锌指蛋白基因OSISAP1转入到烟草中表现出对低温的抗性增强；Sugano等研究发现再冷胁迫下，矮牵牛中所转的ZPT2-2、ZPT2-3基因易受冷诱导表达。对于大豆锌指蛋白，国内外研究的比较少，较为明确的分析只有SCOF-1，它一种由低温和ABA诱导的核定位的锌指蛋白基因，其组成型过量表达诱导COR基因的表达，增强未经抗寒筛选的转基因烟草和拟南芥的抗寒能力。

发明内容

本发明提供一种大豆C2H2型单锌指蛋白转录因子及编码基因与应用。

本发明所提供的C2H2型单锌指蛋白转录因子名称为GmC2H24-like，是具有序列表中SEQ ID N0.2氨基酸残基序列的蛋白质。

序列表中SEQ ID N0.2氨基酸残基序列是由251个氨基酸残基组成的蛋白质，是大豆中典型的单锌指蛋白结构的C2H2转录因子。

GmC2H24-like的编码基因，是序列表中SEQ ID N0.1的DNA序列，序列表中SEQ IDN0.1的DNA序列是由756个碱基组成，该基因的读码框为自5’端第1位到第756位碱基。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的GmC2H24-like的编码基因导入植物细胞，可获得对耐冷性得到提高的转基因细胞系及转基因植株。

本发明的基因对培育改良植物的耐冷能力的大豆品种具有重要意义，使用本发明的基因构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、GFP基因等)或具有抗性的抗生素标记物(氨苄青霉素、卡那霉素等)。携带有本发明GmC2H24-like的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物。

本发明所述大豆C2H2型单锌指蛋白转录因子在培育耐冷大豆品种中的应用。

本发明所述大豆C2H2型单锌指蛋白转录因子还参与生长发育的调控。

本发明所述大豆C2H2型单锌指蛋白转录因子能整合到拟南芥基因组中，并且能够在拟南芥中稳定遗传；转基因拟南芥电导率显著低于野生型拟南芥，转基因拟南芥叶片细胞膜受到的逆境伤害较轻；转基因拟南芥植株抗氧化系统的活性氧清除能力高于非转基因植株；冷胁迫4℃处理24小时后，转基因拟南芥植株比非转基因植株叶片受到的伤害小、转基因拟南芥叶片可溶性糖含量高于野生型拟南芥、转基因拟南芥叶片脯氨酸含量显著增加。

本发明的有益效果是：C2H2型双锌指蛋白在国内外研究中被证实与逆境胁迫特别是耐冷方面起着重要作用，而单锌指蛋白则在植物生长发育中发挥着不可替代的作用，本发明成功挖掘了一个单锌指蛋白基因，在验证其具备调控生长发育相关功能之外，重点研究了其是否具备耐冷特性的功能，最终通过一系列的实验，发现了一个既参与生长发育的调控又具备独特耐冷性的双功能基因。此外，这个单锌指蛋白基因是在吉林32大豆中克隆的，本实验室已构建了吉林32大豆在各个时期的表达图谱，图谱显示该基因在各个组织中均有表达，在根、茎、胚中表达量较高，这也为后期更深入功能的探究打下了坚实的基础。对改良培育新型多功能种质资源有着重要作用。

附图说明

图1是本发明GmC2H24-like的PCR扩增结果电泳图；

图中，M：DL2000 DNA Marker 1、2：目的基因PCR结果；

图2是本发明GmC2H24-like在大肠杆菌Rosetta(DE3)中的表达结果电泳图；

图中，M：低分子量蛋白质Marker，1：pET28a空载提对照，2：pET28a-GmC2H24-like未诱导菌体对照，3：pET28a-GmC2H24-like诱导菌体；

图3A在三缺培养基(SD/-Trp/-His/-Ade 10mM 3-AT)上目的基因GmC2H24-like、阳性对照pGAL4和空质粒pGBKT7在酵母AH109中的表达图；

