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CN109142703B - 基于水溶性钙钛矿纳米晶的黄曲霉素m1的检测方法 - Google Patents

基于水溶性钙钛矿纳米晶的黄曲霉素m1的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于水溶性钙钛矿纳米晶的黄曲霉素M1的检测方法。所述方法首先在CsX、PbX2的原料中添加少量的表面活性剂油胺，通过球磨得到可在水中分散的水溶性钙钛矿纳米晶，再通过表面进一步修饰阴离子表面活性剂使其表面带负电荷，与黄曲霉素M1的抗体相结合，采用荧光免疫检测方法对黄曲霉素M1进行定量检测。本发明制备钙钛矿纳米晶的工艺简单，成本低廉，荧光效率高，可对黄曲霉素M1进行定量检测，检测灵敏度可达0.01ng/mL，开拓了钙钛矿材料的应用范围，具有良好的应用前景。

Description

基于水溶性钙钛矿纳米晶的黄曲霉素M1的检测方法
技术领域
本发明涉及一种基于水溶性钙钛矿纳米晶的黄曲霉素M1的检测方法，属于免疫分析领域。
背景技术
卤化物钙钛矿材料具有出色的光伏性能和较高的能量转化率，在背光荧光粉领域具有巨大潜力。与有机无机杂化钙钛矿(CH3NH3PbX3)相比，无机钙钛矿(CsPbX3)显示出优异的稳定性，在光电子学具有巨大潜在应用价值。
钙钛矿发光性能优异，在生物成像、荧光免疫检测探针等都具有应用潜力，然而其水稳性能依然是技术瓶颈，水溶更是难以实现，大大限制了其在生物方面的应用。为实现水溶性能，有研究通过制备油溶性的钙钛矿纳米晶，随后用固体脂质纳米颗粒来包裹钙钛矿纳米晶实现水溶，然而其制备方法复杂，且有机溶剂使用量大，不利于大批量生产与环保要求([1]Gomez L,de Weerd C,Hueso J L,et al.Color-stable water-dispersed cesiumlead halide perovskite nanocrystals[J].Nanoscale,2017,9(2):631-636.)。
在免疫检测中，荧光免疫检测快捷且操作简易，是一种优异的免疫检测方法。黄曲霉素M1是一种易接触人体的致毒物，且由于大多存在于牛奶等奶制品中，其暴露的对象包含婴幼儿，因此其检测十分必要。目前国内外检测黄曲霉素M1的方法有高效液相法、液质联用、荧光探针法等([2]Wang Y，et al.HPLC determination of aflatoxin M1in liquidmilk and milk powder using solid phase extraction on 0ASIS HLB.Food Control，2012；28(1)：13l一134.[3]Cavaliere C，Foglia P，et al.Anatoxin M1determination incheese by liquid chromatography—tandem mass spectrometry.J Chromatography A，2006；1135(2)：135一141.[4]Tayebi M,et al.Determination of total aflatoxinusing cysteamine-capped CdS quantum dots as a fluorescence probe[J].Colloid&Polymer Science,2016,294(9):1-10.)。其中荧光探针法快捷便利，无需昂贵的仪器，是非常活跃的研究领域。目前，将钙钛矿应用于黄曲霉素M1的检测中仍未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于水溶性钙钛矿纳米晶的黄曲霉素M1的检测方法。
实现上述目的的技术方案如下：
基于水溶性钙钛矿纳米晶的黄曲霉素M1的检测方法，具体步骤如下：
步骤1，将油胺加入到CsX和PbX2粉末中，以300～500rpm的转速球磨1～7h，其中球料质量比为15:1～30:1，所述的X为Cl、Br、I，CsPbX3的摩尔量与油胺的体积比为10～40:1；
步骤2，在球磨粉末中加入水溶性阴离子表面活性剂，加入Tris缓冲液搅拌溶解，调节pH至7～8，得到水溶性钙钛矿溶液；
步骤3，将黄曲霉素M1抗体溶液加入到水溶性钙钛矿溶液中，混匀后室温静置进行吸附，得到抗体和水溶性钙钛矿的混合溶液；
步骤4，将待检测的黄曲霉素M1溶液与包被液混合，37℃下孵育进行包被，包被结束后，除去液体，清洗，甩干，加入4％牛奶稀释液，在37℃孵育，清洗，甩干；
步骤5，将抗体和水溶性钙钛矿的混合溶液滴加到步骤4中包被的待检测的黄曲霉素M1中，检测吸光度，得到初始吸光度F0，之后37℃下孵育，孵育结束后，清洗，甩干，检测吸光度，得到最终吸光度F，根据黄曲霉素M1的浓度与F/F0的标准曲线关系，计算得到待检测的黄曲霉素M1的浓度。
步骤2中，所述的阴离子表面活性剂为十二烷基硫酸钠(SDS)，钙钛矿纳米晶与水溶性阴离子表面活性剂的质量比为5:1～10:1。
步骤3，所述的静置吸附时间为15～30min。
步骤4，所述的包被孵育时间为1～2h。
步骤5，所述的孵育时间为20～30min。
与现有技术相比，本发明具有以下显著优点：
1)采用一步球磨法制备水溶性钙钛矿纳米晶，该方法简单，可批量放大生产，成本低，制得的钙钛矿在水中稳定；
2)将水溶性钙钛矿纳米晶用于黄曲霉素M1的检测，检测灵敏度可达0.01ng/mL，达到实际应用的要求，拓宽了黄曲霉素M1荧光检测范围。
本发明首次将钙钛矿应用于检测黄曲霉素M1的检测中，拓宽了钙钛矿的应用范围。
附图说明
图1为实施例1和实施例3制备的钙钛矿纳米晶的XRD图。
图2为实施例1制备的钙钛矿纳米晶的TEM图。
图3为实施例1制备的钙钛矿纳米晶的PL图。
图4为实施例1制备的钙钛矿纳米晶的紫外吸收图谱随水溶浓度的变化图。
图5为实施例1制备的钙钛矿纳米晶与抗体偶联的TEM图。
图6为实施例1制备的钙钛矿纳米晶与抗体偶联不同pH下的荧光检测变化图。
图7为实施例2钙钛矿纳米晶检测黄曲霉素M1的标准曲线。
