CN109199907A - 黄芪萃取物在制备用于抑制黑色素生成的组合物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黄芪多糖水溶性萃取物在制备用于抑制黑色素生成的组合物的中应用，其中该黄芪水溶性萃取物具有约20千道尔顿至约60千道尔顿的重均分子量。另一方面，本发明提供一种美白或淡斑面膜，其包含如上述的黄芪水溶性萃取物。
Description
【技术领域】
本发明涉及一种黄芪萃取物在制备用于抑制黑色素生成的组合物中的应用，其中该黄芪萃取物为黄芪多糖水溶性萃取物。
【背景技术】
黑色素表现的程度和分布是头发及皮肤颜色的主要调节剂。另一方面黑色素对于太阳光中紫外线辐射的致癌作用及有害影响中扮演重要的防护作用角色。在欧洲，异常的色素沉积过度像是黑斑病和老人斑都可能导致各种皮肤病。而在亚洲，人们则是希望皮肤能更白一点。
过去的研究注重在从植物中筛选出天然化合物来做为抗黑色素生成剂(Jang,J.Y.等人，ExpDermatol 2009,18,232-237；及Lee,H.D.等人，ExpDermatol 2011,20,761-763)。已经知道许多植物可以生产应用于化妆品上的化合物，其中有些化合物具有免疫调节活性并且抑制黑色素生成的作用(Liu,W.S.等人，Mar Drugs 2013,11,1899-1908)。
另外，CN 101134009 B揭示了黄芪的水不溶部分(黄芪皂苷化合物)用于制造护肤组合物的应用。
【发明内容】
在一方面，本发明提供一种黄芪多糖水溶性萃取物在制备用于抑制黑色素生成的组合物的中应用，其中该黄芪多糖水溶性萃取物为具有约20千道尔顿至约60千道尔顿的重均分子量。
在本发明的部分具体实施例中，该黄芪多糖水溶性萃取物中的阿拉伯糖∶半乳糖的摩尔比例为约1.5：1至约3：1，且包含摩尔百分比约5％至约25％的阿拉伯糖、摩尔百分比小于约5％的鼠李糖、摩尔百分比小于约10％的半乳糖醛酸、摩尔百分比约3％至约15％的半乳糖、及摩尔百分比约50％至约95％的葡萄糖。
在本发明的部分具体实施例中，该黄芪多糖水溶性萃取物包含摩尔百分比约5％至约15％的阿拉伯糖、摩尔百分比小于约1.5％的鼠李糖、摩尔百分比小于约4％的半乳糖醛酸、摩尔百分比约3％至约7％的半乳糖、及摩尔百分比约70％至约90％的葡萄糖。
在本发明的部分具体实施例中，该黄芪多糖水溶性萃取物通过包含以下步骤的方法制备：(a)由黄芪萃取出含有阿拉伯糖半乳聚糖组合物的水溶性萃取物；(b)在该水溶性萃取物中添加足够量的低碳数烷醇，以将阿拉伯糖半乳聚糖组合物沉淀出来，并分离沉淀的阿拉伯糖半乳聚糖组合物；(c)将该沉淀的阿拉伯糖半乳聚糖组合物溶于水中，以获得第一水溶液；(d)以离子交换色层层析管柱来纯化该第一水溶液，获得第二水溶液；及(e)自该第二水溶液中分离出该黄芪多糖水溶性萃取物。
根据本发明的较佳具体实施例，所述用于抑制黑色素生成的组合物为一种化妆品组合物，例如，用于美白或淡斑的组合物。
另一方面，本发明提供一种美白或淡斑面膜，其包含黄芪多糖水溶性萃取物，该黄芪多糖水溶性萃取物具有约20千道尔顿至约60千道尔顿的重均分子量。