图3B是目的基因GmC2H24-like、阳性对照pGAL4和空质粒pGBKT7在酵母AH109中表达后进行β半乳糖苷酶活性检测图；

图3C是三缺酵母培养基和β半乳糖苷酶活性检测平板上三个部分分别对应的基因位置图；

图4是本发明GmC2H24-like基因的组织特异性表达量图。

图5A是本发明GmC2H24-like在部分T2代转基因拟南芥中的PCR鉴定结果图；

图中，M：DL2000Marker；+：阳性对照；-：阴性对照；1-5：部分转基因拟南芥株系；

图5B：是本发明GmC2H24-like在部分T2代转基因拟南芥中的bar试纸条鉴定结果图；

图中，WT：野生型拟南芥；1、2、4：部分转基因拟南芥株系；

图6A是野生型和转基因T3代拟南芥22度常温条件下进行实时荧光定量PCR分析基因表达量图；

其中根、茎、叶每组均设计了对照和转基因两种，左侧条形图为野生型拟南芥表达情况，右侧条形图为转基因拟南芥表达情况；

图6B是野生型和转基因T3代拟南芥在4度低温处理后进行实时荧光定量PCR分析基因表达量图；

其中根、茎、叶每组均设计了对照和转基因两种，左侧条形图为野生型拟南芥表达情况，右侧条形图为转基因拟南芥表达情况。

具体实施方式

实施例1、大豆GmC2H24-like基因的克隆

用RNAiso Reagent(购自TaKaRa)分别提取大豆品种吉林32根、茎、叶和种子的总RNA，经1％琼脂糖电泳检测RNA的完整性。cDNA的合成按照Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)的说明书进行。根据GmC2H24-like(NM001255238)设计引物，5’-TAGCTTGAAAACTTAGCACAG-3’和5’-TAACAGCACATACAGAGCAAA-3’。按照以下反应体系及条件进行PCR扩增：25μl体系，内含10×PCR Buffer 2.5μl,2.5mM dNTP mix 2μl,10μM的引物1和引物2各1μl，cDNA 1μl，Taq DNA Polymerase(购自TIAN GEN，2.5u/μl)0.5μl，去离子水17μl。反应条件：预变性94℃8min；94℃30sec，58℃30sec，72℃60sec，共计30个循环；后延伸72℃8min。经PCR扩增得到GmC2H24-like由756个碱基对组成，读码框为自5’端第1位到第756位碱基，编码一个由251个氨基酸残基组成的蛋白质，其中包含一个C2H2单锌指蛋白保守结构域。

实施例2、大豆GmC2H24-like基因在原核中的表达

在基因的5’端和3’端分别设计含BamHI和SalI酶切位点的引物，以经测序鉴定正确的pMD18-T-GmC2H24-like的质粒为模板，进行PCR扩增，pMD18-T购自TaKaRa公司。引物为：

GmC2H24-like-YH-F：5’-CGCGGATCCATGAAACAACACTTTG-3’

GmC2H24-like-YH-R：5’-ACGCGTCGACTCAAAGTTTCAATGC-3’

将扩增产物经琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒(购自维特洁公司)纯化后，用BamHI和SalI双酶切，回收纯化后，与同样用BamHI和SalI双酶切的pET28a(+)(购自Novagen)载体连接。连接产物转化埃希氏大肠杆菌(E.coli)DH5α，经验证后，转入宿主菌Rosetta(DE3)(购自Novagen)中进行表达。

重组蛋白的原核表达：分别取阳性和空载体菌株接于5mL(50μg/mL卡那霉素和15μg/mL氯霉素)LB培养基中，37℃振摇培养过夜。取此种子液1％接种于10mL LB培养基，37℃振荡培养至OD₆₀₀约为0.6，加IPTG(100mM)至终浓度分别为0.6mM、0.8mM、1.0mM、1.2mM，37℃振荡培养，分别于培养的1h、2h、4h、6h，各取1.5mL不同IPTG浓度的诱导菌，4℃5000rpm离心5min收集菌体。

