CN109136266B - 用于治疗或预防结晶样视网膜色素变性的基因载体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于治疗或预防结晶样视网膜色素变性(BCD)的基因载体以及其用途。本发明所述的用于治疗或预防结晶样视网膜色素变性的基因载体，包括：包装质粒，是插入了抗CD59短肽C9的基因序列的AAV2包装质粒；以及载体质粒，是插入了人类细胞色素P450超家族蛋白CYP4V2的基因序列、抗VEGF短肽HRH的基因序列、启动子序列的AAV载体质粒。该AAV载体能够融合表达C9抗CD59短肽至病毒壳蛋白；能够实现CYP4V2及HRH共表达，补偿RPE细胞中CYP4V2基因突变所致蛋白功能缺失，可有效修复RPE细胞的正常功能，并可特异性拮抗血管内皮生长因子VEGF，延缓脉络膜增生所致的视网膜萎缩。本发明还提供了将所述的基因载体用于制备治疗或预防结晶样视网膜色素变性(BCD)的药物的用途。

Description

用于治疗或预防结晶样视网膜色素变性的基因载体及其用途

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种基因载体，更具体地，涉及一种用于治疗或预防结晶样视网膜色素变性(Bietti's crystalline dystrophy，BCD)的基因载体以及其用途。

背景技术

结晶样视网膜色素变性(Bietti's crystalline dystrophy，BCD)是一种可遗传的视网膜退行性眼病。患者一般于青少年阶段出现夜盲；随着病情发展，患者在角膜及眼底出现黄白色结晶状的脂结晶，并伴随视野缺失；疾病晚期，患者视网膜萎缩，并最终失明1。该病在西方属于罕见病，但是在亚洲，特别是在中国，有较高发病率(1/20000)(Hu,D.-N.(1983).Ophthalmic genetics in China.Ophthalmic Paediatrics and Genetics,2(1),39-45.)。遗憾的是，目前没有任何针对该病的有效治疗手段。临床观察表面，BCD患者失明是由于细胞色素P450家族CYP4V2基因突变导致的视网膜色素上皮细胞(Retinal pigmentepithelium,RPE)退化引发的视网膜萎缩及脉络增生所致(Xiaodong Jiao(2001).GeneticLinkage of Bietti Crystallin Corneoretinal Dystrophy to Chromosome 4q35.Am JHum Genet.2000Nov；67(5):1309–1313.)。而AAV2已经被广泛应用于治疗单基因遗传性疾病，并取得较多成果(Naso MF(2017).Adeno-Associated Virus(AAV)as a Vector forGene Therapy.BioDrugs.2017Aug；31(4):317-334.)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基因载体，能够在BCD的预防和治疗中取得一定疗效。

本发明所述的用于治疗或预防结晶样视网膜色素变性的基因载体，包括：包装质粒，是插入了抗CD59短肽C9的基因序列的AAV2包装质粒；以及载体质粒，是插入了人类细胞色素P450超家族蛋白CYP4V2的基因序列、抗VEGF短肽HRH的基因序列、启动子序列的AAV载体质粒。

根据本发明所述的基因载体的进一步特征，所述CYP4V2蛋白的基因序列如SEQ IDNO:1所示；所述HRH的基因序列如SEQ ID NO:2所示；所述C9的基因序列如SEQ ID NO:3所示。

根据本发明所述的基因载体的进一步特征，所述启动子是通用启动子或者视网膜色素上皮细胞的特异性启动子。

根据本发明所述的基因载体的进一步特征，所述通用启动子是选自：CBh启动子、CAG启动子、PGK启动子、EF1α启动子。

根据本发明所述的基因载体的进一步特征，所述CBh启动子的核苷酸序列如SEQID NO:4所示；所述CAG启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述PGK启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；所述EF1α启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。

根据本发明所述的基因载体的进一步特征，所述特异性启动子是RPE65特异性启动子。

根据本发明所述的基因载体的进一步特征，所述RPE65特异性启动子具的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；