在本发明的部分具体实施例中，该黄芪多糖水溶性萃取物中的阿拉伯糖∶半乳糖的摩尔比例为约1.5：1至约3：1，且包含摩尔百分比约5％至约25％的阿拉伯糖、摩尔百分比小于约5％的鼠李糖、摩尔百分比小于约10％的半乳糖醛酸、摩尔百分比约3％至约15％的半乳糖、及摩尔百分比约50％至约95％的葡萄糖。
在本发明的部分具体实施例中，该黄芪多糖水溶性萃取物包含摩尔百分比约5％至约15％的阿拉伯糖、摩尔百分比小于约1.5％的鼠李糖、摩尔百分比小于约4％的半乳糖醛酸、摩尔百分比约3％至约7％的半乳糖、及摩尔百分比约70％至约90％的葡萄糖。
在本发明的部分具体实施例中，该黄芪多糖水溶性萃取物通过包含以下步骤的方法制备：(a)由黄芪萃取出含有阿拉伯糖半乳聚糖组合物的水溶性萃取物；(b)在该水溶性萃取物中添加足够量的低碳数烷醇，以将阿拉伯糖半乳聚糖组合物沉淀出来，并分离沉淀的阿拉伯糖半乳聚糖组合物；(c)将该沉淀的阿拉伯糖半乳聚糖组合物溶于水中，以获得第一水溶液；(d)以离子交换色层层析管柱来纯化该第一水溶液，获得第二水溶液；及(e)自该第二水溶液中分离出该黄芪多糖水溶性萃取物。
本发明的其他目的及优点一部分记载于下述说明中，或者可通过本发明的实施例而理解。应了解前文的发明内容及下文的实施方式仅为例示性及阐释性的说明，而非如申请专利范围般限定本发明。
【附图说明】
图1显示通过细胞增殖测定法测定细胞活性；
图2显示黄芪多糖水溶性萃取物对细胞黑色素含量的影响(平均值±标准偏差；样品数＝6)；
图3为小鼠黑色素瘤细胞沉淀的照片。
细胞与或不与黄芪多糖水溶性萃取物共同培养48小时(0-100纳克/毫升)。*，p<0.05；**，p<0.01。
【具体实施方式】
除非另行定义，所有在本文中所使用的技术及科学术语具有如同本发明所属技术领域技术人员一般所了解的意义。
本文中所使用的「一」乙词，如未特别指明，是指至少一个(一个或一个以上)的数量。
除非另有说明，在说明书及申请专利范围中用以表示成分、反应条件的数量等的所有数字，应理解为加上「约」。因此，除非特别指明，说明书及申请专利范围中所述的数值为近似值。一般而言，本文中所使用的术语「约」，是指一测量值，例如，温度、时间以及剂量等，涵盖：相对于所指定的量，在一实施例中，±15％或±10％的变动，在另一实施例中，±5％的变动，在另一个实施例中，±1％的变动，在又一实施例中，±0.1％的变动，只要上述的变动对实施所揭露的方法而言是适当的。
「阿拉伯糖半乳聚糖蛋白质」或「AGP」通常可以用β-葡萄糖基亚里夫(Yariv)试剂来沉淀得到，属高度糖化的蛋白质，其碳水化合物约占分子量的至少50％，且主要的碳水化合物组成为阿拉伯糖及半乳糖，且该阿拉伯糖残基多半位于末端。其可与AGPs的单株抗体MAC207进行专一性的反应。
本文中所使用的术语「阿拉伯糖半乳聚糖组合物」是指一种组合物，其至少包含，以重量百分百计，至少70％，特别是至少80％，尤其是至少90％的阿拉伯糖半乳聚糖蛋白质，及相关的阿拉伯糖半乳聚糖及其他多糖。
本文所述的「黄芪多糖水溶性萃取物」是指一种经纯化的阿拉伯糖半乳聚糖组合物。
在一方面，本发明提供一种黄芪多糖水溶性萃取物在制备用于抑制黑色素生成的组合物的种应用，其中该黄芪多糖水溶性萃取物具有约20千道尔顿至约60千道尔顿的重均分子量。
根据本发明的较佳具体实施例，所述用于抑制黑色素生成的组合物为一种化妆品组合物，例如，用于美白或淡斑的组合物。