表达产物的SDS-PAGE分析：按照SDS-PAGE电泳常规方法进行。

经过诱导时间和IPTG诱导浓度的优化表明，pET28a(+)-GmC2H24-like在Rosetta(DE3)中的最佳诱导时间是4小时，IPTG的最佳诱导浓度是1.0mM，在此条件下GmC2H24-like蛋白(约为27.64KDa)有很高的表达。

实施例3、大豆GmC2H24-like基因在酵母中的表达

酵母表达载体的构建方法与实施例2方法相同。将GmC2H24-like亚克隆于pGBKT7(购自clontech)载体中，鉴定正确后，转入酵母AH109(购自clontech)中表达。

酵母感受态制备及转化方法参照Matchmaker^TMOne-Hybrid LibraryConstruction&Screening Kit(clontech)说明书进行。

重组质粒pGBKT7-GmC2H24-like转入酵母AH109后，能够在含有10mM 3-AT的缺陷型培养基SD/-Trp/-His/-Ade上生长，说明GmMYB12B2具有转录激活活性，是转录激活子。

实施例4、大豆GmC2H24-like基因的组织特异性表达

分别提取大豆品种吉林32的根、茎、叶、花及成熟种子的总RNA并反转录成cDNA,方法同实施例1。利用Real Time PCR对GmC2H24-like基因在大豆不同组织中的表达情况进行了检测,按照SYBR○R Premix Ex Taq^TMⅡ(购自TaKaRa)说明书,应用AgilentTechnologies Stratagene Mx305P扩增仪进行。其中，以大豆β-tubulin为内参基因，引物序列为tubulin-F:5’-GGAAGGCTTTCTTGCATTGGTA-3’；tubulin-R:5’-AGTGGCATCCTGGTACTGCA-3’。GmC2H24-like基因的引物为GmC2H24-like-qpcr-F：5’-AAAGAACAATAGCGAAGAG-3’；GmC2H24-like-qpcr-R：5’-GAGGGAACCTGATGGTAG-3’。

PCR反应体系如下：

数据分析使用KEYPLOT软件，见图4，结果表明GmC2H24-like基因在大豆的根中表达量最高，是叶片表达量的2.7倍；随着大豆逐渐发育成熟，进入生殖生长阶段。GmC2H24-like基因的表达也是随之升高的。GmC2H24-like基因在大豆组织中的这一表达模式，表明GmC2H24-like基因在大豆种子中可能具有一定调控作用。

实施例5、大豆GmC2H24-like基因在拟南芥中的表达

利用浸花法将pCB35S::GFP-zinc finger protein 4-like转化拟南芥Colμmbia-0生态型。具体方法如下：

5.1拟南芥的培养

l)将拟南芥的种子放入1.5离心管中，加入1mL次氯酸钠消毒3min，无菌水冲洗5-7次，无菌水浸泡，避光，4℃保存，春化4-6天；

2)春化后的种子播种在MS培养基上，用封口膜封好，在湿度80％，光强150μmol·s-1·m-2，光周期16h光照、8h黑暗的人工气候箱中培养；

3)光照培养大约2周，小苗长出4片真叶可进行移栽，移栽后浇PNS营养液，盖保鲜膜，培养条件如上，3-5天后揭膜，正常浇灌水即可；

4)开花时剪去莲座叶以上的主花轴(此时株高约10cm)，以促进次生花轴抽苔，7-9天后可作转化实验，此时株高约15cm，此时最大的花序已产生角果，转化前一天停止浇营养液或水。

5.2农杆菌的扩大培养和收获

l)将含有pCB35S::GFP-zinc finger protein 4-like双元表达载体的农杆菌于5mL(含有50mg/L利福平和100mg/L卡纳霉素)的YEB液体培养基中，28℃，200rpm，培养24h；

