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CN109136240A - 一种分离的核酸及其应用 - Google Patents

一种分离的核酸及其应用 Download PDF

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CN109136240A CN201811078931.8A CN201811078931A CN109136240A CN 109136240 A CN109136240 A CN 109136240A CN 201811078931 A CN201811078931 A CN 201811078931A CN 109136240 A CN109136240 A CN 109136240A
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Abstract

本发明公开了一种分离的核酸及其应用，涉及生物分子技术领域。该核酸的碱基序列如(1)～(3)任一项所示：(1)碱基序列如SEQ ID NO.3所示；(2)第1～225位碱基序列如SEQ ID NO.1所示，第226～1737位碱基序列编码Env蛋白，Env蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；(3)第1～225位碱基序列编码M蛋白，第226～1737位碱基序列如SEQ ID NO.2所示，M蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。该核酸能够大量表达寨卡病毒的免疫抗原，有利于寨卡病毒疫苗或寨卡病毒治疗药物的研究。

Description

一种分离的核酸及其应用
技术领域
本发明涉及生物分子技术领域，具体而言，涉及一种分离的核酸及其应用。
背景技术
寨卡病毒(Zika virus)于1947年首次在非洲乌干达寨卡森林发现，其寄生于恒河猴体内，主要通过蚊虫叮咬传播。目前约有80％的寨卡病毒感染个体并未表现出明显的临床症状，少数有临床症状的感染个体表现为发热、皮疹、关节痛、肌肉痛、头痛、呕吐和眼结膜炎，这些临床症状通常会持续1周以上且表现较为温和。
寨卡病毒传播媒介是埃及伊蚊和白纹伊蚊，它们全年活跃在世界许多地方,包括美国南部沿海大多数州及拉丁美洲和太平洋许多度假区。寨卡病毒病除了提前预防外，尚无特效治疗方法。防止寨卡病毒感染的最有效保护方法就是防止蚊虫叮咬。
但寨卡病毒能够经胎盘屏障由孕妇垂直传给胎儿，并给胎儿造成严重后果，如导致胎儿大脑结构异常，包括脑干和小脑发育不全、延迟髓鞘形成、脑室扩大、大脑薄壁组织严重钙化以及少数的无脑回症状。与其他感染孕妇并影响多种组织器官发育的病毒不同，寨卡病毒似乎只影响神经组织。研究证明46名孕妇在产期感染了寨卡病毒后，直接导致产婴的小头畸形症且大脑严重损害。而目前尚无商业化的寨卡病毒预防性疫苗和治疗性药物。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种分离的核酸，其能够大量表达寨卡病毒的免疫抗原，有利于寨卡病毒疫苗或寨卡病毒治疗药物的研究。
本发明的第二目的在于提供一种载体，其包括有如上的核酸。
本发明的第三目的在于提供一种重组腺病毒的构建方法。
本发明的第四目的在于提供一种重组腺病毒，其由上述构建方法制得，能够表达大量复制并表达目的基因。
本发明的第五目的在于提供一种重组细胞或重组菌，培养该重组细胞或重组菌能够得到高质量的寨卡病毒的免疫抗原，有利于寨卡病毒疫苗或寨卡病毒治疗药物的研究。
本发明的第六目的在于提供一种制备Env蛋白的方法，其能够快速高效获得Env蛋白。
本发明的第七目的在于提供一种寨卡病毒疫苗。
本发明的第八目的在于提供分离的核酸、载体、或重组腺病毒在制备用于预防或治疗寨卡病毒感染的药物中的应用。
本发明是这样实现的：
一种分离的核酸，其碱基序列如(1)～(3)任一项：
(1)如SEQ ID NO.3所示；
(2)第1-225位碱基序列如SEQ ID NO.1所示，第226～1737位碱基序列编码Env蛋白，Env蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
(3)第1～225位碱基序列编码M蛋白，第226～1737位碱基序列如SEQ ID NO.2所示，M蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
在本发明一些实施方式中，分离的核酸3’端连接有PolyA序列(多聚A)，和/或分离的核酸5’端连接有信号肽。PolyA序列可为SV40PolyA序列。信号肽可为信号肽Igκ。
在本发明的一些实施方式，分离的核酸的碱基序列如SEQ IDNO.6或7所示。
一种载体，载体包括有如上的核酸。
在本发明的一些实施方式中，上述载体为重组腺病毒载体。
在本发明的优选实施例中，上述腺病毒载体可为5型腺病毒载体(rAd5)。
在本发明的优选实施例中，上述5型腺病毒载体为pAd5-CMV/V5-DEST质粒载体。
一种重组腺病毒载体的制备方法，其包括将包括有上述核酸的穿梭质粒载体与腺病毒载体接触，通过同源重组的方式将核酸转移至腺病毒载体上，以获得包含有上述核酸的重组腺病毒载体。
在本发明的一些实施例中，上述穿梭质粒载体为pDONR221。
在本发明的一些实施方式中，上述制备方法包括将测序正确的含有上述核酸的穿梭质粒载体(pDONR221-M-Env-PolyA)转化至包含腺病毒载体(pAd5-CMV/V5-DEST)的大肠杆菌TOP10感受态细胞进行同源重组，筛选测序正确的包含有上述核酸的重组腺病毒载体(pAd5-CMV-M-Env-PolyA)。
一种重组腺病毒的构建方法，其包括将上述包含上述核酸的腺病毒载体转染宿主细胞。
在本发明的优选实施例中，上述宿主细胞为293细胞。
一种重组腺病毒，其由上述重组腺病毒的构建方法制得。
一种重组细胞或重组菌，其包括有上述的核酸、或上述的载体或上述重组腺病毒。
在本发明的一些实施方式中，的重组细胞为293细胞。
一种制备Env蛋白的方法，其包括：培养如上的重组细胞或重组菌。
一种寨卡病毒疫苗，其包含：上述分离的核酸、上述载体、上述重组腺病毒或上述制备方法制备得到的Env蛋白。
本发明提供了一种上述分离的核酸在制备用于预防或治疗寨卡病毒感染的药物中的应用。
本发明提供了一种上述载体在制备用于预防或治疗寨卡病毒感染的药物中的应用。
本发明提供了一种上述重组腺病毒在制备用于预防或治疗寨卡病毒感染的药物中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的分离的核酸，其包括有优化重组的寨卡病毒基因序列，该序列具有极好的稳定性，能够大量表达寨卡病毒的免疫抗原，有利于寨卡病毒疫苗或寨卡病毒治疗药物的研究。
本发明提供的包含上述分离的核酸的重组腺病毒及其构建方法，其将含有上述分离的核酸的重组腺病毒载体染进293细胞中，包装得到，该重组腺病毒的病毒液体免疫小鼠后可刺激机体产生很强的抗体滴度。
培养本发明提供的重组细胞或重组菌可大量表达得到高质量的寨卡病毒的免疫抗原，有利于寨卡病毒疫苗或寨卡病毒治疗药物的研究。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为寨卡病毒基因组的示意图；
图2为第一实施例中的载体pDONR221-M-Env-PolyA的菌落PCR检测结果图；
图3为第一实施例中的PCR鉴定pAd5-CMV-M-Env-PolyA质粒的结果图；
图4为第三实施例中的PCR扩增的M-Env片段结果图；
图5为第三实施例中的基因优化前后的病毒液中重组腺病毒rAd5-M-Env-PolyA的WB的检测结果图；
图6为第一对比例中纯化后的重组腺病毒rAd5-M-Env-PolyA的TEM检测结果；
图7为第一对比例中纯化后的重组腺病毒rAd5-M-Env-PolyA的HPLC检测结果；
