CN109097326A - 一种制备间充质干细胞外泌体的方法及其应用 - Google Patents
一种制备间充质干细胞外泌体的方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109097326A CN109097326A CN201810910349.7A CN201810910349A CN109097326A CN 109097326 A CN109097326 A CN 109097326A CN 201810910349 A CN201810910349 A CN 201810910349A CN 109097326 A CN109097326 A CN 109097326A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- excretion body
- supernatant
- concentrate
- excretion
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000029142 excretion Effects 0.000 title claims abstract description 77
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 44
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 31
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims abstract description 13
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims abstract description 11
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims abstract description 11
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 8
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims abstract description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 4
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 230000002792 vascular Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 claims description 11
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims description 8
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 6
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 6
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 5
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 5
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims description 5
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims description 5
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims description 4
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims description 4
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 claims description 4
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 claims description 4
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 claims description 4
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 claims description 4
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 3
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 claims description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 2
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 abstract description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 8
- AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N bicinchoninic acid Chemical compound C1=CC=CC2=NC(C=3C=C(C4=CC=CC=C4N=3)C(=O)O)=CC(C(O)=O)=C21 AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 3
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 description 3
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000037303 wrinkles Effects 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- RDEIXVOBVLKYNT-HDZPSJEVSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-[(1r)-1-aminoethyl]oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol;(2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-(aminomethyl)oxan-2 Chemical compound OS(O)(=O)=O.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@@H](CN)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@H](O2)[C@@H](C)N)N)[C@@H](N)C[C@H]1N.O1[C@H]([C@@H](C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N RDEIXVOBVLKYNT-HDZPSJEVSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-UHFFFAOYSA-N 3,3-dimethyl-7-oxo-6-[(2-phenylacetyl)amino]-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid Chemical compound O=C1N2C(C(O)=O)C(C)(C)SC2C1NC(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102100025137 Early activation antigen CD69 Human genes 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000934374 Homo sapiens Early activation antigen CD69 Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 1
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 238000003921 particle size analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000037394 skin elasticity Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0665—Blood-borne mesenchymal stem cells, e.g. from umbilical cord blood
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/38—Vitamins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/18—Liver cell growth factor (LCGF, Gly-His-Lys)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/24—Interferons [IFN]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种制备间充质干细胞外泌体的方法，包括：清洗人脐带组织表面血液，去除表皮和血管组织，取出华通胶清洗后剪碎，接种培养；传代培养；第二代脐带间充质干细胞接种培养；加入促进外泌体分泌的的细胞刺激因子；待细胞生长至90％融合度时吸出第一细胞上清液用于分离外泌体；将第一细胞上清液离心去除细胞碎片，收集第二细胞上清液；将第二细胞上清液进行第一次超滤浓缩，去除多余水分，得到第一浓缩液；将第一浓缩液进行第二次超滤浓缩，去除多余水分，得到第二浓缩液；将第二浓缩液进行第一次超速离心，取上清液进行第二次超速离心，去除上清液，沉淀为干细胞分泌的外泌体；加入生理盐水清洗，离心，去除上清液，得到外泌体沉淀。
Description
技术领域