当制备为化妆品组合物，本发明的用于抑制黑色素生成可进一步包含一生理上可接受的载剂。所述化妆品组合物可为下列的形式之一：乳液、乳霜、凝胶、液剂、软膏或喷雾，其中该液剂可为注射剂。所述化妆品组合物可经由局部外用、注射或其他合适的方式而投予有需要的个体。
另一方面，本发明提供一种美白或淡斑面膜，其包含如上述的黄芪多糖水溶性萃取物。
在本发明的部分具体实施例中，该黄芪多糖水溶性萃取物中的阿拉伯糖(Ara)∶半乳糖(Gal)的摩尔比例为约1.5：1至约3：1，且包含摩尔百分比约5％至约25％的阿拉伯糖(Ara)、摩尔百分比小于约5％的鼠李糖(Rha)、摩尔百分比小于约10％的半乳糖醛酸(GalA)、摩尔百分比约3％至约15％的半乳糖(Gal)、及摩尔百分比约50％至约95％的葡萄糖(Glc)。
在本发明的部分具体实施例中，该黄芪多糖水溶性萃取物包含摩尔百分比约5％至约15％的阿拉伯糖、摩尔百分比小于约1.5％的鼠李糖、摩尔百分比小于约4％的半乳糖醛酸、摩尔百分比约3％至约7％的半乳糖、及摩尔百分比约70％至约90％的葡萄糖。
在本发明的部分具体实施例中，该黄芪多糖水溶性萃取物通过包含以下步骤的方法制备：(a)由黄芪萃取出含有阿拉伯糖半乳聚糖组合物的水溶性萃取物；(b)在该水溶性萃取物中添加足够量的低碳数烷醇，以将阿拉伯糖半乳聚糖组合物沉淀出来，并分离沉淀的阿拉伯糖半乳聚糖组合物；(c)将该沉淀的阿拉伯糖半乳聚糖组合物溶于水中，以获得第一水溶液；(d)以离子交换色层层析管柱来纯化该第一水溶液，获得第二水溶液；及(e)自该第二水溶液中分离出该黄芪多糖水溶性萃取物。
本发明中的黄芪多糖水溶性萃取物的定义如上所述，其自黄芪(Astragalusmembranaceus)(特别是根部)中分离，较佳是从蒙古黄芪或膜荚黄芪(Astragalusmembranaceus Bge.Var.mongholicus(Bge)Hsiao或A.membranaceus(Fisch)Bge.)的根部分离；较佳是生长在中国内蒙古或山西省的黄芪植物的根部，特别是前者；而且较佳的植物根部是选自生长两年的黄芪。
典型地，本发明中的黄芪多糖水溶性萃取物中阿拉伯糖∶半乳糖的摩尔比例不低于1.5∶1；特别是不低于1.75∶1；尤其是不低于3∶1。典型地，本发明中的黄芪多糖水溶性萃取物的重均分子量介于20至60千道尔顿之间，特别是介于25至40千道尔顿之间，尤其是介于27至35千道尔顿之间。
在所述黄芪多糖水溶性萃取物的萃取流程中，可在有或无碱金属盐(特别是磷酸二氢钾或磷酸二氢钠)这类共萃物存在下，以热水在一温度下(温度一般不低于80℃，特别是不低于90℃，特别是约100℃)萃取黄芪晒干后的根部(一般是于无菌下将干燥的根部切片和分割，修剪干燥的根部，用超过滤水搓洗，再用诸如70％酒精的灭菌溶液冲洗后，将根部切成薄片，并于灭菌条件下风干)一段时间，并视需要重复进行许多次萃取步骤，让根部的阿拉伯半乳聚糖蛋白质及相关的多糖可尽量溶出(一般是在约100℃，萃取三次，每次3小时)。所有在制备根部碎片后进行的步骤都是使用无菌设备和试剂在无菌环境下操作。将热水萃出物浓缩(于60-70℃下真空浓缩至约1公升/千克的干燥根部)，然后用低碳数烷醇(例如酒精，室温下最终浓度是70％)沉淀。