CD59表面抗原已被证实广泛表达在人类RPE细胞膜上，如果眼底注射的AAV2病毒能够特异性结合该表面抗原，将会大幅度提高AAV2病毒的转染效率(Yang P,Tyrrell J,Han I,Jaffe G(2009)50(7):3473-81.Expression and modulation of RPE cellmembrane complement regulatory proteins.Invest Ophthalmol Vis Sci.2009,50(7):3473-81.)。文献报道，短肽C9能够高效识别并特异性结合CD59表面抗原(J BiolChem.2006Sep 15；281(37):27398-404.Epub 2006Jul 14.Defining the CD59-C9bindinginteraction.Huang Y,Qiao F,Abagyan R,Hazard S,Tomlinson S.)。本发明通过融合表达C9与AAV2包装壳质粒的capsin蛋白，可实现AAV2病毒与CD59表面抗原的结合，从而提高病毒感染效率。

介导外源基因表达的启动子的差别也会影响到AAV的治疗效果。本发明采用了一些通用启动子，包括CBh、CAG、hPGK及EF1α,它们已被广泛用于介导无细胞差别外源基因的高效表达。本发明还采用了一些细胞特异性启动子，它们被用于特异性表达外源基因于某一特定细胞。RPE65启动子是RPE细胞的特异性启动子。利用该启动子介导的外源基因表达将只局限于RPE这一特定细胞。

RPE分泌的VEGF在视网膜降解及脉络萎缩中扮演着重要角色，HRH短肽能够通过结合VEGF而有效抑制抗血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)活性。本发明构建AAV2-CYP4V2-HRH共表达载体，利用T2A自裂解肽(MAbs.2015；7(2):403-12.doi:10.1080/19420862.2015.1008351.Cleavage efficient 2A peptides for highlevel monoclonal antibody expression in CHO cells.Chng J,Wang T,Nian R,Lau A,Hoi KM,Ho SC,Gagnon P,Bi X,Yang Y.)短肽连接CYP4V2及HRH，能够有效实现它们的共表达，并且不干预其功能，从而最终达到在补内源性CYP4V2蛋白缺失的同时，表达HRH短肽来抑制VEGF，从而延缓视网膜降解。

因此，本发明提供了一种能与视网膜RPE细胞表面抗原CD59特异性结合的，同时过表达CYP4V2-HRH蛋白的腺相关病毒载体。该载体由两个部分组成。第一个部分是改造过的AAV2包装质粒，该质粒能够融合表达C9抗CD59短肽至病毒壳蛋白；第二部分载体能实现人类细胞色素P450超家族蛋白CYP4V2及HRH抗VEGF短肽的共表达。该外源基因表达由通用启动子或视网膜色素上皮细胞RPE65特异性启动子的基因序列介导。利用这两个质粒生产出来的该腺病毒能够融合表达C9至病毒壳蛋白，并通过特异性结合RPE细胞表面抗原CD59，从而有效提高AAV病毒对RPE细胞的感染能力。同时，该AAV载体能够实现CYP4V2及HRH共表达，前者补偿RPE细胞中CYP4V2基因突变所致蛋白功能缺失，可有效修复RPE细胞的正常功能；后者可特异性拮抗血管内皮生长因子VEGF，延缓脉络膜增生所致的视网膜萎缩。

本发明的第二个目的是提供一种组合物，它包括如本发明所述的基因载体，以及药学上可接受的赋形剂。例如，将所述的基因载体制成用于眼内注射的组合物，可以加入适用于眼内注射剂的赋形剂。优选地，所述的眼内注射是指视网膜下腔注射或玻璃体腔注射。