图8为实施例4制备的钙钛矿纳米晶水溶液照片。
图9为实施例5制备的钙钛矿纳米晶的PL图。
图10为实施例1和对比例1制备的钙钛矿纳米晶与抗体结合后静置后的图。
图11为对比例2制得的钙钛矿纳米晶在水中的分散情况图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。
本发明在CsX、PbX2的原料中添加少量的表面活性剂，通过球磨的方法得到可在水中分散的发光纳米晶，通过表面进一步修饰阴离子表面活性剂使得表面带负电荷，与黄曲霉素M1的抗体相结合，通过荧光免疫检测方法可针对黄曲霉素M1进行定量检测。
实施例1
基于水溶性钙钛矿纳米晶的黄曲霉素M1的检测方法，具体包括如下步骤：
1)将100μL油胺加入到2mmol的CsBr与PbBr2粉末中，充入氩气进行保护，密封球磨罐，以400rpm的转速球磨2h，其中球料质量比为30:1；
2)在80mg球磨粉末中加入10mg的SDS粉末，加入2mL Tris缓冲液，搅拌溶解，调节pH至7.4，得到水溶性钙钛矿溶液；
3)将步骤2)的溶液取8份75μL，分别加425μL纯水稀释，用0.1M的K2CO3溶液对溶液pH进行调节，分别滴加1～8μL并用混匀器进行混匀；
4)取10μL黄曲霉素M1抗体溶液分别加到步骤3)的混合溶液中，混匀并室温静置半小时进行吸附；
5)配制黄曲霉素M1抗原溶液浓度为0.25ug/mL，包被液(Na2CO3、NaHCO3)每个孔滴加100uL，抗原溶液滴加100uL，在酶标仪中晃板多次混合均匀，37℃孵育2h进行包被，之后倒掉孔中溶液进行自动洗板，并摔干；在孔中加入牛奶稀释液(4％的浓度)，在37℃培养1h，之后进行自动洗板三次，留待备用；
6)将100μL不同pH梯度的步骤4)溶液分别加入到孔板中，晃匀，并用酶标仪进行初始值测量；
7)将步骤6)溶液在37℃下培养半小时，自动洗板三次，摔干，用酶标仪测量荧光最终值。
本实施例制得的CsPbBr3钙钛矿纳米晶其结晶性表征XRD见图1的1，其晶相的峰位和强度与钙钛矿的标准卡片相吻合，说明其良好的结晶性。其相貌TEM图见图2，晶粒尺寸分布为50～100nm。其水溶液的PL发光谱图见图3，发光峰中心波长为522nm，半峰宽仅为18nm。其紫外吸收图谱随水溶浓度的变化见图4，在水中的溶解度可达3.4mg/mL。与抗体偶联的TEM图见图5，从a到c依次为CsPbBr3钙钛矿纳米晶、抗体以及偶联后的荧光探针。不同pH下荧光检测变化图见图6，当pH较大时，其检测效果好。
实施例2
1)将100μL油胺加入到2mmol的CsBr与PbBr2粉末中，充入氩气进行保护，密封球磨罐，以400rpm的转速球磨2h，其中球料质量比为30:1；
2)在80mg球磨粉末中加入10mg的SDS粉末，加入2mL Tris缓冲液，搅拌溶解，调节pH至7.4，得到水溶性钙钛矿溶液；
3)将步骤2)的溶液取75μL，加425μL纯水稀释，用0.1M的K2CO3溶液对溶液pH进行调节，滴加8μL并用混匀器进行混匀；
4)取10μL黄曲霉素M1抗体溶液分别加到步骤3)的混合溶液中，混匀并室温静置半小时进行吸附；
5)配制不同浓度的黄曲霉素M1抗原溶液，包被液(Na2CO3、NaHCO3)每个孔滴加100uL，抗原溶液滴加100uL，在酶标仪中晃板多次混合均匀，37℃孵育2h进行包被，之后倒掉孔中溶液进行自动洗板，并摔干；在孔中加入牛奶稀释液(4％的浓度)，在37℃培养1h，之后进行自动洗板三次，留待备用；
6)将100μL步骤4)溶液加入到孔板中，晃匀，并用酶标仪进行初始值测量；
7)将步骤6)溶液在37℃下培养半小时，自动洗板三次，摔干，用酶标仪测量荧光最终值。
钙钛矿纳米晶检测黄曲霉素M1的标准曲线见图7。在0.02to 10.1ng/mL的黄曲霉素M1浓度范围内呈现线性变化，其检测灵敏度可达0.01ng/mL，可满足实际应用的要求。
实施例3
1)将50μL油胺加入到2mmol的CsBr与PbBr2粉末中，充入氩气进行保护，密封球磨罐，以400rpm的转速球磨2h，其中球料质量比为30:1；
2)在50mg球磨粉末中加入10mg的SDS粉末，加入2mL Tris缓冲液，搅拌溶解，调节pH至7.4，得到水溶性钙钛矿溶液；
3)将步骤2)的溶液取8份75μL，加425μL纯水稀释，用0.1M的K2CO3溶液对溶液pH进行调节，用混匀器进行混匀；
4)取10μL黄曲霉素M1抗体溶液分别加到步骤3)的混合溶液中，混匀并室温静置半小时进行吸附；
5)配制黄曲霉素M1抗原溶液浓度为0.25ug/mL，包被液(Na2CO3、NaHCO3)每个孔滴加100uL，抗原溶液滴加100uL，在酶标仪中晃板多次混合均匀，37℃孵育2h进行包被，之后倒掉孔中溶液进行自动洗板，并摔干；在孔中加入牛奶稀释液(4％的浓度)，在37℃培养1h，之后进行自动洗板三次，留待备用；
6)将步骤4)溶液分别加入100μL到孔板中，晃匀，并用酶标仪进行初始值测量；
7)将步骤6)溶液在37℃下培养半小时，自动洗板三次，摔干，用酶标仪测量荧光最终值。
本实施例制得的CsPbBr3钙钛矿纳米晶其XRD见图1的2，其结晶性依然良好。
实施例4
本实施例与实施例3基本相同，唯一不同的在于，将实施例1的步骤1)中油胺体积改为200μL，其他条件保持一致。本实施例制得的钙钛矿纳米晶水溶液照片见图8，水溶性良好。
实施例5
本实施例与实施例3基本相同，唯一不同的在于，将实施例1的步骤1)中CsBr与PbBr2粉末改为CsI与PbI2，其他条件保持一致。本实施例制得的钙钛矿纳米晶其发光图谱见图9，发光性能依然良好。
对比例1
本对比例与实施例3基本相同，唯一不同的在于，将实施例1的步骤2)中Tris改为PBS，其他条件保持一致。本对比例制得的CsPbBr3钙钛矿纳米晶用于黄曲霉素M1的荧光免疫检测。其检测效果稍差，抗体与纳米晶结合后放置有沉淀，见图10。
对比例2
本对比例与实施例3基本相同，唯一不同的在于，将实施例1的步骤1)中油胺改为250μL，其他条件保持一致，本对比例制得的钙钛矿纳米晶在水中的溶解性变差，见图11，绝大部分钙钛矿纳米晶沉淀，不能在水中分散。

