CN109136176A - 一种小鼠冻存精子复苏液复合物及其配制方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小鼠冻存精子复苏液复合物及其配制方法及其应用，其组成成分包括基础液、甲基B环糊精MBCD和聚乙烯醇PVA。所述配制方法中，先将甲基B环糊精MBCD和聚乙烯醇PVA溶解于基础液中，待充分溶解后，通过细菌过滤器过滤，得到所述小鼠冻存精子的复苏液。本发明通过向精子复苏液中添加甲基B环糊精MBCD和聚乙烯醇PVA，促进精子获能过程，使之获得能量的能力增强，具有受精能力精子的数量增加，从而增加与卵子受精的几率，提高受精率。有益于小鼠精子资源保存成功，增加、增速小鼠品系资源的重建。
Description
技术领域
本发明属动物学实验动物学综合领域，具体涉及一种小鼠冻存精子复苏液复合物及其配制方法和应用。
背景技术
小鼠精子冻存是目前保存基因工程小鼠品系最经济有效的方法，一些封闭群和杂交F1代小鼠的精子冻存复苏后的体外受精率较高，能够达到品系重建的目的，但C57BL/6冻融后精子的体外受精率较低，而该品系是基因工程小鼠的主要背景品系，为此，提高基因工程小鼠品系精子冻融后的体外受精率非常重要。
小鼠自然交配情况下，精子需要经过雌性小鼠生殖道到达输卵管伞端，生殖道中的各种活性物质与精子作用使之超活化具备受精能力，该过程称为精子获能；现有的冻融精子的体外受精技术中，往往使用体外受精液(HTF)进行复苏精子，而冻存的小鼠精子复苏后，由于冻存、复苏操作的损伤，活力降低，从而受精能力降低，因而，如何提高冻融小鼠精子的受精率是种质资源保存过程中需要解决的难题。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提出了一种小鼠冻存精子复苏液复合物，其组成成分包含基础液、甲基B环糊精MBCD和聚乙烯醇PVA。
本发明复苏液复合物中，所述基础液、甲基B环糊精MBCD、聚乙烯醇PVA之间的用量比为100ml：(80-140)毫克：(20-100)毫克。优选地，所述基础液、甲基B环糊精MBCD、聚乙烯醇PVA之间的用量比为100ml：100mg：30mg。
本发明所述复苏液复合物中，所述甲基B环糊精MBCD的浓度为0.8-1.4毫克/毫升，即1毫升基础液中含有0.8-1.4毫克甲基B环糊精；优选地，1毫升基础液中含有1.0毫克甲基B环糊精。
本发明所述复苏液复合物中，所述聚乙烯醇PVA的浓度为0.2-1.0毫克/毫升，即1毫升基础液中含有0.2-1.0毫克聚乙烯醇；优选地，1毫升基础液中含有为0.3毫克聚乙烯醇。
本发明所述复苏液复合物中，所述基础液为不含有钙镁离子的磷酸盐缓冲液。优选地，其含有氯化钾、磷酸二氢钾、氯化钠、磷酸氢二钠等，PH值为7.4。优选地，所述不含有钙镁离子的缓冲液为购自Gibco公司的市售产品。
进一步地，本发明还提出了一种小鼠冻存精子复苏液，进一步包括ATP。所述ATP可以是预配制在精子受精液中。即所述小鼠冻存精子复苏液包括：基础液、甲基B环糊精MBCD、聚乙烯醇PVA、ATP。
本发明还提出了一种小鼠冻存精子复苏液的配制方法，具体步骤如下：将甲基B环糊精MBCD和聚乙烯醇PVA溶解于基础液中，待充分溶解后，通过细菌过滤器过滤，得到所述小鼠冻存精子的复苏液。优选地，可得到用于使C57BL/6小鼠冻存精子复苏的复苏液。
本发明配制方法中，所述原料为基础液、甲基B环糊精MBCD、聚乙烯醇PVA；其中，所述基础液为不含有钙镁离子的磷酸盐缓冲液，其含有氯化钾、磷酸二氢钾、氯化钠、磷酸氢二钠等，PH值为7.4。所述基础液、所述缓冲液购自Gibco公司。
本发明配制方法中，所述基础液、甲基B环糊精MBCD、聚乙烯醇PVA之间的用量为100ml：(80-140)毫克：(20-100)毫克；优选地，为100ml：100mg：30mg。
本发明配制方法中，所述方法中采用的原料甲基B环糊精MBCD的浓度为0.8-1.4毫克/毫升，即1毫升基础液中含有0.8-1.4毫克甲基B环糊精；优选地，为1.0毫克/毫升。
本发明配制方法中，所述方法中采用的原料聚乙烯醇PVA的浓度为0.2-1.0毫克/毫升，即1毫升基础液中含有0.2-1.0毫克聚乙烯醇；优选地，为0.3毫克/毫升。