图8为第一对比例中重组腺病毒的抗体滴度测试图；
图9为第二对比例中WB检测基因优化前后重组rAd5-M-Env病毒Env蛋白表达图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例提供的分离的核酸及其应用进行具体说明。
寨卡病毒全长基因组为单股正链RNA分子，序列全长约11000个核苷酸，该病毒属黄病毒科中黄病毒属。寨卡病毒全基因组共编码3419个氨基酸，病毒蛋白全长被分割成为几个功能结构域：核衣壳(Capsid region，C区)、病毒膜前体(Precursor of membraneregion，prM区)、包膜蛋白(Envelope region，E区)和7个非结构蛋白(non-structuralproteins，NS)区域，包括：NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5区)。其全基因组只编码一个单独的开放读码框(open reading frame，ORF)，它能够编码约为3400个氨基酸的多聚蛋白质，然后继续被切割成为成熟的多种病毒蛋白质，寨卡病毒基因组的开放读码框两端为基因组中的非翻译区(untraslated regions，UTR)，如图1所示。黄病毒属的病毒主要免疫抗原为Env蛋白。
本发明实施例提供的一种分离的核酸，其碱基序列如(1)～(3)任一项所示：
(1)碱基序列如SEQ ID NO.3所示；
(2)第1～225位的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，第226～1737为碱基序列编码Env蛋白，Env蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
(3)第1～225位的碱基序列编码M蛋白，M蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，第226～1737位碱基序列如SEQ ID NO.2所示。
具体地，在上述(2)中，第226～1737碱基序列是指任何能够编码氨基酸序列如SEQID NO.4所示Env蛋白的任意序列，在上述(3)中，第1～225位的碱基序列为能够便编码氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示M蛋白的任意序列。
本发明实施例提供的核酸为优化后能够高效表达黄病毒属的病毒主要免疫抗原的碱基序列。该核酸包括有能够编码M蛋白的碱基序列和/或编码Env蛋白的碱基序列，编码M蛋白的碱基序列与编码Env蛋白的碱基序列均为优化后的序列，采用优化后的编码M蛋白的碱基序列(SEQ ID NO.1)、编码Env蛋白的碱基序列(SEQ IDNO.2)或其两者融合的序列(SEQ ID NO.3)均能够起到高效Env蛋白的作用。Env蛋白为黄病毒属的病毒主要免疫抗原，而M蛋白能够起到稳定Env蛋白的作用。
进一步地，上述核酸的3’端连接有PolyA序列(多聚A)。加在核酸的3’端是为了稳定mRNA的状态，从而提高塞卡病毒免疫抗原的表达水平。具体地，PolyA序列可以采用SV40PolyA序列，其来源于猴空泡病毒基因组序列，全长约255bp，含有保守序列AATAAA，对上述核酸产生更好的稳定作用，具体地，加入SV40PolyA序列的核酸序列如SEQ ID NO.6所示。
进一步地，上述核酸的5’端连接有信号肽。信号肽能够增加Env蛋白的分泌效率。具体地，加入了信号肽Igκ以及SV40PolyA序列的核酸序列如SEQ ID NO.7所示。
本发明实施例提供一种载体，其包括有上述核酸。
上述载体可以为以下载体中的一种或多种：克隆载体、表达载体、测序载体、转化载体、穿梭载体以及多功能载体。
进一步地，上述载体为腺病毒载体，优选为5型重组腺病毒载体(rAd5)，更进一步为pAd5-CMV/V5-DEST质粒载体。
具体地，上述腺病毒载体是指包括有上述核酸的碱基序列的重组腺病毒载体。
上述腺病毒载体的构建方法为：将上述分离核酸插入穿梭质粒载体中，穿梭质粒载体采用pDONR221，筛选插入目的基因的穿梭质粒载体，并进行测序，将测序正确的穿梭质粒载体pDONR221-M-Env-PolyA和腺病毒载体接触，具体为将穿梭质粒载体转化至含有腺病毒载体pAd5-CMV/V5-DEST的大肠杆菌TOP10感受态细胞进行同源重组，筛选测序正确的重组腺病毒载体pAd5-CMV-M-Env-PolyA。
本发明实施例提供的一种重组腺病毒的构建方法，其包括将上述腺病毒载体(pAd5-CMV-M-Env-PolyA)转染宿主细胞293细胞中，包装得到。
本发明实施例提供的重组细胞或重组菌，其包括如上述分离的核酸、上述载体或上述重组腺病毒。
本发明实施例提供的制备Env蛋白的方法，其包括培养上述重组细胞或重组菌。具体地，该方法包括培养上述的重组细胞或重组菌，然后从培养物中分离、纯化得到Env蛋白，即为寨卡病毒抗原蛋白。
本发明实施例提供的寨卡病毒疫苗，其包括有上述核酸、上述载体、上述重组腺病毒或上述制备Env蛋白的方法制备的Env蛋白。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
第一实施例
制备pAd5-CMV-M-Env-PolyA质粒。
1.转移质粒的构建(pDONR221-M-Env-PolyA)
1.1.基因合成及引物设计
按照SEQ ID NO.3所示序列，让基因合成公司合成M-Env序列。
以M-Env序列(序列如SEQ ID NO.3所示)为模板，设计上下游引物(引物由Invitrogen公司合成)进行PCR扩增。
其中，上游引物(M-Env-F)的序列如下：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATAGAACCATGGCTGTGACGCTCCCCTCCCATTC-3’(如SEQ ID NO.8所示)；
下游引物(SV40-R)的序列如下：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCAGATGATAAGATACATTGATGAGT-3’(如SEQ ID NO.9所示)。
1.2.PCR扩增
扩增体系：上下游引物各2μL，基因合成质粒模板1μL，Primer STAR mix 25μL，加ddH2O至50μL。
扩增片段M-Env融合序列大小为1737bp，PCR扩增条件为：94℃预变性2min；94℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸1min30s，共30个循环；最后72℃再延伸10min。
将PCR扩增后的M-Env片段与pDONR221-SV40Poly A质粒(本公司保存)分别用SpeI和XhoI双酶切，然后采用T4连接酶进行连接，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞后，涂布于含kana抗生素的固体LB平板。
次日，挑选不同的克隆做PCR菌落，PCR正反向引物为M13-F/M13-R。PCR条件如下：菌液2μL，PCR正反向引物(M13-F/M13-R)各0.5μL(10umol/μl)，2×Taq mix 5μL，ddH2O 2μL；循环条件：95℃，2min；95℃15s，55℃15s，72℃1min30s共30个循环；最后72℃5min。
PCR结束后琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果见图2，M为DL5000DNA marker，1～3为pDONR221-M-Env-PolyA不同的菌落分别PCR结果。图2中可见约2000bp的片段M-Env-PolyA(SEQ ID NO.6)，片段大小均与预期(2007bp)相符；将PCR鉴定阳性的菌，分别接种于5mL含Kana抗生素的LB液体培养基中过夜培养。