Claims (5)

1.基于水溶性钙钛矿纳米晶的黄曲霉素M1的检测方法，其特征在于，具体步骤如下：
步骤1，将油胺加入到CsX和PbX2粉末中，以300~500rpm的转速球磨1~7h，其中球料质量比为15:1 ~ 30:1，所述的X为Cl、Br、I，CsPbX3的摩尔量与油胺的体积比为10~40:1，mol:L；
步骤2，在球磨粉末中加入水溶性阴离子表面活性剂，加入Tris缓冲液搅拌溶解，调节pH至7~8，得到水溶性钙钛矿溶液；
步骤3，将黄曲霉素M1抗体溶液加入到水溶性钙钛矿溶液中，混匀后室温静置进行吸附，得到抗体和水溶性钙钛矿的混合溶液；
步骤4，将待检测的黄曲霉素M1溶液与包被液混合，37℃下孵育进行包被，包被结束后，除去液体，清洗，甩干，加入4%牛奶稀释液，在37℃孵育，清洗，甩干；
步骤5，将抗体和水溶性钙钛矿的混合溶液滴加到步骤4中包被的待检测的黄曲霉素M1中，检测吸光度，得到初始吸光度F0，之后37℃下孵育，孵育结束后，清洗，甩干，检测吸光度，得到最终吸光度F，根据黄曲霉素M1的浓度与F/F0的标准曲线关系，计算得到待检测的黄曲霉素M1的浓度。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤2中，所述的阴离子表面活性剂为十二烷基硫酸钠，钙钛矿纳米晶与水溶性阴离子表面活性剂的质量比为5:1~10:1。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤3，所述的静置吸附时间为15~30min。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤4，所述的包被孵育时间为1~2h。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤5，所述的孵育时间为20~30min。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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