本发明的第三个目的是提供本发明所述的基因载体的用途。

本发明所述的一个用途是将所述的基因载体用于制备治疗或预防结晶样视网膜色素变性(BCD)的药物的用途。

本发明所述的另一个用途是将所述的基因载体用于制备在患有结晶样视网膜色素变性的对象的视网膜色素上皮细胞中共表达CYP4V2及HRH编码序列的药物的用途。

根据上述用途，可以在患有结晶样视网膜色素变性的对象的视网膜色素上皮细胞中恢复正常CYP4V2蛋白的表达。

附图说明

图1是本发明所构建的AAV2/2-C9质粒特征图。

图2是本发明所构建的AAV-pCBh-CYP4V2-HRH质粒特征图。

图3是本发明所构建的AAV-pCAG-CYP4V2-HRH质粒特征图。

图4是本发明所构建的AAV-pPGK-CYP4V2-HRH质粒特征图。

图5是本发明所构建的AAV-pEF1α-CYP4V2-HRH质粒特征图。

图6是本发明所构建的AAV-pRPE65-CYP4V2-HRH质粒特征图。

图7是体外CYP4V2过表达图。图中：1为未感染病毒的空白组；2为AAV2-pCAG-hCYP4V2-HRH对照组；3为AAV2-C9-pCAG-hCYP4V2-HRH组；4为AAV2-pRPE65-hCYP4V2-HRH对照组；5为AAV2-C9-pRPE65-hCYP4V2-HRH。

图8是BCD病人RPE细胞AAV治疗图。图中：i为iPSC(刻度线为200微米)；ii为分化的RPE(刻度线为50微米)；iii为正常人RPE的脂滴染色(刻度线为50微米)；iv为BCD病人RPE脂滴染色(刻度线为15微米)；V为AAV2-pCAG-CYP4V2病毒感染的BCD病人RPE脂滴染色(刻度线为15微米)；viAAV2-pRPE65-CYP4V2病毒感染的BCD病人RPE脂滴染色(刻度线为15微米)。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如业内文献(例如，J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

除非另有规定，否则本文中所用的所有科技术语均具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。

实施例1：腺病毒载体的构建和分离纯化

1.扩增CYP4V2-HRH基因的编码序列。

1)NCBI查询获取人CYP4V2基因的cDNA序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_207352.3)，并合成该序列(SEQ ID NO:1)。

2)根据上述序列，利用T2A融合HRH短肽核苷酸序列，并送公司合成CYP4V2-HRH基因片段(SEQ ID NO:2)。

3)设计并合成引物，利用高保真PCR克隆扩增该CYP4V2-HRH序列。

CYP4V2-F：CGCGGATCCATGGCGGGGCTCTGGCTGG

CYP4V2-R:GGTAAGCTTTTAGCGCGGTATGGCGC

2.扩增多种通用启动子

1)查询Addgene(剑桥非盈利性质粒资源库)获取CBh、CAG、PGK及EF1α启动子序列，质粒ID：42230，16664，21217及26797。

2)利用查询所得启动子序列，合成其DNA序列(SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:7)。

3)合成如下所示的携带酶切位点的引物，利用高保真PCR扩增这些启动子。

CBh-F引物：GTCAACGCGTCGTTACATAACTTACGGTA；

CBh-R引物：TCACGGTACCGCTTGAGTTGAGGCCTG；

CAG-F引物：GTCAACGCGTGCGTTACATAACTTACGGTAAAT；

CAG-R引物：TCACGGTACCGGCACGGGGCGAAGGCAG；

PGK-F引物：GTCAACGCGTGGTTGGGGTTGCGCCTTTTC；

PGK-R引物：TCACGGTACCCCTGGGGAGAGAGGTCGGTG；

EF1-F引物：GTCAACGCGCGTGAGGCTCCGGTGCCC；

EF1-R引物：TCACGGTACCCACGACACCTGAAATGGAA。

3.扩增RPE65启动子

1)提取人全基因组DNA，用于扩增RPE65启动子的模板。

2)根据文献报道(Yang P,Tyrrell J,Han I,Jaffe G(2009)50(7):3473-81.Expression and modulation of RPE cell membrane complement regulatoryproteins.Invest Ophthalmol Vis Sci.2009,50(7):3473-81.)，设计合成引物：