次日，提取不同菌落质粒，并送测序公司测序，测序上游引物为M13-F(SEQ IDNO.10),下游引物为M13-R(SEQ ID NO.11)，双向测通。测序结果显示获得正确的pDONR221-M-Env-PolyA质粒。
2.构建腺病毒表达载体pAd5-CMV-M-Env-PolyA
2.1.将步骤1.2中测序正确的pDONR221-M-Env-PolyA质粒150ng分别与pAd5-CMV/V5-DEST质粒150ng做Gateway LR重组(详细步骤参见Invitrogen公司Gateway重组使用手册)，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞(购自美国Invitrogen公司)，并涂布于含Amp抗生素的固体LB平板。
2.2.次日，挑选不同的克隆做进行菌落PCR，PCR上游引物为T7-F(SEQ ID NO.12)，下游引物V5-C-R(SEQ ID NO.13)，PCR条件如下：菌液2μL，上下游引物(T7-F/V5-C-R)各0.5μL(10μmol/μL)，2×Taq mix 5μL，ddH2O 2μL，循环条件：95℃，2min一步；95℃15s，45℃15s，72℃1min30s，共30个循环；最后72℃5min。PCR结束后琼脂糖(购自西班牙BIOWEST公司)凝胶电泳检测PCR结果见图3，图3中，M为DL5000DNA marker，1～6为pAd5-CMV-M-Env-PolyA不同的菌落分别PCR结果。
2.3.将PCR鉴定阳性的菌，分别接种于5mL含Kana抗生素的LB液体培养基中过夜培养。将PCR鉴定阳性的菌，分别接种于5mL含Amp抗生素的LB液体培养基中过夜培养。次日，提取不同菌落质粒，并送测序公司测序，测序引物T7-F，V5-C-R双向测通。测序结果显示获得正确的pAd5-CMV-M-Env-PolyA质粒。
第二实施例
制备线性化的病毒载体rAd5-M-Env-PolyA。
3.腺病毒载体的扩增
3.1.将步骤2.3测序正确的pAd5-CMV-M-Env-PolyA质粒转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，并涂布于含Amp抗生素的固体LB平板。对比设置阴性对照：将pAd5-CMV/V5-Dest质粒(购自美国Invitrogen公司)转化大肠杆菌ccdBsuvival感受态细胞(购自美国Invitrogen公司)，并涂布于含Amp抗生素的固体LB平板。
3.2.次日分别挑取LB平板上的单克隆，并接种于含200mL Amp的液体培养基，过夜培养后，采用质粒大抽试剂盒分别提取大量的pAd5-CMV-M-Env-PolyA质粒及pAd-CMV/V5-Dest质粒。
4.腺病毒载体线性化处理将步骤3.2中获得的pAd5-CMV-M-Env-PolyA质粒及pAd-CMV/V5-Dest质粒分别用PacI限制性内切酶(购自美国NEB公司)，37℃酶切3h，酶切体系如下：质粒(pAd5-CMV-M-Env-PolyA或pAd-CMV/V5-Dest)：10μg，10ⅹNEB CutSmart buffer：5μL，PacI酶：5μL，加ddH2O至终体积50μL。酶切后用PCR产物回收试剂盒(天根公司)回收酶切后的线性化DNA片段，得到线性化的病毒载体rAd5-M-Env-PolyA，并用微量核酸定量仪对回收后的DNA片段进行定量。
5.重组腺病毒的包装
5.1.取生长状态良好的293细胞一瓶(T75cm2)，转染前一天将293细胞用胰酶消化并计数，在6孔板中每孔加入5ⅹ105个细胞。每孔加2mL DMEM+10％FBS+1％Pen-strep(均购自美国GIBCO公司)。转染当天，将6孔板中培养液弃去并换入1.5mL新鲜的DMEM+10％FBS培养基(不含双抗)。
5.2.准备DNA-lip2000复合物(lip2000购自美国Invitrogen公司)
5.2.1.分别取1μg PacI线性化处理后的pAd5-CMV-M-Env-PolyA和pAd-CMV/V5-Dest质粒(步骤4)，然后分别用DMEM不含血清培养基稀释至250μL轻轻混匀得到质粒稀释液。吸取3μL lip2000，加入247μL DMEM培养基不含血清，轻轻混匀后室温放置5min得到lip2000稀释液。将质粒稀释液与lip2000稀释液混合，室温孵育20min，以形成DNA-lip2000复合物(溶液会浑浊，不影响转染)，将孵育好的DNA-lip2000复合物，滴入6孔板细胞中，前后晃动6孔板混匀，并将6孔板置于37℃，5％CO2培养箱中过夜培养。
5.2.2.次日，将6孔板(购自美国Corning公司)中细胞含有lip2000的培养基吸出，换入新鲜的DMEM+10％FBS培养基。每隔2～3天换一次液，直到开始看到CPE后(转染后7-10天)停止换液。向6孔板中补加培养基并继续培养至CPE达到80％，用移液枪将细胞从6孔板上吹下得到病毒液，将其转移至15mL离心管(购自美国Corning公司)中。将收集的病毒液放入-80℃冰箱30min，然后将病毒液放入37℃水浴锅中解冻，孵育时间不要超过15min，重复两次冻融步骤。
5.2.3.将冻融后的病毒液进行室温离心，3000rpm，15min。分别获得的rAd5-M-Env-PolyA病毒液(沉淀)和rAd5-Dest病毒液，以每管1mL分装入冻存管(购自美国Corning公司)，并保存于-80℃冰箱。
6.TCID50法测定重组腺病毒滴度
6.1.取生长状态良好的293细胞一瓶(T75cm2)在测定前一天将293细胞用胰酶消化，终止消化时弃去胰酶，用DMEM+2％FBS重悬细胞并计数。于96孔细胞板(购自美国Corning公司)放入293细胞，调整细胞浓度为8.3ⅹ104/mL，每孔100μL细胞，摇晃均匀后置于37℃，5％CO2培养箱16～20小时。
6.2.稀释步骤5.2.3获得的rAd5-M-Env-PolyA病毒液：用DMEM+2％FBS培养基做10-1～10-10十倍连续稀释。得到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10倍稀释得到rAd5-M-Env-PolyA病毒稀释液以及rAd5-Dest病毒稀释液。
6.3.于96孔细胞板，每孔加入100μL的步骤6.2获得的10-3～10-10倍稀释的rAd5-M-Env-PolyA病毒稀释液，每个病毒稀释液重复10孔。混合均匀后置于37℃，5％CO2培养箱。同时，另外两纵排加入100μL DMEM+2％FBS培养基做阴性对照。置于CO2培养箱37℃培养7d、10d、14d(7d/10d/14d分别观察细胞及CPE情况)，然后在倒置显微镜下观察，判断并记录每排细胞病变效应情况，结果显示，细胞病变率较高，最后得到的病毒平均滴度在107～108pfu/mL之间，只要有少量细胞发生CPE即为阳性，若不能判断是CPE还是细胞死亡时，则与后面的阴性对照比较。
第三实施例
验证第二实施例的重组腺病毒rAd5-M-Env-PolyA能够表达Env蛋白。
7.PCR鉴定重组腺病毒Env基因
7.1.将步骤5.2.3获得的病毒液用病毒RNA/DNA提取试剂盒(按照操作说明书)提取病毒基因，设置阳性对照(M-Env-PolyA)以及阴性对照(rAd5-Dest)。
7.2.将提取后的病毒DNA用PCR扩增鉴定获得的重组腺病毒插入的目的基因。PCR正反引物为：T7-F/V5-C-R，PCR条件：病毒DNA 1μL，正反向引物各0.5μL，2×PrimerSTARmix 5μL，ddH2O 3μL,循环条件：95℃，2min一步；95℃15s，45℃15s，72℃1min30s共30个循环；最后72℃5min。
7.3.PCR结束后琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，见图4。并将扩增得到的条带送测序公司进行测序。测序证明扩增得到的DNA片段为寨卡病毒M-Env序列。因此，步骤3.2中获得的pAd5-CMV-M-Env-PolyA质粒中包括有M-Env序列。