再用更低碳数的醇类来清洗这些低碳数烷醇的沉淀物(一般是用95％酒精清洗三次)，并用适当浓度悬浮于水中等待进一步处理(一般是18-20％重量/体积)。然后将悬浮液中不溶于水的物质去除，例如由低碳数烷醇(约35％的乙醇)加入沉淀去除。然后，低碳数烷醇沉淀物(例如35％的酒精沉淀物)的上清液再用高浓度的低碳数烷醇作进一步沉淀，例如40-80％的酒精，特别是60-70％的酒精，将内含阿拉伯半乳聚糖蛋白质和结合多糖的阿拉伯半乳聚糖组合物的粗产物沉淀出来。将沉淀再溶于水中，并干燥(喷雾干燥，避免过度加热)，得到分离出来的阿拉伯半乳聚糖组合物的粗产物。该组合物粗产物一般是淡黄色粉末，可溶于水。
可用离子交换色层层析法进一步纯化阿拉伯半乳聚糖组合物的粗产物。将其溶于水，或是将沉淀溶解后的溶液调整至适当浓度(一般约2％)，然后进行超过滤，去除掉低分子量部分，以减少溶液体积(例如，用可排除分子量在5千道尔顿下的超过滤系统(5KMWCOUF系统)进行过滤)。再将超过滤后的上清液流经阳离子交换管柱(例如，SP琼脂糖凝胶阳离子交换管柱，用pH 5.20的20mM乙酰钠(NaOAc)缓冲液平衡)，再将洗脱液装填至阴离子交换管柱中(例如，Q琼脂糖凝胶阴离子交换管柱，用同样的NaOAc缓冲液平衡)。从阴离子交换管柱中洗脱液可直接拿来制备如本文中所述的黄芪多糖水溶性萃取物，或可浓缩干燥形成一种适合用来制备黄芪多糖水溶性萃取物组合物的中间产物。在制备如本文中所述的黄芪多糖水溶性萃取物时，可用能过滤细菌的微过滤膜(例如，0.1μm的滤膜)进行超过滤，去除盐类并减少溶液体积(例如，使用8K MWCO UF系统)。将超过滤后的上清液浓缩(50-60℃下，20-26％)，然后用低碳数烷醇(约80-90％的乙醇)进行沉淀。进一步清洗沉淀(例如，使用无水酒精清洗三次)，并干燥(60-70℃的真空烤箱)，可获得如本文中所述的黄芪多糖水溶性萃取物。
如本文中所述的黄芪多糖水溶性萃取物的制备方法在TW I240629、CN 1179979 C或TW I507201中亦有揭示，兹将前述文献的全文并入本文中作为参考文献。
现参照下列特别的非限定性实施例更详细地说明本发明。
材料与方法
1.细胞
小鼠B16F10黑色素瘤细胞使用Dulbecco改良的Eagle培养基包含有10％胎牛血清、1％谷氨酰胺和50μg/ml庆大霉素且在37℃及5％CO2的条件下来培养。
2.细胞增殖测定
细胞(105/孔)用不同浓度的黄芪多糖水溶性萃取物在无血清培养基中处理24小时。根据制造商的指示，通过细胞计数试剂盒-8(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)来评估细胞增殖状况。
3.黑色素含量测定
在实验最后收集细胞并在冷裂解缓冲液(20mM磷酸钠pH 6.8、1％Triton X-100、1mM PMSF和1mM EDTA)中裂解。将黑色素颗粒在100℃下溶解在Soluene-350(Perkin-Elmer,Waltham,MA,USA)中15分钟，并以15,000g离心15分钟。测量500nm处的吸亮度。
4.统计学分析
所有数据均以平均值±标准偏差表示。使用变异数分析来测定组间的差异。p值小于0.05表示具有统计上的显著性。
实施例1：黄芪多糖水溶性萃取物的制备
步骤A.「浸制切片」