本发明属于干细胞与再生医学领域，具体涉及一种制备间充质干细胞外泌体的方法及其应用。
背景技术
外泌体(Exosome)是由细胞内囊泡结构释放到细胞外的一种膜性囊泡，直径约30-150nm，细胞在正常的生理状况下都会分泌外泌体，通过囊泡中的蛋白质和RNA在细胞间信号传导和细胞间相互调控中起到重要作用，而这种信号传导和相互调控机制复杂，尤其是在肿瘤细胞之间，肿瘤细胞分泌的外泌体是否对肿瘤组织内的免疫抑制、肿瘤细胞迁移、增殖及浸润有促进作用等，现在尚未完全搞清楚。
外泌体研究存在一个亟待解决的瓶颈问题就是外泌体的分离提取，现有方法包括超速离心、免疫磁珠分选等。超速离心是分离外泌体的最常用方法，但是超速离心需要配置超速离心机，这种设备属于特种设备，价格昂贵，使用复杂，而且分离时间长，分离量少，每次只能分离少量液体，需要数小时的离心时间，分离效率低下，限制了一些中小型实验室对外泌体的研究和外泌体批量生产，不具备批量生产的可能。免疫磁珠分选法是选用CD69抗体连接的磁珠通过抗体抗原结合的方式连接在外泌体上，再通过强磁场将外泌体吸附在分选仪上，从而将外泌体从液体中分离出来。免疫磁珠分选法也存在试剂耗材昂贵，分选量少的缺点，因此寻求新的分选方法可以低成本、大批量分离外泌体成为目前研究的重点。
此外，正常培养的间充质干细胞外泌体分泌量少，在细胞培养上清液中含量极低，如果不提前浓缩，得到所需外泌体需要的细胞培养上清液体积巨大，分离困难。虽然通过低氧、饥饿培养等特殊方法处理细胞可以得到大量外泌体及细胞因子蛋白质，但是细胞状态受损，收集外泌体后的间充质干细胞不能再用于其他治疗。
发明内容
本发明的目的是针对间充质干细胞外泌体浓度低、超速离心操作复杂、提取效率低下等技术问题，提供一种间充质干细胞外泌体的制备方法，其制备的间充质干细胞外泌体浓度高，超速离心操作简单，提取效率高。
为此，本发明提供了一种间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：清洗人脐带组织表面血液，去除表皮和血管组织，取出华通胶清洗后剪碎，采用组织贴壁法接种培养；
步骤2：待原代细胞长至70％融合度时进行传代培养；选用生长状况良好的第二代脐带间充质干细胞接种培养；
步骤3：在细胞培养过程中加入促进外泌体分泌的的细胞刺激因子，促进细胞生产和外泌体分泌；
步骤4：待细胞生长至90％融合度时吸出第一细胞上清液用于分离外泌体；
步骤5：将所述第一细胞上清液离心去除细胞碎片，收集第二细胞上清液；
步骤6：将所述第二细胞上清液进行第一次超滤浓缩，去除多余水分，得到第一浓缩液；
步骤7：将所述第一浓缩液进行第二次超滤浓缩，去除多余水分，得到第二浓缩液；
步骤8：将第二浓缩液进行第一次超速离心，去除细小细胞碎片；
步骤9：取上清液进行第二次超速离心，去除上清液，沉淀为干细胞分泌的外泌体；
步骤10：加入生理盐水清洗，超速离心，去除上清液，得到外泌体沉淀。
作为一种优选的实施方式，所述细胞刺激因子包括维生素C、INF-γ(γ干扰素)、HGF(肝细胞生长因子)、bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)。更优选地，所述细胞刺激因子由以下浓度的组分组成：维生素C 50ng/ml、INF-γ25ng/ml、HGF10ng/ml、bFGF5ng/ml。
作为一种优选的实施方式，所述步骤5中，离心速度为3000转/分钟，离心时间为至少20分钟。
作为一种优选的实施方式，所述步骤6中，超滤膜孔径为3KD，离心速度为4500转/分钟，离心时间为至少30分钟。
作为一种优选的实施方式，所述步骤7中，第二次超滤浓缩的条件与第一次超滤浓缩的条件相同。
作为一种优选的实施方式，所述步骤7中，第二浓缩液的体积为第二细胞上清液体积的20％。
作为一种优选的实施方式，所述步骤8中，超速离心的速度为10000转/分钟，离心时间为至少1小时。
作为一种优选的实施方式，所述步骤9和步骤10中，超速离心的速度为100000转/分钟，离心时间为至少1小时。
作为一种优选的实施方式，本发明的方法还包括用生理盐水重悬外泌体沉淀，稀释为外泌体溶液。
作为一种优选的实施方式，本发明的方法还包括用生理盐水重悬外泌体沉淀，稀释为外泌体溶液后，向外泌体溶液加入人血清白蛋白、海藻糖、甘露醇后做成冻干粉。优选地，该冻干粉包括基于浓度为10μg/ml的外泌体溶液体积百分比为2％的人血清白蛋白、终浓度为0.2M的海藻糖、质量体积浓度为6％的甘露醇。
本发明还提供了一种化妆品，其包括利用上述方法制得的外泌体。
本发明的制备方法中，通过添加外泌体刺激因子，可以有效促进脐带间充质干细胞在正常培养过程中大量释放外泌体，而且不影响脐带间充质干细胞正常生长过程；通过结合超滤法和超速离心法，先使用超滤管浓缩，去除细胞培养上清液中多余水分，对外泌体进行浓缩，能够有效减少外泌体超速离心的体积，提高溶液中外泌体浓度，提高分离效率，节约分离时间和成本。此外，在本发明公开的外泌体冻干粉配方中，通过添加人血清白蛋白和海藻糖可以有效保持外泌体中蛋白质和小分子RNA的结构和活性稳定。
附图说明
图1是浓缩前后上清液中总蛋白浓度的对比结果。
图2是本发明的外泌体在扫描电子显微镜下的形态。
图3是分离的外泌体的颗粒直径分布范围。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的详述，但本发明并不限于以下实施例。
如未特别指出，本发明所使用的试剂均为现有试剂，可通过商业渠道获得。
按照以下步骤制备注射针剂：
1、医院采集足月剖腹产胎儿脐带组织，采集前签署客户知情同意书，组织于4℃冷藏无菌环境下运抵实验室，运输过程中使用组织保护液保护脐带组织生物学活性，组织保护液由生理盐水添加25μg/ml的硫酸庆大霉素和5μg/ml的两性霉素B配制，确保运输过程中无细菌和真菌污染；
2、实验室中用组织保护液清洗脐带组织表面血液，去除表皮和血管组织，取出华通胶清洗后剪碎成1-2mm3体积碎块，采用组织贴壁法接种于T75培养瓶中培养，使用无血清且成分明确的增殖培养基培养；
3、原代细胞经14天培养长至70％融合度进行传代培养；
4、选用生长状况良好的第二代脐带间充质干细胞，按10000/cm2密度接种于康宁T175培养瓶中，加入30ml无血清增殖培养基正常培养；
5、在细胞培养过程中加入促进外泌体分泌的的细胞刺激因子，包括维生素C(50ng/ml，按在细胞培养液中的终浓度计)、INF-γ(25ng/ml)、HGF(10ng/ml)、bFGF(5ng/ml)，促进细胞生产和外泌体分泌；
6、培养3-4天后细胞生长至90％融合度时吸出上清液用于分离外泌体，间充质干细胞正常传代培养，根据细胞生长状态决定培养代次；
7、收集的细胞上清液3000转/分钟离心20分钟去除细胞碎片，收集上清液；
8、细胞上清液加入15ml超滤管中浓缩，超滤膜孔径3KD，4500转/分钟离心30分钟，去除多余水分；
9、收集超滤管中液体再次浓缩去除多余水分，浓缩终体积为初始体积的20％，使用BCA(bicinchoninic acid)法测定上清液中总蛋白浓度(结果见图1)，结果显示浓缩前人脐带间充质干细胞无血清培养上清液中总蛋白浓度为(1.43±0.21)μg/ml，液体浓缩后，上清液中总蛋白质浓度为(6.8±0.34)μg/ml；
10、浓缩液体超速离心，10000转/分钟离心1小时去除细小细胞碎片，取上清液再次100000转/分钟离心1小时，去除上清液，沉淀为干细胞分泌的外泌体；
11、加入10ml生理盐水清洗一次，100000转/分钟离心1小时，去除上清液；
12、1ml生理盐水重悬外泌体沉淀，BCA(bicinchoninic acid)法测定外泌体沉淀中总蛋白浓度、扫描电子显微镜拍摄外泌体形态(结果见图2)、用Nanosight纳米粒度分析仪对分离的外泌体进行颗粒分布范围(结果见图3)分析，结果显示提取的外泌体蛋白浓度为(1.21±0.15)mg/ml；
13、根据BCA法测定的总蛋白浓度使用生理盐水对外泌体进行稀释为10μg/ml溶液；
14、外泌体溶液加入人血清白蛋白(基于外泌体溶液的总体积计体积分数为2％)、海藻糖(基于外泌体溶液的总体积计终浓度为0.2M)、甘露醇(基于外泌体溶液的总体积计质量体积百分比为6％)后做成冻干粉长期保存(3ml西林瓶中装1ml液体冻干)；
15、外泌体冻干粉用于面部皮肤保养，使用时，外泌体冻干粉加入1.5ml溶媒(去离子水+0.5wt％透明质酸)完全溶解后使用。
效果验证：
选取20名受试者面部清洁后用75％(v/v)医用酒精面部消毒，将溶解后的外泌体溶液均匀涂抹于面部，用滚针上下轻轻滚动5分钟，无需清洗，每天早晚各使用一次，每周使用2次，连续使用4周。在第0天、7天、14天、21天、28天后用CBS-807皮肤分析系统检测皮肤毛孔大小、皮肤弹性、肤色、皱纹等。结果如以下表1所示，受试者在1周后可以看到皮肤改善，连续使用4周后皮肤改善明显。
表1
| 0天 | 7天 | 14天 | 21天 | 28天 | |
| 毛孔 | ++++ | +++ | +++ | ++ | ++ |
| 弹性 | ++ | +++ | ++++ | ++++ | +++++ |
| 皱纹 | +++ | +++ | ++ | ++ | + |
| 肤色 | ++ | ++ | +++ | +++ | ++++ |
| 皮肤光泽度 | ++ | ++ | +++ | +++ | ++++ |
Claims (10)
1.一种制备间充质干细胞外泌体的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤1：清洗人脐带组织表面血液，去除表皮和血管组织，取出华通胶清洗后剪碎，采用组织贴壁法接种培养；
步骤2：待原代细胞长至70％融合度时进行传代培养；选用生长状况良好的第二代脐带间充质干细胞接种培养；
步骤3：在细胞培养过程中加入促进外泌体分泌的的细胞刺激因子，促进细胞生产和外泌体分泌；
步骤4：待细胞生长至90％融合度时吸出第一细胞上清液用于分离外泌体；
步骤5：将所述第一细胞上清液离心去除细胞碎片，收集第二细胞上清液；
步骤6：将所述第二细胞上清液进行第一次超滤浓缩，去除多余水分，得到第一浓缩液；
步骤7：将所述第一浓缩液进行第二次超滤浓缩，去除多余水分，得到第二浓缩液；
步骤8：将所述第二浓缩液进行第一次超速离心，去除细小细胞碎片；
步骤9：取上清液进行第二次超速离心，去除上清液，沉淀为干细胞分泌的外泌体；
