CN109136407B - 一种快速检测禽腺病毒-i群的pcr方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速检测禽腺病毒‑I群的PCR方法。本发明采用免提核酸法获得核酸进行PCR扩增，与现有技术相比，无需对样品进行繁琐处理，明显缩短检测时间；获得核酸的浓度高出4‑14倍，且不影响核酸纯度；对同一样品检测，其敏感性高出4倍和10倍。免提核酸PCR方法用时短、特异性强、敏感性高、稳定性好，能快速、敏感和特异性地对禽腺病毒‑I群进行检测。

Description

一种快速检测禽腺病毒-I群的PCR方法

技术领域

本发明涉及一种快速检测禽腺病毒-I群的PCR方法。

背景技术

禽腺病毒属于腺病毒科禽腺病毒属，根据其抗原性不同可分为3个群；根据血清交叉中和反应性，禽腺病毒-I群可分为12个血清型(血清型1-7、8a、8b、9-11)。禽腺病毒-I群在世界范围内广泛分布，近年来研究报道，禽腺病毒-I群不同血清型毒株感染引起的鸡肝炎-心包积液综合征、包涵体肝炎等在我国广泛流行，尤其是血清4型禽腺病毒引起的鸡肝炎-心包积液综合征造成肉鸡大量死亡，给我国养鸡业造成了严重的经济损失。为有效控制禽腺病毒-I群的感染，需建立快速、准确的诊断方法。

禽腺病毒-I群的诊断方法包括传统的病原分离鉴定、血清学方法和分子生物学技术。最初通过病理组织学观察肝细胞的核内包涵体和电镜观察病毒粒子形态进行禽腺病毒-I群感染的诊断，随后应用鸡胚、鸡胚肾细胞、鸡胚肝细胞、Vero细胞等进行病毒分离，但这些诊断方法耗时较长，不便于临床疾病的诊断。之后应用琼脂凝胶沉淀试验、间接血凝试验、斑点免疫结合试验、酶联免疫吸附试验、免疫过氧化物酶试验、组织培养和鸡胚培养的病毒中和试验等血清学方法检测抗体进行诊断，但被感染鸡和免疫鸡体内都存在抗体，检测结果很难进行解释。分子生物学技术对禽腺病毒-I群进行检测，而非检测抗体，在病毒感染早期即可进行诊断，针对禽腺病毒-I群Hexon基因进行PCR诊断具有较高的敏感性和特异性，此外，通过PCR扩增的Hexon基因可作为斑点杂交用探针、扩增的Hexon通过限制性内切酶酶切后进行限制性片段长度多态性分析可对禽腺病毒-I群血清分型。故，目前PCR诊断方法是检测禽腺病毒-I群感染的敏感和特异性的诊断方法，但PCR方法步骤较多、耗时较长，如何在原有PCR基础上缩短时间提高效率是目前快速诊断所所要解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速检测禽腺病毒-I群的PCR方法。

本发明首先提供了一种获得病毒核酸的方法，包括如下步骤：将样本经Buffer处理后，得到病毒核酸；所述Buffer为含有45-50mM Tris-HCl、5.8-6.0M尿素和1ml/100ml吐温20的水溶液。

所述Buffer具体可为含有50mM Tris-HCl、6M尿素和1ml/100ml吐温20的水溶液。

所述处理方法为：将样本与所述Buffer混合后98℃静置反应8-10min，然后4℃静置反应10-15min。

所述处理方法具体可为：将样本与所述Buffer混合后98℃静置反应8min，然后4℃静置反应15min。

所述Buffer与样本等体积混合。当待测样本为组织时，将组织研磨后离心取上清。

本发明还保护一种检测禽腺病毒-I群的方法，包括如下步骤：

(1)采用以上任一所述的方法获得待测病毒或待测样本的病毒核酸；

(2)检测步骤(1)得到的病毒核酸中是否存在禽腺病毒-I群的特异片段，如果所述病毒核酸中存在禽腺病毒-I群的特异片段，则待测病毒为I群禽腺病毒或所述待测样本中存在禽腺病毒-I群。

所述“检测步骤(1)得到的病毒核酸中是否存在禽腺病毒-I群的特异片段”的方法为：采用特异引物对对步骤(1)得到的病毒核酸进行PCR扩增，如果扩增产物中存在850-910bp的特异条带，则所述扩增产物中存在禽腺病毒-I群的特异片段；