2)按5mL到500mL扩大培养，过夜培养，条件同上，至OD≈1.0-1.2；

3)5000rpm离心15min，弃去上清，重悬菌体于转化介质中(1/2大量元素，1×微量元素，1×铁盐，1×有机，5％蔗糖，pH 5.7-5.8)，重悬后的OD≈0.8-0.85；侵花前，向转化介质中加表面吸附剂(吐温)几滴来提高侵染率；

5.3真空渗透法转基因

1)拟南芥的角果剪去；

2)将拟南芥的花盆蒙上纱布，用橡皮筋扎紧。花盆倒扣在装有400mL菌重悬液的浸润罐上，使植株的花絮浸没在菌液中，侵花10min，转化后用吸水纸吸去多余菌液，用保鲜膜覆盖，暗培养16-24h；

3)揭膜后，浇足水，正常培养；一个月后，水逐渐减少，当大部分长角果成熟后，然后停止浇水；

4)单株收种子，这些种子被认为是T0代。

5.4转基因拟南芥种子的筛选

1)配制MS固体培养基，高压灭菌冷却后，加入适量的basta，使其终浓度为4mg/L，分装到灭菌培养皿中；

2)取拟南芥T0代种子装入1.5mL的离心管中，加入1mL次氯酸钠消毒5min，无菌水冲洗多次，4℃避光，春化2-3天；

3)将种子移入含有basta的MS培养皿中，加入少量的0.3％的琼脂糖溶液，轻轻摇荡，使种子在培养基上均匀分布，放在人工气候箱中培养；

4)待生长4片真叶时进行移栽，浇PNS营养液，成熟后按单株收种，为T1代种子。将T1代种子继续在含有basta的MS培养皿上筛选，成熟后收种，为T2代种子，直至得到T3代种子进行后续实验。

5.5T2代转基因拟南芥的分子检测与bar试纸条检测

1)分子检测：提取部分转基因拟南芥T2代的叶片总DNA，方法参照UniversalGenomic DNA Extracti-on Kit Ver.3.0(购自TaKaRa)说明书进行。稀释50倍后，取1μl为模板，分别以引物1和引物2，及bar基因的引物(bar-F：5’-AAACCCACGTCATGCCAGCTC-3’；bar-R：5’-CGACAAGCACGGTCAACTTC-3’)进行常规PCR扩增。其中以未转化的野生拟南芥为阴性对照，质粒pCB35S::GFP-zinc finger protein 4-like为阳性对照。

2)bar试纸条检测：取T2代转基因拟南芥植株的新鲜叶片，研磨成匀浆，稍离心，取叶片匀浆液于一新的无菌1.5ml离心管中，拿出试纸条(LibertyLink strip)插入匀浆中进行检测，大概5分钟后观察，显示两条带为转基因植株，只有一条指示带的为野生型非转基因植株。图5A和图5B为GmC2H24-like在部分T2代转基因拟南芥中的PCR鉴定结果与试纸条检测结果。

结果表明，GmC2H24-like基因已经成功整合到拟南芥基因组中，并且能够在拟南芥中稳定遗传。

实施例6、野生型和转GmC2H24-like基因T3代拟南芥低温处理后生理生化指标的测定

分别取野生型、转GmC2H24-like基因的T3代拟南芥植株22度和4度处理后叶片，每个叶片取三次重复。分别测定了POD、可溶性糖、电导率、脯氨酸含量和丙二醛含量。实验随机选取了三个转基因株系和野生型拟南芥作为对照，结果进行了差异显著性分析，结果见表1-表5。

表1：转GmC2H24-like基因部分T3代拟南芥和野生型拟南芥低温处理后相对电导率的测定结果

相对电导率

结果显示：常温条件下，转基因拟南芥和野生型拟南芥叶片相对电导率无显著差异，冷胁迫4℃处理24小时后，转基因拟南芥电导率显著低于野生型拟南芥，转基因拟南芥叶片细胞膜受到的逆境伤害较轻。