步骤10：加入生理盐水清洗，离心，去除上清液，得到外泌体沉淀。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞刺激因子包括维生素C、INF-γ、HGF和bFGF。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤5中，离心速度为3000转/分钟，离心时间为至少20分钟。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤6中，超滤膜孔径为3KD，离心速度为4500转/分钟，离心时间为至少30分钟。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤7中，所述第二浓缩液的体积为所述第二细胞上清液体积的20％。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤8中，超速离心的速度为10000转/分钟，离心时间为至少1小时。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤9和步骤10中，超速离心的速度为100000转/分钟，离心时间为至少1小时。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括用生理盐水重悬所述外泌体沉淀，稀释为外泌体溶液。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括用生理盐水重悬所述外泌体沉淀，稀释为外泌体溶液后，向所述外泌体溶液加入人血清白蛋白、海藻糖、甘露醇后做成冻干粉。
10.一种化妆品，其特征在于包括权利要求1至10任一项所述的方法制得的外泌体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810910349.7A CN109097326A (zh) | 2018-08-10 | 2018-08-10 | 一种制备间充质干细胞外泌体的方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810910349.7A CN109097326A (zh) | 2018-08-10 | 2018-08-10 | 一种制备间充质干细胞外泌体的方法及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109097326A true CN109097326A (zh) | 2018-12-28 |
Family
ID=64849381
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810910349.7A Pending CN109097326A (zh) | 2018-08-10 | 2018-08-10 | 一种制备间充质干细胞外泌体的方法及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109097326A (zh) |
Cited By (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109943533A (zh) * | 2019-03-29 | 2019-06-28 | 上海交通大学医学院附属第九人民医院 | 一种制备脂肪干细胞外泌体的方法、脂肪干细胞外泌体及其应用 |
| CN110038032A (zh) * | 2019-05-10 | 2019-07-23 | 江苏大学 | 人脐带msc外泌体的新型抗肾纤维化的生物制剂及制备方法 |
| CN110124058A (zh) * | 2019-06-06 | 2019-08-16 | 福建医科大学附属第一医院 | 一种来源于骨髓间充质干细胞外泌体-阿霉素纳米靶向药物的制备及体外抗骨肉瘤的研究 |
| CN110279893A (zh) * | 2019-08-13 | 2019-09-27 | 成都清科生物科技有限公司 | 一种外泌体冻干粉及其制备方法和包含该外泌体冻干粉的制剂 |
| CN110317783A (zh) * | 2019-07-19 | 2019-10-11 | 海南正负一贸易有限公司 | 脐带间充质干细胞的外泌体的制备方法和护肤品 |
| CN110964694A (zh) * | 2019-11-11 | 2020-04-07 | 浙江卫未生物医药科技有限公司 | 基于密度梯度离心和超速离心的外泌体的提取方法 |
| CN111434769A (zh) * | 2019-01-15 | 2020-07-21 | 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心 | 一种外泌体的制备方法及应用 |
| CN111568851A (zh) * | 2020-06-03 | 2020-08-25 | 广东壹加再生医学研究院有限公司 | 一种利用围产期msc生产活性因子的方法及美容制剂 |
| CN111826345A (zh) * | 2019-04-17 | 2020-10-27 | 深圳国科靶点药物有限公司 | 一种人脐带间充质干细胞源外泌体制剂 |
| CN112251394A (zh) * | 2020-11-05 | 2021-01-22 | 华夏源细胞工程集团股份有限公司 | 一种结合超滤法和超速离心法的外泌体提取方法 |
| CN112899224A (zh) * | 2021-02-08 | 2021-06-04 | 高连如 | 一种用于负载冠脉支架的细胞外纳米囊泡，制备方法和应用 |
| CN113046307A (zh) * | 2021-03-22 | 2021-06-29 | 奥德干细胞再生医学研究中心股份公司 | 一种iPSC来源干细胞外泌体制备方法及其应用 |
| CN113151162A (zh) * | 2021-04-13 | 2021-07-23 | 广东唯泰生物科技有限公司 | 外泌体在促进壁蜕膜间充质干细胞生长中的应用 |