所述特异引物对由引物F和引物R组成；

所述引物F为如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；

(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；

所述引物R为如下(a3)或(a4)：

(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；

(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子。

所述PCR扩增的反应体系具体可为：核酸2μL，10×PCRbufer 3μL，25mM Mgcl₂4μL，10mM dNTP 2.5μL，上游引物F和下游引物R各0.5μL(25pmol/w)，Taq酶0.5μL，加灭菌超纯水至30μL。

所述PCR扩增的反应程序具体可为：94℃5min变性；94℃1min，55℃l min，72℃90s，30个循环；72℃延伸10min。

以上任一所述特异片段具体可如序列表的序列3所示。

本发明还保护以上任一所述的Buffer在获得病毒核酸中的应用。

本发明还保护以上任一所述的Buffer在禽腺病毒-I群检测中的应用。

本发明还保护一种用于检测禽腺病毒-I群的试剂盒，包括以上任一所述的Buffer和特异引物对。

以上任一所述待测病毒具体可为禽腺病毒-I群的12株标准血清型毒株(FAV-1、FAV-2、FAV-3、FAV-4、FAV-5、FAV-6、FAV-7、FAV-8、FAV-9、FAV-10、FAV-11、FAV-12)、血清4型禽腺病毒分离株(FAV-QDLX-140421-B)、8a型禽腺病毒分离株(FAV-SDWF-140620-B)、8b型禽腺病毒分离株(FAV-QDLX-111025-B)或11型禽腺病毒分离株(FAV-SDLQ-140704-G)。

以上任一所述待测样本具体可为动物组织，例如肝脏组织。

与现有技术相比，本发明采用免提核酸法获得核酸进行PCR扩增，无需对样品进行繁琐处理，明显缩短检测时间；获得核酸的浓度高出4-14倍，且不影响核酸纯度；对同一样品检测，其敏感性高出4倍和10倍。免提核酸PCR方法用时短、特异性强、敏感性高、稳定性好，能快速、敏感和特异性地对禽腺病毒-I群进行检测。

附图说明

图1为不同方法提取核酸PCR扩增结果。1：阴性对照；M：Marker；2：传统Trizol提取核酸PCR法；3：免提核酸PCR法；4：Takara试剂盒提取核酸PCR法。

图2为免提核酸PCR法检测禽腺病毒-I群的12株标准血清型毒株结果。M：marker；1-12：血清1-12型禽腺病毒。

图3为免提核酸PCR方法检测禽腺病毒-I群的特异性。M：Marker；1：血清4型禽腺病毒分离株；2：8a型禽腺病毒分离株；3：8b型禽腺病毒分离株；4：11型禽腺病毒分离株；5：鸡痘病毒；6：新城疫病毒；7：H9N2亚型禽流感病毒；8：鸡传染性贫血病毒；9：传染性染性支气管炎病毒；10：阴性对照。

图4为免提核酸PCR法和传统Trizol提取核酸PCR法敏感性检测结果。M：Marker；1-9：免提核酸PCR结果，分别为原毒、稀释10、100、1000、2000、5000、10000、20000、40000倍；10-18：传统Trizol提取核酸PCR结果，分别为原毒、稀释10倍、100、1000、2000、5000、10000、20000、40000倍。

图5为Takara试剂盒提取核酸PCR法敏感性检测结果。M：Marker；1-10：原毒、稀释10倍、100、1000、2000、5000、10000、20000、40000、阴性对照。

图6为免提核酸PCR法和传统Trizol提取核酸PCR法检测禽腺病毒-I群临床病料结果。A：传统Trizol提取核酸PCR法检测禽腺病毒-I群临床病料结果；B：免提核酸PCR法检测禽腺病毒-I群临床病料结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

禽腺病毒-I群的12株标准血清型毒株(FAV-1、FAV-2、FAV-3、FAV-4、FAV-5、FAV-6、FAV-7、FAV-8、FAV-9、FAV-10、FAV-11、FAV-12)，购自中国兽药监察所。

血清4型禽腺病毒分离株(FAV-QDLX-140421-B)、8a型禽腺病毒分离株(FAV-SDWF-140620-B)、8b型禽腺病毒分离株(FAV-QDLX-111025-B)、11型禽腺病毒分离株(FAV-SDLQ-140704-G)记载于文献Wang J,Wang S,Zou K,ZhangY,Xu S,YinY.Variant Serotypes ofFowl Adenovirus Isolated from Commercial Poultry Between 2007and 2017in SomeRegions of China,Avian Dis,2018,62(2):171-176.公众可以从青岛农业大学获得。

