CN109136375A - Cdh1基因启动子区的甲基化水平检测引物及方法 - Google Patents
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Abstract
CDH1基因启动子区的甲基化水平检测引物及方法基于焦磷酸测序技术。其中包括特异性扩增引物如SEQ NO.1和SEQ NO.2所示，特异性焦磷酸测序引物如SEQ NO.3所示，以及PCR反应试剂、焦磷酸测序相关试剂。本发明可进行快速定量检测，具有特异性高、检测周期短、准确性高等优点。检测结果有助于在分子水平上进行相关肿瘤的筛查，具有临床意义与重要价值。
Description
技术领域：
本发明属于生命科学和生物技术领域，是一种基于焦磷酸测序技术的CDH1基因甲基化水平检测的试剂及应用。
背景技术：
肿瘤抑制基因(tumor suppressor gene，TSG)是生命体调控自身细胞增殖、分化和凋亡过程中的重要复性调节因子之一。当抑癌基因启动子发生高甲基化则引起基因失活从而助于细胞的无限制生长，这一机制存进了肿瘤的形成。因此，对于抑癌因子的相关研究则有助于解释细胞增殖、分化以及癌变等过程。通常在癌症早期就可以检测出抑癌因子的异常甲基化，并通过对癌症相关基因甲基化谱进行筛选，可作为肿瘤的早期诊断、治疗和预后提供理论及实验依据。而研究表明肿瘤抑制基因CDH1基因启动子甲基化水平与特发性肺纤维化、乳腺癌、宫颈癌、胃癌等常见肿瘤具有较高相关性。因而寻求简单、安全、准确、高效的筛选工具，对于癌症防治、降低死亡率具有重大的科学意义。
目前检测CDH1启动子甲基化水平的方法主要包括甲基化特异性PCR(MSP)、甲基化敏感性高分辨率溶解曲线(MS-HRM)、亚硫酸盐测序PCR(BSP)、荧光定量法。目前使用PCR扩增检测来判断样品是否存在甲基化的MSP法得到了普遍的应用。但其存在着不能定量检测以及高假阳性风险的局限性；而通过PCR联合sanger测序技术来检测甲基化水平的BSP法，则受限与其繁琐的操作而不适合大批量测序。且其检测结果受克隆挑选的数目所影响，而只是一种半定量检测方法。
本发明采用准确性高、检测周期短并且检测通量高的PCR联合焦磷酸检测技术。焦磷酸测序技术的原理是：在引物与模板DNA退火之后，通过DNA polymerase、ATP硫酸酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双膦酸酶的协同催化，进而偶联了引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放。因而通过检测荧光的释放及强度即可达到实时测定DNA序列的目的。因此检测过程中单个检测位点的C、T荧光信号强度确切的反映该位点的甲基化状态，进而得到更加直观的检测结果。正因为这一原理，使得焦磷酸测序技术不仅可以进行定性检测，更能实现甲基化水平的定量分析。与此同时，在实现高准确性检测的基础上还具有可以在相对较短时间内实现多样品批量检测，具备检测通量高、检测周期较短等优势。
因此，本发明在保证高检测出率、短检测周期、高通量、高准确度以及低污染风险的基础上，得出有助于遇见相关肿瘤的早期的可靠结果。
发明内容
本发明提出了基于焦磷酸测序技术，用于检测CDH1基因启动子CPG岛甲基化水平的试剂盒，包括dNTPs，缓冲液，热启动DNA聚合酶(Hotstart Taq)，ddH2O，特异性扩增引物SEQ NO1和SEQ NO2，以及测序引物SEQ NO3。其碱基序列依次如下：
SEQ NO1：5’-AGTAATTTTAGGTTAGAGGGTTAT-3’
SEQ NO2：5’-AACTTCCCCAAACTCACAAATACTTTAC-3’
SEQ NO3：5’-GTAGGTGAATTTTTAGTTAATTAG-3’
其中SEQ NO1在其5’端具有生物素标记。
检测CDH1基因启动子甲基化水平的方法，其特征在于，包括：
一.样本中DNA的提取；
二.对基因组DNA进行亚硫酸盐处理，处理方式为180μl浓度为3M的重亚硫酸钠溶液与含有2μg DNA的20μl水溶液混合然后98℃，10min，然后64℃，2.5个小时；
三.以步骤二中的产物作为模板以上游扩增引物SEQ NO.1：5’-AGTAATTTTAGGTTAGAGGGTTAT-3’；下游扩增引物
SEQ NO.2:5’-AACTTCCCCAAACTCACAAATACTTTAC-3’进行PCR扩增；
四.将上一步的PCR产物置于焦磷酸测序仪中进行测序；
五.根据PyroMark软件输出检测报告得出样本中CDH1启动子甲基化水平。
步骤三中所述的扩增条件为预变性95℃15min；94℃30s,60℃30s，72℃，47个循环，72℃10min；根据产物条带是否肉眼可见并且是否位于200与300bp的标记条带之间来判断扩增是否成功，并根据100bp标记条带之下是否有条带来判断是否有引物二聚体；对于扩增成功且无明显引物二聚体的样品，将剩余扩增产物进行焦磷酸测序，所用测序引物如所述的SEQ NO.3。
用于检测CDH1基因chr16：68737132位点CPG甲基化水平的试剂盒，其特征在于，包括250units热启动DNA聚合酶、200μl浓度为10mM dNTPs、2ml PCR缓冲溶液(Tris-HCL)、1.5ml ddH2O、1ml浓度为15mM的MgCl2，特异性扩增引物SEQ NO1，SEQ NO2以及特异性焦磷酸检测引物SEQ NO3一种或多种。
附图说明
图1：经PCR扩增后的CDH1基因启动子区域CPG岛的部分片段琼脂糖凝胶电泳图
图2：CDH1基因启动子CPG岛甲基化水平焦磷酸测序结果图
图3：待测序列，扩增引物及检测引物
具体实施方式
结合实施例对本发明进行阐述
实施例1：对200μl人血液样本进行CDH1启动子甲基化水平检测
一.准备工作：使用TIANamp Genomic DNAKit试剂盒提取人类血液中的基因组DNA，然后使用EZ DNAMethylation-Gold Kit对基因组DNA进行处理，具体操作方法为：向PCR管中加入130μl CT Conversion Reagent试剂及20μl DNA样本。颠倒混匀数次，然后离心处理使液体集中在PCR管底部。置于PCR仪内，反应条件：对基因组DNA进行亚硫酸盐处理，处理方式为180μl浓度为3M的重亚硫酸钠溶液与含有2μg DNA的20μl水溶液混合，98℃10min，64℃2.5hours。而后可依照试剂盒说明书依次操作。
PCR扩增：将经过准备工作预处理的DNA样品加入到PCR体系中，其体系配比如下表：
反应条件为：95℃15min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，50个循环；72℃10min。
注：经预处理的样本以在5小时内进行后续操作为宜，不便立即进行后续操作时，可置于4℃环境下短时间保存，保存超过20小时的样品不建议使用，通常使结果产生较大偏差。
样品焦磷酸测序：
在PyroMark Q96软件中设计需要运行的程序，并按照软件显示向试剂舱加入所需试剂。
将Plate Holder在80℃金属浴上预热。配制实验所需70％乙醇(现配现用)按照PyroMark Q96说明书想试剂槽中分别加入110ml70％乙醇、90ml Denaturation Buffer、110ml 1x wash buffer(通常用10x wash buffer稀释10倍)、110ml超纯水和180ml超纯水。
将Sepharoe beads轻柔混匀后配置如下体系：
Sepharoe beads 1.5μl(lot number10057073或更高)或3μl(lot number低于10057073)
PCR产物20μl
Binding buffer 40μl
Water 18.5μl或17μl
Total volume 89μl
将PCR产物混合物置于常温1400rpm下水平震荡混匀15min。如片段较长可适当延长混匀时间。
向96孔板中加入40μl annealing buffer和10μM的引物1.6μl。
将vacuum prep tool移到PCR板中，抓取sepharose beads；拿起PCR板并检查beads是否大部分被吸附在vacuum prep tool上。按照Q96说明书依次将vacuum prep tool放入70％乙醇中5s，denatureation buffer中5s，washing buffer中10s，然后将vacuumprep tool竖直超过90度保持5s以上，保证washing buffer沥干。
将vacuum prep tool悬停在孔板上方，不要接触液面，注意吸头与含有对应测序引物的板孔对准。关泵，悬停3s以上，保证孔板内液体不被残存负压吸走。
将vacuum prep tool吸头放入对应板孔中，摇动数次释放sepharose beads。
将含有混合物的PSQ 96孔板放置在预热好的Plate Holder上，80℃加热2min后室温放置15min，使其退火至15至20min，即可将样品孔板放入PyroMark Q96中，并运行程序，可得出结果。
试验结束后按照Q96说明书清洗仪器。
Claims (4)
1.CDH1基因启动子区的甲基化水平检测引物，其特征在于，引物序列包括：
上游扩增引物SEQ NO.1：5’-AGTAATTTTAGGTTAGAGGGTTAT-3’；
下游扩增引物
SEQ NO.2:5’-AACTTCCCCAAACTCACAAATACTTTAC-3’
焦磷酸检测引物SEQ NO.3:5’-GTAGGTGAATTTTTAGTTAATTAG-3’.
其中SEQ NO.1的5’端进行生物素标记。
2.检测CDH1基因启动子甲基化水平的方法，其特征在于，包括：
一.样本中DNA的提取；
二.对基因组DNA进行亚硫酸盐处理，处理方式为180μl浓度为3M的重亚硫酸钠溶液与含有2μg DNA的20μl水溶液混合然后98℃，10min，然后64℃，2.5个小时；
三.
以步骤二中的产物作为模板以上游扩增引物SEQ NO.1：5’-AGTAATTTTAGGTTAGAGGGTTAT-3’；下游扩增引物
SEQ NO.2:5’-AACTTCCCCAAACTCACAAATACTTTAC-3’进行PCR扩增；
四.将上一步的PCR产物置于焦磷酸测序仪中进行测序；
五.根据PyroMark软件输出检测报告得出样本中CDH1启动子甲基化水平。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤三中所述的扩增条件为预变性95℃15min；94℃30s,60℃30s，72℃，47个循环，72℃10min；
根据产物条带是否肉眼可见并且是否位于200与300bp的标记条带之间来判断扩增是否成功，并根据100bp标记条带之下是否有条带来判断是否有引物二聚体；
对于扩增成功且无明显引物二聚体的样品，将剩余扩增产物进行焦磷酸测序，所用测序引物如权利要求1所述的SEQ NO.3。
4.用于检测CDH1基因chr16：68737132位点CPG甲基化水平的试剂盒，其特征在于，包括250units热启动DNA聚合酶、200μl浓度为10mM dNTPs、2ml缓冲溶液、1.5ml ddH2O、1ml浓度为15mM的MgCl2，特异性扩增引物SEQ NO1，SEQ NO2以及特异性焦磷酸检测引物SEQ NO3一种或多种。
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