将300千克晒干的黄芪(Astragalus membranaceus)根部经过除污，灭菌清洗并用超过滤水搓洗，然后浸泡在70％酒精中过夜，切成厚约3-5毫米的薄片，在60-70℃的灭菌烘箱中烘干，制成「浸制切片」。这些烘干后的「浸制切片」因干燥减重约<15％。
步骤B.阿拉伯半乳聚糖组合物的粗萃取
将200千克步骤A中制备的「浸制切片」，用UF水(以10KMWCO UF系统进行超过滤的去离子水)在100℃下萃取3次，每次3小时。在60-70℃下，将混合萃取液减压浓缩至约200公升。在浓缩液中加入95％的酒精，使酒精最终浓度达70％，室温下搅拌15分钟，沉淀多糖。轻轻倒出上清液，用95％酒精清洗沉淀3次。将沉淀悬浮在UF水中，浓度约18-20％(由折射计测定)，再加入95％酒精，使酒精最终浓度是35％。将酒精悬浮液离心，丢弃沉淀部分，并在上清液中加入95％酒精，并搅拌使酒精浓度达70％。收集沉淀部分，再用UF水溶解，干燥可得阿拉伯半乳聚糖组合物的粗产物。
阿拉伯半乳聚糖组合物的粗产物是质地轻的黄色粉末，水中溶解度是200毫克/毫升，烘烤减重约<15％。
步骤C.阿拉伯半乳聚糖组合物的纯化
将3.5千克，步骤B中制备的阿拉伯半乳聚糖组合物的粗产物，用UF水溶解得到浓度2％的溶液(体积175公升)。用5K MWCOUF系统将溶液过滤至终体积35-40公升。添加pH5.2的1.0M乙酰钠(NaOAc)缓冲液将浓缩液配制成pH5.2的20mM NaOAc缓冲液。将溶液装填到SP琼脂糖凝胶阳离子树脂交换柱(体积20升，床层高30厘米)中，并用20mM NaOAc洗脱，收集2.5-3.0倍床体积的洗脱液。将收集的洗脱液装填到Q琼脂糖凝胶阴离子树脂交换柱(与SP柱体积和床层高度相同)中，并用20mM NaOAc洗脱，收集3-3.5倍床体积的洗脱液。从Q琼脂糖凝胶阴离子树脂交换柱收集的洗脱液用0.1μm滤器过滤后，再用8K MWCO UF系统进行超过滤。将残留液体用浓缩系统在50-60℃下浓缩至20-26％，再添加无水酒精进行沉淀，酒精最终浓度是80-90％。用无水酒精清洗沉淀3次，然后在60-70℃下烘干，可得纯化的阿拉伯半乳聚糖组合物(即本文中所述的一种黄芪多糖水溶性萃取物)。
纯化的阿拉伯半乳聚糖组合物是一种白色粉末，溶于水、生理食盐水、及5％的葡萄糖水，浓度是20毫克/毫升，而且含水量≤6.0％。组合物的含糖量≦85％(以葡萄糖为标准物，由甲酚-硫酸法来测定)，组合物Ara∶Gal比例≥1.5∶1(采用GLC分析所述组合物三甲基硅甲基糖苷衍生物来测定)。
实施例2：黄芪多糖水溶性萃取物抗黑色素生成活性试验
使用小鼠B16F10黑色素瘤细胞系统评估黄芪萃取物的抗黑色素生成活性。如图1-3所示，使用黄芪多糖水溶性萃取物处理后测定B16F10细胞的存活和黑色素含量。结果可观察于黄芪多糖水溶性萃取物处理的细胞中(1-100纳克/毫升)没有观察到显著的细胞毒性(图1)。经由α黑色素细胞激素处理后的细胞中黑色素含量有显著上升。黄芪多糖水溶性萃取物处理后，即使经由α黑色素细胞激素刺激的B16F10细胞的黑色素含量亦会显著降低(图2)。使用黄芪多糖水溶性萃取物处理会导致B16F10细胞的黑色素含量显著降低且具有剂量依赖性(图3)。这些结果显示黄芪多糖水溶性萃取物具有抑制黑色素生成的能力且对细胞没有伤害。
Claims (10)