鸡痘病毒(鸡痘病毒鹌鹑化弱毒疫苗株CVCC AV1003株)记载于文献：焦同路.表达H5亚型禽流感病毒HA蛋白的重组禽痘病毒的构建及其免疫效力初评[D].中国农业科学院,2012.公众可以从青岛农业大学获得。

新城疫病毒(新城疫弱毒疫苗株LaSota株)记载于文献：李聪研.药物对不同新城疫病毒毒株的作用研究[D].河北农业大学,2008.公众可以从青岛农业大学获得。

H9N2亚型禽流感病毒(H9N2亚型禽流感病毒毒株，C/SD/196/11株)记载于文献：王建琳,曹志伟,王冬冬,等.不同致病性H9N2亚型禽流感病毒诱导鸡TLR-7和Mx基因mRNA转录水平的差异,畜牧兽医学报,2017,48(5):907-913).公众可以从青岛农业大学获得。

鸡传染性贫血病毒记载于文献：Li Changjing,Li Haiying,Wang Dongdong,WangJingjing,Wang Youming,Wang Shouchun,Li Jida,Liu Ping,Wang Jianlin,XuShouzhen,Cui Shangjin,Zhang Yi,Yin Yanbo.Characterization of fowladenoviruses isolated between 2007and 2014in China,Veterinary Microbiology,2016,19762-67.公众可以从青岛农业大学获得。

传染性支气管炎病毒(传染性支气管炎弱毒疫苗株M41株)记载于文献：于秀俊,郑海洲,张莉,等.鸡传染性支气管炎病毒M41及疫苗株H52,H120S1基因的克隆与序列测定[J].河北师范大学学报(自然科学版),2004,28(2):181-186.公众可以从青岛农业大学获得。

实施例1、病毒核酸获得方法的比较

一、免提核酸法获得病毒核酸

免提Buffer：含有50mM Tris-HCl(pH 7.5)、6M尿素和1％(体积百分含量)吐温20的水溶液。

将免提Buffer 20μL与待测样本(当待测样本为组织时，将组织研磨后离心取上清)按照体积1:1混合后98℃静置反应8min，然后4℃静置反应15min。

二、传统的Trizol提取核酸法获得病毒核酸

1、取200μL待测样本，与700μL Trizol试剂(北京擎科新业生物技术有限公司，货号：15596026)充分振荡混匀，4℃静置10分钟。

2、完成步骤1后，加入150μL氯仿，烈振荡5秒，4℃静置3分钟，12000r/min离心15min，取上清。

3、向步骤2得到的上清中加入500μL的异丙醇，颠倒均匀，4℃静置10分钟，12000r/min离心15min，弃上清。

4、采用1mL 75％(体积百分比)乙醇水溶液洗涤步骤3得到的沉淀三次，7500r/min离心5min，取沉淀，干燥后使用20μL DEPC水溶解核酸沉淀，-80℃冰箱保存。

三、TAKARA核酸提取试剂盒法获得病毒核酸

按照TAKARA试剂盒(宝生物技术有限公司，货号：9766)说明书提取病毒核酸。

四、三种方法的效果比较

1、采用上述一、二、三所述的三种方法对同一份血清4型禽腺病毒分离株进行核酸提取并进行核酸浓度测定，结果如表1所示。结果表明，免提核酸法提取的核酸浓度远高于其他两种方法。

表1不同核酸提取方法提取核酸浓度比较

2、采用上述一、二、三所述的三种方法对同一份血清4型禽腺病毒分离株进行核酸提取，将提取的核酸进行PCR扩增，将扩增产物进行凝胶电泳检测。

PCR反应体系：核酸2μL，10×PCRbuffer 3μL，25mM MgCl₂4μL，10mM dNTP 2.5μL，上游引物F和下游引物R各0.5μL(25pmol/L)，Taq酶0.5μL(大连宝生物工程有限公司)，加灭菌超纯水至30μL。设置采用DEPC水代替核酸的阴性对照。