本发明所述复苏液复合物中，所述过滤器的直径为0.22微米。所述过滤器主要用于滤除细菌和病毒。
本发明所述复苏液复合物中，所述充分溶解的时间为3-5分钟；优选地，为4分钟。
本发明所述复苏液复合物中，所述充分溶解的温度为25±5℃；优选地，为25℃。
本发明所述复苏液复合物中，进一步包括冷冻保藏步骤，所述保藏步骤为：将制备得到所述复苏液复合物放置于冰箱中保藏；其中，保藏温度为-20～-80℃；优选地，为-20℃。
本发明还提出了由上述制备方法制备得到的复苏液复合物。
在一个具体实施方式中：在不含有钙镁离子的磷酸盐缓冲液为基础液中，溶解0.8-1.4毫克/毫升的甲基B环糊精MBCD和0.2-1.0毫克/毫升的聚乙烯醇PVA，待溶液充分溶解后，过0.22um的细菌过滤器过滤后，得到所述复苏液复合物，然后放入冰箱冷冻保存。
本发明还提出了所述小鼠冻存精子复苏液复合物在用于使小鼠冻存精子复苏的用途。优选地，小鼠冻存精子为12-14周龄的近交系(C57BL/6)的雄性小鼠冻存精子。
本发明提供的复苏液中含有甲基B环糊精MBCD和聚乙烯醇PVA，可促进精子膜的通透性增加，促进胆固醇外流，胆固醇外流是精子获能过程中变化之一，精子在该复苏液中的孵育就使得精子获得超能力的数量和质量都得到增加，增加具有受精能力的精子数量，从而增加与卵子受精的几率，提高受精率。
本发明的有益效果在于：本发明通过向精子复苏液中添加甲基B环糊精MBCD和聚乙烯醇PVA，促进精子获能过程，使之获得的运动能力增强，具有受精能力精子的数量增加，从而增加与卵子受精的几率，提高受精率。有益于小鼠精子资源保存成功，增加、增速小鼠品系资源的重建。
具体实施方式
结合以下具体实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容
冻精复苏液的配置：使用不含有钙镁离子的磷酸盐缓冲液(DPBS)，分别配置100毫克/毫升的甲基B环糊精MBCD和PVA；使用时再用DPBS配置成含有不同浓度的液体，用0.22um的细菌过滤器过滤后使用。
受精液的配置：用HTF配置100毫摩尔/升的ATP储存液，使用时用HTF稀释到适合的工作浓度，过0.22um的细菌过滤器。
对比例1-4以基础液和不同浓度MBCD组成的组合物作为对照例，用来对解冻后的精子进行复苏。该组合物的配制比例如表1：
表1.对比例1-4中所用组合物的配制情况
| 组分/对比例 | 1 | 2 | 3 | 4 |
| 基础液(ml) | 100 | 100 | 100 | 100 |
| MBCD(mg) | 80 | 100 | 120 | 140 |
对比例5-9以基础液和不同浓度的PVA组成的组合物作为对照例，用来对解冻后的精子进行复苏。该组合物的配制比例如表2：
表2.对比例5-9中所用组合物的配制情况
| 组分/对比例 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
| 基础液(ml) | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| PVA(mg) | 20 | 30 | 50 | 80 | 100 |
对比例10-13配制含有不同浓度ATP的受精液(HTF)，配制比例如表3：
表3.对比例10-13中含ATP的受精液(HTF)的配制情况
| 对比例 | 10 | 11 | 12 | 13 |
| ATP/受精液(mmol/L) | 5 | 0.5 | 0.05 | 0.025 |
精子冻存：取12-14周龄的近交系健康雄性小鼠C57BL/6小鼠，颈椎脱臼处死，无菌取出附睾尾，用眼科剪将附睾尾剪碎，浸入1ml平衡至37℃的精子冻存液中，让精子充分游出。5-7min后，分装入250ul的麦管中，每管装50-80ul，热封口。在液氮蒸汽中放置3-5min预冷后，投入液氮中保存，
精子复苏：从液氮中取出精子冻存麦管13根，在空气中摇动15-30秒，投入37℃水浴中完全解冻30-60秒后，剪掉麦管封口，将精子吹入1ml平衡至37℃精子解冻液(JDY)中，精子完全分散后孵育2-3分钟，然后2500-3000rpm离心3-5min后，弃去上清，保留50ul液体，将精子吹散。对照组使用体外受精液(HTF)，该对照组体外受精液(HTF)中不含有ATP。