RPE65-F引物：GTCAACGCGTATTGCTGGTTTAAGAAGATTTGG；

RPE65-R引物:TCACGGTACCTTTCTTCCAGTTCAGGATCCAGA。

3)高保真PCR扩增RPE65基因上游启动子，全长约1500bp(SEQ ID NO:8)。

4.构建不同启动子介导的AAV表达质粒

1)利用MluI及KpnI，37°过夜酶切AAV穿梭质粒(Addgene，60958)；同时37°过夜酶切扩增的启动子，包括CMV、CAG、PGK、EF1α和RPE65启动子。

2)通过胶回收实验，纯化上述质粒骨架及酶切产物(启动子)。

3)酶连反应：利用T4连接酶，于4°过夜连接，将各启动子分别克隆到AAV穿梭质粒。

4)转化大肠杆菌感受态细胞，并利用氨苄青霉素筛选克隆。

5)挑取单克隆，测序鉴定。

5.构建不同启动子介导的AAV2-C9-hCYP4V2-HRH穿梭质粒(如图2至图6所示)。

1)利用BamH1及HindIII，37°过夜酶切上述AAV2穿梭质粒；同时37°过夜酶切扩增的CYP4V2-HRH基因的cDNA序列。

2)通过胶回收实验，纯化上述质粒骨架及酶切产物(CYP4V2-HRH cDNA序列)。

3)酶连反应：利用T4连接酶，于4°过夜连接，将CYP4V2基因的cDNA序列克隆到各AAV2表达质粒。

4)转化大肠杆菌感受态细胞，并利用氨苄青霉素筛选克隆。

5)挑取单克隆，测序鉴定。

6.构建AAV2/2-C9壳质粒(如图1所示)

1)从Addgene(https://www.addgene.org/81070/)获取rAAV2-retro壳质粒Cap蛋白核苷酸序列。

2)根据该序列融合C9短肽核苷酸序列，并送公司合成附带酶切位点NotI和BmgBI的基因片段。

3)NotI和BmgBI双酶切上述合成基因片段及rAAV2-retro壳质粒。

4)酶连反应：利用T4连接酶，于4℃过夜连接，转化大肠杆菌感受态细胞。

5)挑取单克隆，测序鉴定。

7.包装不同启动子介导的AAV2-C9-hCYP4V2-HRH病毒

1)10cm培养皿培养293细胞(赛默飞基因公司)，长至80％饱和状态。

2)脂质体Lipo2000转染CYP4V2-AAV2表达载体及其包装质粒(包括AAV2/2-C9壳质粒)。

AAV-pCAG-hCY4VP2-HRH质粒：10ug；

AAV2/2-C9壳质粒：5ug；

辅助质粒：5ug；

脂质体：60ul；

加750ul超纯水，混匀，室温静置20分钟，加入到293细胞中。

3)3天后，收取培养基上清，该上清含有大量AAV2-C9-pCAG-hCYP4V2-HRH病毒。

8.AAV2-C9-hCYP4V2-HRH病毒纯化

经碘克丁醇初步纯化后，经过以5ml-Hitrp Q琼脂糖凝胶作为填料的快速蛋白液相色谱仪通过离子交换层析进一步纯化(使用仪器为Pharmacia AKTA FPLC system(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ，美国))。之后用pH8.0，215mM的NaCl淋洗琼脂糖凝胶柱，对峰值的重组病毒载体进行收集。收集的液体通过浓缩器(100K concentrater,Millipore)后，用含0.014％的吐温20淋洗浓缩器对重组病毒载体进行浓缩。再用DNase I消化掉病毒颗粒以外DNA，并通过实时荧光定量PCR的方法确定病毒的滴度。最后用硝酸银染色-SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳法确保病毒载体颗粒没被污染且不含内毒素，并分装零下80℃储存。

实施例2：腺病毒载体的体外过表达验证

1.于十二孔细胞培养板中培养ARPE-19细胞，长至70％饱和状态。

2.加入10000MOI AAV2-C9-pCAG-hCYP4V2-HRH及AAV2-C9-pRPE65-hCYP4V2-HRH病毒，孵育过夜，并以未经改造过的AAV2壳质粒包装的相应AAV2-pCAG-hCYP4V2-HRH及AAV2-pRPE65-hCYP4V2-HRH病毒为对照。

