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CN109136158A - 一种以生物质水解液为原料合成苯乙烯的基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

一种以生物质水解液为原料合成苯乙烯的基因工程菌及其构建方法与应用 Download PDF

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CN109136158A CN201710498760.3A CN201710498760A CN109136158A CN 109136158 A CN109136158 A CN 109136158A CN 201710498760 A CN201710498760 A CN 201710498760A CN 109136158 A CN109136158 A CN 109136158A
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张海波
刘长青
刘会洲
刘炜
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Original Assignee
Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
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Abstract

本发明提供一种以生物质水解液为原料合成苯乙烯的基因工程菌及其构建方法与应用，涉及基因工程技术领域和发酵工程技术领域。该基因工程菌过表达苯丙氨酸氨解酶基因，肉桂酸脱羧酶基因，3‑脱氧‑D‑阿拉伯庚酮糖‑7‑磷酸合成酶基因以及双功能酶分支酸变位酶‑预苯酸脱水酶基因。其构建步骤如下：克隆苯丙氨酸氨解酶基因和肉桂酸脱羧酶基因，连接到质粒；克隆3‑脱氧‑D‑阿拉伯庚酮糖‑7‑磷酸合成酶基因和双功能酶基因，连接到质粒；质粒导入到大肠杆菌感受态中，获得基因工程菌。上述基因工程菌可用于生物质水解液为原料合成苯乙烯。具有绿色和可持续性，且大大高出以葡萄糖为碳源生产的苯乙烯的产量，实现了一直以来无法实现的突破。

Description

一种以生物质水解液为原料合成苯乙烯的基因工程菌及其构 建方法与应用
技术领域
本发明涉及一种以生物质水解液为原料合成苯乙烯的基因工程菌及其构建方法与应用, 属于基因工程技术领域和发酵工程技术领域。
背景技术
苯乙烯是合成橡胶和塑料的单体，用来生产丁苯橡胶、聚苯乙烯、泡沫聚苯乙烯；也用 于与其他单体共聚制造多种不同用途的工程塑料。如与丙烯腈、丁二烯共聚制得树脂，广泛 用于各种家用电器及工业上；与丙烯腈共聚制得得到耐冲击、色泽光亮的树脂；与丁二烯共 聚所制得的一种热塑性橡胶，广泛用作聚氯乙烯、聚丙烯的改性剂等。苯乙烯主要用于生产 苯乙烯系列树脂及丁苯橡胶，也是生产离子交换树脂及医药品的原料之一，此外，苯乙烯还 可用于制药、染料、农药以及选矿等行业。
目前苯乙烯的来源主要是化学合成，主要包括乙苯催化脱氢法和乙苯共氧化法。其中乙 苯催化脱氢法在催化剂的作用下550～600℃脱氢生产苯乙烯，使得工艺受到设备要求高和能 耗高的限制。而乙苯共氧化法存在反映复杂、副产物多、工艺过程长等缺点。同时上述两种 方法都受到原料的不可持续等瓶颈的影响。随着合成生物学的发展，越来越多的化学品通过 反应条件温和，对环境友好的生物催化法合成。并且，生物合成工艺采用可再生的生物质原 料的水解产物葡萄糖为主要原料，具有可持续的优点。Azeem,Muhammad1等人发现利用 Penicillium expansum可以直接发酵森林废弃物生产苯乙烯，但是总体发酵效率较低最高达到 52μg/h。John J.Beck2等人利用Fusarium oxysporum连续发酵60天，获得了可分离量的苯乙 烯，生产效率同样是其限制性因素(US 9,057,080B1)。目前，DavidR.Nielsen3等人已经实 现了利用葡萄糖为原料通过工程大肠杆菌或者工程酵母生产苯乙烯，虽然生产效率相对之前 比较高，但是需要向工程菌株额外添加苯丙氨酸，而苯丙氨酸价格昂贵。除此之外，葡糖糖 的价格较高也成为限制其应用的一个重要因素。生物质水解技术能够有效的降低发酵原料的 成本，但是产物中会形成多种发酵抑制剂,如糠醛、羟甲基糠醛、乙酸、酚类化合物等。从 而抑制了发酵，使得生物质水解液为原料发酵生产苯乙烯的产量受到限制。且葡萄糖为碳源 生产的苯乙烯的量为251±3mg L-1，目前以生物质水解液为原料发酵合成苯乙烯很难超过这 个产量。同时发酵抑制剂会对菌株产生毒性作用，也进一步限制苯乙烯产量。
发明内容
为充分利用生物质资源以及解决上述生物质水解液中形成的多种发酵抑制剂对菌株生长 产生抑制作用、毒性大，进而限制产量等问题，为了减轻发酵抑制剂对菌株的毒性作用，本 发明提供了一种利用生物质水解液耐受性宿主大肠杆菌，以生物质水解液为原料合成苯乙烯 的基因工程菌及其构建方法，采用一株耐受性木质纤维素水解液宿主大肠杆菌菌株(该菌株 授权专利号：CN201310473790.0，菌株保藏编号为CGMCC No.8028)开展生物基苯乙烯的合 成工作，从而实现利用生物质水解液为原料高效合成苯乙烯，所采取的技术方案如下：
本发明的目的之一在于提供一种以生物质水解液为原料合成苯乙烯的基因工程菌，该基 因工程菌过表达苯丙氨酸氨解酶基因，肉桂酸脱羧酶基因，3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合 成酶基因以及双功能酶分支酸变位酶-预苯酸脱水酶基因。
优选的，上述基因工程菌出发菌株为一株耐受性木质纤维素水解液的大肠杆菌菌株，该 菌株已被命名为菌株qibebt-3，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心，保藏编号为CGMCC No.8028。
优选的，所述苯丙氨酸氨解酶，分别来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)的苯丙氨酸氨 解酶基因AtPAL或皱叶欧芹(Petroselinum crispum)的苯丙氨酸氨解酶基因FtPAL；所述肉桂 酸脱羧酶基因，为源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的肉桂酸脱羧酶基因FDC1；所 述3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因，为源于大肠杆菌的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7- 磷酸合成酶基因aroF；所述双功能酶分支酸变位酶-预苯酸脱水酶基因，是源于大肠杆菌的双 功能酶分支酸变位酶-预苯酸脱水酶基因pheA。
优选的，所述来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的苯丙氨酸氨解酶基因AtPAL的GeneBank 登录号为：822493；所述来自皱叶欧芹(Petroselinum crispum)的苯丙氨酸氨解酶基因FtPAL 的UniProtKB/Swiss-Prot:P24481.1；所述肉桂酸脱羧酶基因FDC1的GeneBank登录号为： 330443520；所述3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因aroF的GeneBank登录号为： 947084；所述双功能酶分支酸变位酶-预苯酸脱水酶基因pheA的GeneBank登录号为：947080。
本发明还提供上述基因工程菌的构建方法，步骤如下：
(1)克隆源于拟南芥的苯丙氨酸氨解酶基因AtPAL，源于酿酒酵母的肉桂酸脱羧酶基因 FDC1，并通过限制性内切酶将所得基因连接到质粒pTrcHis2B，获得第一重组质粒；克隆源 于皱叶欧芹的苯丙氨酸氨解酶基因FtPAL，源于酿酒酵母的肉桂酸脱羧酶基因FDC1，并通过 限制性内切酶将所得基因连接到质粒pTrcHis2B，获得第二个重组质粒。
(2)克隆源于大肠杆菌的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因aroF和双功能酶分支 酸变位酶-预苯酸脱水酶基因pheA，并通过限制性内切酶将所得基因连接到质粒pET-duet-1上， 获得第三重组质粒；
(3)步骤1)所得的第一重组质粒和步骤2)所得的第三重组质粒导入到生物质水解液耐 受性菌株qibebt-3的感受态细胞中，获得基因工程菌1；步骤1)所得的第二重组质粒和步骤2) 所得的第三重组质粒导入到生物质水解液耐受性菌株qibebt-3的感受态细胞中，获得基因工程 菌2。
另外，本发明还提供上述基因工程菌在以生物质水解液为原料合成苯乙烯中的应用。
所述生物质为秸秆、木材、浮萍、海藻或玉米中的一种或二种以上。
所述生物质水解液是通过稀酸水解法、稀碱水解法、石灰水解法、羟氧自由基水解法或 酶解法获得的。
所述生物质水解液的制备过程是，利用目的生物质粉碎物，利用稀酸水解法或稀碱水解 法或石灰水解法或羟氧自由基水解法或/和酶解法对生物质粉碎物进行处理，过滤除去剩余 物，离心除残渣后，利用NaOH调节pH值为7.0±0.1之后，添加1g/L漆酶或者辣根过氧化物酶 或者豆壳过过氧化物酶，37℃温浴1h，离心后再用1g/L漆酶或者辣根过氧化物酶或者豆壳过 过氧化物酶37℃温浴1h，离心用所得水解液做发酵用的碳源；如果为了进一步提高水解液中 葡萄糖的含量，将上述所得的水解液添加纤维素酶40FPU/g底物和β-葡萄糖苷酶20CBU/g 底物，于45℃振荡器振荡50h，过滤所得水解液做发酵用的碳源。
生物质水解液的制备方法为：
稀酸水解法：取20g生物质粉碎物，利用1％的硫酸在75～95℃下水解3～5h，过滤除去剩余 物，离心除残渣后，利用NaOH调节pH值为7.0±0.1之后，添加1g/L漆酶或者辣根过氧化物酶 或者豆壳过过氧化物酶，37℃温浴1h，离心后再用1g/L漆酶或者辣根过氧化物酶或者豆壳过 过氧化物酶37℃温浴1h，离心所得水解液做发酵用的碳源。
稀碱水解法：取20g生物质粉碎物，利用1％的NaOH在75～95℃下水解3～5h，过滤除去剩 余物，离心除残渣后，利用HCl调节pH值为7.0±0.1之后，添加1g/L漆酶或者辣根过氧化物酶 或者豆壳过过氧化物酶，37℃温浴1h，离心后再用1g/L漆酶或者辣根过氧化物酶或者豆壳过 过氧化物酶37℃温浴1h，离心所得水解液做发酵用的碳源。
石灰处理：取20g生物质粉碎物，利用无菌水稀释成100g/L，加入20g/l的Ca(OH)2于 60℃温浴1h，过滤除去剩余物，离心除残渣后，利用HCl调节pH值为7.0±0.1之后，添加1g/L 漆酶或者辣根过氧化物酶或者豆壳过过氧化物酶，37℃温浴1h，离心后再用1g/L漆酶或者辣 根过氧化物酶或者豆壳过过氧化物酶37℃温浴1h，离心所得水解液做发酵用的碳源。
羟氧自由基处理：取20g生物质粉碎物，利用无菌水稀释成100g/L，加入次氯酸钠和双 氧水(两者的体积比例为10：1)于60℃温浴1h，过滤除去剩余物，离心除残渣后，利用酸 或碱调节pH值为7.0±0.1之后，添加1g/L漆酶或者辣根过氧化物酶或者豆壳过过氧化物酶，37℃温浴1h，离心后再用1g/L漆酶或者辣根过氧化物酶或者豆壳过过氧化物酶37℃温浴1h， 离心所得水解液做发酵用的碳源。
酶解法：取称取20g生物质粉碎物，加入0.1M pH 4.5的柠檬酸缓冲溶液，使底物浓度达 到10g/l，添加纤维素酶40FPU/g底物和β-葡萄糖苷酶20CBU/g底物，于45℃振荡器振荡50h， 过滤所得水解液做发酵用的碳源。
在本发明的一个优选的实施方案中，提供了一种利用可再生生物质水解液合成苯乙烯的 方法，该方法包括将本发明中的方法构建的重组大肠杆菌菌株在适宜于其生长的条件下在包 含生物质水解液作为碳源和诱导剂的培养基中进行培养，在培养过程中不断通入空气，从尾 气中发酵产物中能够检测到苯乙烯。
优选地，所述生物质水解液主要成分是糖类、油类(例如，植物油诸如棉籽油、棕榈油或 大豆油)、脂肪酸(例如不饱和脂肪酸、饱和脂肪酸或多不饱和脂肪酸)、脂质、磷脂、甘油酯(例 如，甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯等)、多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)，酵母提取物、 来自酵母提取物的成分、聚合物、酸、醇、醛、酮、氨基酸、琥珀酸酯、乙酸酯等。在本发 明中，碳源优选是可再生糖类，如水解生物质，包括甘蔗渣、玉米秸秆、木浆、转化糖、光合作用产物(包括，但不限于葡萄糖)，以及其它单糖(例如，果糖、甘露糖、半乳糖、木糖或阿拉伯糖等)、二糖、多糖等。利用20～40g目的生物质粉碎物，利用稀酸水解法或稀碱水解法或石灰水解法或羟氧自由基水解法或/和酶解法处理，过滤除去剩余物，离心除残渣后，利 用NaOH调节pH值为7.0±0.1之后，添加1g/L漆酶或者辣根过氧化物酶或者豆壳过过氧化 物酶，37℃温浴1h，离心后再用漆酶或者辣根过氧化物酶或者豆壳过过氧化物酶进行处理， 离心用所得水解液做发酵用的碳源，其成分主要为葡萄糖、木糖、糠醛，此外还含有少量羟 甲基糠醛、乙酸、酚类化合物。
本发明获得的有益效果如下：
在本发明的生物合成苯乙烯的方法中，可使用适合于工程大肠杆菌的中等至大规模培养 的任何液体培养基，例如M9液体培养基，在所述液体培养基中可以添加与所述工程大肠杆 菌的抗生素抗性相对应的抗生素或组合以提高生长选择性，例如，如果在工程大肠杆菌的筛 选过程中分别使用了氯霉素和氨苄霉素两种抗生素，则在生物合成过程(例如摇瓶培养或发酵 罐培养)中，在培养基中可以添加上述两种抗生素。此外，在本发明的生物合成过程中，可以 在培养基中添加常规的诱导剂例如IPTG以进行诱导培养。
根据本发明的菌株制备方法制备的工程大肠杆菌菌株可以获得单一组分的苯乙烯。
根据本发明的苯乙烯生物合成方法，苯乙烯的摇瓶培养产量超过320mg/L，合13.3mg/L/h，大大高出传统以生物质发酵生产苯乙烯的52μg/h，实现了一直以来无法实现的突破。
本发明的方法以来源于生物质的水解糖为原料合成苯乙烯，具有绿色和可持续性。
根据本发明的菌株制备方法制备的工程大肠杆菌菌株可以获得单一组分的苯乙烯。
本发明提供了一种以生物质水解液为原料合成苯乙烯的基因工程菌及其构建方法，并且 采用高纤维素水解液耐受性大肠杆菌为宿主以解决发酵抑制剂对菌株生长产生抑制作用等问 题。本发明经济、绿色，从根本上提供了一条利用可持续的方法合成苯乙烯用于缓解苯乙烯 合成行业原料不足的问题。
本发明中涉及的定义和缩写：
在本文中使用下列的缩写或简称：
高纤维素水解液耐受性大肠杆菌(Escherichia coli)：E.coli qibebt-3CGMCCNo.8028
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae):S.cerevisiae
拟南芥(Arabidopsis thaliana):A.Thaliana
皱叶欧芹(Petroselinum crispum)：P.Crispum
“基因片段”在本文中根据具体的使用场合应理解为是与体内特定基因序列相对应的分 离的核酸分子或核酸序列，而非存在于生物体体内的基因组内的基因片段。
“过量表达”或“过表达”是指特定基因在生物体中的表达超过正常水平，例如，通过增强 内源表达或引入外源基因来实现。
附图说明
图1生物质水解液合成苯乙烯的流程图。
图2苯乙烯生物合成代谢途径。
图3苯丙氨酸氨解酶、肉桂酸脱羧酶共表达载体示意图，其中图3A中的AtPAL基因源于拟 南芥，图3B中的FtPAL基因源于皱叶欧芹。
图4 3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶和能够催化分支酸转化为预苯酸及催化预苯酸转 化为苯丙酮酸的双功能酶共表达载体示意图。
图5工程菌合成苯乙烯的气相-质谱检测图；
(其中，A：气相图谱，B：质谱图谱)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
以下实施例所用试剂、材料、方法和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规试剂、材料、 方法和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。
实施例1
(1)苯丙氨酸氨解酶相关基因、肉桂酸脱羧酶相关基因载体质粒(pTrcHis质粒)的构建(图3)
通过在大肠杆菌(E.coli)中共表达来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)的苯丙氨酸氨 解酶基因AtPAL(AtPAL，ID:824493)，肉桂酸脱羧酶基因(FDC1，GI:330443520)获得第 一组质粒。
通过在大肠杆菌(E.coli)中共表达来源于皱叶欧芹(Petroselinum crispum)的苯丙氨酸 氨解酶基因(FtPAL，(EC:4.3.1.24))，肉桂酸脱羧酶基因(FDC1，GI:330443520)获得 第二组质粒。
以上基因都属于已知基因，获得方法采用基因组作为模板进行PCR的方法，或者直接基 因化学法合成，以上方法属于成熟的分子生物学方法，不存在特殊性。本实验所需要的基因 均进行密码子优化后送入华大合成基因序列，得到pGH-AtPAL、pGH-FtPAL、pGH-FDC1。
获得目的基因后，苯丙氨酸氨解酶基因(AtPAL，ID:824493)利用限制性内切酶NcoI 和Xho I以串连的方式连接到pTrcHis2B质粒的第一个表达位点，肉桂酸脱羧酶基因(FDC1， GI:330443520)通过限制性内切酶Bgl II和Kpn I以串连的方式连接到pTrcHis2B质粒的第二个 表达位点。(如图3A所示)酶切体系如表1所示。
表1双酶切体系
反应条件：37℃，酶切1h。
切下目的片段后，采用Omega Bio-Tek公司的胶回收试剂盒进行胶回收。
酶连接体系如表2所示：
表2酶连接体系
16℃过夜连接。
以上质粒构建方法涉及到PCR技术、核酸合成技术、质粒限制性酶切方法、酶切片段回 收方法、酶切片段连接方法等。以上方法属于成熟的分子生物学方法，不存在特殊性。
(2)3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因和能够催化分支酸转化为预苯酸及催化预苯 酸转化为苯丙酮酸的双功能酶分支酸变位酶-预苯酸脱水酶基因载体质粒(pACYC质粒)的 构建(图4)
通过在大肠杆菌(E.coli)中共同过量表达来源于大肠杆菌(E.coli)的3-脱氧-D-阿拉 伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因(aroF，GI:947084),催化分支酸转化为预苯酸及催化预苯酸转 化为苯丙酮酸的双功能酶分支酸变位酶-预苯酸脱水酶(pheA，ID:947080)。
具体实验操作如下：
PCR扩增目的片段aroF和pheA，以E.coli BL21(DE3)基因组为模板，分别以aroF-BamH I/aroF-Not I和pheA-Bgl II/pheA-Xho I为引物，分别扩增aroF和pheA基因。
PCR反应体系如表3所示：
表3PCR反应体系
PCR扩增程序：
获得目的基因后，3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因(aroF，GI:947084)通过 限制性内切酶BamH I和Not I以串连的方式连接到pACYCDuet-1质粒的第一个表达位点。催化 分支酸转化为预苯酸及催化预苯酸转化为苯丙酮酸的双功能酶分支酸变位酶-预苯酸脱水酶 基因(pheA，ID:947080)利用限制性内切酶Bgl II和Xho I以串连的方式连接到pACYCDuet-1 质粒的第二个表达位点(如图4所示)。
以上质粒构建方法涉及到PCR技术、核酸合成技术、质粒限制性酶切方法、酶切片段回 收方法、酶切片段连接方法等。以上方法属于成熟的分子生物学方法，不存在特殊性。
(3)感受态菌株制备：
从37℃过夜(16-20h)培养平皿内挑取一个直径约为2到3毫米的单菌落。把这样的单菌落 接种于一只装有5毫升LB肉汤的30毫升灭菌试管中，于37℃下振荡培养过夜。转移0.2毫升 过夜培养物于一只装有15或20毫升LB的50毫升灭菌三角瓶中.于37℃下振荡培养2到2.5小 时(此时细菌处于对数生长期)。室温下，4000rpm离心5分钟收集对数期细胞。弃培养基， 保留细胞沉淀。加入10毫升冰冷的MgCl2-CaCl2溶液，并轻微打匀。4℃下，4000rpm离心 10分钟收集细胞。弃MgCl2-CaCl2溶液，保留细胞沉淀。加入0.8毫升(每25毫升初始培养物 加入1毫升)冰冷的0.1M的CaCl2溶液，并轻微打匀。冰浴放置若干小时为最好。此时的感受 态细胞可以直接进行转化操作，也可以分装,加入甘油后于-70℃冰冻保藏。
(4)质粒转化
将上述步骤(1)制备的质粒转化入大肠杆菌qibebt-3的感受态中，即构建的到以生物质水 解液为原料合成苯乙烯的基因工程菌，具体为：质粒转化：取质粒3～5uL加入大肠杆菌BL21 (DE3)的感受态中，混匀；冰浴30min，42℃热激55s；加入450μL的LB培养基，在37℃摇 床上活化1h；4 000rpm，离心2min，弃大部分上清，混匀，涂Cm和Amp双抗性的平板，37℃ 培养12h，挑取单克隆，构建得到单转化苯丙氨酸氨解酶相关基因、肉桂酸脱羧酶相关基因 质粒(pTrcHis2B质粒)的菌株。
将上述步骤(1)、(2)制备的质粒转化入大肠杆菌qibebt-3的感受态中，即构建的到以 生物质水解液为原料合成苯乙烯的基因工程菌，具体为：质粒转化：取质粒3～5uL加入大肠杆 菌BL21(DE3)的感受态中，混匀；冰浴30min，42℃热激55s；加入450μL的LB培养基， 在37℃摇床上活化1h；4 000rpm，离心2min，弃大部分上清，混匀，涂Cm和Amp双抗性的平板，37℃培养12h，挑取单克隆，构建得到同时转化上述pTrcHis2B质粒和含有3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶和能够催化分支酸转化为预苯酸及催化预苯酸转化为苯丙酮酸 的双功能酶载体pACYCDuet-1质粒的菌株。
实施例2以生物质水解液为原料发酵合成苯乙烯
(1)生物质水解液的制备(图1)
稀酸水解法：取20g生物质粉碎物(可以是秸秆、木材、浮萍、海藻或玉米中的一种，也 可以是这些物质两种以上混合物，质量比例为1；1)，利用1％的硫酸在75～95℃下水解5h， 过滤除去剩余物，离心除残渣后，利用NaOH调节pH值为7.0±0.1之后，添加1g/L漆酶或者辣 根过氧化物酶或者豆壳过过氧化物酶，37℃温浴1h，离心后再用1g/L漆酶或者辣根过氧化物 酶或者豆壳过过氧化物酶37℃温浴1h，离心所得水解液做发酵用的碳源。
稀碱水解法：取20g生物质粉碎物，利用1％的NaOH在75～95℃下水解5h，过滤除去剩 余物，离心除残渣后，利用HCl调节pH值为7.0±0.1之后，添加1g/L漆酶或者辣根过氧化物酶或者豆壳过过氧化物酶，37℃温浴1h，离心后再用1g/L漆酶或者辣根过氧化物酶或者豆壳过过氧化物酶37℃温浴1h，离心所得水解液做发酵用的碳源。
石灰处理：取20g生物质粉碎物，利用无菌水稀释成100g/l，加入20g/l的Ca(OH)2于 60℃温浴1h，过滤除去剩余物，离心除残渣后，利用HCl调节pH值为7.0±0.1之后，添加1g/L 漆酶或者辣根过氧化物酶或者豆壳过过氧化物酶，37℃温浴1h，离心后再用1g/L漆酶或者辣 根过氧化物酶或者豆壳过过氧化物酶37℃温浴1h，离心所得水解液做发酵用的碳源。
羟氧自由基处理：取20～40g生物质粉碎物，利用无菌水稀释成100g/l，加入次氯酸钠和 双氧水(两者的体积比例为10：1)于60℃温浴1h，过滤除去剩余物，离心除残渣后，利用 酸或碱调节pH值为7.0±0.1之后，添加1g/L漆酶或者辣根过氧化物酶或者豆壳过过氧化物酶， 37℃温浴1h，离心后再用1g/L漆酶或者辣根过氧化物酶或者豆壳过过氧化物酶37℃温浴1h， 离心所得水解液做发酵用的碳源。
酶解法：取称取20～40g生物质粉碎物，加入0.1M pH 4.5的柠檬酸缓冲溶液，使底物浓 度达到10g/l，添加纤维素酶40FPU/g底物和β-葡萄糖苷酶20CBU/g底物，于45℃振荡器振荡50h，过滤所得水解液做发酵用的碳源。
(2)苯乙烯的发酵合成
实施例1步骤(3)所得两种单克隆分别接种于培养瓶中的培养基中分别培养。
上述培养基配方为：胰蛋白胨5g/L、酵母提取物10g/L、生物质水解液(以上五种水解 液)10ml，170mmol/l磷酸二氢钾、720mmol/l磷酸氢二钾，苯丙氨酸1g/L。培养到菌液OD600至0.8左右时，补加终浓度为0.4mM的IPTG。同时加瓶塞，形成厌氧环境。将摇瓶 转入30℃、180rpm摇瓶中培养24h，顶空用气相-质谱测定苯乙烯。苯乙烯的定量采用的方 法是，向诱导24h后的摇瓶中添加20ml的乙酸乙酯，6000rpm离心10min，取1ml的有机 相溶液过0.22μm的有机相膜，得到的液体进行气相定量苯乙烯。
(3)苯乙烯产物测定(图5)
将上述步骤(2)中得到的苯乙烯通过气相色谱(GC)和气相色谱-质谱联用仪(GC-MS) 对其进行分析测定。GC采用CP-FFAP CB毛细管色谱柱(25m×0.25mm；0.2μm)，方法为50℃ 维持1分钟，20℃/分钟程序升温至120℃，然后30℃/分钟升温至240℃，240℃维持5min，检测器温度260℃。GC-MS采用Agilent HP-INNOWax毛细管色谱柱(30m×0.32mm，0.25 μm.)，方法为50℃维持2分钟，然后10℃/分钟程序升温至240℃，240℃维持3分钟。实验 结果显示，样品峰的保留时间和苯乙烯的质谱图如图5A和图5B所示，根据气相检测结果， 检测苯乙烯的产量。
其中，单转化苯丙氨酸氨解酶相关基因、肉桂酸脱羧酶相关基因质粒(pTrcHis2B质粒) 的菌株在步骤(2)中的培养情况下的苯乙烯产量为255mg/L；同时转化上述pTrcHis2B质粒 和含有3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶和能够催化分支酸转化为预苯酸及催化预苯酸 转化为苯丙酮酸的双功能酶载体pACYCDuet-1质粒的菌株，在步骤(2)中的培养情况下， 能够有效的提高产量到320mg/L。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的 人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围该 以权利要求书所界定的为准。

Claims (8)

1.一种以生物质水解液为原料合成苯乙烯的基因工程菌，其特征在于，过表达苯丙氨酸氨解酶基因，肉桂酸脱羧酶基因，3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因以及双功能酶分支酸变位酶-预苯酸脱水酶基因。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述苯丙氨酸氨解酶，分别来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)的苯丙氨酸氨解酶基因AtPAL或皱叶欧芹(Petroselinumcrispum)的苯丙氨酸氨解酶基因FtPAL；所述肉桂酸脱羧酶基因，为源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的肉桂酸脱羧酶基因FDC1；所述3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因，为源于大肠杆菌的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因aroF；所述双功能酶分支酸变位酶-预苯酸脱水酶基因，是源于大肠杆菌的双功能酶分支酸变位酶-预苯酸脱水酶基因pheA。
3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述来自拟南芥(Arabidopsisthaliana)的苯丙氨酸氨解酶基因AtPAL的GeneBank登录号为：822493；所述来自皱叶欧芹(Petroselinum crispum)的苯丙氨酸氨解酶基因FtPAL的UniProtKB/Swiss-Prot:P24481.1；所述肉桂酸脱羧酶基因FDC1的GeneBank登录号为：330443520；所述3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因aroF的GeneBank登录号为：947084；所述双功能酶分支酸变位酶-预苯酸脱水酶基因pheA的GeneBank登录号为：947080。
4.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，出发菌株为一株耐受性木质纤维素水解液的大肠杆菌菌株，该菌株已被命名为qibebt-3，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8028。
5.一种权利要求1-4任一所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：
1)克隆源于拟南芥的苯丙氨酸氨解酶基因AtPAL，源于酿酒酵母的肉桂酸脱羧酶基因FDC1，并通过限制性内切酶将所得基因连接到质粒pTrcHis2B，获得第一重组质粒；克隆源于皱叶欧芹的苯丙氨酸氨解酶基因FtPAL，源于酿酒酵母的肉桂酸脱羧酶基因FDC1，并通过限制性内切酶将所得基因连接到质粒pTrcHis2B，获得第二个重组质粒。
2)克隆源于大肠杆菌的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因aroF和双功能酶分支酸变位酶-预苯酸脱水酶基因pheA，并通过限制性内切酶将所得基因连接到质粒pET-duet-1上，获得第三重组质粒；
3)步骤1)所得的第一重组质粒和步骤2)所得的第二重组质粒导入到大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞中，获得基因工程菌。
6.权利要求1-4任一所述的基因工程菌在以生物质水解液为原料合成苯乙烯中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述生物质为秸秆、木材、浮萍、海藻或玉米中的一种或二种以上。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述生物质水解液是通过稀酸水解法、稀碱水解法、石灰水解法、羟氧自由基水解法或酶解法获得的。
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