1.一种黄芪多糖水溶性萃取物在制备用于抑制黑色素生成的组合物中的应用，其中该黄芪多糖水溶性萃取物具有约20千道尔顿至约60千道尔顿的平均分子量。
2.如权利要求1所述的应用，其中该黄芪多糖水溶性萃取物中的阿拉伯糖∶半乳糖的摩尔比例为约1.5：1至约3：1，且包含摩尔百分比约5％至约25％的阿拉伯糖、摩尔百分比小于约5％的鼠李糖、摩尔百分比小于约10％的半乳糖醛酸、摩尔百分比约3％至约15％的半乳糖、及摩尔百分比约50％至约95％的葡萄糖。
3.如权利要求2所述的应用，其中该黄芪多糖水溶性萃取物包含摩尔百分比约5％至约15％的阿拉伯糖、摩尔百分比小于约1.5％的鼠李糖、摩尔百分比小于约4％的半乳糖醛酸、摩尔百分比约3％至约7％的半乳糖、及摩尔百分比约70％至约90％的葡萄糖。
4.如权利要求1所述的应用，其中该黄芪多糖水溶性萃取物通过包含以下步骤的方法制备：(a)由黄芪萃取出含有阿拉伯糖半乳聚糖组合物的水溶性萃取物；(b)在该水溶性萃取物中添加足够量的低碳数烷醇，以将阿拉伯糖半乳聚糖组合物沉淀出来，并分离沉淀的阿拉伯糖半乳聚糖组合物；(c)将该沉淀的阿拉伯糖半乳聚糖组合物溶于水中，以获得第一水溶液；(d)以离子交换色层层析管柱来纯化该第一水溶液，获得第二水溶液；及(e)自该第二水溶液中分离出该黄芪多糖水溶性萃取物。
5.如权利要求1-4中任一项所述的应用，其中该用于抑制黑色素生成的组合物为用于美白或淡斑的组合物。
6.如权利要求5所述的应用，其中该用于美白或淡斑的组合物为下列的形式之一：乳液、乳霜、凝胶、液剂、软膏或喷雾。
7.一种美白或淡斑面膜，其包含黄芪多糖水溶性萃取物，其中该黄芪多糖水溶性萃取物具有约20千道尔顿至约60千道尔顿的重均分子量。
8.如权利要求7所述的美白或淡斑面膜，其中该黄芪多糖水溶性萃取物中的阿拉伯糖∶半乳糖的摩尔比例为约1.5：1至约3：1，且包含摩尔百分比约5％至约25％的阿拉伯糖、摩尔百分比小于约5％的鼠李糖、摩尔百分比小于约10％的半乳糖醛酸、摩尔百分比约3％至约15％的半乳糖、及摩尔百分比约50％至约95％的葡萄糖。
9.如权利要求7所述的美白或淡斑面膜，其中该黄芪多糖水溶性萃取物包含摩尔百分比约5％至约15％的阿拉伯糖、摩尔百分比小于约1.5％的鼠李糖、摩尔百分比小于约4％的半乳糖醛酸、摩尔百分比约3％至约7％的半乳糖、及摩尔百分比约70％至约90％的葡萄糖。
10.如权利要求7所述的美白或淡斑面膜，其中该黄芪多糖水溶性萃取物通过包含以下步骤的方法制备：(a)由黄芪萃取出含有阿拉伯糖半乳聚糖组合物的水溶性萃取物；(b)在该水溶性萃取物中添加足够量的低碳数烷醇，以将阿拉伯糖半乳聚糖组合物沉淀出来，并分离沉淀的阿拉伯糖半乳聚糖组合物；(c)将该沉淀的阿拉伯糖半乳聚糖组合物溶于水中，以获得第一水溶液；(d)以离子交换色层层析管柱来纯化该第一水溶液，获得第二水溶液；及(e)自该第二水溶液中分离出该黄芪多糖水溶性萃取物。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20190115 |
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| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |