CN109136204A

CN109136204A - 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN109136204A
Application number: CN201810887661.9A
Authority: CN
Inventors: 梅志刚
Original assignee: Guangzhou Four And Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Four And Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2018-10-23
Filing date: 2018-10-23
Publication date: 2019-01-04
Anticipated expiration: 2038-10-23
Also published as: CN109136204B

Abstract

本发明公开了一种3‑羟基‑3‑甲基戊二酰辅酶A还原酶及其编码基因和应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过提取灰树花子实体总RNA，逆转录合成cDNA，并通过克隆技术获得了灰树花的3‑羟基‑3‑甲基戊二酰辅酶A还原酶基因，得到了3579bp的完整基因序列。经功能性实验验证该3‑羟基‑3‑甲基戊二酰辅酶A还原酶不仅可显著提高灰树花中的三萜含量，且还能提高樟芝菌丝体中樟芝三萜的含量。

Description

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及分子生物学、基因工程技术领域。具体地，涉及一种在灰树花中表达的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶及其编码基因和应用。

背景技术

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoAreductase)，简称 HMGR，在甲羟戊酸(MVA)途径中催化3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A转化为甲羧戊酸，由于该过程不可逆，故该酶被视作MVA途径中的第一个限速酶，是细胞质萜类化合物代谢中的重要调控位点。

药理研究表明，三萜类化合物是极具开发潜力的天然资源，萜类化合物广泛存在于高等动、植物及真核生物体内。它在医疗卫生、工农业生产、能源等领域均有重要作用。研究发现，三萜类化合物具有多种生物活性，包括调节免疫、抑制血管新生、抗肿瘤、抗炎症、抗氧化等。

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶作为早期酶类，它决定“碳流”的流向。Schaller等将橡胶树HMGR基因转入烟草，并对该转基因烟草进行研究，结果发现其形态未发生变化，但HMGR的活性增加了4-8倍，且甾醇含量增加了6倍。

灰树花，又称舞茸，是食、药兼用蕈菌，其属于非褶菌目、多孔菌科、树花属，含有多种功能性成分，如多糖、萜类、氨基酸等，具有良好的抗癌、抗病毒功能，因此被誉为“真菌之王，抗癌奇葩”。现有技术中已从灰树花中克隆得到3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因，如中国专利申请（CN105132389，20151209）。

发明内容

本发明的目的在于提供一种灰树花3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因，该3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶不仅可显著提高灰树花中的三萜含量，且还能提高樟芝菌丝体中樟芝三萜的含量。

本发明提供了一种3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶，氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明还提供了一种编码所述的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因，所述基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种包含所述的基因的重组表达载体，含有SEQ ID NO.2所示碱基序列；

所述重组载体的原始载体为pET32a(+)或pBI121。

本发明还提供了一种包含所述重组载体的宿主细胞，宿主细胞为大肠杆菌细胞，农杆菌细胞、灰树花或樟芝菌丝体细胞。

本发明还提供了一种所述的重组宿主细胞在生产樟芝三萜或灰树花中三萜类化合物中的应用。

本发明通过提取一株高表达三萜的灰树花子实体总RNA，逆转录后构建cDNA文库，二代测序数据分析发现了一个3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶，通过RT-PCR技术克隆了灰树花的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因，得到了3579bp的完整基因序列；构建了真核表达载体pBI121-HMGR分别转化灰树花和樟芝菌丝体表达系统，对克隆的HMGR基因功能进行了验证。实验结果表明HMGR基因能够在灰树花及樟芝菌丝体中正常表达；且灰树花3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(HMGR)可显著提高灰树花中的三萜类物质含量，此外，该基因还能够提高樟芝菌丝体中樟芝三萜的含量，且其提高樟芝菌丝体中樟芝三萜含量的能力优于现有技术中已分离获得的灰树花3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因。

附图说明

图1为灰树花阴性对照及采用本发明基因转基因的灰树花中三萜含量检测结果；

图2为未转基因樟芝菌丝体、转不同HMGR基因阳性克隆中樟芝三萜的含量检测结果；

图中1和2为未转基因对照中樟芝三萜的含量，3和4为转现有技术HMGR基因阳性克隆中樟芝三萜的含量（转入的是中国专利申请CN105132389专利中所涉及的灰树花HMGR基因），5和6为本发明转基因阳性克隆中樟芝三萜的含量（转入的是本申请所述HMGR基因）。