8.WB(WesternBlot)检测重组腺病毒Env基因表达
8.1.取生长状态良好的293细胞一瓶(T75cm2)感染前一天将293细胞用胰酶消化并计数，在6孔板中每孔加入5ⅹ105个细胞。每孔加2mL DMEM+10％FBS+1％Pen-strep，24h后细胞汇合率到达90％，向一个孔加入200μL步骤5.2.3获得的rAd5-M-Env-PolyA病毒液感染48小时，确证70％细胞出现CPE，如果CPE未到达70％则再延长感染24小时。另外一个孔设为阴性对照。
8.2.弃去感染后的培养上清，将6孔板置于冰上，向感染病毒孔和阴性孔中分别加入含1％PMSF的细胞裂解液(购自碧云天公司)100μL，轻轻晃动使得裂解液快速裂解细胞，冰上裂解细胞15min。将裂解后的细胞液吸入1.5mL EP管中。7000rpm，4℃离心5分钟，收集上清进行下一步检测。
8.3.取60μL步骤8.2中的上清液加入20μL 4×蛋白上样loadingbuffer，rAd5-Dest与293细胞作为阴性对照，100℃煮沸5min。SDS-PAGE上样，160V，电泳90min。
将电泳结束后的SDS-PAGE Gel用湿转法转膜到PVDF膜上(转膜液根据PVDF膜说明书配置)。90V，冰浴转膜1h。转膜结束后1×PBST溶液洗膜10min。用1×PBST溶液配制5％脱脂奶粉作为封闭液，将转好的膜在封闭液中，4℃封闭过夜。
次日，将膜用1×PBST溶液洗膜10min×2次。取anti-zikaenvelope polyantibody(购自美国GeneTex公司)，按照1:2000的比例用含1％脱脂奶粉的PBST溶液进行稀释，稀释好后，膜置于一抗稀释液中37℃，孵育2h。孵育结束后1×PBST溶液洗膜10min×3次。取anti-rabbit二抗(购自美国Jackson公司)，按照1:2000的比例用含1％脱脂奶粉的PBST溶液进行稀释，稀释好后，膜置于二抗稀释液中37℃，孵育1h。孵育结束后1×PBST溶液洗膜10min×3次。
8.4.化学发光法，按照试剂盒说明书操作，将A、B液显色液(购自美国Pierce公司)混合后，加置PVDF膜(购自美国Millipore公司)上，暗处显色2～3min，化学发光扫膜仪进行照相。WB结果见图5显示，图5中，M为蛋白Marker，1～2为阴性对照293细胞，3为rAd5-Dest病毒感染后293细胞，4为rAd5-M-Env-PolyA病毒感染后293细胞。
rAd5-M-Env-PolyA感染后的293细胞中能检测到寨卡病毒膜蛋白M-Env的表达，而rAd5-Dest感染后的293和293阴性对照细胞中均未检测到M-Env蛋白的表达。因此，第二实施例步骤3.2中的pAd5-CMV-M-Env-PolyA质粒能够表达M-Env融合蛋白。
第一对比例
验证重组腺病毒rAd5-M-Env-PolyA的免疫原性。
9.扩增重组腺病毒rAd5-M-Env-PolyA
9.1.在四个T75cm2方瓶(购自美国Corning公司)中分别接种293细胞，培养基DMEM+10％FBS+1％Pen-strep至密度达到90％，取一瓶T75，用胰酶消化后将细胞进行重悬并进行细胞计数，根据测定的病毒滴度，分别将三种重组腺病毒的病毒液：阳性对照M-Env基因组(未优化的M-Env基因组)、步骤5.2.3中获得的rAd5-M-Env-PolyA病毒液以及rAd5-Dest病毒液，分别加入剩余的3个T75瓶293细胞，使得最终MOI值均为0.1。3～4d后，细胞几乎变圆，且有一半细胞漂浮，则收集所有细胞。约500g转速离心，弃上清，将收集后的细胞(沉淀)冻存于-80℃冰箱，待细胞完全冻住后，将细胞置于37℃水浴，快速化冻。重复该操作，共反复冻融三次。将收集后的细胞冻存于-80℃冰箱，待细胞完全冻住后，将细胞置于37℃水浴，快速化冻。重复该操作，共反复冻融三次得到第二代重组腺病毒。
9.2.将步骤9.1中的第二代重组腺病毒rAd5-M-Env-PolyA进行TCID50检测(测定方法同第二实施例中的TCID50检测)。在多个T225瓶中分别接种293细胞，培养基为DMEM+10％FBS+1％Pen-strep至密度达到90％，取一瓶T225,用胰酶消化后将细胞进行重悬并进行细胞计数，根据测定的病毒滴度，在重组腺病毒的第二代收获液中加入剩余的T225瓶293细胞，使得最终MOI值均为0.1。3～4d后，细胞几乎变圆，且有一半细胞漂浮，则收集所有细胞。约500g转速离心，弃上清，将收集后的细胞(沉淀)冻存于-80℃冰箱，待细胞完全冻住后，将细胞置于37℃水浴，快速化冻。重复该操作，共反复冻融三次，得到病毒保存液。
10.重组腺病毒rAd5-M-Env-PolyA的纯化
10.1.不连续氯化铯密度梯度离心去除主要的细胞污染物和缺陷性病毒颗粒(备注：为确保氯化铯(购自国药集团)密度梯度后较易分辨病毒带，扩增病毒至少需要3×108细胞)：
10.1.1.预冷离心转子至4℃，在离心管中缓慢加入12mL 1.4g/mL氯化铯(53g+87mL 10mM Trz-HCL，PH 7.9)，再非常轻缓地加入9mL 1.2g/mL氯化铯(26.8+92mL 10mMTris-HCL，PH 7.9)。病毒最终的纯度有赖于密度梯度的质量。超净台中在不连续梯度顶部加入13mL步骤9.2的病毒保存液(病毒量必须少于109细胞中所得的，否则将超过密度梯度负荷量，如果保存液的体积少于13mL，用PH 7.910mM Tris-HCL调至13mL)。
10.1.2.平衡离心管，100000×g(SW28转子上为23000rpw)4℃离心120分钟。超净台中取出离心管，用夹子直立固定离心管。用10mL移液器从梯度顶部吸去大部分杂质。用带18G针头的5mL注射器从离心管外壁稍低于病毒带(最下的一条带)的位置进行穿刺(小心抽吸病毒带，避免吸到其它带和杂质)。将含病毒的溶液转移至无菌15mL离心管。加入1倍体积1×TE，得到病毒悬液。
10.2.连续氯化铯密度梯度离心将感染性病毒颗粒和缺陷性病毒颗粒分开：
10.2.1.将20mL 1.35g/mL氯化铯加入离心管中，非常缓慢地从离心管的顶部加入15mL步骤10.1.2.中的病毒悬液，100000×g 4℃离心18小时。超速离心后，用10mL移液器从离心管顶部吸去大部分梯度溶液和杂质(避免吸到底部含病毒的蓝白色条带，这有助于在收集病毒时降低溶液流出速度)。用20G针头从底部穿刺收集底部蓝白色病毒带。
10.3.透析去除氯化铯
10.3.1.将步骤10.2.1中收集的病毒带在10000道尔顿的纤维素酯膜(购自美国BD公司)中进行4℃透析，去除氯化铯盐。透析液含20mM Tris(PH8.0)，25mM NaCl，2.5％(w/v)甘油，透析液的体积应为病毒溶液的200倍，每次透析一小时，然后更换缓冲液，3次更换缓冲液后应已无痕量氯化铯。透析后的病毒溶液分装后冻存与-80℃冰箱。
10.4.将步骤10.3.1中透析后的病毒液分别进行PCR、western-blot(WB)、TCID50(检测步骤请参照第二实施例)、TEM检测以及HPLC检测，TEM检测结果请参照附图6，HPLC检测请参照附图7。结果证明，纯化的重组腺病毒rAd5-M-Env含有M-Env融合序列，2000bp大小符合预期，且重组腺病毒rAd5-M-Env能够表达Env蛋白。
11.验证重组腺病毒rAd5-M-Env-PolyA的免疫原性
11.1.选取6～8周龄、体重18～22g的BALB/c小鼠40只(雌/雄各半)，动物经检验检疫后按体重随机分组，分为空白对照组、rAd5-empty组(阴性对照)，rAd5-Env-PolyA组(阳性对照)、rAd5-M-Env-PolyA组(目标组)，全部样品均为包转成功的病毒液体，采取肌肉注射方式。各实验组的具体信息如表1。
表1为实验组的免疫信息
备注：阳性对照组中的目的基因采用的是未优化的M-Env基因序列。