表2：转GmC2H24-like基因部分T3代拟南芥和野生型拟南芥低温处理后过氧化物酶(POD)活性的测定结果。

过氧化物酶POD活性

结果显示：常温条件下，转基因拟南芥和野生型拟南芥叶片POD活性无显著差异，冷胁迫4℃处理24小时后，转基因拟南芥叶片POD活性明显高于野生型拟南芥，达到了显著性水平，表明转基因拟南芥植株抗氧化系统的活性氧清除能力高于非转基因植株。

表3：转GmC2H24-like基因部分T3代拟南芥和野生型拟南芥低温处理后丙二醛(MDA)含量的测定结果。

MDA丙二醛含量

结果显示：常温条件下，转基因拟南芥和野生型拟南芥叶片丙二醛含量无显著差异，冷胁迫4℃处理24小时后，转基因拟南芥叶片丙二醛含量明显低于野生型拟南芥，达到了显著性水平，表明转基因拟南芥植株比非转基因植株叶片受到的伤害小。

表4：转GmC2H24-like基因部分T3代拟南芥和野生型拟南芥低温处理后可溶性糖含量的测定结果。

可溶性糖含量

结果显示：常温条件下，转基因拟南芥和野生型拟南芥叶片可溶性糖含量无显著差异，冷胁迫4℃处理24小时后，转基因拟南芥叶片可溶性糖含量高于野生型拟南芥。

表5：转GmC2H24-like基因部分T3代拟南芥和野生型拟南芥低温处理后脯氨酸含量的测定结果。

脯氨酸含量

结果显示：常温条件下，转基因拟南芥和野生型拟南芥叶片脯氨酸含量无显著差异，冷胁迫4℃处理24小时后，转基因拟南芥叶片脯氨酸含量显著增加。

实施例7、野生型和转基因T3代拟南芥4度处理前后基因表达情况。

分别提取4度处理前后野生型、转GmC2H2 4-like基因的T3代拟南芥植株的总RNA并反转录成cDNA,方法同实施例1。然后设计引物进行实时荧光定量pcr，方法如实施例4.数据分析结果显示，转基因植株在22度和4度处理前后均比野生型提高了很多，结果见图6A和图6B。

序列表

<110> 吉林大学

<120> 大豆C2H2型单锌指蛋白转录因子及编码基因与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 756

<212> DNA

<213> 大豆 吉林32(大豆 吉林32)

<400> 1

atgaaacaac actttgatct tgaagtggtg gcctcagcag aatatgaatc tgaagttagc 60

agcaaggttg cttccaatat atctatccaa gaaacctatg caggtccttg cagtgacaac 120

ctcaccaact cttccaatgt gacaaatcca atagagcttc atctccattc agatgctatc 180

tcccttgact taactctcaa attcaacaac aatgacttct cattctcaag cacaagtgag 240

agcagcaatg gtcctctctc tcaaactaat ttagcagcca acccgcgagt cttctcttgc 300

aattactgca agcgcaagtt tttcagctcg caggctcttg gcggccacca aaatgcgcac 360

aagagagaaa gaacaatagc gaagagagct atgcgaatgg ggatattctc tgagaggtat 420

gcaagtctag catctctccc ttttcatggt tctttcaggt ccttaggaat aaaggcacac 480

tcttcactgc accacggctt ttcgccaaca atgaggcctc ctgagatgaa aagcagtgca 540

agatttgagc aaggatatgt tggtcctcca atattcttgg aggaggatga ggcagaactc 600

ttgtggcaag gtagctacca tcaggttccc tctgagggag gccatactca tcggaatttc 660

acactcagtg gaagttcaaa tttgagtttt gttggttcga gtcttccacc agttgactta 720

gagaactcaa cacctgagtt gacattgaaa ctttga 756

<210> 2

<211> 251

<212> PRT

<213> 大豆 吉林32(大豆 吉林32)