具体实施方式

实施例1 灰树花HMGR基因的克隆

灰树花总RNA的分离：

取高表达三萜的灰树花子实体60mg，在研钵中用液氮快速研磨成粉末，快速转移至已经加入1ml Trizol的离心管中，用移液器吹打混匀；静置5min，4℃，13000g离心8min；再将上清液移入另一离心管中，加入200μL氯仿，混匀，放置10min，4℃，13000g离心15min；转移上层水相至另一离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，放置 10min；4℃，13000g离心8min，弃上清；再加入500μL的75％乙醇，混匀，8000g离心5min，弃上清；干燥RNA沉淀，加入适量无RNase的水溶解，用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。

根据已克隆得到的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶氨基酸保守序列，设计简并引物，利用同源性基因克隆原理进行cDNA全长克隆：

取1μg总RNA，以random hexamers为引物，按照SuperScript III First-StrandSynthesis System说明操作，反转录生成第一链。 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因CDS序列设计引物如下：

上游引物HMGR-F：ga aga tct atg cgt gcg ata ctt cgc ccg c；

下游引物HMGR-R：cc cac gtg tca ctt cgt ctc cac agc ata gc；

取灰树花总RNA反转录生成的第一链cDNA为模板做PCR扩增。

PCR反应体系如下（50μL体系）：

PCR扩增程序如下：

PCR扩增结束后，采用2%琼脂糖凝胶电泳跑胶、切胶并采用试剂盒回收。

实施例2 灰树花3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶重组表达载体及重组宿主细胞的构建

原核表达载体的构建以及转化大肠杆菌：

根据灰树花HMGR的核苷酸序列，设计扩增出蛋白编码区的上、下游引物，并在上、下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这根据选用的pET32a(+)载体而定)，以便构建重组表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将灰树花HMGR基因在保证阅读框正确的前提下克隆至pET32a(+)载体(Novagen)。将连接产物转入DH5α大肠杆菌感受态细胞。在转化产物中加入800μL LB液体培养基，37℃，180rpm摇床培养45min后，涂布于含IPTG，AMP的LB固体培养皿上，正置培养1h后37℃倒置培养过夜。

以上述扩增引物HMGR-F和HMGR-R对挑选的10-20个单克隆进行PCR鉴定，所述PCR条件：95℃，5min；95℃，30s；57℃，30s；72℃，1min，20个循环；72℃，10min。PCR扩增产物采用1%琼脂糖凝胶电泳跑胶鉴定，并选择电泳条带正确的克隆送上海生工测序，比对测序结果确定酶序列的正确性。

实施例3 真菌表达载体pBI121-HMGR及农杆菌工程菌的构建

将测序正确的重组表达载体pET32a-HMGR和pBI121表达空载体分别进行酶切、回收，并采用T4连接酶将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因连接至双元表达载体pBI121中。对连接产物进行鉴定后再将其转入农杆菌感受态细胞中。

实施例4 转基因灰树花、樟芝菌丝体中三萜类化合物含量的检测

农杆菌介导的菌丝体原生质体转化：

含有pBI121-HMGR的农杆菌工程菌在LB平板上划线培养，28℃培养24-36h；

挑单菌落于5mL LB液体培养基中，28℃，200rpm震荡培养至OD600＝0.6左右；

室温下，4000rpm离心10min，弃上清，菌体重悬于5mL1/2 MS培养基中。28℃，200rpm 培养至OD600＝0.6左右；

分别将灰树花和樟芝菌丝体原生质体与农杆菌混合；

28℃静置共培养36h后，3500rpm，离心10min收集菌体，洗涤后涂布于抗性培养基上，于28℃培养一周后，挑取转化子。

提取转基因菌丝体的总DNA，以菌丝体基因组DNA为模板进行PCR检测，确保HMGR基因已成功进入灰树花、樟芝菌丝体中。

采用加热回流法提取转基因灰树花、樟芝菌丝体中的三萜类化合物：分别取100mg转化子，加入95％乙醇溶液5ml，50℃恒温水浴锅中浸泡2h，过滤取上清，并分别测定提取液中的三萜含量。

转基因灰树花中三萜含量的测定结果表明：其明显高于野生型对照，表明该基因能够在灰树花中表达，且能够提高转基因灰树花中三萜类化合物含量(参见图1)。

测定转基因樟芝菌丝体中樟芝三萜含量，发现其不仅明显高于野生型对照，且其提高樟芝菌丝体中樟芝三萜含量的能力优于现有技术中已分离获得的灰树花3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因（参见图2）。