空白对照组(10只)不进行免疫注射，于实验开始后第28天、56天采血并分离血清待检测，所有样品血清均保存在≤-60℃的低温冰箱中。备注：以上动物实验由第三方检测机构武汉市药检所完成，按照合同约定取走全部实验样品血清。所有实验样品血清抗体滴度严格按照试剂盒说明书(RecombivirusTM Mouse Anti-Zika Virus Envelop(ENV)Protein IgG ELISA Kit)进行操作(购自美国ADI公司)，试剂盒内已提供所需试剂及耗材，具体操作如下：
分别加入100μL的Anti-ZIKV-E校准品和样品血清及Anti-ZIKV-E阳性对照混合液到预处理后的ZIKV-E包被孔板中。摇动包被孔板，使混合液充分混匀并静止孵育60min。倒掉孔板中的液体，用1ⅹ洗液反复洗涤孔板4次(确保无任何样品试剂残留附着在孔板内)，然后倒置孔板与干燥的白纸上拍干孔板内的残余洗液。
加入100μL稀释后的Anti-Mouse IgG HRP结合物到待测孔板中，孵育30min，倒掉孔板中的液体，用1ⅹ洗液反复洗涤孔板5次。加入100μL TMB底物到待测孔板中，孔板中液体会逐渐变蓝，然后将孔板置于暗处15min。加入100μL终止液到待测孔板中，轻轻摇动使孔板内液体充分混匀，混匀后液体将会逐渐变为黄色。
将分光光度计波长调至450nm，然后把待测孔板放入分光光度计中进行读数，将得到数据后计算所有血清样品中抗体滴度值绘制成图，请参照附图8。
根据结果分析可知，目标组和阳性对照组血清滴度明显超过阴性对照及空白组血清滴度，不属于假阳性。注射rAd5-M-Env-PolyA组病毒液(目标组)后的血清滴度要高于注射rAd5-Env-PolyA组病毒液(阳性对照)后的血清滴度。
第二对比例
将本发明提供的M-Env核酸序列与其他现有的M-Env融合序列进行Env表达量的比较。
具体实验步骤参见第三实施例，对比设置1组对比实施例。对比结果请参照附图9，图9中，M为蛋白marker，1为阴性对照293细胞，2为未进行密码子优化的rAd5-M-Env-PolyA病毒(病毒基因序列参见GenBank:KU963796.1)感染的293细胞(对比实施例)，3为密码子优化的rAd5-M-Env-PolyA感染后293细胞(第三实施例)，4为rAd5-Dest病毒感染后293细胞。结果显示，本发明提供的M-Env核酸序列表达量高于其它现有的M-Env融合序列。
综上，本发明提供了一种分离的核酸，其包括有优化重组的寨卡病毒基因序列，该序列具有极好的稳定性，能够高效大量表达寨卡病毒的免疫抗原，有利于寨卡病毒疫苗或寨卡病毒治疗药物的研究。
用本发明实施例提供的重组腺病毒的病毒液体免疫小鼠后可刺激机体产生很强的抗体滴度。此外，该重组腺病毒可以方便地通过黏膜进行免疫，并能诱导机体产生黏膜和系统免疫应答；既具有活疫苗免疫效力高、成本低的优点，也具有灭活疫苗的安全性好等优点。
培养本发明提供的重组细胞或重组菌，可大量表达得到高质量的寨卡病毒的免疫抗原，有利于寨卡病毒疫苗或寨卡病毒治疗药物的研究。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉博沃生物科技有限公司
<120> 一种分离的核酸及其应用
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 225
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gccgtgacct tgccctccca ctccacccgg aagctccaga ccaggagcca gacctggctg 60
gagtccaggg agtacaccaa gcacctgatc cgggtggaga actggatctt tcggaaccca 120
ggctttgccc tggccgccgc cgccatcgcc tggctgctcg gcagctccac cagccagaag 180
gtcatctacc ttgtgatgat cctgctcatc gcccccgcct actcc 225
<210> 2
<211> 1512
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atcaggtgca tcggcgtcag caacagggac tttgtggagg ggatgagcgg aggcacctgg 60
gtcgatgtgg tgctggagca cggggggtgc gtgacagtga tggcccagga caagcccacc 120
gtggacattg agctcgtgac tactacagtg tccaacatgg ccgaggtcag atcctactgc 180
tacgaggcct ccatctccga tatggctagc gactccagat gcccaacaca gggcgaggcc 240
tacctcgata agcagagcga cacccagtac gtgtgcaagc ggacactggt ggacaggggg 300
tgggggaacg ggtgcgggct gtttgggaag gggagcctcg tcacctgcgc caagttcgct 360
tgctccaaga agatgacagg caagagcatc cagcctgaga acctggagta ccggatcatg 420
ctgagcgtgc atggaagcca gcactccggc atgatcgtga acgatacagg gcacgaaacc 480
gatgagaacc gggccaaggt ggagatcaca cccaactccc ctagggctga ggccacactg 540
gggggcttcg gctccctggg gctggattgc gagccccgca ccggcctgga cttcagcgac 600
ctgtactacc tgaccatgaa caacaagcac tggctggtgc acaaggagtg gtttcacgat 660
atccccttgc cttggcacgc cggggccgac acaggcaccc cccactggaa caacaaggag 720
gccctcgtgg agttcaagga cgcccacgcc aagaggcaga ctgtggtggt gttgggatcc 780
caggaggggg ccgtccacac cgccctcgct ggcgccctgg aggccgagat ggatggcgcc 840
aaggggaggc tgagtagcgg gcacctgaag tgccggctca agatggataa gctgaggctg 900
aagggggtga gctactccct ctgcacagcc gccttcacct tcacaaagat ccctgccgag 960
acactgcacg gcaccgtgac agtcgaagtg cagtacgccg gcaccgacgg cccatgcaag 1020
gtgcccgccc agatggccgt ggacatgcag acactcaccc ccgtgggcag actgatcacc 1080
gccaaccccg tgattacaga gtccacagag aacagcaaga tgatgctgga gcttgatccc 1140
ccatttgggg atagctacat tgtgatcggc gtcggcgaga agaagatcac acatcactgg 1200
catcggtccg gcagcaccat cggcaaggcc ttcgaggcca cagtgagagg cgcccggagg 1260
atggccgtcc tgggcgatac agcctgggac ttcgggagcg tggggggcgc cctgaacagc 1320
ctcgggaagg gcatccacca gatcttcggc gccgccttta agtccctctt tgggggcatg 1380