3.换新鲜培养基继续培养。

4. 3天后，收集细胞后提取细胞总蛋白。

5.western blot验证CYP4V2表达状况。

6.结果如图7所示：1为未感染病毒的空白组，仅表达很低量的CYP4V2蛋白；2为AAV2-pCAG-hCYP4V2-HRH对照组，CYP4V2蛋白表达有所提高，并且有能够检测到一定量的HRH表达；3为AAV2-C9-pCAG-hCYP4V2-HRH组，相对于其对照组，CYP4V2及HRH蛋白表达量显著提高，表明C9能够显著提高AAV2病毒对ARPE-19细胞的感染效率；4为AAV2-pRPE65-hCYP4V2-HRH对照组，CYP4V2蛋白表达有所提高，并且有能够检测到一定量的HRH表达；5为AAV2-C9-pRPE65-hCYP4V2-HRH，相对于其对照组，CYP4V2及HRH蛋白表达量同样显著提高，同样表明C9能够显著提高AAV2病毒对ARPE-19细胞的感染效率。最终，实验证明，改造过的AAV2/2-C9质粒及CYP4V2-HRH表达质粒能够有效提高AAV2对RPE的感染能力并实现CYP4V2及HRH的高效共表达。

实施例3：腺病毒载体的功能验证

1.建立BCD病人iPSC细胞系

利用iPSC重编程技术(Cell.2006Aug 25；126(4):663-76.Epub 2006Aug10.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adultfibroblast cultures by defined factors.Takahashi K1,Yamanaka S.)抽取正常人及BCD病人外周血细胞，在CD34+无血清培养基中培养10天后，电转Yamanaka四因子质粒，加无血清培养继续培养两天后，转到Geltrex处理过的细胞培养板，于干细胞培养基E8中继续培养至iPSC克隆出现。通常iPSC在两周后出现，当该克隆长到肉眼可见时，即可传代扩增，用于下一步细胞分化实验。

2.BCD病人及正常人RPE细胞分化

RPE细胞分化依照已发布的方法进行(PLoS One.2015Jul 1；10(7):e0131288.doi:10.1371/journal.pone.0131288.eCollection 2015.Human OcularEpithelial Cells Endogenously Expressing SOX2and OCT4Yield High Efficiency ofPluripotency Reprogramming.Poon MW,He J,Fang X,Zhang Z,Wang W,Wang J,Qiu F,Tse HF,Li W,Liu Z,Lian Q.)，具体如下。于E8培养基中培养BCD病人及正常人iPSC至饱和，然后加入有血清分化培养基A继续培养两天，接着在无血清分化培养基中培养继续培养，三周后即可看到典型鹅卵石形并含有色素沉淀的RPE细胞，该细胞可传代扩增，并用于后续实验(具体培养基配方，见引用文献)。

3.AAV2感染实验

接种RPE细胞至细胞培养板，当细胞生长至70％饱和度时，加入10000MOI AAV2病毒，第二天换液，培养细胞至饱和状态，用以后续分析。荧光染料Bodipy-493/503染色显示BCD病人RPE中出现脂滴积累。为了验证本发明所述的腺病毒载体的功能，利用AAV2-pCAG-hCYP4V2及AAV2-pRPE65-hCYP4V2病毒感染BCD病人RPE细胞(方法与感染ARPE19细胞一致)，MOI为10000。

最终结果如图8所示：i为BCD病人的iPSC；ii为该iPSC分化的BCD病人的RPE细胞；iii为正常人RPE细胞的脂滴积累情况；iv为BCD病人RPE细胞的脂滴积累情况，其脂滴积累程度远远高于iii的正常人RPE；v为BCD病人RPE接受AAV2-C9-pCAG-hCYP4V2-HRH治疗后，细胞积累的脂滴明显得到降低；vi为BCD病人RPE接受AAV2-C9-pRPE65-hCYP4V2-HRH治疗后，细胞积累的脂滴明显得到降低。这些结果说明，上述提供的质粒所包装的AAV病毒，能够有效改善BCD病人RPE细胞的脂代谢障碍，从而达到治疗BCD的目的。