序列表

<110> 广州四和生物科技有限公司

<120> 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶及其编码基因和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1192

<212> PRT

<213> 灰树花(Grifola frondosa)

<400> 1

Met Arg Ala Ile Leu Arg Pro Leu Ser Thr Cys Thr Ala Phe Ser Pro

1 5 10 15

Ile Glu Thr Ile Val Thr Val Phe Val Cys Ala Thr Leu Ala Tyr Phe

20 25 30

Thr Gly Ile Lys His Ser Ser Phe Phe Ala Pro Thr Tyr Pro Thr Ala

35 40 45

Leu Arg Pro Ala His Ala Arg Leu Thr Asn Ala Glu Trp Val Gly Val

50 55 60

Ser Gln Gln Asp Trp Val Asp Ala Trp Lys His Pro Arg Glu Asp Val

65 70 75 80

Lys Leu Leu Glu Leu Gln Gln Ile Val Phe Ser Leu Asp Ala Thr Glu

85 90 95

Ala Val Thr Pro Gly Ser Asn Leu Asp Val Ala Gly Leu Ser Gly Ile

100 105 110

Thr Arg His Leu Thr Thr Gln Val Pro Ser Leu Ser Gly Lys Ala Tyr

115 120 125

Ser Ser Ile Cys His Tyr Pro Ser Ser Asn Ile Thr Ser Ala Ser Cys

130 135 140

Phe Thr Ala Phe Thr Glu Ala Ala Ser Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser

145 150 155 160

Phe Thr Thr Gly Thr Arg Asp Asp Trp Leu Ala Met Leu Lys Ser Glu

165 170 175

Lys Ser Ile Thr Leu Asp Gly Val Lys Tyr Gln Leu Asp Leu Gly Lys

180 185 190

Pro Glu Glu Ser Ile Gly Glu Met Lys Ser Ser Lys Trp Val Ala Tyr

195 200 205

Ala Leu Arg Ala Leu Val Leu Arg Phe Trp Glu Leu Thr Lys Lys Ala

210 215 220

Asp Ser Leu Asp Ile Ile Val Val Leu Thr Gly Tyr Ile Leu Met His

225 230 235 240

Val Thr Phe Leu Arg Leu Phe Leu Ser Ser Arg Ala Leu Gly Ser Asn

245 250 255

Phe Trp Leu Ser Thr Gly Ile Phe Ser Ser Ala Ile Ile Ser Phe Leu

260 265 270

Phe Thr Leu Pro Leu Cys Arg Tyr Leu Asn Ile Pro Leu Asp Pro Ile

275 280 285

Ala Leu Thr Glu Ala Leu Leu Val Cys Thr Val Gly Phe Asp Lys Pro

290 295 300

Leu Arg Leu Ala Arg Ala Val Met Ala His Pro Gln Thr Leu Arg Pro

305 310 315 320

Gln Glu Asn Gly Arg Met Lys Pro Ala Gly Asp Val Ile Leu Glu Ala

325 330 335

Leu Asp Arg Val Gly Asn Val Ile Leu Arg Asp Tyr Ala Leu Glu Ile

340 345 350

Ala Val Leu Leu Val Gly Asn Ser Lys Val Gly Gly Leu Lys Glu Phe

355 360 365

Cys Ala Val Ala Ala Val Ala Leu Ala Met Asp Cys Val Met Thr Phe

370 375 380

Thr Leu Tyr Thr Ser Val Leu Thr Val Met Val Glu Val Arg Arg Ile

385 390 395 400

Lys Lys Val Arg Glu Met Ser Arg Ser Arg Ser Asn Ser Ile Ser Ala

405 410 415

Val Thr Ala Asn Gly Thr Ala Val Arg Ser Ala Leu Ser Arg Pro Ser

420 425 430

Ala Lys Val Gln Thr Pro Ser Pro Ala Ala Pro Lys Lys Leu Arg Asp

435 440 445

Arg Ile Ser Ser Ala Ile Leu Gly Val Lys Gly Ser Phe Leu Arg Asp

450 455 460

Glu Gln Gly Gly Ser Lys Val Gln Ala Ile Glu Glu Asn Pro Met Ala

465 470 475 480

Arg Leu Lys Leu Leu Leu Ile Ala Ser Phe Leu Thr Leu His Ile Leu

485 490 495

Asn Phe Cys Thr Thr Leu Thr Pro Ala Thr Thr Leu Ala Arg His Asn

500 505 510

Arg His Thr Leu Arg Thr Ala Asp Gly Val Pro Pro Pro Pro Arg Val

515 520 525

Asp Ile Thr Ser Pro Ala Ile Ala Ser Val Leu Ala Ser Leu Ala Ala

530 535 540

Ser Glu Lys Met Val Ser Thr Ser Ile Glu Ala Lys Glu Pro Glu Leu

545 550 555 560

Leu Val Lys Val Pro Pro Leu Val Tyr Ile Arg Val Thr Pro Thr Val

565 570 575

Leu Pro Val Ser Arg Val Ala Asn Gly Ser Thr Gly Thr Gly Glu Ala

580 585 590

Ile Asp Asn Phe Met Ser Ser Trp Ser Leu Leu Val Gly Asp Pro Val

595 600 605

Leu Ser Lys Trp Ile Val Val Leu Leu Ala Val Ser Val Ala Leu Asn

610 615 620

Gly Tyr Leu Leu Lys Gly Ile Ala Ala Gly Ser Gly Leu Ala Ala Val

625 630 635 640

Arg Ala Val Arg Ser Gln Gly Val Arg Phe Arg Ser Arg Ala Arg Val

645 650 655

Gly Lys Asp Glu Thr Glu Glu Cys Thr Ala Ala Pro Pro Ala Pro Leu

660 665 670

Thr Ile Val Pro Ser Thr Ala Pro Ile Leu Val Ala Pro Val Ala Ile