PCR反应程序：94℃5min预变性；94℃1min，55℃l min，72℃90s，30个循环；72℃延伸10min。

F:5’-CAARTTCAGRCAGACGGT-3’(序列1)；

R:5’-AAGAGGCCCGGGCAATGC-3’(序列2)。

结果如图1所示。结果表明，采用三种方法提取的核酸经PCR扩增后，其产物为877bp(序列表的序列3)，电泳条带均无杂带。

上述结果表明，免提核酸法提取的核酸浓度高且操作简便，用时少，提取的核酸纯度能够达到检测要求。

实施例2、免提核酸PCR法检测禽腺病毒-I群

一、标准毒株的检测

待测毒株：禽腺病毒-I群的12株标准血清型毒株。

采用实施例1的步骤一建立的免提核酸法提取待测毒株核酸，并将提取的核酸进行PCR扩增，将扩增产物进行凝胶电泳检测。

PCR反应体系：核酸2μL，10×PCR buffer 3μL，25mM MgCl₂4μL，10mM dNTP 2.5μL，上游引物F和下游引物R各0.5μL(25pmol/L)，Taq酶0.5μL(大连宝生物工程有限公司)，加灭菌超纯水至30μL。

PCR反应程序：94℃5min预变性；94℃1min，55℃l min，72℃90s，30个循环；72℃延伸10min。

F:5’-CAARTTCAGRCAGACGGT-3’(序列1)；

R:5’-AAGAGGCCCGGGCAATGC-3’(序列2)。

结果如图2所示。结果表明，免提核酸PCR方法可用于禽腺病毒-I群12个血清型毒株的检测。

二、特异性

待测病毒：四种血清型禽腺病毒-I群(血清4型禽腺病毒分离株、8a型禽腺病毒分离株、8b型禽腺病毒分离株、11型禽腺病毒分离株)、鸡痘病毒、新城疫病毒、H9N2亚型禽流感病毒、鸡传染性贫血病毒、传染性染性支气管炎病毒。

采用实施例1的步骤一建立的免提核酸法提取待测病毒核酸，并将提取的核酸进行PCR扩增，将扩增产物进行凝胶电泳检测。

PCR反应体系：核酸2μL，10×PCR buffer 3μL，25mM MgCl₂4μL，10mM dNTP 2.5μL，上游引物F和下游引物R各0.5μL(25pmol/L)，Taq酶0.5μL(大连宝生物工程有限公司)，加灭菌超纯水至30μL。设置采用DEPC水代替核酸的阴性对照。

PCR反应程序：94℃5min预变性；94℃1min，55℃lmin，72℃90s，30个循环；72℃延伸10min。

F:5’-CAARTTCAGRCAGACGGT-3’(序列1)；

R:5’-AAGAGGCCCGGGCAATGC-3’(序列2)。

结果如图3所示。结果表明，除四种血清型禽腺病毒-I群外，其余病毒全部为阴性，表明该方法检测禽腺病毒-I群具有很好的特异性。

三、敏感性

待测病毒：血清4型禽腺病毒分离株。

取待测病毒原毒及原毒稀释10倍、稀释100倍、稀释1000倍、稀释2000倍、稀释5000倍、稀释10000倍、稀释20000倍、稀释40000倍后的样本，采用免实施例1的一、二、三所述的三种方法进行核酸提取，并将提取的核酸进行PCR扩增，将扩增产物进行凝胶电泳检测。

PCR反应体系：核酸2μL，10×PCR buffer 3μL，25mM MgCl₂4μL，10mM dNTP 2.5μL，上游引物F和下游引物R各0.5μL(25pmol/w)，Taq酶0.5μL(大连宝生物工程有限公司)，加灭菌超纯水至30μL。设置采用DEPC水代替核酸的阴性对照。

PCR反应程序：94℃5min预变性；94℃1min，55℃lmin，72℃90s，30个循环；72℃延伸10min。

F:5’-CAARTTCAGRCAGACGGT-3’(序列1)；

R:5’-AAGAGGCCCGGGCAATGC-3’(序列2)。

结果如图4和图5所示。免提核酸PCR法最低能检测到原病毒稀释20000倍后提取核酸的PCR检测结果；传统Trizol提取核酸PCR法最低能检测到原病毒稀释5000倍后提取核酸的PCR检测结果；Takara试剂盒提取核酸PCR法最低能检测到原病毒稀释2000倍。免提核酸PCR法较传统Trizol提取核酸PCR法和Takara试剂盒提取核酸PCR法的敏感性高，分别是这两种方法的4倍和10倍。