卵子的获得：取5-6周与雄鼠同品系的SPF级雌鼠，实验前3天注射PMSG(孕妈血清激素)5-10IU，48小时后注射HCG(人绒毛膜促性腺激素)5-10IU，14-16小时后，颈椎脱臼处死，打开腹腔，分离输卵管，体视显微镜下找到膨大部，释放卵团，将卵团挑入100ul-200ul预热的37℃体外受精液(HTF)中，即将卵团分别加入至各个待测样品及对照组样品中，并洗涤2-3次，用矿物油覆盖。置于37℃，二氧化碳5％的培养箱中。
受精过程：分别取解冻液(JDY)孵育和HTF孵育的精子液10ul置于卵团液中，置于37℃，二氧化碳5％的培养箱中继续培养，完成受精过程。
受精卵的挑选和计数：6-7小时后，将受精液滴置于显微镜下挑选，选得分散的卵子，移入矿物油覆盖的100ul预热至37℃的KSOM培养液中，继续培养20-22小时后，计数发育至2-4细胞期胚胎计算受精率，见表4。
表4.不同对比例的复苏液孵育后的体外受精率
由以上结果可知，分别使用含有不同浓度的MBCD、PVA和ATP在小鼠精子精子复苏液，体外受精率均得到明显增加。其中，对比例1-4可见，MBCD在100-140mg/ml的浓度范围内得到较好的受精效果，100mg/ml效果最佳。对比例5-9可见，PVA的浓度在20-80mg/ml的浓度范围内均能够得到较好的受精效果，30mg/ml的受精效果最好。对比例10-13可见，ATP的浓度在0.5-0.05mmol/L的浓度范围内均能够得到较好的受精效果，其中0.05mmol/L浓度效果最佳。受精率为63％的对照例14中不含有MBCD、PVA、ATP。
实施例1-8
本发明提出的精子复苏液，即，将基础液、MBCD、PVA组成的组合物作为精子复苏液。进一步地，所述精子复苏液还可以包括ATP。
将基础液、MBCD、PVA和ATP按照实施例1-8的浓度进行配比成为精子复苏液和受精液，得到如下受精率，请见表5。
表5.实施例1-8中的小鼠精子复苏液和受精液的配制情况
由以上结果可知，与对比例1-13和对照例14相比较，冻存后的小鼠精子解冻后经过本发明的含有一定剂量的MBCD或PVA的精子复苏液复合物的孵育，得到较高的受精率；使用解冻液中含有一定剂量的MBCD或PVA的精子复苏液复合物，受精液中含有一定剂量的ATP得到较高的受精率；精子复苏液中含有一定剂量的MBCD和PVA，受精液中同时含有一定剂量的ATP得到受精率再次提高。如实施例2、7。
在精子复苏液中同时使用MBCD和PVA，在不含有ATP的受精液中进行体外受精，也能够得到较高的受精率，如实施例3、8。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
Claims (10)
1.一种小鼠冻存精子复苏液复合物，其特征在于，其组成成分包含基础液、甲基B环糊精MBCD和聚乙烯醇PVA；所述基础液为不含有钙镁离子的磷酸盐缓冲液DPBS。
2.如权利要求要求1所述的小鼠冻存精子复苏液复合物，其特征在于，所述基础液、甲基B环糊精MBCD、聚乙烯醇PVA之间的用量比为100ml：(80-140)毫克：(20-100)毫克。
3.如权利要求要求1所述的小鼠冻存精子复苏液复合物，其特征在于，进一步包括ATP。
4.一种小鼠冻存精子复苏液复合物的配制方法，其特征在于，其具体步骤如下：将甲基B环糊精MBCD和聚乙烯醇PVA溶解于基础液中，待充分溶解后，通过细菌过滤器过滤，得到如权利要求1所述的小鼠冻存精子复苏液复合物；其中，所述基础液为不含有钙镁离子的磷酸盐缓冲液。
5.如权利要求4所述的配制方法，其特征在于，所述基础液、甲基B环糊精MBCD、聚乙烯醇PVA之间的用量比为100ml：(80-140)毫克：(20-100)毫克。
6.如权利要求4所述的配制方法，其特征在于，所述充分溶解时间为3-5分钟。
7.如权利要求4所述的配制方法，其特征在于，所述充分溶解的温度为20-30℃。
8.如权利要求4所述的配制方法，其特征在于，所述过滤器的直径为0.22微米。
9.如权利要求4所述的配制方法，其特征在于，进一步包括将所述复苏液复合物进行冷冻保藏步骤，保藏温度为-20～-80℃。
10.如权利要求1或3所述的复苏液复合物在用于使小鼠冻存精子复苏的用途。
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