675 680 685

Pro Thr Arg Glu Arg Ala Pro Val Gln Leu Ser Ser Pro Val Asp Leu

690 695 700

Asp Lys Val Asp Phe Lys Leu Gln Glu Lys Leu Pro Ile Arg Ala Pro

705 710 715 720

Ile Pro Ile His Pro Leu Thr Pro Glu Pro Glu Val Ala Val Ala Arg

725 730 735

Tyr Thr Gly Pro Val Arg Thr Leu Glu Glu Cys Ile Glu Ile Phe Glu

740 745 750

Asn Gly Pro Arg Pro Val Ser Val Ala Leu Ala Thr Leu Asn Asp Glu

755 760 765

Glu Val Val Met Leu Ala Gln Asn Gly Lys Ile Ala Ala Tyr Ala Leu

770 775 780

Glu Lys Leu Leu Gly Asp Leu Glu Arg Ala Val Arg Ile Arg Arg Ala

785 790 795 800

Leu Ile Ser Arg Ala Ser Arg Thr Lys Thr Leu Glu Asn Ser Leu Val

805 810 815

Pro Met Glu Asn Tyr Asp Tyr Ser Arg Val Val Gly Ala Cys Cys Glu

820 825 830

Asn Val Ile Gly Tyr Met Pro Leu Pro Leu Gly Val Ala Gly Pro Leu

835 840 845

Lys Val Asp Gly Gln Met Tyr Pro Ile Pro Met Cys Lys Ala Leu Asn

850 855 860

Ala Gly Gly Gly Val Thr Thr Val Leu Thr Tyr Asp Ala Met Thr Arg

865 870 875 880

Gly Pro Ala Ile Asp Phe Pro Ser Ile Val Arg Ala Ala Glu Ala Lys

885 890 895

Ala Trp Ile Glu Ser Thr Glu Gly Tyr Ala Ile Val Lys Glu Ala Phe

900 905 910

Glu Ser Thr Ser Arg Phe Ala Lys Leu Gln Asn Ile Lys Cys Ala Met

915 920 925

Ala Gly Arg Thr Leu Phe Val Arg Phe Ala Thr Arg Thr Gly Asp Ala

930 935 940

Met Gly Met Asn Met Ile Ser Lys Ala Thr Glu Lys Ala Leu Asp Val

945 950 955 960

Leu Ser Lys Glu Phe Pro Glu Met Val Val Leu Ala Leu Ser Gly Asn

965 970 975

Tyr Cys Thr Asp Lys Lys Pro Ala Ala Ile Asn Trp Ile Glu Gly Arg

980 985 990

Gly Lys Ser Ile Val Ala Glu Ala Val Ile Pro Gly Lys Ile Val Lys

995 1000 1005

Ser Val Leu Lys Thr Thr Val Glu Ala Leu Cys Asn Leu Asn Thr Lys

1010 1015 1020

Lys Asn Leu Val Gly Ser Ala Met Ala Gly Ser Val Gly Gly Phe Asn

1025 1030 1035 1040

Ala His Asn Ile Ala Met Phe Leu Ala Thr Gly Gln Asp Pro Ala Gln

1045 1050 1055

Asn Val Glu Ser Ser Asn Cys Met Thr Leu Met Glu Pro Thr Asn Asn

1060 1065 1070

Gly Glu Asp Leu Leu Met Thr Val Ser Met Pro Cys Ile Glu Val Gly

1075 1080 1085

Thr Val Gly Gly Gly Thr Ile Leu Ala Pro Gln Gln Ala Val Leu Glu

1090 1095 1100

Leu Leu Gly Val Gln Gly Ala His Ser Thr Asn Pro Gly Gln Asn Ala

1105 1110 1115 1120

Gln Gln Leu Ala Arg Ile Ile Ala Ser Ala Val Met Ala Gly Glu Leu

1125 1130 1135

Ser Leu Ile Ser Ala Leu Ala Ala Gly His Leu Val Arg Ala His Leu

1140 1145 1150

Ala His Asn Arg Ser Gln Leu Asn Thr Pro Leu Pro Gly Pro Thr Glu

1155 1160 1165

Pro Ala Gly Gly Ala Phe Trp Ala Gly Ala Lys Ser Ser Ala Pro Pro

1170 1175 1180

Ala Gly Tyr Ala Val Glu Thr Lys

1185 1190

<210> 2

<211> 3578

<212> DNA

<213> 灰树花(Grifola frondosa)