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gccgtgagcg cc 1512
<210> 3
<211> 1737
<212> DNA
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cacaccgccc tcgctggcgc cctggaggcc gagatggatg gcgccaaggg gaggctgagt 1080
agcgggcacc tgaagtgccg gctcaagatg gataagctga ggctgaaggg ggtgagctac 1140
tccctctgca cagccgcctt caccttcaca aagatccctg ccgagacact gcacggcacc 1200
gtgacagtcg aagtgcagta cgccggcacc gacggcccat gcaaggtgcc cgcccagatg 1260
gccgtggaca tgcagacact cacccccgtg ggcagactga tcaccgccaa ccccgtgatt 1320
acagagtcca cagagaacag caagatgatg ctggagcttg atcccccatt tggggatagc 1380
tacattgtga tcggcgtcgg cgagaagaag atcacacatc actggcatcg gtccggcagc 1440
accatcggca aggccttcga ggccacagtg agaggcgccc ggaggatggc cgtcctgggc 1500
gatacagcct gggacttcgg gagcgtgggg ggcgccctga acagcctcgg gaagggcatc 1560
caccagatct tcggcgccgc ctttaagtcc ctctttgggg gcatgagctg gtttagccag 1620
atcctgatcg gcaccctgct gatgtggctg gggctgaaca ccaagaacgg gagcattagc 1680
ctgatgtgcc tggccctggg cggggtcctg atcttcctga gcacagccgt gagcgcc 1737
<210> 4
<211> 480
<212> PRT
<213> Env蛋白的氨基酸序列
<400> 4
Ile Arg Cys Ile Gly Val Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Met Ser
1 5 10 15
Gly Gly Thr Trp Val Asp Val Val Leu Glu His Gly Gly Cys Val Thr
20 25 30
Val Met Ala Gln Asp Lys Pro Thr Val Asp Ile Glu Leu Val Thr Thr
35 40 45
Thr Val Ser Asn Met Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr Glu Ala Ser
50 55 60
Ile Ser Asp Met Ala Ser Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Ala
65 70 75 80
Tyr Leu Asp Lys Gln Ser Asp Thr Gln Tyr Val Cys Lys Arg Thr Leu
85 90 95
Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser
100 105 110
Leu Val Thr Cys Ala Lys Phe Ala Cys Ser Lys Lys Met Thr Gly Lys
115 120 125
Ser Ile Gln Pro Glu Asn Leu Glu Tyr Arg Ile Met Leu Ser Val His
130 135 140
Gly Ser Gln His Ser Gly Met Ile Val Asn Asp Thr Gly His Glu Thr
145 150 155 160
Asp Glu Asn Arg Ala Lys Val Glu Ile Thr Pro Asn Ser Pro Arg Ala
165 170 175
Glu Ala Thr Leu Gly Gly Phe Gly Ser Leu Gly Leu Asp Cys Glu Pro
180 185 190
Arg Thr Gly Leu Asp Phe Ser Asp Leu Tyr Tyr Leu Thr Met Asn Asn
195 200 205
Lys His Trp Leu Val His Lys Glu Trp Phe His Asp Ile Pro Leu Pro
210 215 220
Trp His Ala Gly Ala Asp Thr Gly Thr Pro His Trp Asn Asn Lys Glu
225 230 235 240
Ala Leu Val Glu Phe Lys Asp Ala His Ala Lys Arg Gln Thr Val Val
245 250 255
Val Leu Gly Ser Gln Glu Gly Ala Val His Thr Ala Leu Ala Gly Ala
260 265 270
Leu Glu Ala Glu Met Asp Gly Ala Lys Gly Arg Leu Ser Ser Gly His
275 280 285
Leu Lys Cys Arg Leu Lys Met Asp Lys Leu Arg Leu Lys Gly Val Ser
290 295 300
Tyr Ser Leu Cys Thr Ala Ala Phe Thr Phe Thr Lys Ile Pro Ala Glu
305 310 315 320
Thr Leu His Gly Thr Val Thr Val Glu Val Gln Tyr Ala Gly Thr Asp
325 330 335
Gly Pro Cys Lys Val Pro Ala Gln Met Ala Val Asp Met Gln Thr Leu
340 345 350
Thr Pro Val Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Val Ile Thr Glu Ser
355 360 365
Thr Glu Asn Ser Lys Met Met Leu Glu Leu Asp Pro Pro Phe Gly Asp
370 375 380
Ser Tyr Ile Val Ile Gly Val Gly Glu Lys Lys Ile Thr His His Trp
385 390 395 400
His Arg Ser Gly Ser Thr Ile Gly Lys Ala Phe Glu Ala Thr Val Arg
405 410 415
Gly Ala Arg Arg Met Ala Val Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly
420 425 430
Ser Val Gly Gly Ala Leu Asn Ser Leu Gly Lys Gly Ile His Gln Ile
435 440 445
Phe Gly Ala Ala Phe Lys Ser Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp Phe Ser
450 455 460
Gln Ile Leu Ile Gly Thr Leu Leu Met Trp Leu Gly Leu Asn Thr Lys