| CN113498434A (zh) * | 2020-01-22 | 2021-10-12 | 京东方科技集团股份有限公司 | 间充质干细胞膜片及其用途 |
| CN113699103A (zh) * | 2021-07-14 | 2021-11-26 | 谢儒生 | 一种禽类间质干细胞外泌体的诱发增援制备工艺及应用 |
| WO2022143590A1 (zh) * | 2020-12-31 | 2022-07-07 | 国典(北京)医药科技有限公司 | 一种外泌体分泌诱导剂及诱导培养基和应用其的外泌体的生产方法及应用 |
| CN114807235A (zh) * | 2021-01-18 | 2022-07-29 | 苏州恒康生命科学有限公司 | 一种永生化间充质干细胞的构建方法及制备外泌体的方法 |
| CN114931589A (zh) * | 2022-05-24 | 2022-08-23 | 苏州大学附属第一医院 | 一种富血小板血浆来源外泌体产品的制备方法和应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20170296627A1 (en) * | 2014-09-05 | 2017-10-19 | Exerkine Corporation | Exersomes, methods of producing and method of using |
| CN107854418A (zh) * | 2017-11-10 | 2018-03-30 | 南京九圣生物科技股份有限公司 | 一种人脐带间充质干细胞外泌体外用乳霜及其制备方法 |
| CN108143748A (zh) * | 2017-12-27 | 2018-06-12 | 佛山科学技术学院 | 一种犬msc外泌体制剂及其制备方法 |
-
2018
- 2018-08-10 CN CN201810910349.7A patent/CN109097326A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20170296627A1 (en) * | 2014-09-05 | 2017-10-19 | Exerkine Corporation | Exersomes, methods of producing and method of using |
| CN107854418A (zh) * | 2017-11-10 | 2018-03-30 | 南京九圣生物科技股份有限公司 | 一种人脐带间充质干细胞外泌体外用乳霜及其制备方法 |
| CN108143748A (zh) * | 2017-12-27 | 2018-06-12 | 佛山科学技术学院 | 一种犬msc外泌体制剂及其制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 赵贵芳: "脐带间充质干细胞及其来源外泌体修复皮肤损伤的机制研究", 《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 * |
Cited By (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111434769A (zh) * | 2019-01-15 | 2020-07-21 | 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心 | 一种外泌体的制备方法及应用 |
| CN109943533A (zh) * | 2019-03-29 | 2019-06-28 | 上海交通大学医学院附属第九人民医院 | 一种制备脂肪干细胞外泌体的方法、脂肪干细胞外泌体及其应用 |
| CN111826345A (zh) * | 2019-04-17 | 2020-10-27 | 深圳国科靶点药物有限公司 | 一种人脐带间充质干细胞源外泌体制剂 |
| CN110038032A (zh) * | 2019-05-10 | 2019-07-23 | 江苏大学 | 人脐带msc外泌体的新型抗肾纤维化的生物制剂及制备方法 |
| CN110124058A (zh) * | 2019-06-06 | 2019-08-16 | 福建医科大学附属第一医院 | 一种来源于骨髓间充质干细胞外泌体-阿霉素纳米靶向药物的制备及体外抗骨肉瘤的研究 |
| CN110124058B (zh) * | 2019-06-06 | 2021-11-26 | 福建医科大学附属第一医院 | 一种来源于骨髓间充质干细胞外泌体-阿霉素纳米靶向药物的制备及体外抗骨肉瘤的研究 |
| CN110317783A (zh) * | 2019-07-19 | 2019-10-11 | 海南正负一贸易有限公司 | 脐带间充质干细胞的外泌体的制备方法和护肤品 |
| CN110279893A (zh) * | 2019-08-13 | 2019-09-27 | 成都清科生物科技有限公司 | 一种外泌体冻干粉及其制备方法和包含该外泌体冻干粉的制剂 |
| CN110964694A (zh) * | 2019-11-11 | 2020-04-07 | 浙江卫未生物医药科技有限公司 | 基于密度梯度离心和超速离心的外泌体的提取方法 |
| CN113498434A (zh) * | 2020-01-22 | 2021-10-12 | 京东方科技集团股份有限公司 | 间充质干细胞膜片及其用途 |