<400> 2

tgcgtgcgat acttcgcccg ctctctacgt gcaccgcgtt ctcgcccatc gagacaatcg 60

tcaccgtctt cgtctgcgcg actctcgcct acttcactgg catcaaacac tcatccttct 120

ttgctccaac ctatccgacg gcccttcgcc ccgctcacgc tcgcctcacc aatgctgaat 180

gggtaggagt gagccagcag gattgggttg atgcgtggaa acacccccgg gaagatgtca 240

agttgctgga gctgcaacag attgtgttct ctctggatgc taccgaagcg gttacaccgg 300

gttcaaatct tgacgttgcg ggcctttctg gaatcactcg ccatctcact acacaagtgc 360

cgtcactctc gggcaaagcg tactcttcca tctgccacta cccatcttca aacattacat 420

ctgcatcatg cttcactgcc ttcaccgaag ctgcttcatc atctacgctt accctctcgt 480

ttactactgg gacgagagac gactggctgg ccatgcttaa aagcgagaag tcgatcactc 540

tggatggagt aaagtaccag cttgatttgg ggaaacctga ggagagcatc ggtgagatga 600

agagtagcaa atgggttgcg tatgcgctcc gcgcgctggt tctgcgtttc tgggaactca 660

cgaagaaagc agactcgctc gatattatag tcgtgctcac gggctatatc ctcatgcatg 720

tcaccttcct gcgcttgttc ctctcgtcgc gtgccctggg ctcaaacttc tggctctcga 780

cgggtatttt ctcttctgct atcatctcgt tcttgtttac ccttccactc tgccgctacc 840

tcaacattcc acttgatcct atcgcgctta ccgaggccct tttggtatgc actgtcggct 900

tcgacaagcc ccttcgtctc gcgcgtgctg tcatggcgca cccacaaact ctgaggcctc 960

aagaaaatgg ccgcatgaag cccgccggcg atgttattct cgaggcgctc gaccgtgtcg 1020

ggaacgttat tctaagggac tacgcgttgg aaattgccgt gctgctcgtc ggcaacagca 1080

aagtcggagg tctcaaggag ttctgcgccg ttgccgccgt tgcacttgcc atggattgcg 1140

tcatgacgtt taccctttac acgtcggtgt tgactgtcat ggtcgaggtt cgccgcatca 1200

aaaaggttcg tgagatgtct cgctctcgct caaattcgat ctcggctgtc actgccaatg 1260

gcaccgccgt gcgctcagcg ctgtcacgtc cttcggctaa ggtgcagaca ccctcccctg 1320

ctgcaccgaa gaagttgagg gaccggatct caagcgctat tctcggcgtt aagggatcgt 1380

tcttgagaga tgagcagggc gggagcaagg tccaggcgat cgaagagaat ccgatggcta 1440

ggcttaagct actattgatc gcttcgttcc tgacgttgca tattttgaac ttctgcacaa 1500

ccctcacacc cgcgacgaca ctcgccagac acaatagaca caccctccgt actgctgatg 1560

gcgtacctcc ccctcctcgt gttgacatta ctagtcccgc catcgcgagt gtgctcgcga 1620

gtctcgctgc ttccgagaag atggtttcca caagcatcga ggcaaaagag cccgagttac 1680

ttgtcaaagt cccgcctctg gtctatatcc gcgtaacacc tacagtccta cctgtctccc 1740

gtgtagcaaa cggtagcacg ggtactggcg aagcgatcga taacttcatg tcaagctgga 1800

gtctgcttgt tggtgacccc gtgctctcca agtggatcgt agtccttctt gccgtgagcg 1860

ttgcactgaa cggctacctc ctcaagggca tcgccgcggg ctctggactc gctgccgttc 1920

gtgctgtccg cagccagggc gtgcgcttcc gctcgcgcgc aagggttggt aaggatgaaa 1980

cggaagagtg caccgctgcc cctcccgcgc ctctaaccat cgtcccatct actgcaccta 2040

ttctggttgc tcctgtggcc atccctacgc gtgaacgtgc cccggttcag ctgagctctc 2100

ctgtcgactt ggataaggta gacttcaagt tgcaggagaa actccccatt cgtgccccca 2160

tacccatcca cccgttgact cctgagccgg aagttgctgt agctaggtac actggccccg 2220

tacgcaccct cgaggagtgc atagaaatct tcgagaatgg tccgcgtccg gtatccgttg 2280

cgcttgcgac attgaacgac gaggaggttg taatgctggc gcagaacggg aagattgcag 2340

cttatgcgct cgagaagctt cttggcgact tggagcgggc tgtccgcatc cgtcgcgctt 2400

taatctcccg tgcttcaagg actaagaccc ttgagaattc ccttgtcccc atggagaact 2460

acgattactc tcgcgttgtg ggtgcgtgct gcgagaatgt gattggatac atgcctcttc 2520

ccttgggtgt tgccggtcct ctgaaggtcg atggccagat gtatcccatc ccgatgtgta 2580

aggcgctgaa tgctggtggg ggcgtcacca ccgttttgac atatgacgcc atgacccgcg 2640

gccctgctat cgatttccct tcgatcgttc gcgctgccga agccaaggct tggatagagt 2700

ccacagaggg gtatgcgatc gtgaaggagg cgttcgagtc gacatcacgc ttcgcgaaac 2760

tgcagaacat caagtgcgcg atggctggcc gaacgctttt cgtgcgattc gcgacgcgca 2820

caggcgacgc gatgggcatg aatatgatct cgaaggctac cgagaaggca ctagatgtgc 2880

tgagcaagga attccccgag atggtcgtgc ttgcgttgtc gggtaactac tgcacggaca 2940

agaagcctgc tgcgatcaac tggatcgagg gtcgtggcaa gagtatcgtg gctgaggccg 3000

tgatccctgg caagattgtg aagagcgttt tgaagacgac tgtcgaggcg ctctgcaacc 3060

ttaacacgaa gaagaacctt gtgggaagcg ctatggctgg gtctgttggc gggttcaacg 3120

cacataatat tgcgatgttc ttggcgaccg gccaggatcc cgcgcagaat gtggaaagtt 3180

caaattgcat gacgcttatg gagccgacca acaacggcga ggacctgctt atgacggttt 3240

ctatgccttg tatcgaggtt ggaacagtcg gaggcggcac tatcctagca ccccaacaag 3300

ctgttcttga gcttctcggc gtgcagggtg cgcattccac aaaccccggt cagaacgccc 3360

aacagcttgc tcgcatcatc gcatctgccg tgatggcggg cgagctctca ctcatcagtg 3420

cgctggcggc aggccacctt gtccgcgcgc acctcgcaca caaccgttcg caactcaata 3480

cccccctacc tggacctact gagcccgccg gcggtgcctt ctgggccggt gcgaagagtt 3540

ctgcgccacc tgctggctat gctgtggaga cgaagtga 3578

Claims

1.一种3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种编码权利要求1所述的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种包含权利要求2或3所述基因的重组表达载体。

5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，原始载体为pET32a(+)或pBI121。

6.一种包含权利要求4或5所述重组表达载体的重组细胞。

7.如权利要求6所述的重组宿主细胞，其特征在于，宿主细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞、灰树花或樟芝菌丝体细胞。

8.如权利要求7所述的重组宿主细胞在生产灰树花三萜中的应用。

9.如权利要求7所述的重组宿主细胞在生产樟芝三萜中的应用。