实施例4：基因载体的应用

本发明所述的基因载体是病毒表达载体，可用于BCD的基因治疗。

可根据标准技术产生重组病毒载体。例如，重组腺相关病毒载体能在人293细胞(其提供反式E1A和E1B特性)中传播，以达到在10⁷～10¹³个病毒颗粒/mL范围内的滴度。

在体内应用之前，病毒载体可通过凝胶过滤方法(例如，琼脂糖柱)进行脱盐，并通过随后的过滤进行纯化。纯化降低给药载体的主体中潜在的有害作用。所给药的病毒基本上不含野生型病毒和可复制型病毒。能通过合适的方法，例如十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，随后进行银染，来证明病毒的纯度。用于人的AAV的合适剂量在约1×10¹⁰～1×10¹⁴个病毒颗粒的范围内。

基因治疗载体是眼内注射给药的，可以采用视网膜下腔或玻璃体腔注射给药。

为了便于临床应用，本发明的药物组合物可以包含在注射用给药器(如注射用针)中，所述的注射用给药器中，可以包含一次给药量的所述的药物组合物。所述的注射用给药器可以被包含在药盒中，以方便储存、使用。运输时需要将装有药物悬浊液的微小容器放置于干冰中。平时应保存于-80C冰箱中。本发明所述的药盒或试剂盒中，还可包括使用说明书，以利于本领域技术人员按照正确的方式使用。如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的药学上可接受的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’sPharmaceuticalSciences(Mack Pub.Co.，N.J.，1991)中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、BBS(Balanced SaltSolution)磷酸盐缓冲液、ringer溶液、生理盐水、平衡盐溶液、甘油或山梨醇等。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质和稳定剂等。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳泓熙生物科技发展有限公司

<120> 用于治疗或预防结晶样视网膜色素变性的基因载体及其用途

<130>

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1578

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atggcggggc tctggctggg gctcgtgtgg cagaagctgc tgctgtgggg cgcggcgagt 60