<400> 2

Met Lys Gln His Phe Asp Leu Glu Val Val Ala Ser Ala Glu Tyr Glu

1 5 10 15

Ser Glu Val Ser Ser Lys Val Ala Ser Asn Ile Ser Ile Gln Glu Thr

20 25 30

Tyr Ala Gly Pro Cys Ser Asp Asn Leu Thr Asn Ser Ser Asn Val Thr

35 40 45

Asn Pro Ile Glu Leu His Leu His Ser Asp Ala Ile Ser Leu Asp Leu

50 55 60

Thr Leu Lys Phe Asn Asn Asn Asp Phe Ser Phe Ser Ser Thr Ser Glu

65 70 75 80

Ser Ser Asn Gly Pro Leu Ser Gln Thr Asn Leu Ala Ala Asn Pro Arg

85 90 95

Val Phe Ser Cys Asn Tyr Cys Lys Arg Lys Phe Phe Ser Ser Gln Ala

100 105 110

Leu Gly Gly His Gln Asn Ala His Lys Arg Glu Arg Thr Ile Ala Lys

115 120 125

Arg Ala Met Arg Met Gly Ile Phe Ser Glu Arg Tyr Ala Ser Leu Ala

130 135 140

Ser Leu Pro Phe His Gly Ser Phe Arg Ser Leu Gly Ile Lys Ala His

145 150 155 160

Ser Ser Leu His His Gly Phe Ser Pro Thr Met Arg Pro Pro Glu Met

165 170 175

Lys Ser Ser Ala Arg Phe Glu Gln Gly Tyr Val Gly Pro Pro Ile Phe

180 185 190

Leu Glu Glu Asp Glu Ala Glu Leu Leu Trp Gln Gly Ser Tyr His Gln

195 200 205

Val Pro Ser Glu Gly Gly His Thr His Arg Asn Phe Thr Leu Ser Gly

210 215 220

Ser Ser Asn Leu Ser Phe Val Gly Ser Ser Leu Pro Pro Val Asp Leu

225 230 235 240

Glu Asn Ser Thr Pro Glu Leu Thr Leu Lys Leu

245 250

Claims (10)

1.一种大豆C2H2型单锌指蛋白转录因子，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ ID N0.2。

2.如权利要求1所述的大豆C2H2型单锌指蛋白转录因子，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID N0.1。

3.如权利要求1所述的大豆C2H2型单锌指蛋白转录因子在培育耐冷大豆品种中的应用。

4.如权利要求3所述的大豆C2H2型单锌指蛋白转录因子在培育耐冷大豆品种中的应用，所述大豆C2H2型单锌指蛋白转录因子还参与生长发育的调控。

5.如权利要求1所述的大豆C2H2型单锌指蛋白转录因子能整合到拟南芥基因组中，并且能够在拟南芥中稳定遗传。

6.如权利要求1所述的大豆C2H2型单锌指蛋白转录因子能整合到拟南芥基因组中，并且能够在拟南芥中稳定遗传，其特征在于：转基因拟南芥电导率显著低于野生型拟南芥，转基因拟南芥叶片细胞膜受到的逆境伤害较轻。

7.如权利要求1所述的大豆C2H2型单锌指蛋白转录因子能整合到拟南芥基因组中，并且能够在拟南芥中稳定遗传，其特征在于：转基因拟南芥植株抗氧化系统的活性氧清除能力高于非转基因植株。

8.如权利要求1所述的大豆C2H2型单锌指蛋白转录因子能整合到拟南芥基因组中，并且能够在拟南芥中稳定遗传，其特征在于：冷胁迫4℃处理24小时后，转基因拟南芥植株比非转基因植株叶片受到的伤害小。

9.如权利要求1所述的大豆C2H2型单锌指蛋白转录因子能整合到拟南芥基因组中，并且能够在拟南芥中稳定遗传，其特征在于：冷胁迫4℃处理24小时后，转基因拟南芥叶片可溶性糖含量高于野生型拟南芥。

10.如权利要求1所述的大豆C2H2型单锌指蛋白转录因子能整合到拟南芥基因组中，并且能够在拟南芥中稳定遗传，其特征在于：冷胁迫4℃处理24小时后，转基因拟南芥叶片脯氨酸含量显著增加。