465 470 475 480
<210> 5
<211> 75
<212> PRT
<213> M蛋白的氨基酸序列
<400> 5
Ala Val Thr Leu Pro Ser His Ser Thr Arg Lys Leu Gln Thr Arg Ser
1 5 10 15
Gln Thr Trp Leu Glu Ser Arg Glu Tyr Thr Lys His Leu Ile Arg Val
20 25 30
Glu Asn Trp Ile Phe Arg Asn Pro Gly Phe Ala Leu Ala Ala Ala Ala
35 40 45
Ile Ala Trp Leu Leu Gly Ser Ser Thr Ser Gln Lys Val Ile Tyr Leu
50 55 60
Val Met Ile Leu Leu Ile Ala Pro Ala Tyr Ser
65 70 75
<210> 6
<211> 2007
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gccgtgacct tgccctccca ctccacccgg aagctccaga ccaggagcca gacctggctg 60
gagtccaggg agtacaccaa gcacctgatc cgggtggaga actggatctt tcggaaccca 120
ggctttgccc tggccgccgc cgccatcgcc tggctgctcg gcagctccac cagccagaag 180
gtcatctacc ttgtgatgat cctgctcatc gcccccgcct actccatcag gtgcatcggc 240
gtcagcaaca gggactttgt ggaggggatg agcggaggca cctgggtcga tgtggtgctg 300
gagcacgggg ggtgcgtgac agtgatggcc caggacaagc ccaccgtgga cattgagctc 360
gtgactacta cagtgtccaa catggccgag gtcagatcct actgctacga ggcctccatc 420
tccgatatgg ctagcgactc cagatgccca acacagggcg aggcctacct cgataagcag 480
agcgacaccc agtacgtgtg caagcggaca ctggtggaca gggggtgggg gaacgggtgc 540
gggctgtttg ggaaggggag cctcgtcacc tgcgccaagt tcgcttgctc caagaagatg 600
acaggcaaga gcatccagcc tgagaacctg gagtaccgga tcatgctgag cgtgcatgga 660
agccagcact ccggcatgat cgtgaacgat acagggcacg aaaccgatga gaaccgggcc 720
aaggtggaga tcacacccaa ctcccctagg gctgaggcca cactgggggg cttcggctcc 780
ctggggctgg attgcgagcc ccgcaccggc ctggacttca gcgacctgta ctacctgacc 840
atgaacaaca agcactggct ggtgcacaag gagtggtttc acgatatccc cttgccttgg 900
cacgccgggg ccgacacagg caccccccac tggaacaaca aggaggccct cgtggagttc 960
aaggacgccc acgccaagag gcagactgtg gtggtgttgg gatcccagga gggggccgtc 1020
cacaccgccc tcgctggcgc cctggaggcc gagatggatg gcgccaaggg gaggctgagt 1080
agcgggcacc tgaagtgccg gctcaagatg gataagctga ggctgaaggg ggtgagctac 1140
tccctctgca cagccgcctt caccttcaca aagatccctg ccgagacact gcacggcacc 1200
gtgacagtcg aagtgcagta cgccggcacc gacggcccat gcaaggtgcc cgcccagatg 1260
gccgtggaca tgcagacact cacccccgtg ggcagactga tcaccgccaa ccccgtgatt 1320
acagagtcca cagagaacag caagatgatg ctggagcttg atcccccatt tggggatagc 1380
tacattgtga tcggcgtcgg cgagaagaag atcacacatc actggcatcg gtccggcagc 1440
accatcggca aggccttcga ggccacagtg agaggcgccc ggaggatggc cgtcctgggc 1500
gatacagcct gggacttcgg gagcgtgggg ggcgccctga acagcctcgg gaagggcatc 1560
caccagatct tcggcgccgc ctttaagtcc ctctttgggg gcatgagctg gtttagccag 1620
atcctgatcg gcaccctgct gatgtggctg gggctgaaca ccaagaacgg gagcattagc 1680
ctgatgtgcc tggccctggg cggggtcctg atcttcctga gcacagccgt gagcgcctaa 1740
taatgactcg aggaattcaa gcttgggatc tttgtgaagg aaccttactt ctgtggtgtg 1800
acataattgg acaaactacc tacagagatt taaagctcta aggtaaatat aaaattttta 1860
agtgtataat gtgttaaact actgattcta attgtttgtg tattttagat tcacagtccc 1920
aaggctcatt tcaggcccct cagtcctcac agtctgttca tgatcataat cagccatacc 1980
acatttgtag aggttttact tgcttta 2007
<210> 7
<211> 2076
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60
gacactagtg ccgtgacctt gccctcccac tccacccgga agctccagac caggagccag 120
acctggctgg agtccaggga gtacaccaag cacctgatcc gggtggagaa ctggatcttt 180
cggaacccag gctttgccct ggccgccgcc gccatcgcct ggctgctcgg cagctccacc 240
agccagaagg tcatctacct tgtgatgatc ctgctcatcg cccccgccta ctccatcagg 300
tgcatcggcg tcagcaacag ggactttgtg gaggggatga gcggaggcac ctgggtcgat 360
gtggtgctgg agcacggggg gtgcgtgaca gtgatggccc aggacaagcc caccgtggac 420
attgagctcg tgactactac agtgtccaac atggccgagg tcagatccta ctgctacgag 480