gccctttccc tggccggcgc cagtctggtc ctgagcctgc tgcagagggt ggcgagctac 120

gcgcggaaat ggcagcagat gcggcccatc cccacggtgg cccgcgccta cccactggtg 180

ggccacgcgc tgctgatgaa gccggacggg cgagaatttt ttcagcagat cattgagtac 240

acagaggaat accgccacat gccgctgctg aagctctggg tcgggccagt gcccatggtg 300

gccctttata atgcagaaaa tgtggaggta attttaacta gttcaaagca aattgacaaa 360

tcctctatgt acaagttttt agaaccatgg cttggcctag gacttcttac aagtactgga 420

aacaaatggc gctccaggag aaagatgtta acacccactt tccattttac cattctggaa 480

gatttcttag atatcatgaa tgaacaagca aatatattgg ttaagaaact tgaaaaacac 540

attaaccaag aagcatttaa ctgctttttt tacatcactc tttgtgcctt agatatcatc 600

tgtgaaacag ctatggggaa gaatattggt gctcaaagta atgatgattc cgagtatgtc 660

cgtgcagttt atagaatgag tgagatgata tttcgaagaa taaagatgcc ctggctttgg 720

cttgatctct ggtaccttat gtttaaagaa ggatgggaac acaaaaagag ccttcagatc 780

ctacatactt ttaccaacag tgtcatcgct gaacgggcca atgaaatgaa cgccaatgaa 840

gactgtagag gtgatggcag gggctctgcc ccctccaaaa ataaacgcag ggcctttctt 900

gacttgcttt taagtgtgac tgatgacgaa gggaacaggc taagtcatga agatattcga 960

gaagaagttg acaccttcat gtttgagggg cacgatacaa ctgcagctgc aataaactgg 1020

tccttatacc tgttgggttc taacccagaa gtccagaaaa aagtggatca tgaattggat 1080

gacgtgtttg ggaagtctga ccgtcccgct acagtagaag acctgaagaa acttcggtat 1140

ctggaatgtg ttattaagga gacccttcgc ctttttcctt ctgttccttt atttgcccgt 1200

agtgttagtg aagattgtga agtggcaggt tacagagttc taaaaggcac tgaagccgtc 1260

atcattccct atgcattgca cagagatccg agatacttcc ccaaccccga ggagttccag 1320

cctgagcggt tcttccccga gaatgcacaa gggcgccatc catatgccta cgtgcccttc 1380

tctgctggcc ccaggaactg tataggtcaa aagtttgctg tgatggaaga aaagaccatt 1440

ctttcgtgca tcctgaggca cttttggata gaatccaacc agaaaagaga agagcttggt 1500

ctagaaggac agttgattct tcgtccaagt aatggcatct ggatcaagtt gaagaggaga 1560

aatgcagatg aacgctaa 1578

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

catcgccata ccaaacagcg ccataccgcg ctgcat 36

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ctggatgtga gcctggcgtt tagcgaaatt agcgtg 36

<210> 4

<211> 564

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60

gacgtcaata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg 120

gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga 180

cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttgtgcccag tacatgacct tatgggactt 240

tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtcg aggtgagccc 300

cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca cccccaattt tgtatttatt 360

tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg gggggggggc gcgcgccagg 420

cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg ggcgaggcgg agaggtgcgg cggcagccaa 480

tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt tatggcgagg cggcggcggc ggcggcccta 540

taaaaagcga agcgcgcggc gggc 564

<210> 5

<211> 584

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat 60

tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 120

aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 180

caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt 240

acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 300

ccatggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 360

ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg 420

ggggggggcg cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga 480

gaggtgcggc ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa gtttcctttt atggcgaggc 540

ggcggcggcg gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg ggcg 584

<210> 6

<211> 513

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

cggggttggg gttgcgcctt ttccaaggca gccctgggtt tgcgcaggga cgcggctgct 60

ctgggcgtgg ttccgggaaa cgcagcggcg ccgaccctgg gtctcgcaca ttcttcacgt 120

ccgttcgcag cgtcacccgg atcttcgccg ctacccttgt gggccccccg gcgacgcttc 180

ctgctccgcc cctaagtcgg gaaggttcct tgcggttcgc ggcgtgccgg acgtgacaaa 240

cggaagccgc acgactcact agtaccctcg cagacggaca gcgccaggga gcaatggcag 300

cgcgccgacc gcgatgggct gtggccaata gcggctgctc agcggggcgc gccgagagca 360

gcggccggga aggggcggtg cgggaggcgg ggtgtggggc ggtagtgtgg gccctgttcc 420

tgcccgcgcg gtgttccgca ttctgcaagc ctccggagcg cacgtcggca gtcggctccc 480

tcgttgaccg aatcaccgac ctctctcccc agg 513

<210> 7

<211> 1188

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 60

tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg 120

aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180

gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa 240

gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 300

gaattacttc cacgcccctg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga 360

agtgggtggg agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt 420

gaggcctggc ctgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt 480

ctcgctgctt tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt 540

tttttctggc aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt 600

tttggggccg cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg 660

ggcctgcgag cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct 720

ctggtgcctg gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg 780

tcggcaccag ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca 840

aaatggagga cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg 900

gcctttccgt cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg agtaccgggc gccgtccagg 960