| CN111568851A (zh) * | 2020-06-03 | 2020-08-25 | 广东壹加再生医学研究院有限公司 | 一种利用围产期msc生产活性因子的方法及美容制剂 |
| CN112251394A (zh) * | 2020-11-05 | 2021-01-22 | 华夏源细胞工程集团股份有限公司 | 一种结合超滤法和超速离心法的外泌体提取方法 |
| WO2022143590A1 (zh) * | 2020-12-31 | 2022-07-07 | 国典(北京)医药科技有限公司 | 一种外泌体分泌诱导剂及诱导培养基和应用其的外泌体的生产方法及应用 |
| CN114807235A (zh) * | 2021-01-18 | 2022-07-29 | 苏州恒康生命科学有限公司 | 一种永生化间充质干细胞的构建方法及制备外泌体的方法 |
| CN114807235B (zh) * | 2021-01-18 | 2023-08-18 | 苏州恒康生命科学有限公司 | 一种永生化间充质干细胞的构建方法及制备外泌体的方法 |
| CN112899224A (zh) * | 2021-02-08 | 2021-06-04 | 高连如 | 一种用于负载冠脉支架的细胞外纳米囊泡，制备方法和应用 |
| CN113046307A (zh) * | 2021-03-22 | 2021-06-29 | 奥德干细胞再生医学研究中心股份公司 | 一种iPSC来源干细胞外泌体制备方法及其应用 |
| CN113151162A (zh) * | 2021-04-13 | 2021-07-23 | 广东唯泰生物科技有限公司 | 外泌体在促进壁蜕膜间充质干细胞生长中的应用 |
| CN113699103A (zh) * | 2021-07-14 | 2021-11-26 | 谢儒生 | 一种禽类间质干细胞外泌体的诱发增援制备工艺及应用 |
| CN113699103B (zh) * | 2021-07-14 | 2023-04-25 | 谢儒生 | 一种禽类间质干细胞外泌体的诱发增援制备工艺及应用 |
| CN114931589A (zh) * | 2022-05-24 | 2022-08-23 | 苏州大学附属第一医院 | 一种富血小板血浆来源外泌体产品的制备方法和应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109097326A (zh) | 一种制备间充质干细胞外泌体的方法及其应用 | |
| CN106109496B (zh) | 人脐带间充质干细胞提取物冻干粉及制备方法 | |
| CN111647554A (zh) | 从脐带间充质干细胞制备的外泌体制剂及其方法 | |
| CN101481677B (zh) | 体外刺激树突状细胞成熟的方法 | |
| CN109893541B (zh) | 经血干细胞来源的外泌体在制备治疗宫腔粘连的药物中的应用 | |
| CN105535022A (zh) | 外泌体在制备治疗急性肝衰竭的药物中的用途和药物组合物 | |
| CN111471647A (zh) | 成体干细胞外泌体的制备方法及其在治疗帕金森疾病中的应用 | |
| CN110885786B (zh) | 细胞因子在促进牙髓干细胞分泌外泌体中的应用 | |
| US20210147797A1 (en) | Cell line consecutively expressing hla g protein and method for preparing the same | |
| CN108096279A (zh) | 一种人间充质干细胞分泌活性成分生发产品的制备方法 | |
| CN113616674A (zh) | 一种具有抗炎作用的细胞外囊泡的应用 | |
| CN108823144B (zh) | 抑制内皮细胞迁移的外泌体活性制剂及其制备方法和应用 | |
| CN118453655B (zh) | 一种间充质干细胞在治疗特发性肺纤维化的应用 | |
| CN114874981A (zh) | 一种间充质干细胞外泌体及用于免疫细胞培养的用途 | |
| CN112022876A (zh) | 骨髓间充质干细胞外泌物在椎间盘退行性疾病中的应用 | |
| CN102409024A (zh) | 构建前列腺癌细胞体外浸润模型 | |
| CN115261410A (zh) | 一种基因编辑工程化m1型巨噬细胞外泌体的制备方法及其应用 | |
| CN114209814B (zh) | Tnfsf15蛋白在促进骨髓干细胞分化为巨噬细胞并扩增中的用途 | |
| CN102747033A (zh) | 一种由牙龈组织培养间充质干细胞和成纤维组织的方法 | |
| CN114672457A (zh) | 来源于肿瘤组织的具有肿瘤特异性杀伤效果的t淋巴细胞及其制备方法和细胞制剂 | |
| CN111778212B (zh) | 动员后造血干细胞血浆外泌体制备方法及其应用 | |
| CN118384089A (zh) | 促进毛发生长的方法和使用的脐带间充质干细胞源外泌体 | |
| CN105233280A (zh) | 基于dc的神经胶质瘤全肿瘤抗原疫苗及其制备方法 | |
| CN101412987A (zh) | 体外骨髓间充质干细胞扩增方法 | |
| CN110237026A (zh) | 一种透明质酸钠复合脂肪干细胞条件培养基冻干制剂 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20181228 |