gcctccatct ccgatatggc tagcgactcc agatgcccaa cacagggcga ggcctacctc 540
gataagcaga gcgacaccca gtacgtgtgc aagcggacac tggtggacag ggggtggggg 600
aacgggtgcg ggctgtttgg gaaggggagc ctcgtcacct gcgccaagtt cgcttgctcc 660
aagaagatga caggcaagag catccagcct gagaacctgg agtaccggat catgctgagc 720
gtgcatggaa gccagcactc cggcatgatc gtgaacgata cagggcacga aaccgatgag 780
aaccgggcca aggtggagat cacacccaac tcccctaggg ctgaggccac actggggggc 840
ttcggctccc tggggctgga ttgcgagccc cgcaccggcc tggacttcag cgacctgtac 900
tacctgacca tgaacaacaa gcactggctg gtgcacaagg agtggtttca cgatatcccc 960
ttgccttggc acgccggggc cgacacaggc accccccact ggaacaacaa ggaggccctc 1020
gtggagttca aggacgccca cgccaagagg cagactgtgg tggtgttggg atcccaggag 1080
ggggccgtcc acaccgccct cgctggcgcc ctggaggccg agatggatgg cgccaagggg 1140
aggctgagta gcgggcacct gaagtgccgg ctcaagatgg ataagctgag gctgaagggg 1200
gtgagctact ccctctgcac agccgccttc accttcacaa agatccctgc cgagacactg 1260
cacggcaccg tgacagtcga agtgcagtac gccggcaccg acggcccatg caaggtgccc 1320
gcccagatgg ccgtggacat gcagacactc acccccgtgg gcagactgat caccgccaac 1380
cccgtgatta cagagtccac agagaacagc aagatgatgc tggagcttga tcccccattt 1440
ggggatagct acattgtgat cggcgtcggc gagaagaaga tcacacatca ctggcatcgg 1500
tccggcagca ccatcggcaa ggccttcgag gccacagtga gaggcgcccg gaggatggcc 1560
gtcctgggcg atacagcctg ggacttcggg agcgtggggg gcgccctgaa cagcctcggg 1620
aagggcatcc accagatctt cggcgccgcc tttaagtccc tctttggggg catgagctgg 1680
tttagccaga tcctgatcgg caccctgctg atgtggctgg ggctgaacac caagaacggg 1740
agcattagcc tgatgtgcct ggccctgggc ggggtcctga tcttcctgag cacagccgtg 1800
agcgcctaat aatgactcga ggaattcaag cttgggatct ttgtgaagga accttacttc 1860
tgtggtgtga cataattgga caaactacct acagagattt aaagctctaa ggtaaatata 1920
aaatttttaa gtgtataatg tgttaaacta ctgattctaa ttgtttgtgt attttagatt 1980
cacagtccca aggctcattt caggcccctc agtcctcaca gtctgttcat gatcataatc 2040
agccatacca catttgtaga ggttttactt gcttta 2076
<210> 8
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cgaaggagat agaaccatgg ctgtgacgct 60
cccctcccat tc 72
<210> 9
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc agatgataag atacattgat gagt 54
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tgtaaaacga cggccagt 18
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
caggaaacag ctatgac 17
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
taatacgact cactata 17
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
accgaggaga gggttaggga t 21

Claims (10)

1.一种分离的核酸，其特征在于，其碱基序列如(1)～(3)任一项所述：
(1)如SEQ ID NO.3所示；
(2)第1-225位碱基序列如SEQ ID NO.1所示，第226～1737位碱基序列编码Env蛋白，Env蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
(3)第1～225位碱基序列编码M蛋白，第226～1737位碱基序列如SEQ ID NO.2所示，M蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
2.根据权利要求1所述的分离的核酸，其特征在于，所述分离的核酸3’端连接有PolyA序列，和/或所述分离的核酸5’端连接有信号肽；
所述PolyA序列优选为SV40PolyA序列；
所述信号肽优选为信号肽Igκ。
3.根据权利要求2所述的分离的核酸，其特征在于，所述分离的核酸的碱基序列如SEQID NO.6或7所示。
4.一种载体，其特征在于，所述载体包括有如权利要求1～3任一项所述的核酸的碱基序列；
优选地，所述载体为腺病毒载体；
进一步优选地，所述腺病毒载体为5型腺病毒载体；
更进一步优选地，所述5型腺病毒载体为pAd5-CMV/V5-DEST质粒载体。
5.一种重组腺病毒的构建方法，其特征在于，其包括：将权利要求4所述的腺病毒载体转染宿主细胞；
优选地，所述宿主细胞为293细胞。
6.一种重组腺病毒，其特征在于，其由权利要求5所述的构建方法构建制得。
7.一种重组细胞或重组菌，其特征在于，其包括有如权利要求1～3任一项所述的分离的核酸、如权利要求4所述的载体或如权利要求6所述的重组腺病毒；
所述的重组细胞优选为293细胞。
8.一种制备Env蛋白的方法，其特征在于，其包括：培养权利要求7所述的重组细胞或重组菌。
9.一种寨卡病毒疫苗，其特征在于，其包括有：如权利要求1～3任一项所述的分离的核酸、如权利要求4所述的载体、如权利要求6所述的重组腺病毒或权利要求8所述的制备方法制备的Env蛋白。
10.如权利要求1～3任一项所述的分离的核酸、如权利要求4所述的载体或如权利要求6所述的重组腺病毒或权利要求7所述的重组细胞或重组菌在制备用于预防或治疗寨卡病毒感染的药物中的应用。
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