四、临床样品检测

临床样本：鸡肝脏23份。

采用免实施例1的一、二所述的三种方法进行核酸提取，并将提取的核酸进行PCR扩增，将扩增产物进行凝胶电泳检测。

PCR反应体系：核酸2μL，10×PCR buffer 3μL，25mM MgCl₂4μL，10mM dNTP 2.5μL，上游引物F和下游引物R各0.5μL(25pmol/w)，Taq酶0.5μL(大连宝生物工程有限公司)，加灭菌超纯水至30μL。设置采用DEPC水代替核酸的阴性对照。

PCR反应程序：94℃5min预变性；94℃1min，55℃lmin，72℃90s，30个循环；72℃延伸10min。

F:5’-CAARTTCAGRCAGACGGT-3’(序列1)；

R:5’-AAGAGGCCCGGGCAATGC-3’(序列2)。

结果如图5所示。结果表明，免提核酸PCR法和传统Trizol提取核酸PCR法检测结果一致，4份病料检测结果阳性，禽腺病毒-I群检出率为17.39％。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一种快速检测禽腺病毒-I群的PCR方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> r=a or g

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> r=a or g

<400> 1

caarttcagr cagacggt 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aagaggcccg ggcaatgc 18

<210> 3

<211> 877

<212> DNA

<213> 禽腺病毒(Avianadenovirus)

<400> 3

aaattcaggc agacggtcgt agctcccact cgcaatgtca ccaccgaaaa ggcacaacgt 60

ctgcagatca gattctaccc gatccagacg gatgacacgc caaacagcta tcgcgtgcgc 120

tacagcgtca acgttgggga cagctgggtg ttggacatgg gggcgaccta tttcgacatc 180

aagggaatcc tagaccgagg gccgtccttc aagccctact gcggcacggc ttacaacccg 240

ctggctccca aggagtccat gtttaacaac tggtcggaga cggcacccgg gcagaacgtg 300

tccgcctccg gtcagctgtc caatgtctat accaacacga gcaccaccaa agacacgacg 360

gcggcgcagg tgacgaagat ttccggcgtc tttcccaacc ccaaccagga cccggaacga 420

atcctctgcg cagtagaaac gcacaccgcg tgctcggtcg cttcgccaag tctcagtaca 480

attacgctta cggtgctacg tcaagcccgt cgccgccgac ggttcccagt ccctcacgca 540

gaccccctac tggatcatga acaacgcggg caccgaatac ctgggggcgg tagccgtcga 600

ggactacacc aacagcctct cgtacccaga taccatgatc gtgccgcctc ccgaggatta 660

cgacgattac aacataggca ccacgcgtgc gctcagtccc aactacatcg gtttcagaga 720

caacttcatc aacctgctgt atcacgactc cggcgtgtgc tcgggcaccc tcaactcgga 780

gcgttcgggc atgaacgtgg tggtcgagct gcccgaccgg aataccgagc tcagctacca 840

gtacatgctg gccgacatga tgtcccgcca tcactat 877

Claims (4)

1.一种获得病毒核酸的方法，包括如下步骤：将样本经Buffer处理后，得到病毒核酸；所述Buffer为由50 mM Tris-HCl、6 M 尿素和体积百分含量为1%的吐温20组成的水溶液；

所述处理方法为：将样本与所述Buffer混合后98℃静置反应8 min，然后4℃静置反应15 min。

2.一种检测禽腺病毒-I群的方法，包括如下步骤：

（1）采用权利要求1所述的方法获得待测病毒或待测样本的病毒核酸；

（2）检测步骤（1）得到的病毒核酸中是否存在禽腺病毒-I群的特异片段，如果所述病毒核酸中存在禽腺病毒-I群的特异片段，则待测病毒为禽腺病毒-I群或所述待测样本中存在禽腺病毒-I群；

所述方法为非疾病诊断和治疗目的的方法。

3.一种Buffer在获得病毒核酸中的应用，所述Buffer为由50 mM Tris-HCl、6 M 尿素和体积百分含量为1%的吐温20组成的水溶液；

将样本与所述Buffer混合后98℃静置反应8 min，然后4℃静置反应15 min。

4.一种Buffer在禽腺病毒-I群检测中的应用，所述Buffer为由50 mM Tris-HCl、6 M尿素和体积百分含量为1%的吐温20组成的水溶液；所述应用为非疾病诊断和治疗的应用；

将样本与所述Buffer混合后98℃静置反应8 min，然后4℃静置反应15 min。

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