cacctcgatt agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt 1020

tatgcgatgg agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac 1080

ttgatgtaat tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag 1140

cctcagacag tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtga 1188

<210> 8

<211> 1533

<212> DNA

<213> 人

<400> 8

attgctggtt taagaagatt tggattatcc ttgtactttg aggagaagtt tcttatttga 60

aatattttgg aaacaggtct tttaatgtgg aaagatagat attaatctcc tcttctatta 120

ctctccaaga tccaacaaaa gtgattatac cccccaaaat atgatggtag tatcttatac 180

taccatcatt ttataggcat agggctctta gctgcaaata atggaactaa ctctaataaa 240

gcagaacgca aatattgtaa atattagaga gctaacaatc tctgggatgg ctaaaggatg 300

gagcttggag gctacccagc cagtaacaat attccgggct ccactgttga atggagacac 360

tacaactgcc ttggatgggc agagatatta tggatgctaa gccccaggtg ctaccattag 420

gacttctacc actgtcccta acgggtggag cccatcacat gcctatgccc tcactgtaag 480

gaaatgaagc tactgttgta tatcttggga agcacttgga ttaattgtta tacagttttg 540

ttgaagaaga cccctagggt aagtagccat aactgcacac taaatttaaa attgttaatg 600

agtttctcaa aaaaaatgtt aaggttgtta gctggtatag tatatatctt gcctgttttc 660

caaggacttc tttgggcagt accttgtctg tgctggcaag caactgagac ttaatgaaag 720

agtattggag atatgaatga attgatgctg tatactctca gagtgccaaa catataccaa 780

tggacaagaa ggtgaggcag agagcagaca ggcattagtg acaagcaaag atatgcagaa 840

tttcattctc agcaaatcaa aagtcctcaa cctggttgga agaatattgg cactgaatgg 900

tatcaataag gttgctagag agggttagag gtgcacaatg tgcttccata acattttata 960

cttctccaat cttagcacta atcaaacatg gttgaatact ttgtttacta taactcttac 1020

agagttataa gatctgtgaa gacagggaca gggacaatac ccatctctgt ctggttcata 1080

ggtggtatgt aatagatatt tttaaaaata agtgagttaa tgaatgaggg tgagaatgaa 1140

ggcacagagg tattaggggg aggtgggccc cagagaatgg tgccaaggtc cagtggggtg 1200

actgggatca gctcaggcct gacgctggcc actcccacct agctcctttc tttctaatct 1260

gttctcattc tccttgggaa ggattgaggt ctctggaaaa cagccaaaca actgttatgg 1320

gaacagcaag cccaaataaa gccaagcatc agggggatct gagagctgaa agcaacttct 1380

gttccccctc cctcagctga aggggtgggg aagggctccc aaagccataa ctccttttaa 1440

gggatttaga aggcataaaa aggcccctgg ctgagaactt ccttcttcat tctgcagttg 1500

gtgccagaac tctggatcct gaactggaag aaa 1533

Claims (5)

1.一种用于治疗或预防结晶样视网膜色素变性的基因载体，其特征在于，包括：包装质粒，是插入了抗CD59短肽C9的基因序列的AAV2包装质粒；以及

载体质粒，是插入了人类细胞色素P450超家族蛋白CYP4V2的基因序列、抗VEGF短肽HRH的基因序列、启动子序列的AAV载体质粒；

所述CYP4V2蛋白的基因序列如SEQ ID NO:1所示；所述HRH的基因序列如SEQ ID NO:2所示；所述C9的基因序列如SEQ ID NO:3所示。

2.根据权利要求1所述的基因载体，其特征在于，所述启动子是通用启动子或者视网膜色素上皮细胞的特异性启动子；

所述通用启动子是选自：CBh启动子、CAG启动子、PGK启动子、EF1α启动子；所述CBh启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述CAG启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述PGK启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；所述EF1α启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO:7所示；

所述特异性启动子是RPE65特异性启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。

3.一种组合物，包括如权利要求1所述的基因载体，以及药学上可接受的赋形剂。

4.如权利要求1所述的基因载体用于制备治疗或预防结晶样视网膜色素变性的药物的用途。

5.如权利要求1所述的基因载体用于制备在患有结晶样视网膜色素变性的对象的视网膜色素上皮细胞中共表达CYP4V2及HRH编码序列的药物的用途。

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